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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TESIS Presentada para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS por Andrea Tovar Aguilar Ingeniero en Biotecnología “Diseño y construcción de vectores de expresión para el estudio de microRNAs con implicaciones en mejoramiento genético de semillas Arabidopsis thaliana" Dirigida por Dr. Noé Valentín Durán Figueroa Dr. Jesús Agustín Badillo Corona México, D.F., Enero de 2012 i ii iii iv Créditos El trabajo de esta tesis fue realizado en el Laboratorio de posgrado de Biotecnología Molecular, el cual incluye el Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del RNA del Departamento de Bioprocesos de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Noé Valentín Durán Figueroa y del Dr. Jesús Agustín Badillo Corona; con la asesoría del Dr. Edgar Salgado Manjarrez y del Dr. Juan Aranda Silvestre y como asesor externo la Dra. Berenice García Ponce de León. Durante el desarrollo de esta tesis se obtuvo el apoyo del CONACyT a través de la beca de Maestría con número de registro 386174, el financiamiento para la ejecución del proyecto fue posible gracias al apoyo SIP-20121693, CONACyT- 184245 para el Dr. Noé Valentín Durán Figueroa v Comité tutorial Dr. Noé Valentín Durán Figueroa* Director de tesis Dr. Jesús Agustín Badillo Corona* Director de tesis Dr. Edgar Salgado Manjarrez * Asesor de tesis Dr. Juan Aranda Silvestre* Asesor de tesis Dra. Berenice García Ponce de León ** Asesor de tesis * Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional ** Instituto de Ecología- Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM vi AGRADECIMIENTOS. Al Dr. Agustín Badillo Corona por permitirme integrarme a su equipo de trabajo, por el apoyo recibido para poder realizar este proyecto, por su paciencia, tiempo y comentarios que hacen que sea una mejor estudiante. Al Dr. Noé Valentín Durán Figueroa por su gran apoyo durante la realización de este proyecto, por su paciencia durante la enseñanza y por la confianza que me ha brindado para realizar un excelente trabajo. A mi comité tutorial integrado por el Dr. Edgar Salgado Manjarrez, Dr. Juan Aranda Silvestre y la Dra. Berenice García Ponce de León por sus observaciones durante los tutoriales y comentarios constructivos de la tesis realizada. A mi mamá y hermanos que siempre me han apoyado en realizar mis metas, en especial a Dania y Denise que llenan mi vida de inmensa felicidad. A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología Molecular, especialmente a mis amigas Alma, Flor, Jessy, Karla y Valeria por la enseñanza en el lab así como por los momentos compartidos durante estos dos años que han sido inolvidables. vii Índice de Contenido RESUMEN .......................................................................................................................................... xii ABSTRACT .......................................................................................................................................... xiii I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1 II. ANTECEDENTES. ................................................................................................................... 3 2.1 Biogénesis de microRNAs .................................................................................................... 3 2.2 Desarrollo del Gametofito femenino .................................................................................. 4 2.2.1 La doble fecundación ........................................................................................................ 5 2.3 Apomixis ............................................................................................................................. 7 2.3.1 Aplicaciones biotecnológicas de la apomixis ............................................................. 7 2.4 Función y estructura de las proteínas ARGONAUTA ........................................................ 8 2.4.1 Características del dominio PIWI ................................................................................ 9 2.4.2 Características del dominio PAZ .................................................................................. 9 2.5 Papel de la ARGONAUTA9 en la gametogénesis femenina ...................................... 10 2.6 Función de los miRNAs en plantas ................................................................................... 10 III. HIPÓTESIS ........................................................................................................................... 12 IV. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................... 13 V. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 14 5.1 General ................................................................................................................................. 14 5.2 Específicos ............................................................................................................................ 14 VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 15 6.1 Diagrama General ............................................................................................................... 15 6.2 MATERIALES ........................................................................................................................ 15 6.2.1 Reactivos. ......................................................................................................................... 15 viii 6.2.2 Medios de Cultivo para bacterias y plantas ................................................................. 16 6.2.3 Cepas bacterianas utilizadas ......................................................................................... 16 6.2.4 Plásmidos utilizados ........................................................................................................ 16 6.2.5 Herramientas Bioinformáticas utilizadas ...................................................................... 17 6.2.6 Diseño de iniciadores...................................................................................................... 18 6.2.7 Material biológico ............................................................................................................ 20 6.2.7.1 Germinación de semillas y crecimiento de plántulas ......................................... 20 6.3 MÉTODOS ............................................................................................................................. 20 6.3.1 Preparación de células calcio-competentes ............................................................ 20 E. coli TOP10 y DHα5 ............................................................................................................. 20 Agrobacterium tumefaciens ................................................................................................... 21 6.3.2 Extracción de DNA genómico .................................................................................... 21 6.3.3 Extracción de DNA plasmídico a partir de bacterias transformadas ................... 22 6.3.4 Condiciones generales del PCR para Amplificación de la Región más Probable del Promotor (RGPM) ................................................................................................................. 23 6.3.5 Purificación a partir de gel de Agarosa.................................................................... 23 6.3.6 Construcción de vectores pBluescript y pBI ................................................................ 24 6.3.6.1 Subclonación de la RGMP en el vector pBS ........................................................ 24 6.3.7 Construcción del vector pBI con la RGMP ............................................................... 25 6.3.8 Inserción de la RGMP::GUS en Agrobacterium tumefaciens ................................ 25 6.3.9 Transformación de Arabidopsis thaliana por inmersión floral .............................. 26 6.3.10 Selección de semillas transformadas ........................................................................... 27 6.3.11 Buffer de Fosfatos para la tinción GUS ........................................................................ 27 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................. 28 7.1 Selección de miRNAs interactores de AGO9 ................................................................... 28 7.2 Análisis bioinformáticos de elementos cis ....................................................................... 29 ix 7.3 Localización de miRNAs en el genoma de Arabidopsis ................................................. 29 7.4 Datos de expresión de los miRNAs en el genoma de Arabidopsis thaliana ............... 31 7.5 Estrategia de construcción de vectores ........................................................................... 36 7.5.1 Digestiones enzimáticas de las RGMP en pBS ........................................................ 38 7.6 Construcción de las fusiones transcripcionales RMPM::GUS ........................................ 41 7.6.1 Fusión transcripcional RGMP::GUS ........................................................................... 43 7.6.1.1 Caso del miR822 y miR858 .................................................................................... 43 7.6.1.2 Caso del miR157, miR159 y miR867 .................................................................... 45 7.7 Confirmación por PCR de la transformación de Agrobacterium ................................... 46 7.8 Transformación de Arabidopsis por el método de inmersión floral ............................. 48 7.9 Selección de semillas candidatas positivas ..................................................................... 