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Análise da resposta imune em ratos tratados com Factor de Transferência

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN 
 
 
 
 
 Analisis de la respuesta inmune en ratones 
BALB/c tratados con Factor de Transferencia 
 
 
 
Tesis que para obtener el grado de Doctorado en 
Ciencias en Inmunología 
 
 
PRESENTA 
 
MenC Estela Valderrábano Ortiz 
 
 
 
 
DIRECTOR: Dra. Sonia Mayra Pérez Tapia 
 
DIRECTOR: Dr. Sergio Estrada Parra 
 
 
 
 
 
 
México, D.F. 2009 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
 
 
Pagina 
 
ÍNDICE I 
ABREVIATURAS 
ÍNDICE DE FIGURAS 
RESUMEN 
ABSTRACT 
I INTRODUCCION 1 
 A) Extracto Dializable de Leucocitos 3 
 B) Especificidad del EDL 5 
 C) Estructura 8 
 D) Efecto Biológico 12 
II JUSTIFICACION 17 
III HIPOTESIS 17 
IV OBJETIVO GENERAL 17 
V OBJETIVOS PARTICULARES 18 
VI MATERIAL Y METODOS 19 
 a) Obtención de EDL 19 
 b) Obtención de EDL específico 19 
 c) Prueba de DTH 20 
 d) Esquema de Inmunización con OVA, EDL y EDLOVA 22 
 e) Ensayo de ELISA para anticuerpos contra OVA 23 
 f) “Western-blot” 25 
 g) Formación de centros germinales 27 
 h) Cuenta celular y caracterización de diferentes poblaciones 
 celulares del ganglio y sangre periférica 29 
i)Cuenta celular e identificación de plasmablástos y 
 células plasmáticas en médula ósea 31 
 
VII RESULTADOS 
 a) Prueba de DTH 33 
 b) Ensayo de ELISA para IgM e IgG contra OVA 34 
 c) “Western-blot” 38 
 d) Peso de los ganglios 39 
 e) Número de células de los ganglios inguinales de los diferentes 
 grupos 42 
 f) Formación de centros germinales 43 
 g) Caracterización de las poblaciones linfocitarias en el ganglio 
 regional 47 
 h) Cuenta celular e identificación de plasmablástos y células 
 plasmáticas en médula ósea 54 
 
VIII DISCUSION 58 
IX CONCLUSIONES 73 
X BIBLIOGRAFÍA 74 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
Ab Anticuerpo 
AFC Célula formadora de anticuerpo, del inglés “Antibody forming cell” 
Ag Antígeno 
BSA Albúmina sérica bovina, del inglés “bovine seric albúmina” 
cAMP Adenosín monofosfato cíclico 
CPA Célula presentadora de antígeno 
DC Célula dendrítica 
DO Densidad óptica 
DTH Hipersensibilidad cutánea tardía, del inglés “delayed type 
hypersensibility” 
DTT Dithiotreitol 
EDL Extracto dializable leucocitario 
ELISA Enzymed linked immunosorbet assay 
FT Factor de Transferencia 
HEV Vénulas de endotelio alto, del inglés “high endothelium venules” 
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución, del inglés “High performance 
liquid cromatography” 
HSV Virus Herpes simplex 
i.d. intradremoreacción 
IFN Interferón 
IgG Inmunoglobulina G 
IgM Inmunoglobulina M 
KDa kilodaltones 
LIF Factor inhibidor de la migración de los leucocitos 
MIF Factor inhibidor de la migración de los macrófagos 
OVA Ovoalbúmina 
PBA PBS con albúmina sérica bovina 
PBS Regulador de salina-fosfatos 
PNA Aglutinina de cacahuate 
POX Peroxidasa 
i 
PPD Derivado proteínico purificado de M. tuberculosis 
RIC Respuesta inmune celular 
TF-HSV Factor de transferencia específico para Herpes virus 
Th Linfocitos T cooperadores 
THY-1 Antígeno θ, epitopos encontrados en timocitos murinos 
Th0 Linfocitos T cooperadores vírgenes 
TLR Receptores tipo Toll 
TNF Factor de necrosis tumoral 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ii 
RESUMEN 
“Análisis de la respuesta inmune de ratones BALB/c tratados con 
Factor de Transferencia” 
 
Los Extractos Dializables Leucocitarios (EDL), son moléculas que 
transfieren la respuesta inmune celular (RIC) de un organismo 
inmunocompetente a otro. Esta transferencia es antígeno específica, 
siendo lo más sobresaliente la transferencia de hipersensibilidad tardía 
(DTH) y la producción de citocinas, además de el restablecimiento del 
perfil celular en sangre periférica. Sin embargo a pesar de múltiples 
investigaciones aún no se conoce por completo su mecanismo de 
acción, por lo que es importante determinar si la inmunomudalación 
celular provocada por el EDL interviene en el cambio de isotipo (switch) 
de inmunoglobulinas. 
OBJETIVO. Caracterizar la respuesta inmune humoral contra 
ovoalúmina (OVA) en ratones BALB/c retados con OVA y/o EDL. 
MATERIALES Y MÉTODOS. Se inmunizaron diferentes grupos de 
ratones BALB/c con OVA, EDL y/o EDLOVA, el día cero y el día 14 para 
el grupo con OVA y los días cero, 14, 21 y 28 para los grupos con EDL y 
EDLOVA, se tomaron muestras de sangre desde el día cero hasta el día 
36 para todos los grupos; se midió la concentración de IgG e IgM 
específica para OVA por prueba de ELISA. Se sacrificaron 3 ratones de 
cada grupo los días 9, 15 y 23 post-inmunización y se les extrajeron los 
ganglios. Se realizaron cortes de los ganglios y se identificó por 
inmunohistoquímica la presencia de linfocitos B en reacción de centro 
germinal (PNA+), y de linfocitos T (THY-1+); se identificó por citometría 
de flujo diferentes poblaciones celulares (linfocitos T, linfocitos B, 
macrófagos, células dendríticas y células plasmáticas). Se sacrificaron 4 
ratones de cada grupo el día 20 post-inmunización, se les extrajo la 
médulaósea y se identificaron con anticuerpos monoclonales y 
citometría de flujo los linfocitos B, plasmablastos y células plasmáticas. 
RESULTADOS. En el ensayo de ELISA encontramos que el grupo que se 
inmunizo con OVA y se reto con EDLOVA fue capaz de producir IgG 
específica para OVA, así como el grupo que fue inmunizado solo con 
EDLOVA. Los ganglios de los ratones tratados con EDLOVA tuvieron un 
menor peso, tienen células PNA positivas dentro de los folículos del 
nódulo linfático, pero tienen un menor número de centros germinales 
por ganglio y tienen un menor número de células plasmáticas; en 
sangre periférica tienen aumentados los linfocitos B, plasmablastos y 
células plasmáticas. El grupo inmunizado con OVA-EDLOVA presentó un 
mayor número y tamaño de los centros germinales, además de tener 
aumentadas todas las poblaciones celulares que se midieron en el 
ganglio, y también aumentaron los plasmablástos y células plasmáticas 
de la médula ósea. 
CONCLUSIONES. El EDLOVA es capaz de inducir la respuesta inmune 
humoral contra OVA; generando células plasmáticas de larga vida 
cuando se utiliza como reto de inmunización. 
 
 
ABSTRACT 
 
“Immune response analysis in BALB/c mice treated with Transfer 
Factor” 
 
Murine dialyzable spleen extracts (DSE) are similar to Transfer 
Factors in that they can transfer cell mediated immunity (CMI) from an 
immunocompetent organism into a naïve one in an antigen-specific 
manner. This is an antigen specific transference and the cytokine 
production and DTH are the most important test for that. DSE had been 
used successfully in the treatment of Hipogammaglobulinemy, having 
an augmentation in IgG serum levels. 
Objective. In this work we investigated if treating mice with DSE 
obtained from OVA immunized mice (DSEova) could modify the humoral 
immune response against OVA in naïve mice. 
Methods. DSEova preparation: splenic cell suspensions from OVA 
immunized BALB/c mice were disrupted by freeze-thaw cycles, extracts 
were then dialyzed with a membrane pore of 10 kDa. Ten BALB/c mice 
were treated on days 0, 14, 21 and 28 with 20�g of DSEova alone. Serum 
samples were obtained between days 0-36, and IgM and IgG anti-OVA 
were assayed by ELISA. Mice were sacrified on days 9, 15 and 23 post-
immunization, and germinal centers (GC) in lymph nodes were 
identified by immunohistochemistry using PNA and THY-1. Mice were 
sacrified on the 20th day after immunization, and plasma cells in lymph 
node and bone marrow were identified by flow citometry. 
Results. Compared to control saline-treated animals, DSEova treated 
mice produced IgM and IgG anti-OVA. Compared to saline-treated mice, 
DSEova-mice showed increased numbers of GC, but of smaller size than 
OVA-treated mice. the numbers of plasmablast and plasma cells in 
lymph node and bone marrow were higher in the group boosted with 
DSEova with respect to the OVA group. 
Conclusion. In this in-vivo model, compared to control-mice, DSEova 
would appear to stimulate the Ag-specific antibody responses and the 
appearance of GC. Numbers of plasmablast and plasma cells in mice 
boosted with DSEova, augmented in bone marrow, these could mean 
that the response of these mice will be better in a next encounter with 
the antigen, So we could confirm that stimulation with DSE augment 
the immunity of the receptor transferring the cellular response and 
enhancing the humoral response 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1
I INTRODUCCION 
 
 
 La teoría celular de la inmunidad, que afirmaba que las células del 
huésped eran los mediadores principales de la inmunidad, fue defendida 
inicialmente por Elie Metchnikoff, su demostración de la existencia de 
fagocitos rodeando una espina clavada en una larva de estrella de mar 
traslúcida, publicada en 1893, fue tal vez la primera prueba experimental 
de que las células responden a invasores extraños. 
 
La inmunidad mediada por células, o inmunidad celular, está 
mediada por los linfocitos T; la defensa frente a microorganismos 
intracelulares como virus, parásitos y bacterias intracelulares, es una 
función de la inmunidad celular, la cual favorece la destrucción de los 
microorganismos que residen en los fagocitos, o en las células infectadas, 
con el fin de eliminar los reservorios de la infección (Abbas AK, 2002). 
 
