ANA-LUISA-GOMEZ-GOMEZ

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN 
BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 
 
 
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE NANOPARTÍCULAS 
DE ORO BIOSINTETIZADAS CON CURCINA EN LÍNEAS 
CELULARES CANCERÍGENAS 
 
T E S I S 
 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRO EN BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 
PRESENTA 
I.A. ANA LUISA GÓMEZ GÓMEZ 
 
 
DIRECTORES DE TESIS 
DR. ABDÚ ORDUÑA DÍAZ 
DR. VALENTIN LÓPEZ GAYOU 
 
 
TEPETITLA DE LARDIZABAL, TLAXCALA DICIEMBRE 2016 
 
 
 
 
 
 
 
I 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al personal del Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada del Instituto 
Politécnico Nacional por las facilidades otorgadas durante el desarrollo de esta tesis. 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por los apoyos 
económicos brindados como becaria, así como al Programa de Fortalecimiento 
Académico para Indígenas 2015-1. También a los proyectos SIP 20160211, Estudio 
de residuos nanoestructurados provenientes del proceso CSVT-HFCVD mediante 
espectroscopías. 
A los directores de tesis el Dr. Abdú Orduña Díaz y al Dr. Valentín López Gayou, 
por la confianza y orientación durante este trabajo de maestría. 
A los integrantes del comité tutoral, la Dra. Alma Leticia Martínez, Dra. Lidia Patricia 
Jaramillo Quintero, Dr. José Francisco Sánchez Ramírez y Dr. Raúl Jacobo Delgado 
Macuil por las observaciones realizadas a lo largo de los exámenes tutorales y en 
la revisión de este trabajo. 
A la Facultad de Ciencias Básicas, Ingeniería y Tecnología de la Universidad 
Autónoma de Tlaxcala por la oportunidad de trabajar en sus laboratorios y 
permitirme conocer a Doña Chío, Franzue, Iris, Suri, Yvett, en general gracias por 
su gentileza a todos los estudiantes de la Dra. Patricia Jaramillo. 
Al laboratorio del Dr. Marco Antonio Cerbón, en particular al Dr. Ignacio González 
de la Facultad de Química de la UNAM, gracias por las líneas celulares. 
Un agradecimiento especial al Dr. Saúl Rojas Hernández y su grupo de 
investigación del Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular de la Sección de 
Estudios de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina, por su 
apoyo incondicional en el desarrollo experimental de la última etapa del proyecto. 
 
II 
 
Finalmente a mis amigos Nancy, Jade, Miguel, Made Jair, Frank y la Q.F.B. Lety 
Saldaña. A los fiesteros Nallely (Zoe), Mago, Mire, Edgar, Richard, Roger, Elías, 
Gera, Carlitos nunca olvidare las convivencias leves. A mis amiguitos de trabajo Ana 
Lau, Janette, Manuel, Ángel, Orlando y Gera. A los chicos de la ESM-IPN Mara, 
Arturo Contis, Alexander, José Luis, Alfredo, Diego, Itzel, Sonia. A Vero Garrido y 
Jorge por su apoyo en las extracciones de RNA. A mis compañeros de generación 
Ana María, Vero, Meli, Flor, Aidé, Gina, Isaí y Beto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III 
 
 
DEDICATORIAS 
 
A mi familia 
A mis padres Victor y Victoria, por su amor y apoyo incondicional, les dedico esta 
tesis con mucho cariño. 
A mis hermanos Javier y Adriana por ser mis cómplices e incondicionales. A 
Alejandra, Alán y José por sus ocurrencias que me roban una sonrisa cada día. A 
mi tía Luisa por su cariño y atinados consejos, a ustedes que siempre están conmigo 
a pesar de la distancia, les agradezco y dedico este logro en familia. 
A Sergio por su amor incondicional. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV 
 
 
RESUMEN 
 
Jatropha curcas L. es un cultivo de importancia debido a sus diversas aplicaciones 
y propiedades antimicrobianas, antipiréticas y antitumorales. Esta última 
característica se ha relacionado con una proteína llamada curcina, ya que estudios 
recientes han demostrado que esta proteína presenta actividad citotóxica sobre 
algunas líneas celulares cancerígenas, debido a su actividad RNA N-glucosidasa, 
lo que sugiere su posible uso como agente terapéutico. En los últimos años la 
nanotecnología ha hecho aportaciones en el área biomédica, mediante el uso de 
estructuras nanométricas se podría dirigir el efecto citotóxico de curcina. En el 
presente trabajo se realizó la biosíntesis de nanopartículas de oro con curcina, las 
cuales fueron caracterizadas por espectroscopía UV-Visible, espectroscopía 
infrarroja por transformada de Fourier (FTIR por sus siglas en inglés) y microscopía 
electrónica de transmisión (MEB), y se evaluó su efecto citotóxico sobre las líneas 
celulares HeLa, MDA-MB-231 y PC-3 (cáncer cervicouterino, mama y próstata, 
respectivamente). Las nanopartículas obtenidas de acuerdo con las micrografías 
tuvieron un tamaño de partícula promedio de 12.08 nm, con formas cuasi esféricas, 
mientras que por espectroscopía UV-Visible se determinó la banda de superficie de 
plasmón a 535 nm, esto indica la formación de estructuras monodispersas y que 
concuerda con los resultados obtenidos por MET. Por espectroscopia IR-FT se 
observaron los picos correspondientes a la amida I y amida II (1656 y 1533 cm-1 
respectivamente) presentes en las proteínas así como corrimientos de estos picos 
junto con la presencia de picos en la región de 1000 a 1500 cm-1, que de acuerdo a 
la literatura se relacionan con las interacciones entre el oro y grupos funcionales de 
los aminoácidos presentes en curcina. 
 
 
 
 
V 
 
 
ABSTRACT 
 
Jatropha curcas L. is an important crop because of its various applications and 
antimicrobial, antipyretic and anti-tumor properties. This latter feature has been 
linked to a protein called curcin, as recent studies have shown that this protein has 
cytotoxic activity on some cancer cell lines, due to their activity RNA N-glycosidase, 
suggesting its possible use as a therapeutic agent. In recent years, nanotechnology 
has made contributions in the biomedical area, by using nanometric structures could 
direct the cytotoxic effect of curcin. In this paper the biosynthesis of gold 
nanoparticles with curcin was made, which were characterized by UV-visible 
spectroscopy, infrared spectroscopy by Fourier transform (FT-IR) and transmission 
electron microscopy (SEM), and its effect was evaluated cytotoxic on HeLa cell lines, 
MDA-MB-231 and PC-3 (cervical cancer, breast, and prostate cancers, 
respectively). The nanoparticles obtained according to the micrographs had an 
average particle size of 8.12 nm, with quasi-spherical shapes, while by UV-Visible 
band surface plasmon at 535 nm was determined, it indicates the formation of 
monodisperse structures and consistent with the results obtained by TEM. 
Spectroscopy IR-FT corresponding to amide I peaks were observed and amide II 
(1656 and 1533 cm-1 respectively) present in proteins and shifts of these peaks 
coupled with the presence of peaks in the region of 1000 to 1500 cm -1, which 
according to the literature they relate to interactions between gold and functional 
groups of the amino acids present in curcin 
 
I 
 
 
ÍNDICE 
 
RESUMEN .......................................................................................................................................... IV 
ABSTRACT ......................................................................................................................................... V 
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES ........................................................................................................ 3 
2.1. CÁNCER: PROBLEMÁTICA Y GENERALIDADES ............................................................ 3 
2.2. CARACTERÍSTICAS DE LAS CELULAS NEOPLASICAS ................................................. 6 
2.3. MUERTE CELULAR ............................................................................................................ 7 
2.4. CULTIVO DE Jatropha curcas L. ......................................................................................10 
2.5. PROTEÍNAS Y SU CLASIFICACIÓN ................................................................................ 11 
2.6. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ..................................................................................... 11 
2.7. CURCINA .......................................................................................................................... 13 
2.8. PROTEÍNAS INACTIVADORAS DE RIBOSOMAS .......................................................... 14 
2.9. NANOTECNOLOGÍA Y SUS APLICACIONES ................................................................. 16 
2.10. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS .............................................................................. 17 
2.11. BIOSINTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO ........................................................ 18 
2.12. TECNICAS ESPECTROSCÓPICAS PARA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN 
DE NANOPARTÍCULAS ............................................................................................................... 20 
2.12.1. ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE ................................................................. 20 
2.12.2. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR)
 21 
2.12.3. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA .............................................................................. 22 
2.12.4. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB) ........................................... 22 
2.12.5. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET) ................................... 23 
2.13. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 24 
2.14. HIPÓTESIS ................................................................................................................... 25 
2.15. OBJETIVOS .................................................................................................................. 25 
2.15.1. OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 25 
 