49 7.9.1 Germinación de semillas en medio selectivo .............................................................. 50 7.10 Análisis de la expresión de GUS en tejido de Arabidopsis ............................................ 52 VIII. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 54 IX. PERSPECTIVAS .................................................................................................................... 55 Índice de figuras Figura 1. Ruta de la Biogénesis de miRNAs en plantas. ............................................................. 3 Figura 2. Desarrollo del gametofito femenino en Angioespermas. ........................................... 5 Figura 3. Desarrollo de gametos en plantas sexuales y apomícticas. ....................................... 6 Figura 4. Estructura de la proteína Ago2 humana. ...................................................................... 8 Figura 5. Estructura del dominio PIWI. ......................................................................................... 9 Figura 6. Cristalografía del dominio PAZ de la proteína AGONAUTA. ..................................... 10 Figura 7. Esquema del vector pBS. .............................................................................................. 17 Figura 8. Representación gráfica de la selección de la RGMP. ................................................ 18 Figura 9. Análisis de elementos cis de la RGMP. ........................................................................ 29 x Figura 10. Localización genómica de miRNAs en Arabidopsis thaliana. ................................. 31 Figura 11. Datos de expresión del gen de Ubiquitina en Arabidopsis. ................................... 32 Figura 12. Análisis de la expresión de miRNAs interactores de AGO9 en el desarrollo de Arabidopsis thaliana. ...................................................................................................................... 34 Figura 13. Análisis de la expresión de miRNAs en los diferentes tejidos de Arabidopsis thaliana. ............................................................................................................................................ 35 Figura 14. Gradiente de temperaturas para amplificar la RGMP del miR390. ....................... 36 Figura 15. PCR de la RGMP de miRNAs. ...................................................................................... 37 Figura 16. Estructura de pBS con la RGMP. ................................................................................ 37 Figura 17. Obtención de DNA plasmídico por la técnica de Lisis alcalina. ............................. 38 Figura 18. Restricciones enzimáticas. .......................................................................................... 39 Figura 19. Restricciones enzimáticas. .......................................................................................... 40 Figura 20. Digestiones enzimáticas con HindIII y XbaI en pBS. ............................................. 40 Figura 21. Estructura de las fusiones transcripcionales RGMP::GUS. ..................................... 41 Figura 22. Patrón de digestión de pBI. ........................................................................................ 42 Figura 23. Diagrama de las construcciones RGMP::GUS. ......................................................... 43 Figura 24. Patrón de digestión del miR822 con EcoRV. ............................................................ 43 Figura 25. Patrón de digestión del miR858 con EcoRV. ............................................................ 44 Figura 26. Restricciones con las enzimas HindIII y XbaI. ........................................................ 44 Figura 27. Digestiones enzimáticas con HindIII y XbaI. ........................................................... 45 Figura 28. Diseño de Inciadores antisentido GUS y sentido pBI. ............................................ 45 Figura 29. PCR de RGMP::GUS con iniciadores específicos...................................................... 46 Figura 30. Amplificación por PCR de la RGMP en Agrobacterium. .......................................... 47 Figura 31. Amplificación de la RGMP por PCR en Agrobacterium. .......................................... 47 Figura 32. Crecimiento de Arabidopsis thaliana en condiciones de invernadero. ................. 49 Figura 33. Geminación de semillas en medio selectivo. ........................................................... 49 Figura 34. Germinación de semillas de Arabidopsis. ................................................................. 50 Figura 35. Selección de plántulas posiblemente transformadas del miR858. ........................ 51 Figura 36. Selección de plántulas posiblemente transformadas del miR157. ........................ 52 Figura 37. Tejido colectado de Arabidopsis para analizar la expresión de GUS. .................. 52 Figura 38. Análisis de la expresión de miRNAs en Arabidopsis del miR858. ......................... 53 xi Figura 39. Análisis de la expresión de miRNAs en Arabidopsis del miR157. ......................... 53 Índice de tablas Tabla 1. Lista de iniciadores para amplificar la RGMP de miRNAs .......................................... 19 Tabla 2. Lista de miRNA seleccionados y descripción de su gen blanco ................................ 28 Tabla 3. Elementoscis analizados de la RGMP de miRNAs interactores de AGO9 ............... 30 Tabla 4. Tabla de anotación de genes MIR. ............................................................................... 31 Tabla 5. Datos de expresión de miRNAs interactores de ARGONAUTA9 ............................... 33 Tabla 6. Resumen de vectores construidos con la RGMP de miRNAs. ................................... 48 xii RESUMEN La apomixis es un método de reproducción asexual a través de semillas, en la actualidad existe un gran interés de lograr inducir este tipo de reproducción en plantas de interés agrícola. En 2010 se publicó la existencia de una proteína llamada ARGONAUTA9 en la planta modelo Arabidopsis thaliana, la cual presenta un fenotipo similar al de plantas apomícticas puesto que se demostró regula la formación de los precursores de los gametos femeninos, AGO9 pertenece a un grupo de proteínas llamadas ARGONAUTA las cuales interactúan con moléculas de RNA no codificante (sRNAs) en distintos procesos de silenciamiento a nivel transcripcional y postranscripcional, regulando la expresión de genes por complementariedad de secuencias. Recientemente, miRNAs han sido asociados a la formación de gametos, semillas y embriones, principalmente microRNAs interactores de la proteína AGO9 se han sugerido participan en la regulación de la gametogénesis femenina. En este trabajo se realizó la construcción de vectores de expresión a los cuales se les insertó la Región Genómica Más Probable del promotor (RGMP) del miRNA fusionada al gen reportero GUS, lo que permitió observar la actividad del promotor de cada gen miR y deducir la expresión espacial y temporal del miRNA interactor de AGO9. Para esto se clonaron 13 RGMP en el vector pBS y a partir de esas clonaciones de logró hacer la construcción en el vector pBI de 5 RGMP::GUS. Se transformaron plantas silvestres (Wt) de Arabidopsis por el método de inmersión floral por infección de Agrobacterium tumefaciens con las construcciones del miR858 y miR157, la tinción GUS mostró que el miR858 se expresa en distintos tejidos de Arabidopsis thaliana como hoja, silicuas y pétalos; mientras tanto el miR858 se observó su expresión en anteras, estos resultados fueron comprobados por PCR con oligos específicos para amplificar la RGMP y el gen uidA. En conclusión, se generaron plantas transgénicas que contienen la RGMP de dos miRNAs fusionada al gen GUS que permiten evaluar la expresión en espacio (tejido) y tiempo (estado de desarrollo) específicos. xiii ABSTRACT Apomixis is a method of asexually reproduction through of seeds, there is currently great interest in achieving induce this type of reproduction into agronomical crops. In 2010 was published the existence of ARGONAUTE9 (AGO9) protein in the model plant Arabidopsis thaliana; AGO9 protein controls female gamete formation by restricting the specification of female gametophyte precursors, the mutant ago9 has a phenotype similar to apospory-apomictic plants. ARGONAUTE proteins bind to small regulatory RNAs, which are key posttranscriptional regulators of eukaryotic gene expression by complementary sequences. Recently, microRNAs (miRNAs) have been associated with the formation of gametes, seeds and embryos. miRNAs interactors of AGO9 are suggested involved in regulation of female gametogenesis and therefore, in apomixis mechanisms. In this work, was carried out the design and construction of expression vectors with the promoter genomic region (RGMP) of miRNAs, RGMP was fused to GUS reporter gene, promoter activity was observed for each gene and deduce miR spatial and temporal expression of miRNA AGO9 interactor. 13 RGMP were cloned in the subcloning vector pBS, the RGMP from these clones was used to make the construction with the pBI vector of 5 RGMP::GUS. We used the floral-dip method for Arabidopsis transformation using an Agrobacterium tumefaciens cell culture. miR157 and miR858 GUS staining showed that miR858 expressed in different tissues of Arabidopsis thaliana like leaf, petal and siliques; meanwhile the miR858 expression was observed in anthers. These results were checked by PCR with primers specific for amplifying the RGMP and the uidA gene. In conclusion, we generated transgenic plants containing the two RGMP of miRNAs fused to GUS gene expression for to evaluate the spatial and temporal expression in Arabidopsis thaliana. 