La inmunidad protectora frente a un microorganismo se produce por 
la respuesta del huésped ante éste (inmunidad activa), pero también puede 
adquirirse pasivamente mediante la transferencia de linfocitos ó 
anticuerpos procedentes de una persona con inmunidad específica contra 
un determinado antígeno. Este proceso se conoce como inmunidad pasiva, 
después de esta transferencia el sujeto receptor es capaz de responder 
contra el antígeno, sin haber estado nunca expuesto o haber 
experimentado una respuesta contra el mismo (Abbas AK, 2002). 
 
Este fenómeno de transferencia de la inmunidad celular de un 
donador inmune a un receptor no inmune fue realizado por Landsteiner y 
Chase (Landsteiner y Chase, 1942), y empleado por Lawrence (Lawrence, 
 2
1949) para el desarrollo de lo que hoy conocemos como factor de 
transferencia (FT) o extractos dializables de leucocitos (EDL). 
 
Otra función de la respuesta inmune celular (RIC) es la cooperación 
con los linfocitos B para la formación de anticuerpos, esta cooperación 
está mediada por citocinas y un componente de membrana, el ligando de 
CD40 (CD40-L) ó CD154; a continuación se describirá en detalle como se 
lleva a cabo esta cooperación. 
 
Los ganglios linfáticos son el sitio donde se conjuntan de manera 
dinámica los elementos necesarios para la formación de anticuerpos: 
células presentadoras de antígeno, los linfocitos T, los linfocitos B y un 
ambiente de quimiocinas y citocinas necesarios para que ésto se lleve a 
cabo. 
 
Las células dendríticas (DC) se encargan de llevar al antígeno (Ag) 
desde los tejidos hasta las nódulos linfoides por la vía aferente, mientras 
que los linfocitos T y B pasan de la sangre al nódulo linfoide por las 
vénulas con epitelio alto (del inglés high endotelial venules, HEV); si al 
llegar al nódulo no encuentran al antígeno para el que son específicas, 
regresan a la circulación sanguínea y llegan hasta otro nódulo a continuar 
la búsqueda. 
 
Solo se inicia una reacción inmunológica en el ganglio linfático 
cuando los linfocitos T y B se encuentran con el antígeno para el que son 
específicos, los linfocitos T cooperadores (Th0) son activados por las 
células presentadoras de antígeno (CPA), estos linfocitos al reconocer al 
antígeno proliferan y se diferencian en linfocitos Th, los cuales comienzan 
a producir citocinas y están listos para interactuar con los linfocitos B que 
reconocieron al mismo antígeno. Esta interacción entre los linfocitos Th y 
 3
B se lleva al cabo en el área paracortical del nódulo linfoide, donde forman 
lo que se llama el foco primario (Jacob et al, 1991, Kuppers et al, 1993). 
 
En el foco primario los linfocitos B se dividen durante unos días, 
algunos se diferencian a células plasmáticas o formadoras de anticuerpos 
(AFC) y migran a los cordones medulares para producir anticuerpos 
específicos para el antígeno, otros migran a los folículos primarios y 
proliferan hasta formar un centro germinal, en el centro germinal los 
linfocitos B sufren un proceso de hiper-mutación somática y selección, que 
da como resultado un incremento en la afinidad de los receptores y los 
anticuerpos por el antígeno. Algunos de los linfocitos B del centro germinal 
se diferencian en linfocitos B de memoria, los cuales son necesarios para 
aumentar la respuesta secundaria en caso de un futuro encuentro con el 
mismo antígeno (Berek et al, 1991, Cyster et al, 2003, Kelsoe et al, 1999). 
 
 
Extracto Dializable de Leucocitos (EDL) y 
Factor de Transferencia (FT) 
 
En 1942, Landstainer y Chase describieron por primera vez la 
transferencia de la respuesta inmune celular (RIC),utilizando células de 
exudado peritoneal de cobayos sensibilizados a tuberculina o cloruro de 
picrilo. Las células de los animales sensibilizados eran transferidas a los 
receptores no sensibilizados y éstos adquirían la capacidad de expresar la 
RIC de los donadores. Estos autores encontraron que la transferencia era 
mejor cuando se realizaba entre donadores y receptores que tuvieran 
alguna relación genética y sólo cuando usaban células íntegras y viables 
(Landstainer y Chase, 1942). 
 
 4
En 1949, Lawrence demostró que la transferencia celular también era 
posible en humanos. Utilizó linfocitos viables intactos de un individuo 
normal con una intradermorreacción (i.d.) positiva al PPD, que es una 
manifestación de la hipersensibilidad tardía cutánea ó DTH (de las siglas 
en inglés “delayed type hypersensitivity”), inyectándolos a un individuo con 
una i.d. negativa al PPD, provocando que el segundo individuo (el receptor 
de las células), al ser posteriormente retado con PPD, presentara una i.d. 
positiva (Lawrence, 1949). 
 
En 1955 el mismo Lawrence, demostró que la i.d., podía ser transferida, 
utilizando extractos solubles de leucocitos provenientes de 20 ml de sangre 
total. En estos experimentos Lawrence utilizó lisados de leucocitos de 
donadores que presentaban i.d. positivas a antígenos tales como la 
coccidioidina, el toxoide diftérico, la proteína M del estreptococo y el PPD; 
en todos los casos los receptores eran individuos con i.d. negativas a estos 
antígenos, 24 h después de haber recibido el extracto soluble, los 
receptores eran capaces de presentar reacciones de DTH positivas a los 
antígenos que eran reconocidos por los donadores y el efecto parecía ser 
antígeno específico (Lawrence, 1955). 
 
Al componente activo de estos extractos celulares se le llamó “factor de 
transferencia” (FT); Lawrence dio a conocer que el FT podía pasar a través 
de una membrana de diálisis con un corte molecular menor a 20 
kilodaltones (KDa) sin perder su capacidad biológica; además, Lawrence 
supuso que estos dializados contenían solo una especie molecular (el FT), 
hoy en día, se sabe que la preparación que originalmente se llamó FT, es 
en realidad un conjunto de moléculas a las que ahora se les nombra 
“extractos dializables de leucocitos” o EDL (Lawrence, 1955) y dentro del 
conjunto de moléculas que forman este extracto se encuentran las 
moléculas responsables de la transferencia de la RIC. 
 5
El descubrimiento de la actividad biológica de los EDL o FT proporcionó 
las primeras evidencias de que las células inmunocompetentes son 
capaces de comunicarse efectivamente entre ellas con un lenguaje que 
consta de factores solubles diferentes a las inmunoglobulinas; en ese 
momento, (los años 50’s), no existían datos de la comunicación a través de 
citocinas. 
 
El EDL es aquel que proviene del rompimiento de leucocitos de sangre 
periférica, ó de células linfoides obtenidas de bazo, seguido de un proceso 
de ruptura y diálisis donde se obtiene la fracción de bajo peso molecular 
que dializa; el término factor de transferencia (FT) quedó reservado 
únicamente para los componentes del EDL que transfieren la respuesta de 
linfocitos T de una manera antígeno específica y que tienen un peso 
molecular comprendido entre 3.5 y 5 KDa. De acuerdo con Kirkpatrick su 
naturaleza química es de polipéptidos (Kirkpatrick et al, 1992), y de 
acuerdo con Fudenberg, Pizza y Borvak son polipéptidos unidos a 
oligonucleótidos (Borvak et al., 1989; Fudenberg y Pizza, 1993). 
 
 En adelante se mencionarán EDL y FT indistintamente, aclarando 
que todos los autores han trabajado únicamente con EDL pero lo han 
llamado factor de transferencia. 
 
 
B) Especificidad del DLE 
 
En 1960 Rapaport y Lawrence, obtuvieron EDL de un grupo de 
californianos con DTH positiva a la coccidioidina, un antígeno de 
Coccidioides imitis, un hongo endémico de la zona, lo aplicaron a un grupo 
de neoyorquinos con DTH negativa a dicho antígeno, adquiriendo estos 
últimos una respuesta de DTH positiva a coccidioidina, antígeno al cual 
eran positivos los donadores; el efecto anterior demostró especificidad en 
 6
la transferencia de la DTH. Como control de estos experimentos realizaron 
repetidas veces la prueba de DTH a neoyorquinos que no fueron 
transferidos con EDL y eran negativos a esta prueba, nunca se hicieron 
positivos a la coccidioidina (Rapaport et al., 1960), con ésto demostraban 
que la pequeña cantidad de Ag a la que exponían a los sujetos no era 
suficiente para despertar una RIC. 
 
En 1981, Petersen y col., desarrollaron un modelo murino para el 
estudio de la transferencia de DTH, en el cual utilizaron preparaciones de 
EDL, obtenidos de forma idéntica a partir de esplenocitos de animales no 
sensibilizados y sensibilizados con PPD, ferritina, citocromo C, peroxidasa 
de rábano y un antígeno particulado de cándida. Todas ellas se aplicaron a 
ratones vírgenes, 24 h después los animales fueron retados con los 
diferentes antígenos empleados, reaccionando solamente a los antígenos 
con los que el donador había sido previamente inmunizado. Los controles 
utilizados en estos experimentos fueron ratones que recibieron EDL 
proveniente de animales no inmunes, estos animales no presentaron DTH 
positiva ante ninguno de los antígenos anteriormente mencionados 
(Petersen et al., 1981). 
 
Lawrence y Borkowsky prepararon extractos dializables de donadores 
que eran inmunes a toxoide diftérico o a candida, y sometieron estos 
extractos a inmunoabsorción en placas de poliestireno cubiertas con los 
diferentes antígenos y después de un tiempo de incubación, los extractos 
se recuperaron y se probó su actividad de inhibición de la migración de 
leucocitos (LIF), observándose que los extractos dializables de las placas 
que estaban cubiertas con cándida ya no eran capaces de inhibir la 
migración de los leucocitos, después de la inmunoabsorción; lo mismo 
pasaba con el toxoide diftérico (Lawrence y Borkowsky, 1983). 
 
 7
Kirkpatrick reforzó el concepto de la transferencia de DTH, 
demostrando que el EDL inducía en el receptor un evento 
inmunológicamente específico, al utilizar antígenos sintéticos para 
inmunizar ratones, obtener EDL y con éste realizar un estudio de 
transferencia de DTH. En estos experimentos, los ratones que recibieron el 
EDL específico, únicamente reaccionaron con el antígeno para el cual el 
ratón donador fue sensibilizado. Como control adicional se retó al receptor 
con los demás antígenos sintéticos, sin que se observara ningún tipo de 
reacción de DTH positiva (Kirkpatrick et al., 1980). 
 