II 
 
2.15.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 25 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA......................................................................................................... 26 
3.1. ESTRATEGÍA GENERAL DE TRABAJO .......................................................................... 26 
3.2. DESGRASADO DE LA HARINA DE SEMILLAS DE J. curcas ......................................... 27 
3.3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE CURCINA ............................................................. 27 
3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO 
(BCA) 27 
3.5. ELECTROFORESIS (SDS-PAGE) .................................................................................... 28 
3.6. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE CURCINA ......................................................................... 30 
3.7. BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO ............................................................ 31 
3.8. SÍNTESIS QUÍMICA DE NANOPARTÍCULAS DE ORO .................................................. 32 
3.9. CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO................................................. 32 
3.10. CULTIVOS CELULARES .............................................................................................. 32 
3.11. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA ................................................. 33 
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 34 
4.1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE CURCINA ............................................................. 34 
4.2. ELECTROFORESIS (SDS-PAGE) .................................................................................... 35 
4.3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE CURCINA ......................................................................... 35 
4.4. BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO ............................................................ 36 
4.4.1. CARACTERIZACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE ...................... 36 
4.4.2. CARACTERIZACIÓN MEDIANTE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE 
TRANSMISIÓN (MET) ............................................................................................................ 43 
4.4.3. CARACTERIZACIÓN MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA POR 
TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) ............................................................................... 45 
4.5. SÍNTESIS QUÍMICA DE NANOPARTÍCULAS DE ORO .................................................. 52 
4.5.1. CARACTERIZACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE ...................... 52 
4.5.2. CARACTERIZACIÓN MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA POR 
TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) ............................................................................... 53 
4.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO CITOTÓXICO .................................................................... 54 
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 61 
 
III 
 
BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................................. 62 
ANEXOS ............................................................................................................................................ 70 
ANEXO A ...................................................................................................................................... 70 
ANEXO B ...................................................................................................................................... 71 
ANEXO C ...................................................................................................................................... 72 
ANEXO D ...................................................................................................................................... 74 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Algunos cambios bioquímicos y genéticos que ocurren en células cancerosas del ser 
humano. Se observan algunos cambios bioquímicos en células cancerosas; aquí sólo se muestran 
algunos de ellos (Murray & Gross, 2009). ........................................................................................... 6 
Figura 2. Representación esquemática de las vías de señalización celular de activación de apoptosis 
en una célula (Martínez, 2009)............................................................................................................ 9 
Figura 3. Arbusto (a), frutos (b) y semillas (c) de Jatropha curcas (Heller, 1996) ............................ 10 
Figura 4. Mecanismo de acción de las RIPs (Proteínas Inactivadoras de los Ribosomas). Todas las 
RIPs escinden una adenina (A4324) en el ARNr de la subunidad mayor de los ribosomas, 
imposibilitando la unión del factor de elongación II. (Stirpe et al., 2004) .......................................... 14 
Figura 5. Representación esquemática de la estructura de las proteínas inactivadoras de ribosomas. 
(Domashevskiy & Goss, 2015) .......................................................................................................... 15 
Figura 6. Aplicaciones terapéuticas en cáncer de nanopartículas de oro. (Ghosh et al., 2008) ...... 17 
Figura 7. Diagrama del proceso de biosíntesis (Akhtar et al., 2013) ................................................ 19 
Figura 8. Localización en la región visible de nanopartículas de oro (Au) y plata (Ag), dependiendo 
de su morfología (Izaguirre-López, 2010) ......................................................................................... 20 
Figura 9. Equipo FTIR VERTEX 70................................................................................................... 21 
Figura 10. Esquema general del efecto del haz de electrones sobre la muestra. ............................ 23Figura 11. Diagrama de la estrategia general de trabajo para la evaluación del efecto citotóxico de 
nanopartículas de oro biosintetizadas con curcina ........................................................................... 26 
Figura 12. Líneas celulares en medio DMEM suplementado con SFB al 10%, antibióticos al 1%, 37 
°C y 5% de CO2 (HeLaa MDA-MB-231b y PC-3c). ............................................................................ 33 
Figura 13. Cromatografía de intercambio iónico del extracto T/A de semillas de J. curcas en SP-
Sepharosa®, eluído con un buffer de fosfatos 5mM pH 7 con NaCl 1 M ......................................... 34 
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IV 
 
Figura 14. Electroforesis SDS-PAGE. 1) Marcador de peso molecular; 3) Extracto T/A; 4 y 5) 
Fracciones 9 a 15 obtenidas por cromatografía de intercambio iónico; 6 y 7) Fracciones 9 a 15 
obtenidas por cromatografía de intercambio iónico, dializadas y ultrafiltradas en membranas de 30 
kDa y 10 kDa. ................................................................................................................................... 35 
Figura 15. ARNr de hígado de ratón ................................................................................................. 35 
Figura 16. Espectros de absorción UV-Vis de los controles a diferentes temperaturas : a) C1: HAuCl4 
+ SDS; b) C2: Curcina + SDS; c) C3: Curcina + HAuCl4 .................................................................. 38 
Figura 17. Espectros de absorción UV-Vis de los tratamientos: a) A1: 150 µg/mL curcina + 200 µg/mL 
HAuCl4; b) A2: 225 µg/mL curcina + 150 µg/mL HAuCl4 y c) A3: 300 µg/mL curcina + 100µg/mL 
HAuCl4 ............................................................................................................................................... 39 
Figura 18. Espectro UV-Vis de la biosíntesis de Cur- AuNPs a 70 °C (a); electroforesis SDS-PAGE 
de las Cur-AuNPs y curcina (b). ........................................................................................................ 42 
Figura 19. Micrografías MET a) y b) de la biosíntesis de Cur-AuNPs (A2, 70 °C); c) y d) biosíntesis 
de Cur-AuNPs (C3, 70 °C, sin SDS) ................................................................................................ 43 
Figura 20. Micrografía MET de la biosíntesis de Cur-AuNPs (A2 a 70 °C) y su respectiva distribución 
de tamaño. ......................................................................................................................................... 44 
Figura 21. Espectros FTIR de los controles: a) C1: HAuCl4 + SDS; b) C2: Curcina + SDS y c) C3: 
Curcina + HAuCl4 .............................................................................................................................. 48 
Figura 22. Espectros FTIR de las muestras: a) A1: 150 µg/mL curcina + 200 µg/mL HAuCl4; b) A2: 
225 µg/mL curcina + 150 µg/mL HAuCl4 y c) A3: 300 µg/mL curcina + 100µg/mL HAuCl4 ............. 49 
Figura 23. a) Espectros FTIR de curcina; b) Biosíntesis de las nanopartículas de oro con curcina a 
70 °C .................................................................................................................................................. 51 
Figura 24. Espectro UV-Vis de la síntesis química de nanopartículas de oro. ................................. 52 
Figura 25. Espectro FTIR de las nanopartículas sintetizadas químicamente .................................. 53 
Figura 26. Estructura del complejo proteína-surfactante del modelo "Necklace and bead" y sus dos 
posibilidades. (A) La proteína envuelta alrededor de la micela. (B) Los núcleos de las micelas se 
encuentras en los sitios hidrfóbicos de la proteína. (Xu & Keiderlin, 2004). ..................................... 54 
Figura 27. Ensayo MTT de la línea celular MDA-MB-231; a) Control, b) células MDA-MB-231 en 
presencia de curcina y c) células MDA-MB-231 tratadas con Cur-AuNPs. ...................................... 56 
Figura 28. Ensayo MTT de la línea celular HeLa; a) Control, b) células HeLa tratadas con curcina y 
c) células HeLa tratadas con Cur-AuNPs. ........................................................................................ 56 
Figura 29. Figura 23. Ensayo MTT de la línea celular PC3; a) Control, b) células PC3 tratadas con 
curcina y c) célulasPC3 tratadas con Cur-AuNPs. ............................................................................ 56 
Figura 30. Evaluación del efecto citotóxico de curcina, nanopartículas con curcina, nanopartículas 
con citrato, en la línea celular MDA-MB-231 ..................................................................................... 57 
Figura 31. Evaluación del efecto citotóxico de curcina, nanopartículas con curcina, nanopartículas 
con citrato, en la línea celular HeLa .................................................................................................. 57 
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V 
 
Figura 32. Evaluación del efecto citotóxico de curcina, nanopartículas con curcina, nanopartículas 
con citrato, en la línea celular PC-3 .................................................................................................. 58 
Figura 33. Curva estándar de BSA para la cuantificación de proteínas ........................................... 70 
Figura 34. Espectro UV-Vis de los reactivos utilizados en la biosíntesis de nanopartículas de oro 71 
Figura 35. Espectro FTIR del SDS y HAuCl4 en la biosíntesis de nanopartículas de oro. ............... 74 
 
 
 
 ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Tratamientos utilizados contra cáncer (American Cancer Society, 2014). ........................... 5 
Tabla 2. Comparación de características citomorfológicas de los procesos de muerte celular: 
apoptosis y necrosis. Adaptada de Elmore (2007) y tomada de Martinez (2009). ............................. 8 
Tabla 3. Métodos químicos para la síntesis de nanopartículas ........................................................ 18 
Tabla 4. Concentraciones para la construcción de la curva estándar de BCA ................................. 28 
Tabla 5. Solución estándar para la preparación de geles de electroforesis SDS-PAGE ................. 29 
Tabla 6. Composición de los geles de electroforesis SDS-PAGE .................................................... 29 
Tabla 7. Composición de buffer muestra para electroforesis SDS-PAGE ........................................ 29 
Tabla 8. Condiciones experimentales para la biosíntesis de nanopartículas de oro ........................ 31 
Tabla 9. Diseño experimental para la biosíntesis de nanopartículas ................................................ 32 
Tabla 10. Concentraciones de los tratamientos utilizados en la evaluación del efecto citotóxico sobre 
las líneas celulares cancerígenas ..................................................................................................... 33 
Tabla 11. Efecto de los tratamientos en el proceso de biosíntesis de Cur-AuNPs. ......................... 41 
Tabla 12. Asociación de las señales obtenidas por FTIR ................................................................. 47 
Tabla 13. Concentraciones de los direferentes tratamientos ............................................................ 58 
Tabla 14. Efecto de los tratamientos en la inhibición de la proliferación celular .............................. 60 
Tabla 15. Efecto de curcina sobre diferentes líneas celulares ........................................................ 60 
Tabla 16. Concentraciones utilizadas para la obtención de la curva estándar de BSA ................... 70 
 
 
 
 
 
 
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I 
 
 Abreviaturas comunes en el texto 
 
A absorbancia 
BCA ácido bicinconínico 
HAuCl4 ácido tetracloroaúrico 
ADN ácido desoxirribonucleico 
ARN ácido ribonucleido 
BSA albúmina sérica bovina 
MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol 
cm centímetro 
eV electronvoltios 
°C grados Celsius 
g gramo 
h horas 
kDa 
KeV 
kiloDalton 
kiloelectronvoltios 
λ longitud de onda 
µL microlitro 
mg miligramos 
mL mililitro 
mM milimolar 
min minutos 
M Molar 
nm nanometros 
N 
OMS 
Normal 
Organización mundial de la salud 
pH potencial de hidrógeno 
rpm revoluciones por minuto 
RPS Resonancia de plasmón superficial 
s segundos 
 
 
I 
 
Nomenclatura de aminoácidos 
 
A 
B 
C 
D 
E 
F 
G 
H 
I 
K 
L 
M 
N 
P 
Q 
R 
S 
T 
V 
W 
Y 
Z 
 
 
Ala 
Asx 
Cys 
Asp 
Glu 
Phe 
Gly 
His 
Ile 
Lys 
Leu 
Met 
Asn 
Pro 
Gln 
Arg 
Ser 
Thr 
Val 
Trp 
Tyr 
Glx 
 
Alanina 
Asparagina o ácido aspártico 
Cisteína 
Ácido aspártico 
Ácido glutámico 
Fenilalanina 
Glicina 
Histidina 
Isoleucina 
Lisina 
Leucina 
Metionina 
Asparagina 
Prolina 
GlutaminaArginina 
Serina 
Treonina 
Valina 
Triptofano 
Tirosina 
Glutamina o ácido glutámico 
 
1 
 
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 
 
Jatropha curcas L. es un cultivo de importancia debido a sus diversas aplicaciones, 
como fuente alternativa para la obtención de biodiesel, en la elaboración de jabones 
y cosméticos, en la industria farmacéutica debido a que algunas partes de la planta 
se utilizan en medicina tradicional, por sus propiedades antimicrobianas, 
antipiréticas, y antitumorales; esto la convierte en una especie de interés 
biotecnológico (Heller, 1996; Makkar et al., 1998). Las semillas de Jatropha curcas 
L. contienen entre 22-28% de proteína (Devappa et al., 2010), destacando una 
proteína inactivadora de ribosomas de tipo 1 denominada curcina, que presenta 
actividad antifúngica, antiviral y antitumoral (Lin et al., 2010). Debido a estas 
características, diversas investigaciones han evaluado su actividad antitumoral en 
líneas celulares cancerígenas, destacando su efecto sobre cáncer de mama (MDA-
MB-231, MDA-MB-45), cáncer colorectal (HT-29), cáncer de cérvix (HeLa) y gliomas 
cáncer de cerebro, describiendo morfológicamente la degeneración de organelos y 
la ruptura de la membrana durante la apoptosis (Jaramillo et al., 2012; Mohamed et 
al., 2014). Estos resultados son de relevancia debido a que actualmente el cáncer 
es un problema de salud pública, ya que es la principal causa de muerte a nivel 
mundial y está asociado a factores como edad, estilo de vida, género y factores 
comórbidos, tales como tabaquismo y predisposición genética. Existen diversos 
tratamientos, los cuales dependen del tipo, localización y etapa de desarrollo. 
En los últimos años la nanotecnología ha hecho aportaciones en el área biomédica, 
mediante el uso de estructuras nanométricas en la entrega de fármacos como parte 
de las terapias dirigidas (Logothetidis, 2012; Leyva, 2013). Principalmente las 
nanopartículas de oro han destacado como nanoportadores para la entrega de 
fármacos o de biomoléculas como proteínas, péptidos, ADN O ARN, debido a que 
estas nanopartículas no son tóxicas y son relativamente fácil de sintetizar (Kumar 
et al., 2012), por estas características las nanopartículas han sido sintetizadas 
mediante métodos químicos y funcionalizadas con material biológico para diversas 
aplicaciones con fines terapéuticos como el tratamiento de cáncer (Ghosh et al., 
 
2 
 
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 
2008; Mohamed et al., 2014). Sin embargo, dado el alto potencial de aplicación de 
los nanomateriales, se debe considerar el diseño de nuevos procesos de síntesis 
que tengan el menor impacto hacia el medio ambiente, de tal manera que se llegue 
a un producto de manera eficiente y sin la formación o uso de sustancias tóxicas. 
Dentro de estas nuevas alternativas se encuentra la biosíntesis de nanopartículas, 
este método utiliza microorganismo o extractos de plantas para la reducción de los 
iones metálicos y por tanto la formación de nanopartículas, lo que provee un método 
fácil, en condiciones menos drásticas de temperatura y por lo tanto menor costo 
energético, y sin el uso de sustancias tóxicas (Salinas et al, 2012; Muniyappan & 
Nagarajan, 2014). Investigaciones recientes han utilizado extractos de Jatropha 
curcas para la síntesis química de nanopartículas de oro evaluando su efecto 
citotóxico en cáncer de cerebro, (Mohamed et al., 2014), también han utilizado 
extractos de Jatropha curcas y Jatropha gossypifolia en la biosíntesis de 
nanopartículas de plata evaluando su efecto citotóxico en líneas celulares de cáncer 
de pulmón (Nazeema & Sugannya, 2014), con base a lo mencionado anteriormente 
en este proyecto se propone la biosíntesis de nano partículas de oro con curcina y 
evaluar su actividad citotóxica en diversas líneas celulares neoplásicas. 
 
 
 
 
3 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
2.1. CÁNCER: PROBLEMÁTICA Y GENERALIDADES 
 
El cáncer es actualmente un problema de salud a nivel mundial, la Organización 
Mundial de la Salud (OMS) en 2012 señaló que este padecimiento causó 8.2 
millones de defunciones en el mundo. En México, de acuerdo con la Unión 
Internacional Contra el Cáncer (UICC), el cáncer es la tercera causa de muerte y 
estima que cada año se detectan 128 mil casos nuevos. En 2010 la Secretaría de 
Salud registró, 70,445 defunciones por cáncer, de las cuales el 50.9% fueron 
mujeres y 49.1% hombres. Debido a su gran incidencia el cáncer en México, 
representa un reto ya que su apropiado control implica mejorar programas de 
prevención y detección oportuna de cáncer (DOC); optimizar el diagnóstico e instituir 
un tratamiento específico, además de suministrar cuidados paliativos para mejorar 
la calidad de vida del paciente (INEGI, 2014). 
En la población mexicana el cáncer representa un problema de salud pública, a 
partir del año 2006 el cáncer de mama ha sido el de mayor incidencia en el sector 
femenino seguido por el cáncer cervicouterino ambos son la principal causa de 
muerte de feminas en un intervalo de edad de 30 a 54 años. Mientras quen en la 
población masculina el cáncer de prostata tiene mayor repercución en las 
defunciones seguidas del otras tipos de cáncer como el de tráquea, bronquios y 
pulmón (CIEDD, 2013; INEGI, 2014). 
El “cáncer” es un término genérico que designa a un amplio grupo de enfermedades 
que pueden afectar cualquier parte del organismo, se le atribuyen denominaciones 
como “tumores malignos o neoplasias malignas”. Se origina cuando células 
anormales en alguna parte del cuerpo comienzan a multiplicarse rápidamente y sin 
control, pueden invadir partes adyacentes del cuerpo o propagarse a otros órganos, 
a este proceso se le conoce como metástasis (CIEDD, 2013). A su vez el cáncer 
forma parte del grupo de enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), es decir 
 