1 I. INTRODUCCIÓN En el genoma de plantas y animales existen secuencias de RNA no codificante que regulan procesos de desarrollo, diferenciación y respuesta a estrés. Particularmente se ha comprobado con claridad el papel que juegan los RNAs pequeños (sRNAs) en diversos procesos biológicos. Así, amplia evidencia demuestra que los sRNAs son responsables del silenciamiento de genes por complementariedad de secuencias con su gen blanco y actúan junto a su pareja, la proteína ARGONAUTA (AGO) que los une, para regular la expresión genética a nivel transcripcional y postranscripcional. Los sRNAs se pueden dividir principalmente en 3 clases: piRNAs de 28-30 nucleótidos (nt) que son de expresión preferencial en líneas germinales y siRNAs de 21-24 nt presentes tanto en plantas como animales y los microRNAs (miRNAs) de 21-22 nt con funciones clave en fenómenos de identidad celular. Ensayos realizados en la planta modelo Arabidopsis thaliana han demostrado que la proteína AGO9 está asociada al fenómeno llamado apomixis, que es una forma de reproducción asexual mediante la formación de semillas. Se sabe que en la mutante de este gen se presenta un fenotipo similar al de plantas apomícticas. Esto ha permitido elucidar un nuevo mecanismo de reproducción entre plantas sexuales a asexuales y por lo tanto convierte al fenómeno de importancia esencial en la biotecnología moderna ya que plantea la posibilidad de inducir apomixis en plantas de interés agrícola como maíz, trigo y arroz. Por lo anterior, es importante conocer cuáles son los mecanismos moleculares que regulan la formación de gametos en plantas ya que existen miRNAs que son interactores de AGO9 que han sido asociados en la regulación de la formación del gameto femenino. Resulta clave conocer la función biológica que tiene cada miRNA interactor de AGO9 en la formación de semillas, para ello es necesario el conocimiento preciso de su expresión espacial y temporal que tienen en la planta modelo Arabidopsis thaliana. 2 Una de las estrategias para estudiar la expresión espacial y temporal de miRNAs en tejido reproductivo de Arabidopsis es a través de su promotor fusionado a un gen reportero que delate la expresión del mismo. En este trabajó se realizó la construcción de vectores de expresión para analizar la expresión de miRNAs que interactúan con AGO9, a través de la transformación de Arabidopsis mediante la infección por Agrobacterium tumefaciens. La expresión del miR157 y miR858 se analizó a través de la expresión de GUS en donde se observó la expresión en anteras, frutos (silicuas) y hojas. 3 II. ANTECEDENTES. 2.1 Biogénesis de microRNAs La mayoría de los miRNAs se producen a partir de regiones intergénicas conocidos como genes MIR, estas regiones son trascritas por la RNA Pol II generando un RNA largo llamado pri-miRNA, este transcrito formado es procesado por una proteína de unión a RNA llamada DAWDLE (DDL) la cual se ha sugerido que estabiliza el transcrito y lo conduce hacia los cuerpos nucleares llamados “D bodies”, en donde es procesado por un complejo proteico compuesto por las proteínas SE (SERRATE), HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1) una proteína de unión a RNA de doble cadena, Dicer-Like 1 (DCL1) y CBC una proteína de unión a Cap. Figura 1. Ruta de la Biogénesis de miRNAs en plantas. (a) A partir de regiones intergénicas la RNA Pol II genera un trascrito llamado pri-miRNA que es procesado por un complejode proteínas formando un dsRNA que forma una estructura “tallo y asa”, posteriormente DCL1 corta el fragmento generando el dúplex miRNA-miRNA*. (b) El dúplex en transportado hacia el citoplasma en donde AGO carga a miRNA. 4 Este complejo genera un RNA de doble cadena (dsRNA), que se pliega a si mismo generando una estructura “tallo y asa” llamado pre-miRNA que es cortado por DCL1 generando fragmentos de 21 nt formando un dúplex que es conocido como miRNA-miRNA*, el dúplex es metilado en el extremo 3’OH por una metiltransferasa llamada HEN1 (Figura 1a). Una vez metilado el dúplex es exportado hacia el citoplasma por HASTY, una exportina nuclear y el miRNA es cargado por la proteína ARGONAUTA para llevar a cabo el proceso de silenciamiento, el miRNA* se ha comprobado que es degradado por una nucleasa SDN (Voinnet 2009) (Figura 1b). 2.2 Desarrollo del Gametofito femenino El desarrollo del gametofito femenino ocurre en dos etapas, la megasporogénesis y la megagametogénesis, el desarrollo comienza a partir de la diferenciación de una célula sub-epidérmica de la capa L2, en la célula madre de la megasporas (MMC), posteriormente ocurre un proceso de meiosis formando cuatro núcleos haploides de los cuales 3 degeneran y uno sobrevive que se le conoce como megaspora funcional (FM) (Figura 2). A partir de este paso comienza la megagametogénesis en donde la FM es sometida a 3 rondas de mitosis sin citokinesis generando una estructura con 8 núcleos llamada syncytium, posteriormente se lleva a cabo un proceso de celularización y diferenciación para dar lugar al gametofito femenino o saco embrionario (Chevalier et al., 2011). Los óvulos son el órgano sexual femenino en Arabidopsis, al igual que otras plantas con flores el gametofito femenino de Arabidopsis presenta una estructura que es característica de las angiospermas llamado Polygonum (Friedman et al., 2009). La estructura del gametofito o saco embrionario presenta 7 células de cuatro tipos celulares: tres antípodas, dos sinérgidas, una célula central 2n (CC) que dará lugar al endospermo y una célula huevo 1n (CH) que formará el embrión. 5 Figura 2. Desarrollo del gametofito femenino en Angioespermas. Iniciación de la megasporogenesis y megagametogénesis en Arabidopsis. La diferenciación de la MMC da lugar a la FM, a través de 3 rondas de mitosis se genera una estructura conocida como syncytium, posteriormente se lleva a cabo un proceso de celularización y diferenciación que da lugar al gametofito femenino. Imagen tomada de Chevalier et al., 2011. 2.2.1 La doble fecundación La mayoría de las angiospermas forman semillas a través de un proceso que es conocido como doble fecundación; este proceso es necesario para llevar a cabo la formación de semillas. Los gametos masculinos y femeninos en plantas son llamados gametofitos femenino y masculino respectivamente, el gametofito masculino se encuentra contenido en el polen que contiene en su estructura dos células espermáticas contenidas dentro de una célula vegetativa, una vez que los granos de polen germinan, las células espermáticas viajan a través del tubo polínico hasta llegar al gametofito femenino para llevar a cabo la doble fecundación. Por el contrario la estructura del saco embrionario contenido dentro del óvulo como ya se ha mencionado está constituido por siete células, dos sinergidas que participan en la atracción del tubo polínico, tres células antípodas de función desconocida, una célula huevo que dará lugar al embrión después de ser fecundado por una de las dos células espermáticas y la célula central que fecundada por la célula espermática restante formará el endospermo dando lugar 6 a la formación de semillas. Este proceso es conocido como doble fecundación ya que se necesitan dos células masculinas que fecunden a dos células femeninas para llevar a cabo la formación de semillas maduras (Schmidt et al., 2011). Figura 3. Desarrollo de gametos en plantas sexuales y apomícticas. El desarrollo del gametofito femenino en plantas sexuales comienza con la diferenciación de una célula epidérmica en la MMC, generando 4 núcleos haploides, 3 degeneran y uno sobrevive. Ocurren tres rondas de mitosis sin citokinesis, ocurre un proceso de celularización y diferenciación formando al gametofito femenino. Formación de gametos femeninos en plantas apomícticas (apomixis apospórica, dipospórica) y a partir de células somáticas de óvulos. Imagen tomada de Rodríguez-Leal y Vielle-Calzada 2012. 7 2.3 Apomixis La formación de semillas de forma asexual es conocida como apomixis, este tipo de reproducción es característica ya que la descendencia de estas plantas es idéntica a las plantas progenitoras, este es un método de clonación natural a través de semillas. Las plantas apomícticas se diferencian de las plantas que se reproducen de manera sexual en que en la apomixis se pueden formar embriones sin llevar a cabo meiosis y sin tener la necesidad de ser fecundados por las células espermáticas puesto que la planta tiene la capacidad de formar el embrión de manera autónoma (Shi y Yang 2010). Se pueden distinguir dos principales formas de apomixis, la primera es en la que se pueden formar embriones a partir de células somáticas de óvulos y la segunda, donde se pueden formar sacos embrionarios no reducidos producto de una división meiótica aberrante que evita la reducción cromosómica (apomixis diplospórica) o directamente de células somáticas del óvulo (apomixis apospórica) (Figura 3) (Rodríguez-Leal y Vielle-Calzada 2012). La apomixis puede coexistir con la reproducción sexual en el mismo óvulo o en diferentes óvulos del mismo individuo, lo que sugiere que la apomixis se pudo haber originado como una modificación de la reproducción sexual (Koltunow y Grossniklaus, 2003). 2.3.1 Aplicaciones biotecnológicas de la apomixis La gran importancia que representa la elucidación de los mecanismos que regulan la gametogénesis resulta de gran importancia por la aplicación que se puede generar. Ya que en la apomixis se obtienen embriones idénticos a la planta progenitora, representa un gran potencial para proveer de manera constante fuentes renovables de semillas comestibles que se producirán en cantidades y a través de las generaciones, por lo tanto se tendría la perpetuidad de las especies conservando las características por medio de la reproducción a través de semillas “apomícticas” (Koltunow 1993). 