En 1985, Kirkpatrick, también demostró que el FT era capaz de unirse 
específicamente al antígeno que lo indujo. Para ello empleó EDL obtenido 
de ratones sensibilizados con ferritina, posteriormente incubó los 
dializados en superficies plásticas cubiertas con ferritina, observando que 
al recuperar el extracto, éste perdía su capacidad de transferencia de DTH 
para ferritina (Kirkpatrick 1980 y 1985). La actividad específica puede ser 
recuperada eluyendo el FT de la superficie plástica con urea 8 Molar o 
acetonitrilo. Esta técnica es ampliamente utilizada hasta el día de hoy, 
para la purificación de FT específico (Kirkpatrick & Rozzo, 1992). 
 
 A un grupo de pacientes que cursaban con herpes genital y/o herpes 
labial, se les dio tratamiento con EDL específico para el virus Herpes 
simplex (HSV), obtenido de pacientes convalecientes de herpes y a otro 
grupo de pacientes con herpes se les dio EDL inespecífico; la inmunidad 
celular de estos pacientes fue evaluada por la prueba de LIF en presencia 
del antígeno, que en este caso era el HSV. Estas pruebas se realizaron 
antes, durante y después del tratamiento con el EDL específico para HSV. 
El 25.4% de los pacientes fueron positivos para la prueba de LIF, antes del 
tratamiento o con el EDL inespecífico, mientras42.5% de los pacientes que 
se trataron con EDL específico fueron positivos a la prueba; demostrando 
 8
así la transferencia de la inmunidad celular específica al antígeno que 
indujo al EDL (Pizza et al., 1996). 
 
 En otros estudios se analizaron las propiedades inmunobiológicas 
del EDL de origen humano específico contra Staphylococcus aureus, 
demostrando que este era capaz de estimular leucocitos humanos in vitro e 
in vivo. Las pruebas realizadas fueron inhibición de la migración de 
macrófagos (MIF), LIF, y cuantificación de la formación de rosetas E 
(linfocitos T). Utilizando como antígeno al S. aureus, encontraron que todas 
las pruebas eran positivas después del tratamiento con EDL específico. 
Para las pruebas in vivo se utilizaron las reacciones de DTH a S. aureus, 
induciendo en los receptores DTH positivas al Ag después de haber 
recibido el EDL específico (Liubchenko et al., 1997). 
 
 
C) Estructura 
 
Lawrence fue el primero en demostrar que el material en los extractos 
dializables de leucocitos responsables de la transferencia de la DTH era 
orcinol positivo, biuret positivo, resistente a DNasa, a RNasa pancreática y 
a tripsina; y que el eluído obtenido, después de pasarlo a través de una 
columna de Sephadex® G-25, daba un pico de absorción entre 260/280 y 
el peso molecular era menor a 10 KDa (Lawrence et al., 1963). Más tarde 
Spitler et al. demostraron que la digestión enzimática con pronasa (enzima 
proteolítica, rompe proteínas o péptidos hasta fragmentos pequeños) 
eliminó la actividad biológica del EDL, pero que se mantuvo estable 
después de un calentamiento a 56°C por 2 horas (Spitler et al., 1973). Por 
lo anterior, se sugirio que la naturaleza del EDL podría ser peptídica. 
 
En 1979 Wilson y Fudenberg, utilizando Sephadex® G-25 lograron 
separar dos fracciones del EDL, una de ellas inhibía la migración de 
 9
leucocitos dependiente de antígeno, es decir inducía LIF y dicha fracción 
tenía un peso molecular mayor a 5 KDa. La capacidad de inhibición se 
mantuvo estable al calentarla a 56°C por 30 min, pero fue parcialmente 
destruida al calentarla a 80°C por 30 min. También hicieron una 
purificación con Biogel P-10, obteniéndo moléculas con un peso molecular 
comprendido entre los 14 KDa y 17 KDa, de naturaleza peptídica y 
ribonucleotídica (Wilson y Fubenberg, 1979). 
 
 En la figura 1 se puede observar la separación de EDL por Sephadex 
G-25 realizada por Kirkpatrick y Gallin, demostrando que el EDL tiene un 
peso molecular alrededor de 5 KDa (Kirkpatrick and Gallin, 1974). 
 
En 1983 Wilson y Fudenberg demostraron que los EDL inducían dos 
efectos: uno antígeno dependiente, el cual era mediado por el FT contenido 
en ese EDL y otro efecto antígeno independiente, que inducía un efecto 
inespecífico sobre la inmunidad celular, donde participa la respuesta 
inflamatoria. Entre los componentes que tienen efecto inespecífico se 
encuentran prostaglandinas, nicotinamida, ácido ascórbico, histamina, 
serotonina, bradicinina, factores de diferenciación de linfocitos (timosina 
1), quimioatrayentes para monocitos, y factores inmovilizadores de 
neutrófilos (Wilson y Fudenberg, 1983). 
 
A partir de un EDL bovino específico contra PPD (bEDLPPD) Wilson, 
Paddock y Fudenberg purificaron el factor de transferencia, y encontraron 
que era soluble en agua, pero insoluble en fenol ó eter y que podía ser 
precipitado en etanol. Lo analizaron por cromatografía de alta presión en 
fase líquida (HPLC, “high-performance reverse phase liquid 
chromatography”) donde encontraron un solo pico, la especie molecular 
que se encontraba aquí contenía por lo menos un grupo co-planar cis-diol 
libre, el cual fue demostrado también por cromatografía de afinidad con ac. 
borbórico. 
 10
 
También lo sometieron a la acción de endonucleasas, exonucleasas, 
proteasas y fosfatasas, llegando a la conclusión de que éste tenía una 
estructura de oligorribonucleopéptido (Wilson, Paddock y Fudenberg, 
1982). 
 
En 1989 Borvak y col., midieron la absorbancia en UV del EDL 
ultrafiltrado en Sephadex® G-15, antes y después de pasar el extracto por 
una columna de afinidad con m-aminofenil y ácido borbórico inmovilizado. 
Este fraccionamiento bioespecífico provocó un enriquecimiento de material 
protéico, que aparentemente contiene purinas y pirimidinas y que tenía 
actividad biológica; esto indica que es posible que los componentes activos 
del EDL sean moléculas protéicas unidas a moléculas parecidas al RNA 
(Borvak et al., 1989), lo que confirmó los resultados de Wilson y Fudenberg 
y se puede observar en la figura 2 que también lo comprobaron Kirkpatrick 
y Gallin. 
 
FIGURA 1. Separación de EDL por Sephadex G-25. Se eluyeron seis picos con una 
densidad óptica de 225 nm, este espectro demostro que el EDL tiene un peso molecular 
alrededor de 5 KDa (Kirkpatrick and Gallin, 1974). 
 11
 
FIGURA 2. Espectro de absorbancia de luz UV del EDL, el pico máximo de absorción 
estuvo entre 250 y 255 nm, lo que sugiere la presencia de ácidos nucléicos (Kirkpatrick 
and Gallin, 1974). 
 
En 1990 Borvak empleo HPLC en fase reversa y diversas técnicas 
químicas, con las cuales se realizó el análisis de aminoácidos contenidos 
en las dos fracciones principales del EDL, demostrando la presencia de 
lisina, serina, glicina y ácido glutámico (Borvak et al., 1990). 
A fines del siglo XX, Kirkpatrick logró purificar y secuenciar factores de 
transferencia murino y bovino, Las secuencias se obtuvieron por HPLC y 
los productos fueron digeridos con bromuro de cianógeno, obteniendo una 
secuencia de aminoácidos conservada, LLYAQDL/VEDN, en los 7 
diferentes factores de transferencia analizados; estos péptidos no fueron 
capaces de transferir DTH por sí solos, sin embargo la administración 
conjunta de estos péptidos con el FT bloqueó la actividad de transferencia 
de DTH, característica clave del FT, por lo que se propuso que los péptidos 
generados con bromuro de cianógeno se unen al mismo sitio efector al que 
se unen los FT (Kirkpatrick, 2000). 
 12
 
Esta fracción antígeno específica del EDL contiene una gran cantidad 
de diferentes FTs, considerando el peso molecular y la composición de los 
diferentes FTs, es factible que cada FT contenga como estructura base por 
lo menos 45 aminoácidos (tomando en cuenta el peso molecular de 5000 
Da). Por lo tanto, si se consideran las posibles combinaciones con los 20 
aminoácidos conocidos, entonces deben existir varios millones de 
variaciones en la estructura primaria (4520), y por lo tanto varios millones 
de FT específicos para todos los diversos antígenos existentes (Kirkpatrick, 
1988) que corresponden a la suma de las experiencias inmunes del 
individuo del cual se obtienen el EDL. 
 
 
D) Efecto biológico 
 
El mecanismo por el cual los EDLs ejercen su efecto biológico no está 
completamente establecido y los trabajos más representativos de su efecto 
tanto in-vitro como in-vivo que sirven de antecedentes para este trabajo se 
mencionan a continuación. 
 
En 1970 diferentes grupos de investigación demostraron que el EDL era 
capaz de inhibir la migración de macrófagos de una manera antígeno 
específica, además de inducir DTH en respuesta a antígenos específicos; 
esto lo demostraron en pacientes con el Síndrome de Wiskott-Aldrich, una 
inmunodeficiencia en los cuales la RIC transferida permaneció por más de 
seis meses y se favoreció la producción de MIF y LIF de manera antígeno 
específica (Fudenberg et al., 1989; Wilson y Fudenberg, 1981; Spitler et 
al., 1972; Levin et al., 1970 ). 
 
En los años 80’s Lawrence y Borkowsky propusieron que los EDL 
contenía una función inductora, la cual consiste en activar células que se 
 13
encuentran en reposo de manera antígeno específica; demostrando esto 
con EDL de donadores inmunizados con toxoide diftérico, el cual se 
sometió a inmunoabsorciónen placas de poliestireno que contenían 
adsorbido toxoide diftérico, después de ésto se realizó la prueba de 
producción de MIF en presencia de dicho antígeno, y encontraron que el 
EDL fue anulado en su actividad inductora de MIF después de la 
inmunoabsorción (Lawrence y Borkowsky, 1983). 
 