4 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
aquellas que no se transmiten de persona a persona son de larga duración y lenta 
evolución. 
El cuerpo está formado de muchos tipos de células, las cuales crecen y se dividen 
en una forma controlada para producir más células según sean necesarias para 
mantener el cuerpo sano. Cuando las células envejecen o se dañan, mueren y son 
reemplazadas por células nuevas. En el caso de las células cancerosas en lugar de 
morir, continúan creciendo y forman nuevas células anormales. Las células 
cancerígenas pueden también invadir o propagarse a otros tejidos, algo que las 
células normales no pueden hacer. 
Las células se transforman en células cancerosas debido a una alteración en el 
ADN. En una célula normal, cuando se altera el ADN, la célula repara la alteración 
o muere. Por el contrario, en las células cancerosas el ADN alterado no se repara, 
y la célula no muere como debería. En lugar de esto, esta célula persiste en producir 
más células que el cuerpo no necesita (American Cancer Society, 2014). 
El tratamiento del cáncer requiere una cuidadosa selección de una o más 
modalidades terapéuticas, como la cirugía, la radioterapia o la quimioterapia. El 
objetivo consiste en curar la enfermedad o prolongar considerablemente la 
supervivencia y mejorar la calidad de vida del paciente. Existen diversos 
tratamientos (Tabla 1), donde los factores más importantes que se deben tomar en 
cuenta son el tipo de cáncer y su localización (American Cancer Society, 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
Tabla 1. Tratamientos utilizados contra cáncer (American Cancer Society, 2014). 
Tratamientos Descripción Nombre comercial 
Quimioterapia 
Uso de fármacos para destruir 
las células cancerosas 
Carboplatino más paclitaxel (Taxol®), con o 
sin etopósido (VP-16) 
Carboplatino más docetaxel (Taxotere®) 
Cisplatino más gemcitabina (Gemzar®). 
Gemcitabina más docetaxel 
Oxaliplatino más 5-fluorouracilo y leucovorín 
(ácido folínico) 
Oxaliplatino más capecitabina(Xeloda). 
Doxorrubicina (Adriamycin®) y estreptozocina 
Temozolomida más capecitabina. 
Radioterapia 
Utiliza partículas o rayos de alta 
energía para destruir las 
células cancerosas o para 
disminuir su crecimiento. 
Radioterapia con haces externos 
Radioterapia interna (braquiterapia) 
Cirugía 
El tipo de cirugía dependerá del 
lugar donde está el cáncer y 
cuán extenso sea. 
 
Terapia 
hormonal 
Reducen los niveles 
hormonales (estrógeno y 
testosterona) o evitan que las 
células cancerosas puedan 
usarlas 
Leuprolida (Lupron®) 
Goserelin (Zoladex®) 
Flutamida (Eulexin®) 
Bicalutamida (Casodex®). 
Terapia génica 
Propone reemplazar o alterar la 
expresión de algunos genes 
que promueven el proceso 
tumoral. 
GM-CSF como adyuvante en la terapia génica 
contra cáncer cervical 
Terapias 
dirigidas 
Usa medicamentos u otras 
sustancias para identificar y 
atacar las células cancerosas 
causando poco daño a las 
células normales. 
Cetuximab (Erbitux®) bloquea el EGFR 
Trastuzumab (Herceptin®) 
Pertuzumab (Perjeta®) 
Lapatinib (Tykerb®) 
Everolimus (Affinitor®). 
Otros 
medicamentos 
Bifosfonatos: utilizado en el 
cáncer metastásico. 
Pamidronato (Aredia®) 
Ácido zoledrónico (Zometa®). Denosumab 
(Prolia®, Xgeva®) 
Octreótidaútil se utiliza en 
algunos pacientes con tumores 
neuroendocrinos. 
Octreótida (Sandostatin®) 
Lanreotida (Somatuline®) 
 
 
 
6 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.2. CARACTERÍSTICAS DE LAS CELULAS NEOPLASICAS 
 
El comportamiento de las células cancerosas es más fácil de estudiar cuando éstas 
crecen en cultivos, es decir de manera in vitro. La característica más importante de 
una célula neoplásica es la evasión de las señales que cesan el crecimiento y la 
división celular, y por ende a la muerte celular programada. La señalización celular 
es un fenómeno en el que se transmite información a través de la membrana 
plasmática hacia el interior celular y muchas veces al núcleo. Estas señales incluyen 
el reconocimiento del estímulo en la superficie externa y la transferencia de la señal 
por la membrana plasmática (figura 1), así como la transmisión de la señal al interior 
celular, iniciando una respuesta que puede incluir un cambio en la expresión 
genética, una alteración en la actividad de enzimas metabólicas, un cambio de la 
permeabilidad iónica, la activación de la síntesis de ADN, activación de oncogenes, 
liberación de factores angiogénicos o la muerte celular, por mencionar algunos. 
(Karp, 2010; Murray & Gross, 2009). 
 
Figura 1. Algunos cambios bioquímicos y genéticos que ocurren en células cancerosas del ser 
humano. Se observan algunos cambios bioquímicos en células cancerosas; aquí sólo se muestran 
algunos de ellos (Murray & Gross, 2009). 
 
7 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
De manera general la habilidad de evadir señales antiproliferativas es uno de los 
signos característicos de las células cancerígenas, que tiene como consecuencia 
una clona celular con capacidad de dividirse de forma incontrolada. El factor clave 
en este proceso es la proteína del retinoblastoma (pRb), que cuando está 
hipofosforilada bloquea la proliferación mediante el secuestro y alteración funcional 
de los factores de transcripción E2F, responsables del control de la expresión de los 
genes esenciales para la progresión de la fase G1 a la fase S en el ciclo celular 
(Vicencio et al., 2008). 
 
2.3. MUERTE CELULAR 
 
La muerte celular puede ocurre principalmente dos vías: apoptosis y necrosis (tabla 
2) (Kerr et al., 1972; Zhivotovsky y Orrenius, 2001). Se ha postulado y comprobado 
que la necrosis celular es un proceso desordenado e independiente de energía, 
presenta cambios irreversibles en el núcleo celular (cariólisis) y pérdida de la 
estructura citoplasmática, además hay una clara disfunción en la mitocondria y 
aumento en el volumen celular, desencadenando citólisis (Zhivotovsky y Orrenius, 
2001), liberando todo el material citoplasmático hacia el exterior de la célula, 
ocasionando procesos inflamatorios y necróticos en los tejidos afectados, por otra 
parte la muerte por apoptosis es un proceso limpio y ordenado, caracterizado por el 
encogimiento general del volumen de la célula y su núcleo, pérdida de adhesión a 
las células contiguas, vesículas en la superficie celular, disección de la cromatina 
en pequeños fragmentos y cuerpos apoptóticos eliminados por fagocitosis 
(Martínez, 2009; Karp, 2010). 
 
 
 
 
 
8 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
Tabla 2. Comparación de características citomorfológicas de los procesos de muerte celular: 
apoptosis y necrosis. Adaptada de Elmore (2007) y tomada de Martinez (2009). 
Característica Apoptosis Necrosis 
Número de células 
Células individuales o 
pequeños grupos de células 
Generalmente grandes 
cantidades 
Volumen celular Encogimiento celular 
Hinchamiento celular, 
citólisis 
Efecto en integridad de 
membrana plasmática 
Membrana celular intacta 
Membrana celular 
comprometida 
Efecto en citoplasma 
Retenido en cuerpos 
apoptóticos 
Liberado al espacio 
extracelular 
Efecto en núcleo 
Condensación de cromatina 
(Picnosis) 
Fragmentación del núcleo y 
cromatina 
Procesos de 
inflamación tisular 
No hay presencia de 
inflamación 
Inflamación usualmente 
presente 
 
La apoptosis puede iniciarse por estímulos internos, como anormalidades en el 
ADN, y externos, como determinadas citocinas (proteínas secretadas por células 
del sistema inmunitario), sin embargo, cabe mencionar que existe comunicación 
cruzada entre estas vías y que señales apoptóticas extracelulares pueden causar la 
activación de la vía intrínseca (Karp, 2010). La vía extrínseca, se inicia por la 
interacción de los receptores transmembranales con sus respectivos ligandos lo 
que desencadena la activación de las caspasas (figura 2). Algunos de estos 
receptores son el Fas, el receptor-1 del factor de necrosis tumoral (TNF-R1) y el 
DR3. La fijación del Fas ligando a su receptor (Fas) provoca el reclutamiento 
citoplasmático del adaptador FADD (del inglés Fas-associated death domain 
protein), al cual fija la procaspasa 8. La asociación Fas/FADD y procaspasa 8 forma 
un complejo denominado complejo de señalización de muerte (DISC, por sus 
iniciales en inglés Death Inducing Signalling Complex). La procaspasa 8 es activada 
en el DISC por una proteólisis y actúa sobre las procaspasas 3, 6 y 7 que coordinan, 
entonces, la muerte celular (Sánchez & Arboleda, 2008). 
 