8 2.4 Función y estructura de las proteínas ARGONAUTA La regulación de la expresión de genes mediante sRNAs viene dada por mecanismos de silenciamiento a nivel transcripcional (TGS) y postranscripcional (PTGS) en donde las proteínas ARGONAUTA (AGO) participan, estos mecanismos de silenciamiento son conservados en organismos procariotes y eucariotes resultando esenciales para mantener la integridad del genoma. Las proteínas AGO unen sRNAs no codificantes de 20 a 30 nt de tamaño, juntos participan en el silenciamiento de genes por la complementariedad de secuencias. Las proteínas AGO tienen multidominios que son conservados: PAZ, MID y PIWI. El dominio PAZ de unión a RNA localizado en la región amino terminal, el PIWI de actividad endonucleasa localizado en el extremo Carboxilo Terminal y el MID el cual funge como sitio alostérico para regular la unión a microRNAs, el dominio MID ancla el extremo 5’ del RNA pequeño. En las proteínas AGO reside un sitio catalítico de endonucleasa, el cual corta el RNA de cadena sencilla (Mallory y Vaucheret, 2010). Figura 4. Estructura de la proteína Ago2 humana. (A) Esquema de la secuencia primaria de Ago2. (B) Estructura obtenida por cristalográfica de la proteína AGO. Imagen tomada de Schirle y MacRae 2012. La Figura 4 muestra la estructura cristalográfica de la proteína Ago2 humana, la diferencia en las proteínas AGO de procariotes y eucariotes difiere principalmente9 en las posiciones de los dominios que son conservados, además se demostró que en Ago2 humana existen dominios L1 y L2 que funcionan como ligas entre los dominios N, PAZ, MID y PIWI (Schirle y MacRae 2012). 2.4.1 Características del dominio PIWI El dominio PIWI pertenece al grupo de la familia de la RNasa H, en el núcleo del dominio PIWI se encuentra una estructura terciaria que es característica de la familia de las enzimas RNasas H (Figura 5). El plegamiento que presenta también es característico de otras enzimas con actividad de nucleasas, lo que ha permitido adoptar a algunas proteínas AGO la actividad “Slicer” como mecanismo de silenciamiento del gen al reprimir la expresión de la proteína ya que corta el mRNA en el complejo formado por RISC (Song et at., 2004). Figura 5. Estructura del dominio PIWI. Diagramas del domino de RNasa de E. coli HI y de Methanococcus jannaschii RNasa HII; estructuras que presentan similitud con la estructura secundaria de elementos de la RNasa H. Imagen tomada de Song et al., 2004. 2.4.2 Características del dominio PAZ Uno de los dominios conservados en las proteínas AGO es el dominio PAZ nombrado así después que se observó la presencia de tres proteínas que contenían este dominio (Piwi, Argonauta y Zwille) el cual consiste en ~130 aminoácidos, localizándose solo en dos familias de proteínas, Argonauta y Dicer; el dominio PAZ 10 presenta una mayor afinidad por unir RNA que DNA (Song y Joshua-Tor, 2006). Análisis estructurales y bioquímicos del dominio PAZ han demostrado que AGO en el complejo de silenciamiento RISC interactúa de manera directa con el sRNA, además que presenta una forma de plegamiento OB (oligonucleotide/oligosaccharide-binding) en donde se encuentran localizados residuos aromáticos conservados que unen el extremo 3’ de la cadena sencilla (Lingel et al., 2003) (Figura 6). Figura 6. Cristalografía del dominio PAZ de la proteína AGONAUTA. Estructura cristalográfica de dominio PAZ. Imagen tomada de Song y Joshua-Tor, 2006 2.5 Papel de la ARGONAUTA9 en la gametogénesis femenina Estudios transcriptómicos del óvulo de Arabidopsis thaliana han evidenciado el papel relevante que tiene AGO9 en la formación de gametos en Arabidopsis, la primera evidencia fue publicada por Olmedo-Monfil et al., 2010 en donde se demuestra que el gen AGO9 tiene altos niveles de transcripción en óvulos silvestres y nulos en tejidos vegetativos. 2.6 Función de los miRNAs en plantas Los miRNAs juegan un papel importante en distintos procesos de regulación de genes a nivel post-transcripcional. A pesar de que se ha demostrado su 11 participación en distintos procesos de silenciamiento de genes en plantas y animales se conoce poco de los mecanismos que regulan el silenciamiento de genes a nivel transcripcional por la vía de miRNAs. Para elucidar los mecanismos transcripcionales por los cuales se lleva a cabo la regulación de genes se han realizado análisis bioinformáticos de distintas especies como Caenorhabditis elegans, Homosapiens, Arabidopsis thaliana y Oryza sativa a través del análisis de su promotor, lo que ha permitido demostrar que existe una similitud entre los genes de los miRNAs de estas cuatro especies ya que se demostró que los genes de estos miRNAs tienen el mismo tipo de promotores así como las proteínas que codifican para los mismos genes. La caracterización de estos promotores han permitidos descubrir que existen elementos conservados como la Caja TATA a través de las diferentes especies, los análisis en la planta modelo Arabidopsis thaliana han permito predecir la región promotora del miRNA, pues se ha demostrado que con solo seleccionar 500 pb río arriba del gen del miRNA existen los elementos suficientes para predecir la secuencia que corresponda el promotor de miRNA (Zhou et al., 2007). 12 III. HIPÓTESIS Existen microRNAs interactores de la proteína ARGONAUTA9 de Arabidopsis thaliana que se expresan en diferentes estados de desarrollo en el tejido reproductivo femenino, de acuerdo a su patrón de expresión estos microRNAs pueden tener una función biológica relevante en el control de la gametogénesis femenina. 13 IV. JUSTIFICACIÓN Las plantas comestibles como el maíz, trigo y arroz forman semillas de manera sexual a través de un proceso conocido como doble fecundación en donde se pierden o se ganan características de las plantas progenitoras, lo anterior provocado por la combinación de material genético que se lleva a cabo en la reproducción sexual. En la naturaleza existe una amplia variedad de plantas que se reproducen de manera autónoma es decir de manera asexual, este es un método de clonación natural a través de semillas conocido como apomixis que se presenta en una gran diversidad de plantas Uno de los mayores retos de la Biotecnología Agrícola ha sido la inducción en plantas de interés agrícola del mecanismo que provoca que se reproduzcan de manera asexual llamado apomixis; de modo que se ha demostrado que existen RNAs pequeños que regulan este proceso, principalmente miRNAs interactores de AGO9 se sugiere regulan diversas etapas del proceso de desarrollo del gameto femenino y masculino en Arabidopsis, la importancia de elucidar cuales son los mecanismos moleculares que regulan la gametogénesis mediados por miRNAs es de vital importancia para el fin que se ha propuesto ya que así se logrará mantener las características requeridas heredándolas generación tras generación. 14 V. OBJETIVOS 5.1 General Diseñar y construir vectores de expresión con la región promotora de genes MIR para estudiar la expresión de microRNAs interactores de ARGONAUTA9 en Arabidopsis thaliana. 5.2 Específicos Determinar en el genoma de Arabidopsis thaliana la región genómica más probable del promotor (RGMP) de los genes MIR. Amplificar por PCR y clonar las RGMP de los genes MIR en vectores de expresión para construir fusiones transcripcionales promotor miRNA::GUS. Transformar genéticamente mediante Agrobacterium tumefaciens la planta modelo Arabidospsis thaliana con al menos un vector promotor miRNA::GUS y generar una línea transgénica estable. 15 VI. MATERIALES Y MÉTODOS La metodología que se siguió se muestra a continuación, se dividió en tres etapas consecutivas que describen de manera general lo realizado en el presente trabajo. 6.1 Diagrama General 6.2 MATERIALES 6.2.1 Reactivos. Los reactivos utilizados fueron: AGAROSA grado molecular de Vivantis, Extracto de levadura y Triptona de Becton-Dickinson, Agar bacteriológico, Extracto de carne de Bioxon, Tris de Bio Basic Inc., Cloruro de Sodio (NaCl), Acetato de potasio, Glucosa Anhidra, EDTA, UREA, y Ácido acético glacial de Alta Pureza Maquiladora (México), Hidróxido de Sodio (NaOH), Lauril Sulfato (SDS), K3[Fe(CN)6] y K4[Fe(CN)6]*3H2O de Sigma y X-GLUC de Gold Biotechnology (USA). Las enzimas utilizadas fueron HindIII (#ER0501), XbaI (#R0145L), SalI, SmaI (#ER0661), EcoRV (#ER0301), T4 DNA Ligasa y Buffer de carga, fueron adquiridos de Fermentas y BioLabs. ETAPA 1 - Análisis de las secuencias de los miRNAs con el genoma de Arabidopsis thaliana. -Detección de la RGMP del miRNA a través de programas bioinformáticos ETAPA 2 - Amplificación por PCR de la RGMP del miRNA - Construcción de vectores a partir de los productos obtenidos de PCR ETAPA 3 - Trasformación de Agrobacterium tumefaciens . - Transformación de A. thaliana por el método de inmersión floral. - Detección de los genes MIR 16 6.2.2 Medios de Cultivo para bacterias y plantas Medio MS (Murashige and Skoog). Mezcla basal de sales (0.43%w/v), sacarosa (3%w/v), agar (0.7%w/v). El pH se ajustó a 5.9 con HCl. El medio se esterilizó en autoclave por 15 min a 121°C y 15 psi. Medio LB (Luria-Bertani). Triptona (1%w/v),extracto de levadura (0.5%w/v), NaCl (1%w/v). El pH se ajustó a 7.0 con NaOH. El medio se esterilizó en autoclave por 15 min a 121°C y 15 psi. Medio YEB. Extracto de levadura (1 g L-1), extracto de carne (5 g L-1), sacarosa (5 g L-1), peptona (5 g L-1), MgSO47H2O (0.5 g L -1). El pH se ajustó a 7.0 con HCl. El medio se esterilizó por autoclave por 15 min a 121° C y 15 psi. 6.2.3 Cepas bacterianas utilizadas Se utilizaron cepas de Escherichia coli para llevar a cabo las transformaciones, se utilizó la cepa Top10 y DHα5, estas fueron crecidas en medio LB y para su conservación fueron mantenidas a -70°C. E coli TOP10. Es una cepa con una alta eficiencia de transformación, clonación y propagación de plásmidos. Permite una replicación estable de un alto número de copias y su genotipo es similar a la cepa DH10B con las siguientes características hsdR, mcrA, lacZΔM15, endA1, y recA1. E coli DH5α. Permite una alta eficiencia de subclonación con un genotipo: F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF), U169 recA1, endA1, hsdR17. 