 Rozzo y Kirkpatrick prepararon extractos dializables murinos a 
partir de cepas de ratones genéticamente respondedoras a ciertos 
antígenos (BALB/c (H-2d), C57BL/10 (H-2d), B10.M (H-2f)) y de cepas 
genéticamente no respondedoras a los mismos antígenos (B10.Q (H-2q), 
CBA (H-2K) y SWR/J (H-2q)). Los EDL de las altamente respondedoras 
fueron capaces de transferir la DTH a las cepas no respondedoras; sin 
embargo, los EDL preparados a partir de las cepas no respondedoras no 
fueron capaces de transferir la DTH a las cepas no respondedoras ni a las 
altamente respondedoras. Con estos resultados los autores propusieron 
que el EDL es capaz de transferir el fenotipo altamente respondedor a los 
receptores genéticamente no respondedores y que la producción del factor 
de transferencia está regulado o restringido por el MHC en los genes Ir, 
pero la actividad no está restringida en los receptores (Rozzo y Kirkpatrick, 
1988). 
 
 En pacientes con carcinoma renal se realizó un estudio cuando estos 
fueron tratados con FT y se observó que aumentaban 10 veces el número 
total de linfocitos CD4+, así como el número total de linfocitos CD3+ y 
CD8+, además de que el 80% de los pacientes mostró una mejoría clínica 
(Mrazova y Mraz, 1993). 
 
En 1996 Alvarez-Thull y Kirkpatrick propusieron que el mecanismo 
inmunológico del FT es la activación de linfocitos T cooperadores tipo 1 
 14
(Th1) al hacer un estudio en el cual estimulan ratones BALB/c con FT 
específico contra el virus Herpes simplex (TF-HSV), una semana después 
colectaron los bazos de estos ratones e in vitro estimularon los esplenocitos 
con HSV, y en los sobrenadantes se encontró IFNγ y una baja ó nula 
producción de IL-4 e IL-10 (Alvarez-Thull & Kirkpatrick, 1996). 
 
En 1996 se realizó un estudio en el que se estimularon monocitos y 
células endoteliales con productos de las paredes celulares de diferentes 
microorganismos (i.e. LPS, ac. lipoteicoico y peptidoglicana) seguidos por 
un tratamiento con EDL, encontrando que el EDL suprimió la producción 
de TNF, indujo la liberación de IL-8 en los monocitos y aumentó los 
niveles de cAMP, así mismo aumentó la producción de IL-6 e IL-8 en las 
células endoteliales; los autores proponen que el efecto del EDL sobre los 
mediadores proinflamatorios es similar a la acción del cAMP, aumentando 
la producción de estos compuestos, sugiriendo de esta manera que el 
aumento del cAMP es uno de los efectos biológicos que los EDL tienen 
sobre las células endoteliales y los monocitos (Ojeda et al., 1996). 
Posteriormente siguiendo este estudio del efecto de los componentes 
bacterianos y el tratamiento con EDL, los mismos autores, confirmaron 
por citometría de flujo que el EDL era capaz de aumentar la expresión de 
TLR2 y TLR4 (Ojeda et al., 2005) 
 
En 1976 Silverman y cols. utilizaron FT en el tratamiento de la 
Hipogammaglobulinemia congénita, el cual tuvo un efecto benéfico sobre 
los linfocitos B en la síntesis de inmunoglobulinas. Estudiaron 9 pacientes 
con Hipogammaglobulinemia tratados durante los 6 años anteriores con γ-
globulina exógena, estos pacientes reportaban un nivel sérico de IgM de 
35 mg/dl.; después de las 4 dosis iniciales de FT (producto de la diálisis de 
1x 108 linfocitos por dosis) sus niveles de IgM cambiaron y se volvieron 
indetectables, además de que hubo un aumento en los niveles de IgG de 
 15
56 mg/dl. a 130 mg/dl.; estos niveles aumentaron de una manera similar 
a los niveles alcanzados con la gammaglobulina exógena. 
 
El nivel sérico de IgG de los pacientes se mantuvo durante los 
siguientes 12 meses, con un refuerzo trimestral de 1 dosis de factor de 
transferencia, por lo tanto estos pacientes no requirieron terapia adicional 
de gamma globulina exógena, por primera vez durante el curso de su 
enfermedad se mostraron clínicamente asintomáticos. 
 
Este aparente efecto en la interacción de los linfocitos T y B puede 
ser explicado de la siguiente manera el FT estimula a los linfocitos T los 
cuales aparentemente son responsables del switch de IgM a IgG en los 
linfocitos B reflejando así el cambio en la respuesta humoral. 
 
En 1976 el mismo grupo utilizó factor de transferencia en pacientes 
con macroglobulinemia de Waldenstrom (cáncer de células plasmáticas 
con sobreproducción de IgM); los pacientes fueron tratados con 12 
unidades de FT (1 unidad = producto de la diálisis de 1x 108 linfocitos por 
dosis). 
 
En los pacientes con macroglobulinemia los niveles séricos de IgM 
disminuyeron mas del 40%, de 730mg/dl. a 480mg/dl. Cuando se dejo de 
administrar el FT, los niveles de IgM en suero regresaron a los valores 
antes del tratamiento o aun mayores. Es posible que estos cambios sean 
resultado del aumento en la inmunidad celular contra las poblaciones 
celulares malignas por efecto del FT o que se modula la producción de IgM 
debido a la interacción entre linfocitos T y B. 
No hubo cambio significativo en los niveles de IgG durante el 
tratamiento con el FT, sin embargo se observó una caída de 600mg/dl. a 
300mg/dl. después de descontinuar el uso del FT. 
 
 16
En 1996 Estrada-Parra y cols. realizaron un estudio en pacientes 
con diagnostico de dermatitis atópica moderada a severa, a todos los 
pacientes se les tomó al inicio del tratamiento una muestra sanguínea 
para la determinación de niveles séricos de inmunoglobulinas A, G, M y E 
total, subpoblaciones de linfocitos CD3, CD4 y CD8. Además se realizarón 
coproparasitoscópicos en serie de 3, exudado y cultivo faríngeo y nasal 
para búsqueda de eosinófilos. 
Los resultados demostraron una disminución de las células CD4, 
eosinófilos e IgE, al compararlos con los niveles séricos al inicio del 
estudio, aunque sin ser estadísticamente significativos. Desde el punto de 
vista clínico se observó una mejoría en los cuatro parámetros valorados: 
eritema, eczema, pápulas y prurito, al término de la administración del FT. 
 
En el 2000 Espinosa y cols. realizaron un estudio en pacientes con 
diagnóstico de Asma moderada intermitente y moderada persistente a los 
cuales además del tratamiento convencional, se les administro FT. 
 
Los resultados demostraron una disminución en los niveles séricos de 
IgE, aunque estos no fueron estadísticamente significativos, sin embargo 
se observó una mejoría clínica en los pacientes como consecuencia del 
efecto del FT, desapareciendo las crisis asmáticas y no hubo necesidad de 
continuar el tratamiento con esteroides, solo con FT. 
Los niveles de IL-4 no fueron detectables; sin embargo, los pacientes 
pasaron de un asma moderada a asma leve. 
 
En otro estudio se observó la morfología de los cojinetes plantares y de 
los órganos linfoides de ratas que fueron sensibilizadas con FT, se 
encontró que el número de linfoblastos y de células plasmáticas 
aumentaba después del tratamiento, evidenciando así que el FT estimula 
la linfopoiesis (Chivinda et al., 2000). 
 
 17
II JUSTIFICACIÓN 
 
Los EDL se han utilizado los últimos 30 años como agentes 
terapéuticos obteniendo buenos resultados en diferentes patologías, sin 
embargo a pesar de múltiples investigaciones aún no se conocen bien sus 
mecanismos de acción por lo que es importante investigar en detalle 
cuáles son las poblaciones celulares que se activan, qué citocinas se 
regulan y si la respuesta inmune humoral se altera ó no después de su 
administración. 
 
 
 
III HIPOTESIS 
 
El EDL estimula de forma diferencial a las poblaciones celulares de 
los ganglios, especialmente los regionales al sitio de inoculación, 
induciendo en ellas la activación y producción de diferentes citocinasy la 
cooperación para la producción de anticuerpos. 
 
 
 
IV OBJETIVO GENERAL 
 
Caracterizar la respuesta inmune humoral contra OVA en ratones BALB/c 
retados con OVA y/o EDL específico para OVA. 
 
 
 
 
 18
V OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Obtener EDL a partir de ratones BALB/c sanos (EDL) y de 
ratones inmunizados con ovoalbúmina (EDLOVA), EDL específico 
 
 Evaluar la transferencia de respuesta celular (DTH) anti-OVA a 
las 24 y 48h en ratones BALB/c estimulados con EDL y EDLOVA 
 
 Identificar si la administración de EDL y EDLOVA modifica la 
cinética de producción de anticuerpos en respuesta primaria y/o 
secundaria 
 
 Analizar las poblaciones celulares del ganglio regional (linfocitos 
T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células 
plasmáticas) de ratones BALB/c estimulados con EDL y EDLOVA, 
en los días donde se observa un pico de producción de 
anticuerpos 
 
 Analizar las poblaciones celulares en sangre periférica (linfocitos 
T, linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y células 
plasmáticas) de ratones BALB/c estimulados con EDL y EDLOVA, 
en los días donde se observa un pico de producción de 
anticuerpos 
 
 Identificar las poblaciones de linfocitos B, plasmablastos y 
células plasmáticas de la médula ósea de ratones BALB/c 
estimulados con EDL y EDLOVA, en los días donde se observa un 
pico de producción de anticuerpos 
 
 
 19
VI MATERIAL Y MÉTODOS 
 
 
a) Obtención de EDL 
 
Un grupo de 15 ratones BALB/c de 6 semanas de edad, se 
sacrificaron para extraerles los bazos; se disgregó el tejido en Hanks 1x 
(Gibco, Grand Island, NY), con ayuda de una malla de Nylon® de 70µm, 
esteril (BD Falcon) un émbolo de jeringa y después se procedió a lisar las 
células con diez ciclos de congelamiento (-70°C) y descongelamiento (37°C); 
el lisado se dializó posteriormente, empleando una membrana de corte 
molecular de 12 000Da. 
Finalmente se liofilizó el dializado, obteniendo así EDL no específico 
(figura 4); cuantificando la concentración de péptidos de este por el método 
del ácido bicinconinico, la cual fue de 500 µg/ml. 
 