 
9 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mientras que en la vía intrínseca se generan una serie de estímulos intracelulares, 
específicamente en la mitocondria, que causan cambios estructurales en la 
membrana mitocondrial, principalmente por la apertura de poros de transición y 
alteración en el potencial transmembranal, lo que conlleva una liberación hacia el 
citosol de sustancias pro-apoptóticas que en estado normal permanecen dentro del 
espacio intermembranal. La regulación de esta vía se da por los miembros pro-
apoptóticos y anti-apoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 (quienes a su vez son 
controladas por la proteína supresora de tumores p53), los cuales inducen o 
reprimen la liberación de estos factores al citoplasma. Principalmente los factores 
inductores de apoptosis como el Citocromo c, factores de fragmentación del núcleo 
y proteínas como Smac/Diablo (en inglés: Second mitochondrial activator of 
caspases / Direct IAP Binding protein with low PI) que neutralizan los inhibidores 
endógenos de la apoptosis (AIF, por sus iniciales en inglés Apoptosis Inducing 
Factor) y la serín-proteasa HtrA2/Omi (en inglés: High-temperature requirement). 
Los mecanismos por los cuales estas proteínas son liberadas dependen 
presumiblemente del tipo celular y la naturaleza del estímulo (Sánchez & Arboleda, 
2008; Martínez, 2009). 
Figura 2. Representación esquemática de las vías de señalización celular de activación de apoptosis 
en unacélula (Martínez, 2009). 
 
10 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.4. CULTIVO DE Jatropha curcas L. 
 
El nombre del género Jatropha deriva del griego “jatŕos” que significa doctor y 
“trophe” que significa alimento, pertenece a la familia de las Euphorbiaceae, que 
comprende aproximadamente a 175 especies. Se considera nativa de América 
central, aunque fue difundida por Asia y África por comerciantes portugueses para 
utilizarla como cercado (Divakara et al., 2010; Dehgan & Webster, 1979). 
Es una planta caducifolia, que mide entre 3-8 metros de altura, posee una copa 
ancha e irregular, el tallo crece con discontinuidad morfológica. Puede tener hasta 
dos épocas de floración y fructificación por ciclo anual. Esta especie es capaz de 
sobrevivir en suelos pobres en nutrientes y se adapta a zonas semiáridas, lo que la 
convierte en una especie de interés para el control de la erosión. Puede vivir unos 
30 años durante los cuales produce frutos, es decir cápsulas de 4-5 cm de longitud 
y 3-4 cm de ancho; que en su interior contiene de tres a cuatro semillas (figura 3), 
las cuales presentan un alto contenido de aceite (56-60%) y proteínas (23-28%) 
principalmente (Heller, 1996; Becker 2008; Devappa et al., 2010). 
Las semillas de J. curcas identificadas como no tóxicas pueden tener un uso 
potencial como fuente de proteína y aceite para consumo humano (Makkar et al., 
1998), dentro de las proteínas que contiene esta semilla tenemos a la curcina, una 
proteína de reserva que se encuentra en el endospermo de la semilla, constituye el 
20% del total de las proteínas almacenadas en el grano (Srivastava et al., 2012). 
 
a) b) c) 
Figura 3. Arbusto (a), frutos (b) y semillas (c) de Jatropha curcas (Heller, 1996) 
 
11 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.5. PROTEÍNAS Y SU CLASIFICACIÓN 
 
Las proteínas juegan un papel central en los sistemas biológicos, debido a que 
cumplen diversas funciones (estructura, transporte, motilidad, defensa, 
reconocimiento, almacenamiento, actividad catalítica). Desde el punto de vista 
estructural, se definen como cadenas polipeptídicas constituidas por aminoácidos, 
unidos entre sí por enlaces peptídicos. La estructura de las proteínas se ha dividido 
en cuatro niveles estructurales (primario, secundario, terciario y cuaternario). La 
conformación asumida por las proteínas nativas comprende diferentes estructuras 
dentro de su molécula que definen sus propiedades inmunológicas, enzimáticas u 
hormonales (Badui, 2006). Las proteínas pueden clasificarse con base a su 
composición, solubilidad y función biológica o estructura tridimensional. 
Las proteínas en las semillas están constituidas principalmente por tres grupos. 
Proteínas estructurales (forman parte estructural de la célula), proteínas con 
actividad biológica (generalmente son enzimas), y proteínas de reserva o 
almacenamiento. A su vez las proteínas de reserva o almacenamiento se pueden 
clasificar en función de su solubilidad en cuatro grupos: en albúminas (solubles en 
agua), globulinas (solubles en soluciones salinas), glutelinas (solubles en 
soluciones ácidas y alcalinas) y prolaminas (solubles en etanol al 70%) (Osborne, 
1924; Duranti, 2006) 
 
2.6. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 
 
Las técnicas cromatográficas son las más utilizadas para la separación y 
purificación de moléculas con actividad biológica como proteínas. En general la 
cromatografía se basa en la absorción y/o adsorción de moléculas en matrices. La 
adsorción depende de las propiedades particulares de la proteína, lo que hace que 
la adsorción sea selectiva. Son técnicas que dan buen aumento en la actividad 
específica y pureza, con buenos rendimientos, debido a su gran resolución y rapidez 
(García & Navarrete, 1999; Mayolo-Deloisa et al., 2012). 
 
12 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 Filtración en gel o de exclusión por tamaño: separa en función al tamaño de 
las moléculas, reteniendo las partículas pequeñas. El método se basa en que 
las proteínas de mayor tamaño pasan con mayor rapidez por la fase 
estacionaria, mientras que las moléculas de menor tamaño son retenidas a 
través de dichos poros (Mayolo-Deloisa et al., 2012). 
 La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas con base a su 
carga iónica neta. La separación se lleva a cabo por la competencia entre 
proteínas con diferente carga superficial por grupos cargados opuestamente 
sobre un adsorbente o una matriz de intercambio iónico. Las proteínas 
dependiendo del pH de la solución, tienen carga eléctrica. La carga neta de 
la proteína, a un determinado pH depende de su punto isoeléctrico. A 
diferencia de la cromatografía en gel, la cromatografía de intercambio iónico 
concentra la fracción de interés (García & Navarrete, 1999; Mayolo-Deloisa 
et al., 2012). 
 Cromatografía de interacción hidrofóbica, se basa en la fuerza de interacción 
entre zonas hidrófobas de la proteína y un ligando o grupo inmovilizado 
hidrofóbico. La técnica consiste en retener la proteína en una matriz con 
ligando hidrofóbico como butilo-matriz, en un ambiente de alta concentración 
salina (fuerza iónica) y la elución de la proteína después de lavar las 
proteínas no adsorbidas disminuyendo la fuerza iónica del amortiguador de 
elución (García & Navarrete, 1999). 
 Cromatografía de afinidad, está técnica se basa en la interacción de 
proteínas con ligandos unidos a una matriz de forma muy específica, por 
ejemplo: antígeno-anticuerpo, enzima-sustrato, inhibidor-enzima, metal-
proteína, etc. Consiste en unir, de preferencia covalentemente, el ligando a 
una matriz inerte, ligando para el cual la proteína tiene cierta afinidad, lavar 
la columna o el gel en lote y después provocar la disociación de la proteína 
de interés por un cambio en las condiciones, lo que causa un cambio 
reversible en la proteína y reducción en la afinidad. Por ser una técnica 
costosa, no se recomienda como primer paso de purificación o único (García 
& Navarrete, 1999). 
 