6.2.4 Plásmidos utilizados pBluescript KS II (+). Es un vector de aproximado de 3.0 kb contiene un gen que da resistencia a Ampicilina a las bacterias que han sido transformadas lo que 17 permite hacer una selección de transformadas; está integrado por un fragmento del gen lacZ, el fragmento del gen lacZ codifica para la β-galactosidasa. El plásmido contiene promotores T3 y T7 que proceden de los fagos T3 y T7 respectivamente y que interrumpen el gen lacZ, localizándose en los sitios del MCS (sitio múltiple de clonación) (Figura 7). Figura 7. Esquema del vector pBS. Esqueleto del plásmido pBS KS II (+) sin inserto, imagen hecha con el programa Serial Cloner. 6.2.5 Herramientas Bioinformáticas utilizadas Para realizar el análisis de las secuencias de los miRNAs se utilizó la página de Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org) con la anotación más reciente TAIR 10. La ubicación genómica de los miRNAs se llevó a cabo a través de (http://www.arabidopsis.org/servlets/ViewChromosomes); los datos de expresión se realizaron en www.genevestigator.com. El análisis de elementos cis se realizó en (http://www.bioinformatics2.wsu.edu) y en (http://www.dna.affrc.go.jp). La construcción in vitro de los vectores de expresión se llevaron a cabo con el programa “Serial Cloner”. http://www.arabidopsis.org/ http://www.arabidopsis.org/servlets/ViewChromosomes http://www.genevestigator.com/ http://www.bioinformatics2.wsu.edu/ http://www.dna.affrc.go.jp/ 18 6.2.6 Diseño de iniciadores Para analizar la actividad del promotor del miRNA se realizaron análisis bioinformáticos los cuales permitieron identificar la Región Genómica más probable del Promotor (RGMP) de miRNAs interactores de AGO9. Las secuencias de los miRNAs fueron analizadas en la página de Arabidopsis TAIR (http://www.arabidopsis.org/). Se realizó un análisis de elementos cis de la RGMP de genes MIR que corresponden a miRNAs para comprobar la correcta elección O’Connor et al 2005. (http://www.bioinformatics2.wsu.edu). Figura 8. Representación gráfica de la selección de la RGMP. Se muestra la localización de la RGMP (azul claro) río arriba del gen MIR del miRNA así como los sitios de restricción con los que fueron seleccionados los iniciadores. En todos los casos a para cada miRNA seleccionado se diseñaron iniciadores con sitios HindIII y XbaI para amplificar la RGMP de los miRNAs en Arabidopsis thaliana como se ilustra en la Figura 8. Los criterios de selección de la RGMP fue de acuerdo a lo publicado por Zhou et al., en 2007, en donde se demostró que con seleccionar 500 pb río arriba del gen es suficiente para sugerir fuertemente que en esa región se encuentra el promotor del gen. Los tamaños de los fragmentos que fueron considerados como RGMP fueron de 1000 pb y 500 pb como valor mínimo. La lista de iniciadores que se diseñaron para amplificar la RGMP de miRNAs y los utilizados para secuenciar las construcciones en el vector pBS se muestran en la Tabla 1. http://www.arabidopsis.org/ http://www.bioinformatics2.wsu.edu/ 19 Tabla 1. Lista de iniciadores para amplificar la RGMP de miRNAs Nombre Primers Secuencia miR867a Fw 5’ –AAGCTTCGGGATCAATTATGGGATTGGCAC– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGCATGACAACATAAGAACCCAAACGC– 3´ miR858a Fw 5’ –AAGCTTCGGGTTCAAATTAGTCAGTGCACAGTTTC– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGCTCACTTTGTCAAGCCTAGCATCG – 3´ miR830a Fw 5’ –AAGCTTCGCCAATCCACAGGGATTTTTAGAGG– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGACACTAGCGAGACTCTGGTG– 3´ miR822a Fw 5’ –AAGCTTCGAGCTTTACGAATTTGTTACAGCCC– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGGTTACTTCAACTGCAAACCTTG– 3´ miR447b Fw 5’ –AAGCTTCGGTGACGAAGCTGATACCAAGTAGCAG– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGCATCGTTTGAAATTGCCTTGTCT– 3´ miR408 Fw 5’ –AAGCTTCGGCAACCAATACTGAACCAATCCAAAG– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGTACTGCGATCTGGCTAAAGCGT– 3´ miR403 Fw 5’ –AAGCTTCGATCAATCCAAACCCGTCCTGC– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGCGCCGGCGCTCAAGAAGA– 3´ miR158a Fw 5’ –AAGCTTCGGGTGGTCACCGCATCTTTTGTT– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGCTCTTCTTCTGCAGTCGCTAG– 3´ miR171a Fw 5’ –AAGCTTCGGCATGGTATTGACGTAAGAACTCT– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGGGACTCTCTCATGCTTAAAGTGCGG– 3´ miR161 Fw 5’ –AAGCTTCGGGGAACAGAAAAGGGAAGATGGCT – 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGCATTGATCGACGCAATAAACTGG– 3´ miR157a Fw 5’ –AAGCTTCGCCTTCCCATTTGGAACCTTTCCTCC– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGCACTATCAATGCCTCTCAATTCTC– 3´ miR156a Fw 5’ –AAGCTTCGGGTCCACAAATAAACATGGCCT– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGGCGTTTCTCTTGTCCCAACTCT– 3´ miR159a Fw 5’ –AAGCTTCGGGGCCCATATAATGGGCTCATA– 3´ Rv 5’ –TCTAGACGCTTCCATCGTCAGATCAAGATCTA– 3´ M13Fw M13Rv Fw Rv 5’ – GTTTTCCCAGTCACGAC – 3´ 5’ – CAGGAAACAGCTATGAC – 3’ 20 6.2.7 Material biológico 6.2.7.1 Germinación de semillas y crecimiento de plántulas Se utilizaron plantas silvestres (Wt) de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0. Las semillas fueron desinfectadas mediante varios lavados con etanol puro, se tomaron de 30-50 semillas de Arabidopsis y se pusieron en un tubo de 0.5 mL, se le adicionaron 100 µL de ETOH puro y se agitó por vortex aproximadamente durante 30 segundos. Se retiró el ETOH restante y se dejó evaporar en campana de flujo laminar a temperatura ambiente, las semillas desinfectadas fueron germinadas en cajas petri que contenían medio MS con un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 1 semana. Una vez que se observó la formación de plántulas aproximadamente transcurridas dos semanas se transfirieron a tierra y se mantuvieron en condiciones de invernadero. Las semillas provenientes de plantas transformadas fueron crecidas en medio MS con antibiótico como medio selectivo. Las semillas colectadas de plantas de Arabidopsis thaliana previamente infectadas con Agrobacterium fueron esterilizadas por el método de gas cloro. Se colocaron semillas de Arabidopsis en tubos de 0.5 mL en un desecador al cual se le coloco cloro al 40 % y en una campana de extracción se le adicionaron 4 mL de HCl, el desecador fue cerrado y se dejó aproximadamente durante 4 horas. Las semillas fueron germinadas con un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 1 semana. 6.3 MÉTODOS 6.3.1 Preparación de células calcio-competentes E. coli TOP10 y DHα5 Las cepas utilizadas de E. coli fueron DHα5 para las clonaciones en el vector pBS y la cepa Top10 para las construcciones en pBI. Se inoculó una colonia de la cepa E. coli DHα5/Top10 en 5 mL de medio de cultivo LB estéril, con agitación a 200 rpm y a 37°C durante toda la noche. Posteriormente en un matraz con 50 mL de medio 21 LB estéril se inoculó con 1 mL el cultivo previo y se incubó a 37°C con agitación constante durante 4-5 horas hasta obtener una OD ~ 0.4-0.6 a 600 nm. Transcurrido el tiempo indicado se colocó el matraz en hielo durante 15 minutos, posteriormente se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos a 4°C retirando el sobrenadante y la pastilla formada fue resuspendida cuidadosamente en CaCl2 0.1 M frío; se realizaron 3 lavados con CaCl20.1 M frío con 20 mL, 10 mL y 7.5 mL respectivamente y se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos, en cada paso de lavado el matraz fue colocado en hielo durante 15 minutos. Se realizaron alícuotas de 100 µL y fueron mantenidas a -70°C. Agrobacterium tumefaciens Se inoculó una colonia de Agrobacterium tumefaciens de la cepa C58C1 resistente a kanamicina en tubo con 5 mL de medio YEB estéril a 28° C y a 200 rpm durante toda la noche, a partir de ese cultivo se inoculó un matraz de 250 mL con 50 mL de medio YEB estéril 2 mL del cultivo previo, se mantuvo a 28°C con agitación constante hasta alcanzar una OD de 0.5 a 600 nm. Una vez obtenida la OD deseada se enfrío el cultivo durante 10 minutos en hielo y posteriormente se centrifugó a 6000 rpm durante 5 minutos. Se realizó un lavado con CaCl2 20 mM y se dejó en hielo aproximadamente durante 15 minutos, transcurrido el tiempo se centrifugó a 6000 rpm durante 5 minutos y la pastilla formada fue resuspendida en CaCl2 a 20 mM al 10% de glicerol estéril. Se realizaron alícuotas de 100 µL y se mantuvieron a -70°C. 6.3.2 Extracción de DNA genómico A partir de plántulas de Arabidopsis silvestres se extrajó DNA genómico por dos métodos: el primero se realizó con el kit Genomic DNA Purification de Promega siguiendo las instrucciones que sugiere el fabricante y el segundo fue por el método de UREA. 22 La extracción por el método de UREA se hizo de la siguiente manera: se trituro tejido de la plántula en nitrógeno líquido y se le adicionó 50 µL de Buffer UREA (UREA, NaCl 0.5 M, Tris HCl 1M y EDTA 0.5 M pH 8) fue mezclado por vortex y se le adicionó 100 µL de Buffer UREA, posteriormente se adicionó 100 µL de Fenol– Cloroformo y fue mezclado por vortex; se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos. La fase acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se adicionaron dos volúmenes de etanol puro