 
 
FIGURA 4. Obtención de EDL no específico 
 
 
b) Obtención de EDL específico (EDLOVA) 
 
Para la obtención del EDL específico para ovoalbúmina (EDLova) un 
grupo de 10 ratones se inmunizó vía subcutánea con 20 µg de OVA 
(Sigma, St. Louis, MO) y adyuvante incompleto de Freund, el día cero y 
14, se les realizó una prueba de DTH al final del esquema de 
inmunización, se sacrificaron y extrajeron los bazos de los animales que 
DLE 
Ciclos de 
congelamiento 
y descongela-
miento Dialisis <12 
KDa BALB/c bazo 
 20
dieron DTH positiva a OVA para obtener el EDL; la obtención de realizó de 
la misma forma que en el paso anterior. 
 
Se cuantificó la concentración de péptidos de este por el método del 
ácido bicinconinico, la cual fue de a 100 µg/ml. 
 
 
c) Prueba de DTH (Hipersensibilidad cutánea retardada) 
 
Se formaron 4 grupos de 10 ratones cada uno, se trataron como se 
describe a continuación y en el cuadro 1: 
1) Testigo negativo (Solución Salina) 
2) Testigo positivo (OVA) 
3) EDLOVA (Extracto Dializable Leucocitario específico para OVA) 
4) EDL (Extracto Dializable Leucocitario) 
 
Grupo Tratamiento Reto 
1)Testigo negativo SS día cero y 14 con 
adyuvante incompleto 
de Freund 
OVA en cojinete 
plantar, día 15 
2)Testigo positivo OVA día cero y 14 con 
adyuvante incompleto 
de Freund 
OVA en cojinete 
plantar, día 15 
3) EDLOVA EDLOVA día 12 OVA en cojinete 
plantar, día 15 
4) EDL EDL día 12 OVA en cojinete 
plantar, día 15 
Tabla 1. Esquema de inmunización para prueba de DTH 
 
 21
Para el grupo de OVA primero se realizó un esquema de inmunización 
14 días antes de realizar la prueba de DTH; este esquema consistió en 
inmunizar el día cero con 20 μg de OVA y adyuvante incompleto de Freund 
vía subcutánea en la base de la cola, al día 7 se dio un refuerzo sólo con 
20 μg de OVA y otro más el día 14; una vez completado este esquema de 
inmunización al siguiente día se realizó la prueba de DTH. 
 
Para los grupos de EDL y EDLOVA se aplicó a cada grupo 20μg de EDL y 
EDLOVA respectivamente, vía subcutánea en la base de la cola; ésto se 
realizó 72 h antes de realizar la prueba de DTH. 
 
El grupo de solución salina siguió el mismo esquema de inmunización 
que el grupo de OVA, al día cero recibió SS y adyuvante incompleto de 
Freund, en los días 7 y 14 solo SS (figura 5). 
 
 
 
 FIGURA 5. Esquema de inmunización y prueba de DTH 
 NOTA: todos los ensayos de DTH se realizaron en las patas traseras 
 
 Para la lectura de la prueba de DTH, se obtuvo una lectura basal, se 
midieron el grosor de los cojinetes plantares, tanto de la pata derecha 
como la pata izquierda de cada uno de los ratones de todos los grupos, 
posteriormente se inocularon 20 μl de SS en la pata izquierda de cada 
0 7 12 14 15 16 17 18 días post-inmunización 
OVA OVA OVA
EDLOVA 
EDL 
Reto en el cojinete plantar 
para todos los grupos 
Lectura del grosor del cojinete plantar 
 22
ratón de todos los grupos, como un control de inflamación; en la pata 
derecha de cada uno de los ratones de todos los grupos se inocularon 20μl 
OVA a una concentración de 1μg/μl. 
 
 A las 24 h se tomó la primera lectura del grosor del cojinete plantar 
tanto de la pata derecha como de la pata izquierda, la segunda lectura se 
tomó a las 48 h. 
 
 Para realizar la comparación en el cambio del grosor del cojinete 
plantar de cada grupo, se restó el valor de la pata izquierda (SS) al valor de 
la pata derecha (OVA) de cada ratón en cada una de las lecturas, para 
comparar este valor con el basal y obtener así la variación del grosor del 
cojinete plantar; los datos se graficaron como deltas (diferencias). 
 
 
d) Esquema de Inmunización con OVA, EDLOVA y EDL 
 
Se inmunizaron 6 diferentes grupos de 10 ratones BALB/c, de 6 
semanas de edad, utilizamos como antígeno OVA, EDLOVA y EDL; el 
esquema de inmunización para OVA fue los días cero y catorce por vía 
subcutánea con adyuvante incompleto de Freund, para EDL y EDLOVA los 
días 14, 21 y 28, se tomaron muestras de suero los días 0, 3, 5, 7, 11, 13, 
16, 19, 23, 26, 30, 33 y 36. 
 
Los sueros se almacenaron a -20°C para su posterior determinación 
de IgG e IgM específicas para OVA. 
 
Los grupos se trataron como se describe a continuación y en la 
figura 6: 
 
1) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero y día 14 con OVA 
 23
2) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero, día 14, 21 y 28 con 
 EDLOVA 
3) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero, día 14, 21 y 28 con 
 EDL 
4) OVA con adyuvante incompleto de Freund día cero y día 14 SS 
5) EDLOVA día cero y día 14 SS 
6) EDL día cero y día 14 SS 
7) SS con adyuvante incompleto de Freund y día 14 con SS 
 
 
FIGURA 6. Esquema de Inmunización de ratones BALB/c 
 
e) Determinación de anticuerpos contra OVA 
 
A los sueros obtenidos se les realizó la determinación de 
inmunoglobulinas por ELISA para IgM, e IgG total y se realizó de la 
siguiente manera: 
1.- Se adicionó OVA a una concentración de 0.5µg/100µl diluida en 
regulador de carbonatos a cada pozo de una placa de poliestireno de fondo 
plano de 96 pozos (maxisorb), se incubó a 4°C por 24 h, para la adsorción 
del antígeno a la fase sólida, protegida con su tapa. 
1.-OVA OVA 
2.-OVA EDL OVA EDL OVA EDL OVA 
3.-OVA EDL EDL EDL 
4.-OVA SS 
5.-EDL OVA SS 
6.-EDL SS 
0 1 3 5 7 13 14 16 19 21 23 26 28 30 33 36 días post-inmunización
Muestras de suero 
 
cuantificar IgM e IgG 
específicaspara OVA 
 24
2.- Pasada la incubación se eliminó el volumen de la placa por 
inversión y se desechó el líquido remanente sacudiendo la placa sobre un 
papel absorbente. 
3.- Se lavaron los pozos con 150µl de PBS-Tween 20 (PBST), se dejaron 
los pozos con el regulador de lavado en reposo durante 3 min, al termino 
de este tiempo, se eliminó la solución por inversión como en el paso 
anterior y se repitió el proceso de lavado 2 veces más. 
4.- Se agregaron 100µl de regulador de bloqueo (PBST-leche) a todos 
los pozos y se incubó a 37°C durante 45 min. 
5.- Terminada la incubación se lavaron los pozos de la misma manera 
que en el paso 3. 
6.- Se adicionaron los sueros de los ratones, así como los controles, 
diluidos en PBST-leche, se incubaron a 37°C durante 45 min. 
7.- Se realizaron los lavados de la misma forma que en el paso 3. 
8.- Se adicionó el conjugado (IgG de cabra ant-IgG de ratón, marcada 
con peroxidasa ó IgG de cabra ant-IgM de ratón) diluido en PBST-leche, se 
incubo a 37°C durante 45 min. 
9.- Se lavaron los pozos como se realizó en el paso 3. 
10.- Se adicionaron 100µl del sustrato de la enzima TMB (BIO-RAD) 
incubar a temperatura ambiente en la obscuridad durante 15 min 
11.- Detener la reacción enzimática adicionando 100µl de ácido 
sulfurico 8N a cada pozo. 
Posteriormente se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectofotómetro. 
 
 
f) Técnica de “Western Blot” 
 
 Se realizó la técnica de “Western Blot” revelando con los sueros de 
los ratones inmunizados con EDLova de la siguiente manera: 
 
 25
 Electroforesis SDS-PAGE: 
 
1.- Se preparó un gel de poliacrilamida al 10% y otro al 15%, 
primero se montó la cámara y se le agregó agua para comprobar que 
estaba perfectamente sellada. 
 Se preparó un gel de corrimiento al 10% con 8.3 ml de una mezcla al 
30% de Acrilamida/Bisacrilamida, 9.9 ml de agua destilada. 6.3 ml de Tris 
1.5M (pH 8.8), 0.25 ml de SDS y 0.25 ml de APS y 10 μl de TEMED; una 
vez mezclados todos los reactivos se llenó la cámara dejando un espacio 
para el gel concentrador y el peine, se colocó butanol en la parte superior y 
se dejo polimerizar. 
 Se preparó un gel concentrador con 0.83 ml de una mezcla al 30% 
de Acrilamida/Bisacrilamida, 3.4 ml de agua destilada. 0.63 ml de Tris 1M 
(pH 6.8), 50 μl de SDS y 50 μl de persulfato de amonio al 10% (APS) y 5 μl 
de TEMED; una vez gelificado el gel de corrimiento, se eliminó el butanol, y 
se lavó con agua destilada, hasta que se eliminó todo el butanol y se llenó 
la cámara con el gel concentrador y se puso el peine. 
 Para el gel al 15% lo único que cambió fueron los volúmenes de la 
mezcla de Acrilamida/Bisacrilamida, que fue de 10 ml y el volumen del 
agua, que fue de 8.3, todo lo demás es igual que lo anterior. 
 2.- La muestra se diluyó volumen a volumen en regulador de 
muestra con SDS al 10% y ditiotreitol 1M (DTT), se hirvieron en baño 
maría durante 5 min, y se colocaron en el gel; en el primer pozo se colocó 
el marcador de peso molecular y posteriormente las muestras. 
 3.- El gel se corrió a 30 mA con regulador de corrimiento 1X y SDS al 
10%, hasta que el frente de corrimiento llegara hasta el final del gel. 
 4.- Se sacó el gel y se colocó en una charola que contenía regulador 
de transferencia y se colocó a manera de sándwich entre papel filtro 
cortado a la medida del gel y una membrana de nitrocelulosa (3 papeles 
 26
filtro-gel-membrana de notrocelulosa-3 papeles filtro), se colocó dentro del 
cassete de transferencia y se cerró. 
5.- El cassete se colocó dentro de la tina de transferencia de forma 
que la nitrocelulosa quedará en el polo positivo y el gel en el polo negativo; 
se realizó la transferencia a 60V durante 2h. 
6.- Transcurrido el tiempo se sacó la membrana y se tiñó con una 
solución de rojo de Punceao por 10 min, para verificar que las proteínas 
fueron transferidas, se destiñó con agua destilada y se dejó secar. 
 