13 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
2.7. CURCINA 
 
Felke en 1914 fue el primero en aislar una toxoalbúmina de las semillas de J. curcas 
y la designó como curcina. La curcina es una proteína inactivadora de ribosomas 
tipo 1, es de interés debido a su actividad antiviral, antifúngica y antitumoral debida 
a su actividad ARN N-glucosidasa, presenta un peso molecular aproximado de 28.2 
kDa, punto isoeléctrico de 8.54, y está compuesta por 251 aminoácidos. En cuanto 
a su estructura, Srivastava et al., (2012) realizó un modelo 3D concluyendo que los 
aminoácidos Tyr118, Thr156 y Asp133 forman un puente de hidrógeno con la 
adenina del ARNr 28S, de los cuales solo el residuo Tyr118 se encuentra en 
contacto directo con la adenina. 
La citotoxicidad de la curcina se debe a su capacidad de inhibir la síntesis de 
proteínas de células eucariotas intactas, dañando catalíticamente los ribosomas por 
su actividad ARN N-glucosidasa, que se adhiere al enlace N-glucosidico de la 
adenina, haciendo al ribosoma incapaz de ligarse a los factores de elongación I o II 
(Lin et al., 2010; Srivastava et al., 2012). Se ha demostrado su actividad citotóxica 
sobre las líneas tumorales de cáncer de mama MDA-MB-231 y MCF-7, glioma de 
cáncer de cerebro (Jaramillo et al., 2012; Mohamed et al., 2014). Investigaciones 
recientes han demostrado que la curcina no solo puede inhibir la proliferación de 
células tumorales, sino que también promueve la apoptosis celular (Srivastava et 
al., 2012; Zheng et al., 2013), como se concluyó en la investigación realizada por 
Mohamed et al., (2014) en la cual evaluaron el efecto de curcina en líneas celulares 
sanas y cancerígenas, siendo estas últimas más susceptibles presentando 
disfunción mitocondrial, degeneración de orgánelos, supresión de los mecanismos 
de defensa, disminución de la expresión del factor nuclear κB (NF-κB ), y finalmente 
la muerte por apoptosis. 
 
 
 
 
14CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.8. PROTEÍNAS INACTIVADORAS DE RIBOSOMAS 
 
Las proteínas inactivadoras de ribosomas o RIPs (Ribosome Inactivating Proteins) 
inhiben la síntesis de proteínas por su acción sobre los ribosomas de manera 
irreversible. Presentan actividad ARNr N-glucosidasa, es decir que cuando entran 
a una célula pueden escindir enlaces glucosidicos específicos de un residuo de 
adenina (posición 4324 sobre el bucle conservado GAGA de hígado de ratón 28S 
ARNr), de esta manera inhiben la síntesis de proteínas por interferencia con los 
enlaces entre el 28S ARN y los factores de elongación (figura 4). 
 
 
Las RIPs de plantas han sido clasificadas en tres tipos (figura 5): 
 
 Tipo 1 están formadas por una sola cadena polipeptídica que es la que 
presenta la actividad inhibidora de síntesis de proteínas. Con un peso 
molecular de 26-32 kDa aproximadamente. 
 Tipo 2 están formadas por dos cadenas polipeptídicas heterólogas, una 
cadena inhibidora de síntesis de proteínas equivalente a las RIPs de tipo 1 
(cadena A), que se une a la cadena B mediante un puente disulfuro. Con un 
peso molecular de 60-65 kDa aproximadamente. 
Figura 4. Mecanismo de acción de las RIPs (Proteínas Inactivadoras de los Ribosomas). Todas las 
RIPs escinden una adenina (A4324) en el ARNr de la subunidad mayor de los ribosomas, 
imposibilitando la unión del factor de elongación II. (Stirpe et al., 2004) 
 
15 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 Tipo 3 son sintetizadas como precursores inactivos (ProRIPs) que requieren 
de una serie de procesos proteolíticos para su forma activa (RIP) y no son 
utilizadas para propósitos terapéuticos (De Virgilio et al., 2010, Stirpe et al., 
2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Representación esquemática de la estructura de las proteínas inactivadoras de ribosomas. 
(Domashevskiy & Goss, 2015) 
 
16 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.9. NANOTECNOLOGÍA Y SUS APLICACIONES 
 
La nanotecnología en el área biomédica presenta oportunidades revolucionarias en 
la lucha contra diversas enfermedades. Un área con potencial en la detección de 
moléculas asociadas con enfermedades como cáncer, diabetes mellitus, y 
enfermedades neurodegenerativas, así como la detección de microorganismos y 
virus asociados con infecciones. Por ejemplo en terapias de cáncer, las 
nanopartículas prometen una novedosa respuesta a estímulos externos de manera 
que las convierten en terapias convenientes o en sistemas terapéuticos de entrega 
(Logothetidis, 2012) 
Para propósitos farmacéuticos las nanopartículas (NPs) se definen en el Handbook 
of Pharmaceutical Technology como las partículas coloidales sólidas en un rango 
de tamaño de 1 a 100 nm. Los distintos materiales empleados como matrices de 
transporte y liberación ofrecen un perfil farmacocinético controlado, una posible 
administración dirigida hacia el órgano blanco (Leyva, 2013). 
Durante la pasada década, diversos vehículos de entrega han sido diseñados 
basandose en diferentes nanomateriales como polímeros, dendrimeros, liposomas 
y nanotubos. Recientemente las nanopartículas de oro han surgido como una 
atractiva alternativa para la entrega de medicamentos en blancos específicos. Su 
funcionalización puede ser mediante moléculas pequeñas, polímeros, anticuerpos 
o biomoléculas como proteínas, ADN o ARN (figura 6). La liberación eficiente de 
estos agentes terapéuticos es un prerrequisito para una terapia efectiva. Las 
nanopartículas de oro presentan propiedades físicas y químicas únicas que las 
hacen explotables para el transporte y liberación de fármacos. La primera de estas 
se basa en que el núcleo de oro es esencialmente inerte y no tóxico, la segunda se 
debe a que son fáciles de sintetizar (con tamaños de 1 a 150 nm), y por ultimo sus 
características fisicoquímicas podrían activar la liberación de fármacos en lugares 
remotos (Ghosh et al., 2008; Kumar et al., 2012). 
 
17 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.10. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS 
 
Las nanoparticulas metálicas se pueden sintetizar por métodos físicos y químicos. 
Los métodos físicos (top-down) consisten en la subdivisión de los metales sólidos 
(bulk) para la obtención de las nanopartículas, por ejemplo, tales como evaporación 
metálica, electrólisis, pulverización catódica, entre otros, sin embargo, la desventaja 
de estos métodos se denota en la distribución del tamaño de partícula, estructura e 
imperfecciones en la superficie. Los métodos químicos (bottom-up) consisten en la 
fabricación de nanopartículas a través de la condensación de átomos o entidades 
moleculares en una fase gaseosa o en solución (tabla 3). Estos métodos parten de 
la reducción de iones metálicos a sus correspondientes átomos y son útiles para 
obtener nanopartículas uniformes. Diferentes agentes reductores han sido 
empleados para reducir los iones metálicos generando dispersiones coloidales, 
dentro de los cuales se encuentran formaldehídos, alcoholes, monóxido de carbono, 
hidracina entre otros. Por otra parte, los métodos antes mencionados para la 
síntesis de nanopartículas involucran altos requerimientos de energía, aunado a la 
baja conversión de materia, y al uso de productos químicos peligrosos o tóxicos, por 
estas razones se han buscado nuevos métodos de síntesis más simples y viables 
Figura 6. Aplicaciones terapéuticas en cáncer de nanopartículas de oro. (Ghosh et al., 2008) 
 
18 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
para la obtención de nanomateriales, tal es el caso de la biosíntesis, que emplea 
diversos microorganismos como bacterias y hongos, o bien extractos de plantas. La 
biosíntesis ofrece múltiples ventajas, como productos no tóxicos y amigables con el 
medio ambiente y menor costo. Debido a la necesidad de diseñar métodos más 
convenientes para aplicaciones farmacéuticas o biomédicas la biosíntesis es una 
alternativa frente a los métodos químicos (Ghosh et al., 2008; Duncan et al., 2010; 
Martín-Gago et al., 2011; Friederici-Muñoz, 2013, Leyva, 2013; Muniyappan & 
Nagarajan, 2014). 
 
Tabla 3. Métodos químicos para la síntesis de nanopartículas 
Nanopartícula Método de síntesis 
Agente 
reductor 
Referencia 
1-2 nm 
Reducción de AuCl(PPh3) 
con diborano 
Fosfina (Schmid, 1992) 
1.5 – 5 nm 
Reducción bifásica del 
agente reductor tiol 
Alcanotiol (Brust et al., 1994) 
3.5 – 10 nm 
Inducción de tamaño por 
calor 
Alcanotiol (Teranishi, et al., 1995) 
10 -150 nm 
Reducción de HAuCl4 o 
AgNO3 con citrato de 
sodio en agua 
Citrato (Turkevich et al.,1951) 
 
 
2.11. BIOSINTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO 
 
La síntesis biológica de nanopartículas metálicas particularmente de oro, usando 
plantas o microorganismos (extractos, tejido o compuestos específicos) ha recibido 
mayor atención como una alternativa conveniente ante los métodos químicos y 
físicos, debido a la simplicidad, costo y velocidad del proceso de síntesis, lo anterior 
destaca su potencial a futuro en la producción a gran escala de nanoestructuras 
metálicas con diversas morfologías y tamaños, dependiendo el objetivo de su 
aplicación. 
 