mezclando perfectamente. Se centrifugó a 12000 rpm por 5 minutos y se decantó el sobrenadante; la pastilla fue lavada con etanol al 70 % centrifugando 2 minutos y se dejó secar, fue resuspendida en agua estéril y mantenida a -20° C. 6.3.3 Extracción de DNA plasmídico a partir de bacterias transformadas La extracción del plásmido por lisis alcalina se realizó de la siguiente manera, se inoculó una colonia transformada de la cepa DHα5 en un tubo con 5 mL de medio LB estéril con ampicilina con agitación constante a 37 °C toda la noche. Se obtuvo una pastilla de células mediante centrifugación a 18000 g por 30 s y se retiró el sobrenadante, se adicionaron 100 µL de Solución de Lisis I fría (Glucosa 50 mM, Tris*HCl y pH 8.5) y se agitó por vortex hasta observar la solución homogénea, posteriormente se adicionaron 200 µL de la Solución de Lisis II recién preparada (NaOH 0.2 N y SDS al 1%) y el tubo se mantuvo en hielo durante 5 minutos. Se adicionaron 150 µL de Solución de Lisis III fría (Acetato de potasio 5 M, ácido acético glacial [12 % concentración final] y agua) agitando por inversión del tubo y manteniéndolo en hielo durante 5 minutos, el resultado de la lisis fue centrifugado a 18000 g durante 5 minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y se le adicionaron dos volúmenes de etanol absoluto, se dejo en hielo por 5 minutos y se centrifugó a 18000 g durante 5 minutos y se retiro el sobrenadante, la pastilla que se obtuvo del paso anterior fue lavada con etanol al 70 % y centrifugada durante 2 minutos, el sobrenadante se decantó y se dejó evaporar el 23 etanol restante, la pastilla fue resuspendida en agua estéril adicionada con RNasa A de Fermentas a una concentración de 0.02 mg mL-1. El plásmido obtenido se mantuvo a – 20°C. 6.3.4 Condiciones generales del PCR para Amplificación de la Región más Probable del Promotor (RGPM) Para determinar la temperatura de alineamiento adecuada para amplificar la RGMP se realizó un gradiente de temperaturas. La RGMP fue amplificada a partir de DNA genómico de plantas silvestres de Arabidopsis thaliana mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Se utilizó la enzima KOD Hot Start DNA polimerasa (NOVAGEN) siguiendo las instrucciones que sugiere el fabricante. El volumen de trabajo que se utilizó fue de 25 µL, la reacción de PCR se realizó de la siguiente manera: 2.5 µL de Buffer para KOD Hot Start, 1.5 µL de MgSO4 25 mM, 2.5 µL de dNTP’s 2 mM, 0.5 µL KOD Hot Start DNA polimerasa, 1 µL del primer Fw (Forward) a una concentración de 10 pmol µL-1, 1 µL del primer Rv (Reverse) a una concentración de 10 pmol µL-1, 1 µL de DNA y se ajustó el volumen a 25 µL con agua miliQ estéril. La reacción fue llevada a cabo en un Termociclador con 30 ciclos de PCR, la temperatura de desnaturalización fue de 95°C por 30s, la de alineamiento fue 60°C por 30s y la de amplificación fue de 72°C por 1 minuto. Una vez terminados los ciclos las reacciones fueron mantenidas a 4°C. Posteriormente a partir de un gel de agarosa al 7% se purificó la banda correspondiente a la RGMP con el kit Gel and PCR Clean-Up System de Promega siguiendo las instrucciones que sugiere el fabricante. 6.3.5 Purificación a partir de gel de Agarosa Los productos de PCR, plásmidos y digestiones fueron analizados en geles de agarosa del 0.7 al 1 % y observados en un fotodocumentador Gel Logic 440 marca Kodak, las bandas que correspondían a los fragmentos de interés fueron 24 purificadas con el kit SV Gel and PCR Clean-Up System de Promega siguiendo las instrucciones que sugiere el fabricante. Los geles se corrieron a 100 V en una solución de TBE. 6.3.6 Construcción de vectores pBluescript y pBI 6.3.6.1 Subclonación de la RGMP en el vector pBS Para la construcción del vector pBlueScript KS II (+) (pBS), se realizó una reacción de ligación, el volumen de trabajo fue de 20 µL, el vector pBS fue utilizado como vector de subclonación, a la reacción se le adicionó: 1 µL de vector pBS, 4 µL de DNA (producto purificado de productos de PCR), 1 µL de T4 DNA Ligasa de Fermentas, 2 µL de buffer Ligasa 10x y 1 µL de la enzima EcoRV ya que el vector pBS no fue digerido previamente, posterior a eso se ajustó con agua estéril a un volumen de 20 µL. La reacción fue mantenida a 4°C durante toda la noche. Para la transformación de bacterias fue utilizada la cepa DHα5 de E. coli, el método de transformación fue por choque térmico; a 100 µL de células calcio- competentes DHα5 contenidas en un tubo eppendorf de 1.5 mL se le adicionaron 5 µL de la reacción de ligación, el tubo fue mantenido a 4°C durante 15 minutos, posteriormente se incubo 1 minuto a 42°C, 2 minutos a 4°C y posteriormente se le adicionaron 400 µL de medio LB estéril, las células fueron incubadas a 37°C con agitación constante durante 45 minutos. Transcurrido el tiempo se inocularon por extensión de aza en cajas petri que contenían medio LB adicionado con el antibiótico que da resistencia pBS (ampicilina 100 mg mL-1). Las cajas se incubaron a 37 °C durante 18 horas. El plásmido se obtuvo a través de dos formas por lisis alcalina y con Kit Plus SV Minipreps DNA Purification System de Promega siguiendo las instrucciones del fabricante. 25 6.3.7 Construcción del vector pBI con la RGMP Se realizó una reacción de ligación con un volumen de trabajo de 20 µL, el vector pBI fue cortado previamente con la enzima EcoRV para asegurar la integridad del vector, posterior a eso se procedió a linealizar el vector pBI con las enzimas HindIII y XbaI; a la reacción de ligación de le adicionó 1 µL de vector pBI digerido, 1 µL de DNA que corresponde a la RGMP, 1 µL de la enzima T4 DNA Ligasa de Fermentas y 2 µL de Buffer Tango 10X. La reacción se mantuvo a 4 °C durante toda la noche. Se transformaron células calcio competentes de E. coli Top10 con 5 µL de la reacción de ligación, el método de transformación fue por choque térmico, las bacterias fueron crecidas en cajas petri con medio LB al cual se leadicionó kanamicina a una concentración de 30 mg mL-1, las cajas se mantuvieron a 37 °C durante 18 horas. Posteriormente el plásmido fue extraído a través de Lisis Alcalina; para comprobar la inserción del plásmido en el vector pBI se realizó PCR con el mix Taq 5x Master Mix de Biolabs y además se realizaron digestiones enzimáticas con HindIII y XbaI. 6.3.8 Inserción de la RGMP::GUS en Agrobacterium tumefaciens A 100 µL de células calcio competentes de Agrobacterium se le adicionaron 10 µL del vector construido con la RGMP-pBI, posteriormente se mantuvieron las células durante 5 minutos en hielo y después se realizó el choque térmico a 37°C durante 25 minutos, una vez transcurrido ese tiempo se le adicionó 1 mL de medio YEB estéril sin antibiótico y se dejo incubar durante 3 horas las células, posteriormente fueron sembradas en cajas petri por extensión de aza en medio YEB adicionado con kanamicina y rifampicina. Las cajas se incubaron a 28°C durante 3 días hasta observar colonias bien definidas (Chen et al 1994). A las colonias formadas se les realizó PCR de colonia con oligos específicos para amplificar la RGMP para confirmar la inserción de la RGMP en el genoma de 26 Agrobacterium, se utilizó el mix Taq 5x Master Mix; el volumen de trabajo fue de 25 µL a la reacción se le adicionó 1 µL del primer Fw, 1 µL del primer Rv, 5 µL del 5x Master Mix, y se ajustó con agua miliQ estéril a 25 µL, las condiciones de PCR fueron las siguientes: 30 ciclos de PCR, se calentó a 95°C durante 5 minutos al inicio de los ciclos, posteriormente la temperatura de desnaturalización fue de 95°C por 30 s, de alineamiento fue 60°C por 30 s y la de amplificación fue de 72°C por 1 minuto, al final de los ciclos se mantuvo la reacción a 68°C durante 5 minutos. Una vez terminados los ciclos las reacciones fueron mantenidas a 4°C. Las muestras fueron observadas en un gel de agarosa al 0.7 %. 6.3.9 Transformación de Arabidopsis thaliana por inmersión floral Se inoculó una colonia de Agrobacterium transformada en un tubo de 5 mL en medio YEB con antibióticos, el cultivo se dejo crecer 24 h en agitación constante a 28°C. A partir del cultivo previo se inoculó un matraz de 500 mL con 250 mL medio YEB adicionado con los antibióticos necesarios incubando a 28°C y agitación a 200 rpm aproximadamente por 16 horas (OD ~1.5–2.0). El cultivo fue centrifugado a 4000 rpm durante 10 minutos hasta obtener una pastilla, posteriormente en una solución de sacarosa al 5 % la pastilla fue resuspendida. Arabidopsis thaliana se transformó por el método de inmersión floral, a plantas de Arabidopsis de aproximadamente dos semanas post-germinación se les retiraron las silicuas formadas y se observó que las plantas estuvieran en condiciones óptimas. Antes de realizar la transformación de la planta, al cultivo de Agrobacterium se le adicionó Silwet L-77 al 0.02 %, posteriormente las inflorescencias fueron sumergidas en el cultivo celular durante 10 s con ligera agitación. Las plantas fueron cubiertas con plástico durante 1 día para mantener la humedad y se mantuvieron en condiciones de invernadero, hasta obtener semillas maduras. 27 6.3.10 Selección de semillas transformadas Se colectaron semillas maduras de plantas que habían sido expuestas al cultivo con Agrobacterium, estas semillas se desinfectaron con varios lavados de ETOH puro, las semillas desinfectadas fueron germinadas en condiciones estériles en cajas petri con medio MS y kanamicina a una concentración de 30 mg mL-1, posteriormente fueron puestas en período de estratificación en oscuridad durante dos días a 4°C, transcurrido ese tiempo las semillas se colocaron en una cámara de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad (Zhang et al 2006). Una vez que las semillas habían germinado se realizó una selección de plántulas candidatas a ser plantas transformadas, las plántulas que mostraron una coloración verde en comparación con las demás plántulas fueron seleccionadas así como también la formación de hojas verdaderas, estas pequeñas plantas fueron pasadas a tierra y fueron mantenidas en condiciones de invernadero. 