 
“Western Blot” 
 
 1.-Se marcó la membrana con un lápiz para identificar la parte 
superior y se separó el marcador de peso molecular. 
 2.- Se colocó la membrana en una charola y se adicionó solución de 
bloqueo (PBST) hasta cubrir bien la membrana y se dejó en agitación 
durante 1 h. 
 3.- Se diluyó el suero de los ratones inmunizados con EDLova 1:100 
en solución dilutora (PBST) y se colocó en la membrana una vez pasada la 
incubación del bloqueo, se dejó toda la noche a -4°C. 
 4.- Se lavó 10 veces con PBST y después se lavó 5 veces con PBS1x. 
 5.- Se colocó como anticuerpo secundario IgG de cabra peroxidado 
subclases 1, 2a, 2b y 3, en una dilución 1:1000 en solución dilutora y se 
incubó a 37°C durante 1h. 
 6.- Se lavó 10 veces con PBST y después se lavó 7 veces con PBS1x. 
 7.- Se adicionó solución reveladora (3 amino, 9 etil carbazolona y 
N,N dimetilformamida), se dejó actuar por 10 min en oscuridad, 
transcurrido el tiempo se destiñe con agua destilada. 
 
 
 27
 
g) Formación de Centros Germinales 
 
Se inmunizaron diferentes grupos de ratones, en la zona inguinal, vía 
subcutánea con 20µg de OVA, EDLOVA y EDL como control de la 
inmunización se utilizó SS; al día 14 se les realizó un reto con el mismo 
tratamiento para unos grupos y para otros combinados, como se muestra 
a continuación: 
 
1.- SS-SS 
2.- OVA-OVA 
3.- EDLova-EDLova 
4.- EDL-EDL 
5.- OVA-EDLova 
6.- OVA-EDL 
 
Se sacrificaron 3 ratones de cada grupo los días 9, 15 y 23 post-
inmunización y se les extrajeron los ganglios inguinales, se tomaron fotos 
de los ganglios en cada uno de los tiempos, se peso cada uno de los 
ganglios, se colocaron en un medio de congelación (Tissue-TEK) a -20°C. 
 
Se realizaron cortes de 7µm de los ganglios en un criostato a -23°C, las 
laminillas se guardaron a -20°C hasta su uso, se les realizó una tinción de 
inmunohistoquímica para observar la presencia de linfocitos B en los 
centros germinales (células positivas a la aglutinina de cacahuate, PNA), y 
de linfocitos T (células THY-1) la inmunohistoquímica se realizó de la 
siguiente manera: 
 
1.- Incubar las laminillas a T° ambiente (T°amb) durante 20 min 
inmediatamente después de descongelar. 
2.- Delimitar e incubar a T° amb durante 1 hora con H2O2 al 9% en PBS 
1x con 0.1% de azida de sodio. 
 28
3.- Lavar al menos 3 veces con BSA (albúmina bovina) al 0.2% en PBS 
1x, cada lavado 10 min. 
4.- Incubar a 34°C durante 20 min con bloqueador universal diluído 
1:10 
5.- Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior sobre papel 
absorbente, e incubar a T° amb durante 1 hora con suero humano al 2% 
en BSA al 1% en PBS 1x pH 7.4. 
6.- Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior e incubar el 
anticuerpo primario biotinado en la dilución correspondiente en BSA al 1% 
con suero humano al 2% (CD40-L, PNA, control de isotipo), a T° amb 
durante 1 hora o toda la noche a 4°C. 
7.- Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 
min. 
8.- Incubar a T° amb durante 20 min con Streptoavidina-peroxidada. 
9.- Lavar 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 10 min. 
10.- Revelar al microscopio, con Azul-gris y detener la reacción con BSA 
al 2%. 
11.- Dejar las laminillas durante 10 min en BSA. 
12.- Incubar a 34°C durante 20 min con H2O2 al 9% en PBS 1x con 
0.1% de azida de sodio, solo los cortes que llevan doble marcaje, para los 
cortes que ya no llevan un 2do anticuerpo se incuban con BSA al 2%. 
13.- Decantar y eliminar el exceso de la incubación anterior e incubar 
con el segundo anticuerpo en la dilución correspondiente en BSA al 1% 
con suero humano al 2% (THY-1, control de isotipo), a T° amb durante 1 
hora o toda la noche a 4°C. 
14.- Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado 
10 min. 
15.- Incubar a T° amb durante 1 hora con un anticuerpo peroxidado ( 
Rata-POX) ó con Streptoavidina-peroxidada, según sea el caso. 
16.- Lavar al menos 3 veces con BSA al 0.2% en PBS 1x, cada lavado10 min. 
 29
17.- Revelar al microscopio, con Nova Red y VIP, detener la reacción 
con BSA al 2%. 
18.- Lavar con abundante agua destilada. 
19.- Dejar secar a T° amb y montar las laminillas. 
 
 
 
h) Cuenta celular y caracterización de diferentes poblaciones 
linfocíticas ganglio y sangre periférica 
 
Se extrajo el ganglio regional al sitio de inoculación (ganglio 
inguinal), se realizó un conteo de células totales y se analizaron las 
poblaciones celulares (CD3, CD4, CD8, CD19, células plasmáticas 
(CD19/CD138)) presentes en los ganglios y en sangre periférica por 
citometría de flujo. 
Se realizó de la siguiente manera: 
 
1. Se sacrificaron 3 ratones de cada grupo, los días 9, 15 y 23 post 
inmunización, se identificó el ganglio inguinal y se extirpo lo más rápido 
posible, teniendo cuidado de que no llevara grasa. 
2. Se colocaron en PBS frío, conforme se iban obteniendo. 
3. Se colocaron todos los ganglios de un grupo en la parte esmerilada 
de un portaobjetos y se maceraron con otro portaobjetos, cuidando no 
dejar secar los ganglios. 
4. Una vez macerados, se agrego más PBS 1x a los portaobjetos, 
dejando caer el liquido en el pozo de una placa de 24 pozos, lavando bien, 
para recuperar el mayor número de células. 
5. Se pasó la suspensión celular por una malla (para eliminar restos de 
tejido) hacia un tubo de 15 ml y se agrego más PBS. 
 30
6. Se centrifugo a 1000 rpm durante 5 min, se elimino el sobrenadante 
y se resuspendió en 1 ml de PBA frío (para tinción de citometría). 
7. Se contó en cámara de Neubauer y se ajusto la suspensión celular 
para teñir 500 000 células en 100 µl. 
8. Se colocaron 100 µl de la suspensión celular en pozos de placas con 
fondo en V y se incubo durante 3 min, con 50 µl de bloqueador universal 
diluido 1:10. 
9. Se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min y se elimino el 
sobrenadante por inversión. 
10. En el volumen restante se agregaron 30 µl de una mezcla de los Ab 
diluidos en sus correspondientes diluciones, se incubo a T°amb durante 
15 min en oscuridad. 
11. Pasada la incubación se agregó PBA (llenando el pozo, sin que se 
desborde), y se centrifugo 5 min a 1000 rpm. 
12. Se realizó un segundo lavado con PBA. 
 13. Se eliminó el sobrenadante y se agregaron 50 µl de 
PBS/formaldehído, se paso a tubos que ya contenían 250 µl de 
PBS/formaldehído y se guardaron a 4°C y protegidos de la luz hasta su 
lectura. 
14. Las muestras fueron adquiridas en el citómetro de flujo (Cyan, DAKO) 
en el cual se midió la intensidad de fluorescencia y se analizaron con el 
software Summit V4.3 integrado al mismo equipo. 
 
 
i) Cuenta celular e identificación plasmablastos y células plasmáticas 
en medula ósea 
 
 Se extrajo la medula ósea del fémur de los ratones, se disgregó, se 
realizó un conteo de células totales y se realizó una tinción con 
anticuerpos monoclonales para identificar por citometría de flujo las 
 31
poblaciones de linfocitos B (CD19+), plasmablastos (CD138+/CD19+) y 
células plasmáticas (CD138+/CD19-). 
 
Se realizó de la siguiente manera: 
 
 1.- Se sacrificaron 7 ratones de cada grupo, los días 10 y 20 post-
inmunización, se obtuvieron los fémures de cada ratón y se extrajo la 
médula ósea lo más rápido posible, inyectando solución salina a través del 
fémur y dejándola caer en una placa de 24 pozos, después se homogeneizó 
con la punta de una micropipeta, para disgregar las células. 
2. Se colocaron en PBS 1x frío, conforme se iban obteniendo. 
3. Se pasó la suspensión celular por una malla (para eliminar restos de 
tejido) hacia un tubo de 15 ml y se agrego más PBS 1x y se 
centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. 
4. Se elimino el sobrenadante y se resuspendió en 1 ml de PBA frío 
(para tinción de citometría) y se mantuvieron en hielo. 
5. Se contó en cámara de Neubauer y se ajusto la suspensión celular 
para teñir 1 000 000 células en 100 µl. 
6. Se colocaron 100 µl de la suspensión celular en pozos de placas con 
fondo en V y se incubo durante 5 min, con 50 µl de bloqueador universal 
diluido 1:10. 
7. Se centrifugo a 1000 rpm durante 5 min y se eliminó el 
sobrenadante por inversión. 
10. En el volumen restante se agregaron 30 µl de una mezcla de los Ab 
diluidos en sus correspondientes diluciones (CD19/CD138, CD45, CD11b) 
se incubo 15 min en oscuridad a T° amb. 
11. Pasada la incubación se agrego PBA (llenando el pozo, sin que se 
desborde), y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. 
12. Se realizó un segundo lavado con PBA. 
 32
 13.Se eliminó el sobrenadante y se agregaron 50 µl de 
PBS/formaldehído, se paso a tubos que ya contenían 250 µl de 
PBS/formaldehído y se guardaron a 4°C y protegidos de la luz hasta su 
lectura. 
 14. Las muestras fueron adquiridas en el citómetro de flujo (Cyan, 
DAKO) en el cual se midió la intensidad de fluorescencia y se analizaron 
con el software Summit V4.3 integrado al mismo equipo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33
VII RESULTADOS 
 
a) Prueba de DTH 
 
 En la figura 7 se muestra la gráfica del cambio en el grosor de los 
cojinetes plantares de los diferentes grupos de ratones. 
 Podemos observar que el EDLOVA si es capaz de transferir la 
respuesta inmune celular a OVA, si se reta al animal 72 h después de 
haber sido inoculado el EDLOVA, dando una diferencia en el grosor del 
cojinete plantar desde las 24 h después del reto con OVA. 
 