19 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
Se sabe que en los extractos biológicos (plantas o microorganismos) se encuentran 
diversos compuestos que fungen como agentes reductores y/o estabilizantes, por 
lo que juegan un rol importante en la síntesis de nanopartículas. En principio el 
mecanismo de biosíntesis se lleva a cabo por reducción química de los precursores 
metálicos a átomos por medio de los agentes reductores presentes, continuando 
con un proceso de nucleación y subsecuentemente el crecimiento de la 
nanopartícula (figura 7) (Iravani, 2011; Punjabi et al., 2015). 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Diagrama del proceso de biosíntesis (Akhtar et al., 2013) 
 
20 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.12. TECNICAS ESPECTROSCÓPICAS PARA IDENTIFICACIÓN Y 
CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS 
 
Las técnicasespectroscópicas son herramientas para la identificación de 
compuestos, al proporcionar espectros que pueden interpretarse para obtener 
mayor información sobre la interacción de átomos y grupos funcionales (Shriner, 
2013). 
 
2.12.1. ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE 
 
Los espectros de absorción óptica proporcionan información sobre la densidad 
electrónica, tamaño y estructura. Así, para estas nanopartículas metálicas, la 
espectroscopia UV-Vis es una herramienta para su caracterización, ya que 
dependiendo del material y estructura será su absorción (figura 8). La 
espectroscopia UV-Vis, es capaz de revelar los diferentes mecanismos de 
formación de las nanopartículas monometálicas y bimetálicas a partir de las 
observaciones de los cambios en los espectros UV-Vis durante el proceso de 
reducción, además de determinar si el proceso de síntesis ha concluido (Izaguirre-
López, 2010; Friederici-Muñoz, 2013; Talbott, 2014). 
 
Figura 8. Localización en la región visible de nanopartículas de oro (Au) y plata (Ag), dependiendo 
de su morfología (Izaguirre-López, 2010) 
 
21 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
2.12.2. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE 
FOURIER (FT-IR) 
 
La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) proporciona 
información adicional sobre la estructura de un compuesto, ya que permite 
identificar grupos funcionales. Los compuestos orgánicos absorben un haz de 
radiación electromagnética con longitudes de onda menores que las de la luz visible, 
cuando dicho haz posee una energía igual a la del enlace orgánico en vibración, la 
transformación de Fourier se usa como método matemático para el desarrollo en 
serie la curva obtenida (interferograma) y está constituida por el sumatorio de senos 
y cosenos de las distintas frecuencias ópticas que componen la radiación (Shriner, 
2013). 
La espectroscopía FTIR es una herramienta importante para el estudio de las 
monocapas sobre la superficie de las nanopartículas (figura 9). La frecuencia y el 
ensanchamiento de las bandas en las regiones vibracionales de tensión de los 
enlaces C-H y C-C son indicativos del orden en la estructura tridimensional de las 
monocapas autoensambladas de un ligando. Los espectros de FTIR proporcionan 
información sobre las características estructurales y los enlaces en la formación de 
complejos conjugados (Friederici-Muñoz, 2013; Talbott, 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Equipo FTIR VERTEX 70 
 
22 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.12.3. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 
 
La microscopia electrónica es una herramienta que permite visualizar estructuras 
nanométricas. Es de gran utilidad en medición del tamaño, distribución y forma de 
las nanopartículas. La microscopia electrónica ocupa electrones como fuente de 
iluminación: dado que estos presenta dualidad onda partícula, es posible ajustar la 
longitud de onda de los electrones en función de la energía cinética que estos 
adquieran al ser acelerados por una diferencia de potencial. 
 
2.12.4. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB) 
 
Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM por sus siglas en inglés) 
brindan información sobre la topografía y la composición de la superficie de la 
muestra. El microscopio electrónico de barrido utiliza una técnica que consiste en 
un haz de electrones que focaliza, mediante un sistema de lentes 
electromagnéticos, y “barre” un área determinada sobre la superficie de la muestra 
que se desea estudiar. Este bombardeo de electrones da como resultado la emisión 
de electrones y fotones de la muestra que captadas con detectores adecuados se 
obtiene información sobre la naturaleza de la muestra (figura 10). 
En la microscopia electrónica de barrido se detecta, por una parte, los electrones 
secundarios, electrones que emergen de la superficie de la muestra con una energía 
inferior a 50 eV, que proporcionan una imagen de alta resolución de la morfología 
superficial de la muestra (SEI, Secondary Electron Image). Por otra parte, los 
electrones retrodispersados, electrones con mayor energía que 50 eV, que dan una 
imagen cualitativa de las zonas con distinto número atómico (BEI, Backscattered 
Electron Image). Por ultimo con la detección de los fotones de Rayos-X proporciona 
espectros e imágenes acerca de la composición de elementos químicos de la 
muestra (EDX, Energy Dispersive X-Ray spectroscopy). Esquema del SEM con dos 
detectores, uno el de electrones secundarios y el otro de Rayos-X (Martín-Gago et 
al., 2011). 
 
23 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
 
 
 
 
2.12.5. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET) 
 
En la miscroscopía electrónica de transmisión (TEM sus siglas en inglés), un haz 
de electrones de alta energía incide sobre la superficie de un material. El haz de 
electrones interactúa con el material, proporcionando una variedad de señales 
dependiendo del detector. La información a partir de los electrones transmitidos es 
en forma de imágenes. En TEM, los electrones son acelerados hasta energías 
de100 KeV o mayores (por encima de 1MeV) y proyectados sobre una muestra 
delgada (menos de 200 nm) mediante un sistema de lentes condensadores. Una 
parte de los electrones son dispersados o absorbidos por la muestra (figura 10). La 
gran ventaja que ofrece TEM reside en su elevado rango de magnificación que va 
desde 50 hasta más de 106 aumentos y su capacidad para suministrar tanto 
imágenes como información de difracción. La información de los electrones 
dispersados en una imagen TEM se origina por una muestra tridimensional, pero es 
proyectada en un detector en dos dimensiones (Viudez, 2011). 
Figura 10. Esquema general del efecto del haz de electrones sobre la muestra. 
 
24 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.13. JUSTIFICACIÓN 
 
Debido a la incidencia de cáncer en la población a nivel mundial, es una prioridad el 
desarrollo de tratamientos efectivos, capaces de destruir las células cancerosas sin 
dañar los tejidos sanos. En los últimos años las terapias dirigidas han surgido como 
alternativa, ya que actúan sobre blancos específicos, es decir sobre las células 
cancerígenas mediante el uso de fármacos, proteínas, genes, anticuerpos, que 
inducen la apoptosis celular. Estudios recientes han demostrado que la curcina 
presenta actividad citotóxica sobre algunas líneas celulares cancerígenas, ya que 
no solo puede inhibir la proliferación de células tumorales, sino que también 
promueve la apoptosis celular, debido a su actividad RNA N-glucosidasa, lo que 
sugiere su posible uso como un agente terapéutico. Por otra parte las 
nanopartículas metálicas exhiben propiedades diferentes una vez aplicadas a los 
sistemas biológicos, ya que su tamaño nanométrico les confiere la habilidad para 
penetrar distintas membranas biológicas. Es por esto que la funcionalización de 
nanopartículas metálicas unidas a agentes terapéuticos antitumorales ofrece una 
alternativa para el tratamiento contra cáncer. Debido a todo lo anterior en el presente 
trabajo se propone la biosíntesis de nanopartículas de oro con curcina, bajo la 
perspectiva de una futura aplicación como terapia dirigida. 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES 
2.14. HIPÓTESIS 
 
Se ha demostrado el efecto citotóxico de curcina en diferentes líneas celulares 
cancerígenas, por lo que esta proteína ha cobrado importancia por su posible uso 
como agente terapéutico. Por lo anterior se espera que las nanopartículas de oro 
biosintetizadas con curcina incrementen el efecto citotóxico debido a la 
funcionalización, área superficial y tamaño. 
 
2.15. OBJETIVOS 
 
2.15.1. OBJETIVO GENERAL 
 
Evaluar la actividad citotóxica de nanopartículas de oro biosintetizadas con curcina, 
en líneas celulares de cáncer de mama, cervicuouterino y próstata. 
 