6.3.11 Buffer de Fosfatos para la tinción GUS Se colectaron inflorescencias de Arabidopsis previamente sometida al proceso de inmersión floral y fueron colocadas en un Buffer de Fosfatos (Fostafo de Sodio monobásico y dibásico 50 mM, Triton X-100 0.5% y X-GLu 5 mg/mL) a 37°C durante toda la noche. 28 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Selección de miRNAs interactores de AGO9 La elección de los 13 miRNAs interactores de la proteína ARGONAUTA9 se realizó en base a dos principales criterios: 1) se conoce el gen blanco y 2) sugieren tener expresión en tejido reproductivo en Arabidopsis thaliana. En la Tabla 2 se muestra los miRNAs seleccionados y su gen blanco. Tabla 2. Lista de miRNA seleccionados y descripción de su gen blanco Nombre del miRNA Gen blanco miR867 SEC14 cytosolic factor family protein miR858 MYB12, MYB83 miR830 Protein of unknown function DUF966 miR822 DC1 domain.containing protein miR447 Auxin-resistence protein miR408 Peptide chain release factor miR403 Cytocrome P450, family 71; ARGONAUTE2 miR158 pentatricopeptide (PPR) repeat- containing protein miR171 GRAS domain or SCARECROW-like proteins miR161 genes PPR miR157 genes SPL's miR156 Factor de trancripción SQUAMOSA. PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) miR159 Reprimen genes conservados (GAMYB-like) que codifican para factores de transcripción de R2R3 MYB miR390 Locus TAS miR167 Factor de respuesta auxinas 29 7.2 Análisis bioinformáticos de elementos cis La transcripción de los genes ocurre por señales que funcionan como activadores o represores, estas señales pueden ser en trans (factores de transcripción) y en cis (secuencias específicas en el promotor de cada gen). Para determinar cuál era la Región Genómica más probable del Promotor (RGMP) de los genes MIR, se inició con un análisis de elementos cis a través de programas bioinformáticos para ubicar la presencia de elementos regulatorios relevantes en http://www.dna.affrc.go.jp cada secuencia elegida como posible RGMP de miRNAs. La secuencia analizada se llevó a cabo de acuerdo al sentido de la transcripción seleccionando la región río arriba del miRNA maduro como se ilustra en la Figura 9. Figura 9. Análisis de elementos cis de la RGMP. Representación gráfica de la región que fue tomada como RGMP del miRNA de acuerdo al sentido de la transcripción del miRNA maduro. En donde las líneas en colores representan un elemento cis distinto que fue analizado. A través de la página http://www.dna.affrc.go.jp se realizó un análisis detallado de las secuencias. Los elementos relevantes encontrados para el objetivo del trabajo fueron seleccionados y se muestran a continuación en la Tabla 3 de algunos miRNAs. 7.3 Localización de miRNAs en el genoma de Arabidopsis En el genoma de Arabidopsis thaliana existen 5 cromosomas en los cuales se analizó la presencia de los miRNAs previamente seleccionado con el objetivo de saber la localización del miRNA, esto se llevó a cabo a través de la página http://www.arabidopsis.org/servlets/ViewChromosomes. Lo que permitió realizar de una manera más ilustrativa la distribución de estos miRNAs en el genoma de http://www.dna.affrc.go.jp/ http://www.dna.affrc.go.jp/ http://www.arabidopsis.org/servlets/ViewChromosomes 30 Arabidopsis. Los locus con los que fueron localizados los miRNAs se muestran en la Tabla 4 con el miRNA que corresponde. Tabla 3. Elementos cis analizados de la RGMP de miRNAs interactores de AGO9 miRNA Elementos cis Función miR867 Caja CCAAT La caja CCAAT comparte un dominio con CCT (de CONSTANS, CONSTANS-LIKE, TOC1) para regular la floración en Arabidopsis (Wenkel et al., 2006) ABRE Regulación transcripcional de genes ABI3 yABAincluyendo RD29B y D29A en semillas, germinación de embriones y plantulas en Arabidopsis (Nakashima et al., 2006) GA (Giberelina) GA juega un papel importante en la germinanción de semillas en Arabidopsis (Ogawa et al., 2003) miR858 ARF Factor de respuesta auxinas en Arabidopsis (Hagen et al., 2002) GA (Giberelina) Similar al motivo ABRE, secuencia encontrada en 24 genes que regulan la germinación de semillas (Nakashima et al., 2006. y Ogawa et al., 2003) miR447 RAV Expresión en hojas de roseta y raíz en Arabidopsis (Kagaya en al., 1999) miR408 ABA Factor de respuesta a estrés (Choi et al., 2000) miR158 Caja GCC Regulación de la respuesta a jasmonato (Brown el at., 2003) miR171 MYB Sitios de union a MYB (ATMYB2) respuesta a deshidratación (Abe et al., 1997 ) Motivo TGACGT Requerido para la expresión de alfa-amilasa en los cotiledones y en la formación de semillas (Yamauchi 2001). Posteriormente se localizó a los miRNAs en cada uno de los cromosomas de Arabidopsis (Figura 10) en donde se puede observar que el miR830, miR161, miR157, miR858 y miR159 se localizan en el cromosoma1, en el cromosoma 2 se encuentran los miR156, miR408 y miR403, el miR447 y el miR867 se encuentran en el cromosoma 4 y por último en el cromosoma 5 se encuentra el miR822. 31 Tabla 4. Tabla de anotación de genes MIR. Nombre Anotación (TAIR10) No. de loci miR867 AT4G21362 1 miR858 AT1G71002 1 miR830 AT1G14071 1 miR822 AT5G03552 1 miR447 AT4G03455 3 miR408 AT2G47015 1 miR403 AT2G47275 1 miR158 AT3G10745 2 miR171 AT3G51375 4 miR161 AT1G48267 1 miR157 AT1G66783 4 miR156 AT2G25095 13 miR159 AT1G73687 4 Figura 10. Localización genómica de miRNAs en Arabidopsis thaliana. miR830 (AT1G14071), miR161 (AT1G48267), miR157 (AT1G66783), miR858 (AT1G71002) y miR159 (AT1G73687); en el cromosoma 2 se encuentran los miR156 (AT2G25095), miR408 (AT2G47015) y miR403 (AT2G47275); en el cromosoma 4 el miR447 (AT4G03455) y el miR867 (AT4G21362) y en el cromosoma 5 esta miR822 (AT5G03552). 7.4 Datos de expresión de los miRNAs en el genoma de Arabidopsis thaliana Para determinar si los microRNAs seleccionados se expresan en tejido reproductivo y/o en semillas de Arabidopsis, primeramente se analizaron los datos de expresión 32 de miRNAs interactores de AGO9 obtenidos por estudios transcriptómicos. Para hacer esto, cada miRNA que fue localizado en el genoma de Arabidopsis, demostró que la expresión de un solo miRNA ocurre en más de un cromosoma de los 5 que contiene Arabidopsis thaliana. Esto resultó interesante ya que la existencia de un solo miRNA en distintos lugares del genoma sugiere la regulación de distintos genes, como por ejemplo el miR156 que se encuentra 8 veces en el genoma, por lo tanto existen 8 diferentes promotores que regulan el mismo gen MIR (Tabla 5). Los datos de expresión fueron analizados en distintos estados de desarrollo en Arabidopsis, estos datos fueron revisados a través de www.genevestigator.com. Para realizar el análisis de la expresión de los genes MIR de los miRNA, se evaluó primeramente un gen que se expresa de manera constitutiva que fue Ubiquitina (AT1G01660), en la Figura 11 se observa la expresión del gen en los distintos estados de desarrollo como por ejemplo en plántulas, hojas de roseta, formación del tallo, inflorescencias, silicuas y semillas maduras. Figura 11. Datos de expresión del gen de Ubiquitina en Arabidopsis. Análisis de la expresión del gen AT1G01660 en los distintos estados de desarrollo de Arabidopsis thaliana. http://www.genevestigator.com/ 33 Tabla 5. Datos de expresión de miRNAs interactores de ARGONAUTA9 miRNA No. Loci Target Lecturas Normalizadas Col-0 (Hojas) Col-0 (Planta completa) dcl1 (whole plant) dcl2/3/4 (Planta completa) M1 4dpi 4dpi 4dpi miR390 a,b 935 396 834 289 miR167a a,b,c ARF8 21379 14835 325 21587 miR159a a,b,c DUO1, MYB120 666908 187933 207828 434378 miR158a 18 100 3 34 miR156a a,b,c,d,e,f,g,h SPL2, SPL3, SPL4, SPL5 129 53 20 23 miR157a a,b,c,d SPL2, SPL4 99 20 6 9 miR161 a.1, a.2 EMB2654 12214 9878 47964 17838 miR171a a,b,c 154 664 104 462 miR403 a ago-02 55 74 6 39 miR408 a ARPN 1452 557 1249 724 miR447b a,b 68 50 8 110 miR822 207 74 346 1 miR827 a SPX 10 12 0 12 miR830 4 1 5 5 miR846 a JR/MBP 1492 729 267 1293 miR858 a MYB12, MYB83 2 9 2 50 miR867 0 81 0 115 La expresión de los miRNAs en el desarrollo de Arabidopsis se realizó para los miRNAs miR867, miR858, miR822, miR408, miR403 y el miR159 ya que para los demás miRNAs no había datos existentes de su expresión, estos datos fueron analizados junto al de gen AT1G01660 que corresponde a Ubiquitina que funcionó como control al realizar estos análisis, la expresión de miRNAs se muestra en 3 estados de desarrollo de Arabidopsis: plántulas, hojas de roseta jóvenes y en el desarrollo de flores. En la Figura 12 se muestra los niveles de expresión de los miRNAs en plántulas, hojas de roseta y en flores; se puede observar que lo niveles de expresión varían de acuerdo a los diferentes estados de desarrollo de Arabidopsis. Figura 12. Análisis de la expresión de miRNAs interactores de AGO9 en el desarrollo de Arabidopsis thaliana. Datos muestran la expresión de miRNAs en tres estados de desarrollo de Arabidopsis. Los genes analizados fueron miR867 (AT4G21362), miR858 (AT1G71002), miR822 (AT5G03552), miR408 (AT2G47015), miR403 (AT2G47275) y el miR159 (AT1G73687). El miR822 (verde) disminuye su expresión de acuerdo a lo mostrado en la Figura 12, pues se observa una disminución en su expresión de manera considerable de acuerdo crecimiento de Arabidopsis. El miR408 (naranja) se expresa en plántulas y aumenta su nivel de expresión en hojas de roseta y disminuye en flores. Los niveles de expresión que presenta el miR403 (morado) son bajos en comparación con los otros miRNAs analizados, alcanzando el nivel de expresión en flores del miR867. Caso contrario al miR159 que sus niveles de expresión son mayores en plántulas y se ve disminuido en hojas de roseta. El gen de Ubiquitina como se muestra se expresa de manera constitutiva en plántulas, hojas de roseta y en flores. Estos análisis se realizaron con el objetivo de conocer su expresión en las diferentes etapas de desarrollo de Arabidopsis thaliana. Los niveles de expresión en los distintos tejidos de Arabidopsis de muestran en la Figura 13, al igual que los análisis anteriores se realizaron con el gen de Ubiquitina como control, estos datos arrojan la presencia de los miRNAs en Arabidopsis thaliana. La variación de la expresión de estos genes se muestra de manera diversa en los distintos tejidos y en distintos niveles. Figura 13. Análisis de la expresión de miRNAs en los diferentes tejidos de Arabidopsis thaliana. 