SS
 24
h
SS
 48
h
OV
A 
24
h
OV
A 
48
h
ED
L-o
va
 24
h
ED
L-o
va
 48
h
ED
L 2
4h
ED
L 4
8h
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Δ
 d
el
 g
ro
so
r 
de
l c
oj
in
et
e 
pl
an
ta
r
 
FIGURA 7. Comparación de los delta en los diferentes grupos de ratones para la 
prueba de DTH. Los diferentes grupos de ratones se retaron con 20μl de OVA a una 
concentración de 1μg/μl en la pata derecha en el día 15, los deltas se obtuvieron restando 
el valor del grosor de la pata izquierda al de la pata derecha y comparando con la lectura 
del tiempo cero. El grupo de OVA se inmunizó con 20 μg de OVA el día 0 y 14; los grupos 
de EDLOVA y EDL fueron transferidos el día 12 con 20 μg EDLOVA y EDL respectivamente. n 
de 10 ratones por grupo. Solo se encontraron diferencias significativas entre los grupos de 
OVA y SS con una p≤0.05 por prueba de Tukey. 
 
 Las diferencias entre los grupos no son estadísticamente 
significativas, debido a las variaciones entre cada uno de los ratones, sin 
 34
embargo se observa una tendencia a un mayor grosor en el grupo de 
EDLOVA en comparación con el de EDL y SS. 
 
 El grupo de EDL se comportó igual al grupo de SS, por lo tanto 
podríamos considerar este cambio en el grosor como una inflamación 
inespecífica, sin embargo para el grupo de EDL la induración se mantuvo 
hasta las 48 h y desapareció en el grupo de SS. 
 
 
b) Ensayo de ELISA para IgM e IgG contra OVA 
 
 Se estandarizó la técnica de ELISA para la identificación de 
anticuerpos específicos para OVA; lo que se hizo fue adsorber en placas de 
maxiprep de 96 pozos diferentes concentraciones de OVA y diferentes 
diluciones de los sueros, para identificar cual sería la más adecuada para 
los ensayos, las gráficas se muestran a continuación: 
 
La concentración que se eligió para OVA fue de 0.5 μg, debido a que 
a esa concentración se tuvo un buen nivel de detección, como se observa 
en la figura 8; las diluciones de los sueros fueron de 1:20 para los ratones 
tratados únicamente con EDLOVA, EDL y salina (grupos 5, 6 y 7), para los 
ratones tratados con OVA fue de 1:100 (grupos 1, 2, 3 y 4). 
Una vez establecidas las condiciones del ELISA se probaron los 
sueros de los días 0, 3, 7, 19, 26, 30 y 36. 
 
Para la respuesta de IgM podemos observar en la figura 9 la curva 
del control positivo, un primer aumento importante en la DO al día 7 post-
inmunización, después del reto con el antígeno, se observa un máximo en 
el día 19, estos resultadosconcuerdan con los encontrados por Lillard 
(J.W. Lillard et al. 1999), por lo tanto el grupo de ratones que tenemos 
como control positivo, se comporta de manera esperada. 
 35
 
 
ELISA de ratones con EDL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
dil 1:20 dil 1:40 dil 1:80 dil 1:160 dil 1:320
A
bs
or
ba
nc
ia
 a
 4
50
 n
m
0.5 µg
1µg
2µg
5µg
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 FIGURA 8. Estandarización de prueba de ELISA para OVA 
 
Al inmunizar con OVA y dar refuerzo con EDLOVA (grupo 2), se logra 
un aumento en la producción de IgM, que es máxima, después de la 2ª 
administración de EDLOVA, alcanzando su máximo en el día 26; para este 
día, la DO de este grupo con el grupo control de OVA no tiene diferencias 
estadísticas significativas; este efecto no se logra ver cuando el refuerzo es 
EDL inespecífico (grupo 3), ya que los niveles de anticuerpo disminuyen en 
el día 26, sin embargo se ve un aumento para el día 36, en el cual los 
niveles de anticuerpos son estadísticamente iguales con los grupos 1, 2 y 
4. 
ELISA de ratones con OVA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
dil 1:100 dil 1:200 dil 1:400
A
bs
or
ba
nc
ia
 a
 4
50
nm
0.5 µg
1µg
2µg
5µg
 36
El grupo 5, que se trató solo con EDLOVA, logra un pico en la DO 
después de la 3ª administración de EDLOVA, en el día 26, sin embargo 
estos niveles caen para el día 36 y no tienen diferencia significativa con el 
grupo de SS (grupo7). 
 
FIGURA 9. Efecto en la producción de IgM contra OVA en suero de ratones tratados 
con diferentes estímulos. 
 
El grupo tratado solo con EDL inespecífico (grupo 6) nunca alcanza 
un pico de DO, los niveles detectados desde el día 3 se mantienen y estos 
son estadísticamente iguales a los de SS. 
 
Al observar la gráfica de ELISA para IgG (figura 10), en la curva del 
control positivo (grupo 1), vemos un primer aumento importante en la DO 
al día 7 post-inmunización, después del reto con el antígeno, se observa 
un máximo en el día 19, estos resultados concuerdan con los encontrados 
por Lillard (J.W. Lillard et al. 1999). 
Para el grupo de OVA en el día cero y como refuerzo EDLOVA (grupo 
2) se logra un pequeño aumento en la producción de IgG hasta después de 
la 2ª administración de EDLOVA en el día 36, no tiene diferencia 
significativa con el grupo 1, sin embargo en este día los niveles de Ab de 
este grupo ya disminuyeron. 
0 10 20 30 40
0
1
2
3 OVA-OVA
OVA-EDLOVA
OVA-EDL
OVA-SS
EDLOVA-SS
EDL-SS
SS
días post-inmunización
Ab
s 
a 
45
0 
nm
inmunización 
 37
 
FIGURA 10. Efecto en la producción de IgG contra OVA en suero de ratones tratados 
con diferentes estímulo 
 
 El grupo que fue tratado únicamente con EDLOVA (grupo5) muestra 
un aumento en los niveles de IgG, después de la 3ª administración de 
EDLOVA, sin embargo estos niveles disminuyen para el día 36, pero son 
estadísticamente diferentes al grupo de SS (grupo 7) durante toda la 
cinética de producción de IgG. 
 
 En el grupo que fue inmunizado el día cero con OVA y el refuerzo 
con EDL inespecífico (grupo 3) observamos el mismo comportamiento que 
el grupo 2, que recibió como refuerzo EDLOVA, ya que no hay diferencia 
significativas entre estos. 
 
Para al grupo que se trató solo con EDL (grupo 6), se logra ver un 
aumento en la producción de IgG en el día 26, después de la 3ª 
administración de EDL, sin embargo para el día 36 regresan a los niveles 
que presenta el grupo de SS (grupo 7). 
 
 
 
0 10 20 30 40
0
1
2
3
OVA-OVA
OVA-EDLOVA
OVA-EDL
OVA-SS
EDLOVA-SS
EDL-SS
SS
días post-inmunización
Ab
s 
a 
45
0 
nm
inmunización 
 38
 
 
c) Ensayo para la identificación de fracciones de antígeno en el 
EDLOVA 
 Una vez que se observó que el EDLOVA era capaz de inducir la 
formación de anticuerpos de clase IgG específicos para OVA, se intentó 
identificar por la técnica de “Western blot” la posible presencia de péptidos 
de OVA en la preparación del EDLOVA. 
 
 En la figura 11 podemos observar que no hubo bandas de ningún 
peso, en ninguna de las concentraciones a las que se evaluó el EDLOVA. 
 
 
 
 FIGURA 11. Análisis por Western blot de diferentes 
 concentraciones de EDLOVA en un gel de poliacrilamida 
 al 15% revelado con suero anti-OVA 
 
 
 
d) Peso y tamaño de los ganglios 
 
45 KDa 
30 KDa 
20.1 KDa 
14.3 KDa 
6.5 KDa 
 
3.5 KDa 
2.5 KDa 
 PM 1μg 1μg 5μg 10μg 
OVA EDLova 
 39
 Los ganglios se pesaron en una balanza analítica, para determinar si 
había diferencias entre los diferentes grupos, en la figura 12 se muestran 
los resultados. 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0
2
4
6
8
10
SS
OVA
EDLOVA
EDL
OVA-EDLOVA
OVA-EDL
días post-inmunización
pe
so
 d
el
 g
an
gl
io
 e
n 
m
g
 
FIGURA 12. Peso promedio de los ganglios inguinales de ratones que recibieron 
diferentes tratamiento de los días 9, 15 y 23 post-inmunización 
 
Como grupo testigo tenemos al grupo que solo recibió solución 
salina, en el cual no se esperaba más cambios que los que pudieran darse 
por el contacto con los antígenos ambientales, o por el crecimiento de los 
ratones. 
 El otro grupo control fue el grupo inmunizado con OVA en el día cero 
y 14, lo esperado es un aumento en el peso de los nódulos linfoides, 
reportando por Herman (P.G. Herman, I. Yamamoto, 1972); lo que 
observamos en nuestro modelo es un aumento al doble del peso, 
comparado con el grupo de solución salina, desde el día 9 post-
inmunización, alcanzando el peso máximo en el día 15 (aprox. tres veces 
más) el cual es estadísticamente significativo. 
 
Los ganglios de los ratones tratados con EDLOVA no muestran 
cambios en el peso con respecto al grupo testigo (SS). 
 