2.15.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 Determinar y caracterizar curcina a partir de residuos de harina desgrasada de 
semillasde Jatropha curcas L. 
 Biosintetizar nanopartículas de oro con curcina, variando parámetros de 
temperatura, concentración de curcina, HAuCl4 y agente estabilizador. 
 Caracterizar y analizar las nanopartículas biosintetizadas con curcina por 
técnicas de espectroscopía UV-Vis e Infrarrojo por Transformada de Fourier 
(FTIR) y microscopía electrónica de Transmisión (MET). 
 Evaluar la actividad citotóxica de las nanopartículas biosintetizadas sobre las 
líneas celulares MDA-MB-231, HeLa y PC-3 
 
 
 
26 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
 
3.1. ESTRATEGÍA GENERAL DE TRABAJO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Obtención de harina de las semillas de 
J. curcas 
Desgrasado de la harina de semillas de 
J. curcas 
Extracción de proteínas por lixiviación 
Separación y purificación de curcina 
mediante cromatografía de intercambio 
iónico 
Identificación de curcina mediante 
electroforesis SDS-PAGE y 
cuantificación por el método BCA 
Determinación de la actividad enzimática 
ARN N-glucosidasa de curcina 
Biosíntesis de nanopartículas de oro con 
curcina como agente reductor y HAuCl4 
como precursor metálico (Cur-AuNPs) 
Caracterización de nanopartículas de oro 
por espectroscopía UV-Visible, FTIR y 
microscpía electrónica de transmisión 
(MET) 
Evaluación del efecto citotóxico de las 
nanopartículas Cur-AuNPs y Citrato-
AuNPs en las líneas celulares MDA-MB-
231, HeLa y PC-3 
Síntesis de nanopartículas de oro con 
citrato de sodio como agente reductor y 
HAuCl4 como precursor metálico 
(Citrato-AuNPs) 
Figura 11. Diagrama de la estrategia general de trabajo para la evaluación del efecto citotóxico de 
nanopartículas de oro biosintetizadas con curcina 
 
27 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
3.2. DESGRASADO DE LA HARINA DE SEMILLAS DE J. curcas 
 
Se desgrasó harina de semillas de J. curcas con hexano en una proporción 1:7 (p/v), 
durante 24 h en agitación continua a 4ºC. Se eliminó el solvente por decantación, 
filtración y centrifugación (11000 rpm, 4ºC, 30 min), y se dejó secar en una campana 
de extracción durante dos días. Después se guardó la harina en recipientes de 
plástico y en obscuridad (Stirpe et al., 1976). 
 
3.3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE CURCINA 
 
La harina de semilla de J. curcas L desgrasada se mezcló con una solución 
amortiguadora Tris-HCl 50 mM, pH 7.5 con NaCl 0.15 M, en una proporción 1:3 p/v. 
La mezcla se agitó durante 24 h a 4ºC. Posteriormente se centrifugó durante 30 
minutos a 11,000 rpm y 4ºC, el sobrenadante se dializó contra una solución 
amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M y pH de 4.5, 24 h con cambios cada 6 h, 
en refrigeración y en continua agitación. El dializado se centrifugó durante 30 min a 
4ºC y 11,000 rpm, el sobrenadante (extracto T/A) se colectó y almacenó en 
refrigeración (Kittikajhon et al., 2009). La separación y purificación de curcina del 
extracto T/A se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, en una 
columna empacada con SP-Sepharosa®, el extracto T/A fue eluído en un buffer de 
fosfatos 5 mM pH 7 NaCl 1M. Se colectaron fracciones de 2 mL y se midió su 
absorbancia a 280 nm (Lin et al., 2010). 
 
3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO 
BICINCONÍNICO (BCA) 
 
Se realizó la cuantificación de proteínas totales a las fracciones obtenidas de la 
cromatografía de intercambio iónico, así como al extracto T/A, mediante el método 
colorimétrico BCA (Bollag & Edestein, 1991). Se realizó una curva de calibración 
(tabla 4), empleando como control albúmina de suero bovino (BSA) en agua 
destilada al 1% (1mg/mL), se realizaron ocho diluciones con concentraciones 
 
28 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
conocidas de BSA de las cuales se tomaron 100 µL y se le adicionaron 2 mL de la 
solución de BCA (sulfato de cobre y ácido bicinconínico 50:1), después se incubaron 
15 min a 60 °C. Finalmente las absorbancias se determinaran a 562 nm. Se realizó 
la misma formulación con las muestras (100 µL de muestra más 2 mL de BCA). 
Tabla 4. Concentraciones para la construcción de la curva estándar de BCA 
 
H2O 
(µL) 
BSA 
(1mg/mL) 
Concentración final 
(mg/mL) 
Blanco 1000 - 0 
Dilución 1 950 50 0.05 
Dilución 2 900 100 0.1 
Dilución 3 850 150 0.15 
Dilución 4 800 200 0.2 
Dilución 5 600 400 0.4 
Dilución 6 400 600 0.6 
Dilución 7 200 800 0.08 
Dilución 8 - 1000 1 
 
3.5. ELECTROFORESIS (SDS-PAGE) 
 
Se realizaron geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-
PAGE) para el análisis electroforético del extracto T/A, y del proceso de separación 
y purificación de la curcina, de acuerdo al método de Laemmli (1970). La 
composición de los geles se muestran en las tablas (5 y 6); con una T de 30% y una 
C de 2.67%. Cada muestra se dilluyó (1:2) en buffer de muestra (tabla 7) y se 
cargaron 10 mg/mL de la muestra por carril. Para estimar el peso de las proteínas 
se utilizó el marcador Precision Plus Protein Unstained Standards (BIO-RAD No. 
Cat. #1610363). 
 
 
29 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
Tabla 5. Solución estándar para la preparación de geles de electroforesis SDS-PAGE 
Solución Tris (M) Glicina (g) pH SDS (%) 
0.5 M Tris-HCl 0.5 - 6.8 - 
1.5 M Tris-HCl 1.5 - 8.8 - 
Buffer de corrida 0.125 72 8.3 0.5 
SDS - - - 10 
Mezcla de acrilamida-bisacrilamida % acrilamida (p/v) % bisacrilamida 
30% Ta. 2.67% Cb 29.2 0.8 
a % concentración de acrilamida y bisacrilamida 
b % concentración de entrecruzamiento de acrilamida-bisacrilamida 
* Ajuste de pH con HCl concentrado 
 
Tabla 6. Composición de los geles de electroforesis SDS-PAGE 
Solución o reactivo Gel concentrado (4%) Gel de separación (12%) 
Agua desionizada 6.1 mL 3.4 mL 
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 2.5 - 
1.5 M Tris-HCL, pH 8.8 - 2.5 mL 
SDS 10% 100 µL 100 µL 
Solución de acrilamida-bisacrilamida 
(30 T, 2.67% C) 
1.3 mL 4 mL 
Persulfato de amonio (10% p/v) 50 µL 50 µL 
TEMED 10 µL 5 µL 
 
Tabla 7. Composición de buffer muestra para electroforesis SDS-PAGE 
Solución o reactivo Volumen (mL) 
Agua desionizada 3.55 
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 
Glicerol 2.5 
SDS (10% p/v) 2 
Azul de bromofenol (0.5% p/v) 0.2 
Β-mercaptoetanol 0.5 
 
 
30 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
3.6. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE CURCINA 
 
La actividad ARN N-glucosidasa se realizó de acuerdo al método de Endo et al., 
(1987). La extracción de ARN se realizó a partir de hígado de ratón, el cual se 
maceró en un mortero con nitrógeno líquido, después se tomó una porción en un 
tubo eppendorf de 1.5 mL, posteriormente se agregaron 500 µL de trizol y se 
homogenizo durante 5 minutos en un vortex. Después se agregó 200 µL de fenol-
cloroformo-isoamílico (24:1), se agitó a velocidad máxima durante 5 minutos en 
vortex y se centrifugó durante 15 minutos a 4ºC y 13000 rpm, el sobrenadante se 
transfirió a un tubo eppendorf, nuevamente se agregaron 200 µL de fenol-
cloroformo-isoamílico (24:1) y se centrifugó a las condiciones antes mencionadas. 
El sobrenadante se colocó en un eppendorf nuevo y se adicionaron 300 µL alcohol 
isopropílico congelado, se homogenizó y dejó en reposo durante 90 minutos en un 
congelador, al término de este tiempo se centrifugó durante 15 minutos a 4ºC y 
13000 rpm, el sobrenadante se eliminó por decantación con precaución para no 
perder el botón formado en la base del tubo eppendorf. El botón se resuspendió con 
400 µL de etanol al 70% congelado y se centrifugó a las condiciones antes 
señaladas. Se eliminó el sobrenadante y el exceso de líquido sobre una toalla de 
papel. Se agregaron 30 µL de agua destilada estéril para disolver perfectamente el 
botón de ARN extraído. Se verificó la integridad, pureza y cantidad de ARN obtenido 
por absorbancia a 260 y 280 nm. 
Se incubaron 15 µg de ARN con 1 µg de curcina en solución buffer (10 mM Tris-HCl 
pH 7.4/60 mM KCl/10 mM MgCl2) a 37ºC durante 30 minutos a un volumen final de 
100 µL. La reacción