7.5 Estrategia de construcción de vectores El análisis de miRNAs a través de la actividad de su promotor, es la estrategia de estudio que permite saber la expresión espacial y temporal en Arabidopsis. El primer paso para realizar la construcción de vectores fue la extracción de DNA genómico de Arabidopsis para realizar los PCR y amplificar la RGMP de los miRNAs. A partir de ese DNA se realizó un gradiente de temperaturas para conocer cuáles eran las temperaturas a las cuales se amplificaba con mayor precisión la banda de interés (Figura 14), en donde se puede observar que en el gradiente de temperaturas se amplifica la banda de interés de aproximadamente 3000 pb, pero solo en las temperaturas 60°C y 62°C se amplifica la banda de interés de forma específica por lo que se eligió hacer los PCR de los miRNAs a una temperatura de alineamiento de 60°C. Este ejercicio solo se realizó para la RGMP del miR390 y miR167 ya que estos miRNAs fungieron como controles positivos para la realización delos experimentos consecuentes. Figura 14. Gradiente de temperaturas para amplificar la RGMP del miR390. Se muestra el fragmento amplificado por PCR del miR390 de 3000 pb, carril 1 T 54°C, carril 2 T 56°C, carril 3 T 60°C, carril 4 T 62°C. Una vez que ya se tenía la temperatura de alineamiento adecuada se prosiguió a realizar los PCR para amplificar las RGMP de miRNAs, estos PCR se realizaron con la enzima KOD para obtener fragmentos específicos. En la Figura 15 se muestra los productos de PCR de cada una de las RGMP de los miRNAs, ahí se puede observar los fragmentos amplificados, las bandas que corresponden a los fragmentos de interés fueron purificadas a partir de un gel de agarosa. Figura 15. PCR de la RGMP de miRNAs. Amplificación de la RGMP de miRNAs interactores de AGO9. Las clonaciones de la RGMP se llevaron a cabo en el sitio EcoRV que se localiza en al MSC del vector pBS (Figura 16), todos los insertos contenían sitios de restricción HindIII y XbaI excepto el miR167 que contiene sitios SalI y SmaI puesto que dentro de su secuencia existen sitios de corte HindIII y XbaI, estos sitios de restricción los contienen para poder ser clonados en clonados en pBI y queden en el marco de lectura adecuado para hacer la fusión transcripcional con el gen GUS. Figura 16. Estructura de pBS con la RGMP. Se muestra la estructura sin ningún inserto del vector pBS, la inserción de la RGMP se realizó en el MSC de pBS en el sitio EcoRV. Figura hecha con el programa Serial Cloner. Carril PCR 1 miR830 2 miR403 3 miR822 4 miR858 5 miR867 6 miR161 7 miR171 8 miR159 9 miR157 10 miR156 Se transformaron colonias DH5α y se seleccionaron al menos 10 colonias para cada cepa que presentaba resistencia al antibiótico para hacer la extracción del plásmido por lisis alcalina y caracterizar molecularmente la presencia de la inserción deseada, a partir de ellas se obtuvo el plásmido el cual fue analizado en un gel de agarosa al 0.7% Figura 17, en donde se puede observar ver la pureza de cada plásmido y se puede sugerir un ligero incremento en el peso comparado con pBS solo (sin inserto). Posteriormente los plásmidos de los miRNAs fueron digeridos con las enzimas HindIII y XbaI, esto con la finalidad de hacer una selección de clonas presuntamente transformadas, los pesos esperados para cada miRNA fue de 355 pb para el miR408, miR447 (742 pb), miR158 (496 pb) (Figura 17a) y miR822 (844 pb) (Figura 17b). En donde 3000 pb corresponden a pBS y 500-1000 pb pertenecen a la RGMP de miRNAs que fue insertada en el vector; las clonas resultantes positivas fueron secuenciadas con primers universales para pBS M13 Fw y M13 Rv. Figura 17. Obtención de DNA plasmídico por la técnica de Lisis alcalina. Carriles 1-5 corresponden al miR408, 6-10 al miR447 y 11-14 al miR158. B. Carriles 1-6 son los correspondientes al miR822a. 7.5.1 Digestiones enzimáticas de las RGMP en pBS Para analizar que las colonias habían sido transformadas con los plásmidos que contenían el inserto deseado, se realizaron restricciones enzimáticas las cuales mostraron el patrón esperado, las reacciones de digestión se analizaron en un gel de agarosa en donde se puede observar la liberación del inserto con el peso esperado así como la del vector pBS, para el caso del miR158 se analizaron tres a A b colonias las cuales corresponden a los carriles 1, 2 y 3 de la Figura 18a, en donde se esperaba la liberación de un fragmento de 496 pb donde de acuerdo al marcador de peso molecular indicado con una “M” se liberó de manera adecuada ya que corresponde al peso del fragmento insertado, los carriles 4, 5, 6 y 7 pertenecen al miR822 donde cada carril representa a una clona diferente que fue analizada, los insertos liberados para ese miRNA fue de 844 pb. En la Figura 18b se muestra la RGMP del miR408 para el que se analizaron 5 colonias que resultaron positivas en los carriles 1, 2,3, 4 y 5 liberando fragmentos de 1000 pb, en este caso se puso un control que consistió en el vector pBS sin inserto y digerido con las enzimas HindIII y XbaI, el peso del vector pBS fue comparado con el liberado en las digestiones realizadas con las construcciones RGMP-pBS. Figura 18. Restricciones enzimáticas. Plásmidos digeridos con las enzimas HindIII y XbaI, se observa la liberación de los insertos correspondientes a las RGMP. (a) corresponde al miR858 carriles 4, 5, 6 y el carril 7 al miR822. (b) carriles 1-6 pertenecen al miR408 y carril 7 control pBS sin inserto digerido con HindIII y XbaI. Para el caso del miR447 se analizaron 3 colonias de las cuales como se observa en la Figura 19a solo 1 colonia resultó positiva la correspondiente al carril 3 liberando un inserto de 742 pb, los carriles 1 y 2 resultaron colonias negativas pues solo se observa el vector pBS cortado con las enzimas HindIII y XbaI correspondiente a un tamaño de 3000 pb. Las construcciones de RGMP en pBS que corresponden a los miR156, miR157 y miR159 se muestran en la Figura 19b en donde todas las colonias analizadas fueron positivas, con los pesos de los fragmentos esperados carril 1 y 2 son del miR159, 3 y 4 miR156 y 5,6 y 7 pertenecen al miR157. a b Figura 19. Restricciones enzimáticas. (a) Se muestra la correcta inserción del la RGMP del miR447, carril 3 clona positiva, en (b) carril 1 y 2 miR156, 3 y 4 miR157 y 5, 6, y 7 miR159 y (c) corresponden al miR403. El miR403 se muestra en la Figura 19c en donde se puede observar las clonas analizadas positivas, ya que liberaron el fragmento insertado con el peso esperado de 1000 pb. Las clonaciones para el miR858 se muestran en la Figura 20a, las dos colonias analizadas resultaron positivas al liberar cada una un fragmento de 999 pb el cual corresponde a la RMGP; del miR867 8 colonias resultaron positivas (Figura 20b) con los pesos esperados de la RGMP. En el caso del miR161 y miR171 las digestiones de muestran en la Figura 20c, para el miR171 se esperaba un fragmento de 1100 pb en donde solo dos resultaron positivas, carriles 3 y 4. La RGMP insertada en pBS del miR161 fue de 999 pb, en los carriles 5, 6, 7, 8, y 9 liberando el fragmento en todos los casos. Figura 20. Digestiones enzimáticas con HindIII y XbaI en pBS. (a) Fragmentos liberados de miR858 carril 1 y 2, (b) miR867 carriles 1-7 liberando fragmentos de 999 pb. (c) miR171 carriles 1-4 resultando positivas 2 colonias 3 y 4 tamaño del inserto 1100 pb, carriles 5-9 pertenecen al miR161tamaño del fragmento 999 pb. a b c Las colonias que resultaron positivas con restricciones enzimáticas fueron secuenciadas, cada una de las muestras fue analizada y comprobada que tuviera los sitios de restricción HindIII y XbaI con los que se diseñaron los iniciadores; se realizó un alineamiento de las secuencias iniciales con las muestras que se mandaron obtenidas con la construcción de los vectores en pBS para tener certeza que el fragmento que había sido insertado era el correcto, además se realizó un BLAST en la página de Arabidopsis TAIR http://www.arabidopsis.org/ para comprobar que la RGMP que se había clonado en pBS correspondían a la secuencia del promotor del miRNA, así teniendo evidencia por digestión de enzimas, secuenciación y realizando un BLAST se pasó a realizar las siguientes construcciones en pBI. 7.6 Construcción de las fusiones transcripcionales RMPM::GUS Se llevó a cabo la fusión del gen uidA (beta-glucoronidasa; GUS) con la RGMP de miRNAs, el vector que se utilizó fue pBI ya que contiene en su estructura el gen GUS. La estructura de la construcción se muestra en la Figura 21, la RGMP quedó fusionada al gen GUS. La inserción fue en el MSC de pBI en los sitios HindIII y XbaI, la selección de colonias fue a través de la selección al antibiótico kanamicina que da el vector pBI. Figura 21. Estructura
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