 40
 Los ganglios de los grupos de ratones que recibieron el tratamiento 
combinado, ya sea con EDLOVA o EDL disminuyeron el peso con respecto al 
grupo de OVA en los días 15 y 23, pero los ganglios del grupo que recibió 
EDLOVA como refuerzo pesan más que el grupo testigo; se observó que el 
efecto del EDL al igual que el EDLOVA como refuerzos incidió en un menor 
peso de los ganglios regionales. 
 
Con el fin de documentar los cambios en los ganglios regionales de 
los diferentes grupos se tomaron fotos de estos órganos. 
 
En las figuras 13, 14 y 15 se puede observar que los ganglios del 
grupo de OVA siempre son más grandes, los ganglios del grupo de EDLOVA 
se aprecian muy parecidos a los del grupo de SS, al igual que los del grupo 
de EDL y para los grupos combinados, los ganglios del grupo OVA-EDL se 
aprecian un poco más pequeños que los de OVA-EDLOVA. 
 
 
FIGURA 13. Ganglios regionales de los diferente grupos en el día 9 post-inmunización 
 
SS OVA
OVA-EDLova OVA-EDLEDL 
EDLova
 41
 
 FIGURA 14. Ganglios regionales de los diferentes 
 grupos en el día 15post-inmunización 
 
 
 
 FIGURA 15. Ganglios regionales de los diferentes 
 grupos día 23 post-inmunización 
 
 
 
 
e) Número de células de los ganglios inguinales de los diferentes 
grupos de ratones 
 
 Se realizó una cuenta de células totales de cada uno de los 
diferentes grupos, para llevarlo a cabo se realizó una mezcla de los 
ganglios de 3 ratones de cada grupo, se disgregaron, se contaron en 
cámara de Neubauer con azul tripano, después se saco un promedio por 
ganglio. 
OVA
OVA-EDLova OVA-EDLEDL
EDLovaSS
SS OVA 
OVA-EDLova OVA-EDLEDL 
EDLova 
 42
 
Observamos en la figura 16que el grupo control de estimulación, el 
grupo de OVA, muestra los resultados esperados, que son aumento en el 
número de células en el día 15 y 23 post-inmunización, estos concuerdan 
con los pesos de los ganglios. 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0
5.0×106
1.0×107
1.5×107
SS
OVA
EDLOVA
EDL
OVA-EDLOVA
EDL
días post-inmunización
N
o 
de
 c
el
ul
as
/g
an
gl
io
FIGURA 16. Comparación entre diferentes días post-inmunización del número 
 de células totales en los ganglios inguinales de los diferentes grupos. 
 
 
No se encontraron diferencias en el número total de células entre los 
grupos de SS y EDLOVA, sin embargo en este día es cuando los ganglios de 
EDLOVA tienen el mayor número de células. 
El grupo de EDL tampoco muestra un cambio en el número de 
células con respecto al grupo testigo 
 
Para los grupos combinados de OVA-EDLOVA u OVA-EDL se observa 
un aumento en el número de células totales, sin embargo el aumento no es 
como el del grupo control de SS, este aumento se mantiene en el grupo de 
OVA-EDLOVA en el día 15, pero disminuye en el día 23; para el grupo de 
OVA-EDL se mantiene el peso del día 9. 
 
 43
 
f) Formación de centros germinales 
 
 La tinción inmunohistoquímica para tratar de detectar CD40-L no 
fue positiva, probablemente porque la aparición de este ligando es 
transitoria, o probablemente el sistema de amplificación de la señal fue 
insuficiente. 
Por lo tanto para evidenciar la cooperación de los linfocitos T se 
realizó un doble marcaje, de células PNA positivas (linfocitos B en reacción 
de centro germinal) en color gris y células THY-1 positivas (linfocitos T) en 
color rojo; de esta manera podemos observar la translocación de los 
linfocitos T hacia los centros germinales (área de B) en el ganglio. 
 
En las figuras 17, 18 y 19 podemos observar que en el grupo de SS 
(testigo), la formación de centros germinales se da hasta el día 15 post-
inmunización, estos pueden ser consecuencia de los antígenos 
ambientales a los que están expuestos los ratones. 
 
El grupo de OVA (control de inmunización) desde el día 9 muestra 
centros germinales bien formados y de tamaño considerable, los cuales se 
mantienen hasta el día 23 (figuras 17, 18 y 19), como lo reportado por Liu 
en 1991. 
 
El grupo de EDLOVA también tiene formación de centros germinales 
desde el día 9, solo que estos son de menor tamaño que los del grupo de 
OVA, además de que también es menor el número de centros germinales 
por ganglio, estos centros germinales se mantienen hasta el día 23 sin 
aumentar de tamaño o en número (figuras 17, 18 y 19). 
 
 
 
 44
 
 FIGURA 17. Inmunohistoquímica para PNA en gris y THY-1 
en rojo de ganglio inguinal de los diferentes grupos, día 9 post-inmunización 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 FIGURA 18. Inmunohistoquímica para PNA en gris y THY-1 en 
 rojo de ganglio inguinal de los diferentes día 15 post-inmunización 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 FIGURA 19. Inmunohistoquímica para PNA en gris y THY-1 en 
 rojo de ganglio inguinal de los diferentes día 23 post-inmunización 
SS 10x OVA 10x 
EDLOVA 10x EDL 10x 
SS EDLOVA 10x
EDL 10x 
OVA 10x
OVA-EDLOVA 10x OVA-EDL 10x
SS 10x OVA 10x EDL
OVA 10x 
EDL 10x OVA-EDLOVA 10x OVA-EDL 10x 
 45
En el grupo de EDL se observan células PNA positivas en el día 9, 
sin embargo no se ve la formación de un centro germinal, para el día 15 se 
observa un mayor número de células PNA positivas, pero la formación de 
un centro germinal se observa hasta el día 23 post-inmunización (figuras 
17, 18 y 19). 
 
Para los grupos combinados observamos que los centros germinales 
que se forman son de mayor tamaño que los del grupo que solo fue 
inmunizado con OVA, sin embargo el grupo que recibió el refuerzo con 
EDLOVA tiene además mayor número de centros germinales (figura 21). 
 
 
Estas tinciones se realizaron con la finalidad de además de observar 
la formación de los centros germinales, se pudiera distinguir si los 
linfocitos T estaban moviéndose hacia la zona B, lo cual estaría reflejando 
de manera indirecta la cooperación. 
 
En la figura 20 se puede observar que hay linfocitos T dentro del 
centro germinal desde el día 9 en el control de estimulación (grupo de 
OVA) y también logramos ver a los linfocitos T en el centro germinal del 
grupo de EDLOVA en el día 15 y 23 post-inmunización. 
FIGURA 20. Centros germinales de los ganglios regionales de los grupos de OVA y 
EDLOVA con linfocitos B PNA+ (gris) y linfocitos T Thy-1+ (rojo) a un aumento de 40x. 
 
EDLOVA día 23, 40x OVA día 9, 40x EDLOVA día 15, 40x 
 46
En la figura 21 podemos observar que no hay diferencias entre el 
grupo de EDLOVA y el grupo de SS, sin embargo el grupo de EDLOVA 
muestra una tendencia a un mayor número de centros germinales en el 
día 15 post-inmunización comparado con los grupos de SS y de EDL. 
 
El número de centros germinales fue estadísticamente diferente, por 
la prueba de Tukey con una p≤0.0001, para los grupos de OVA, OVA-
EDLOVA y OVA-EDL con respecto al testigo, el grupo de EDLOVA y EDL, cabe 
destacar que los centros germinales del grupo OVA-EDLOVA fueron más 
grandes que los de los otros grupos. 
 
 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0
5
10
SS
OVA
EDLOVA
EDL
OVA-EDLOVA
OVA-EDL
 * * *
 * *Días post-inmunización
N
o 
de
 c
en
tr
os
 g
er
m
in
al
es
 P
N
A
+ 
po
r 
ga
ng
lio
 
 FIGURA 21. Promedio del número de centros germinales en el ganglio inguinal de los 
 diferentes grupos en diferentes días post-inmunización p≤0.0001 
 
 
 
 
 47
g) Caracterización de las poblaciones linfocitarias en el ganglio 
regional 
 
 En la figura 22 se observa el análisis de las poblaciones linfocitarias 
del ganglio regional en los mismos días post-inmunización que se han 
estado analizando, a continuación se muestran las gráficas de los 
promedios de 3 diferentes experimentos de los cuales cada día es una 
mezcla de 3 ganglios de diferentes ratones cada uno. 
 
Como podemos observar en la figura 22, no hay diferencias en las 
células CD3 positivas del ganglio regional, debido a que el número de 
células obtenido en cada uno de los diferentes experimentos no es el 
mismo y por este motivo la variación es grande, sin embargo se puede 
observar una tendencia de un mayor número de células en los grupos de 
OVA y OVA-EDLOVA, sin embargo el grupo que solo recibió EDLOVA se 
observa prácticamente igual al de SS. 
 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0
5000000
10000000
SS
OVA
EDLova
EDL
OVA-EDLova
OVA-EDL
Días post-inmunización
N
o 
de
 c
el
ul
as
 C
D
3+
 /g
an
gl
io
 
 FIGURA 22. Promedio de 3 experimentos de células CD3+ en el ganglio regional de 
los diferentes grupos en diferentes días post-inmunización 
 
 
 48
 En las figuras 23 y 24 observamos las gráficas de las células CD4+ y 
CD8+, tampoco hay una diferencia entre los diferentes grupos, aunque 
nuevamente se observa esa tendencia de un mayor número de células 
tanto en las CD4+ como en las CD8+ en los grupos OVA y OVA-EDLOVA en 
los días 15 y 23 post-inmunización y los otros grupos nuevamente se 
observan prácticamente iguales. 
 
 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0.0
2000000.0
4000000.0
6000000.0
8000000.0
SS
OVA
EDLova
EDL
OVA-EDLova
OVA-EDL
Días post-inmunización
N
o 
de
 c
el
ul
as
 C
D
4+
 / 
ga
ng
lio
 
 FIGURA 23. Promedio de tres experimentos de células CD4+ en el ganglio 
 regional de los diferentes grupos, en diferentes días post-inmunización 
 
 
 
9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23 9 15 23
0
1000000
2000000
3000000
SS
OVA
EDLova
EDL
OVA-EDLova
OVA-EDL
Días post-inmunización
N
o 
de
 c
el
ul
as
 C
D
8+
 / 
ga
ng
lio

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