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CONTENIDO INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TÍTULO DEL TRABAJO: OBTENCIÓN Y CARACTERIZACION DE ALCALOIDES DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina México, D. F. Mayo 2006. PRESENTAN: ANTUNEZ MARTÍNEZ NAYELI DE LA CRUZ ROMAN MIRNA QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIEROS FARMACÉUTICOS DIRECTOR: Dr. Gustavo Valencia del Toro Pag. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….. 3 1.-ALCALOIDES…………………………………………………………………………. 3 2. Erythrina……………………………………………………………………………........... 7 2.1 ETNOBOTANICA…………………………………………………………………. 8 2.2 QUIMIOTAXONOMIA…………………………………………………………… 9 2.3 ESTRUCTURAS.....................................…………………………………………….. 2.4. ACTIVIDAD FISIOLÓGICA Y FARMACOLÓGICA DE LOS ALCALOIDES DEL GÉNERO Erythrina................................................................................................... 10 12 3.TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES …………………………………... 15 4.TÉCNICAS DE IDENTIFICACION DE ALCALOIDES……………………………….. 16 5. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………... 17 6. OBJETIVOS……………………………………………………………………………... 17 6.1 OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………. 17 6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS………………………………………………………. 17 7.METODOLOGÍA………………………………………………………………………… 18 7.1 EXTRACCION DE ALCALOIDES……………………………………………….. 19 7.2 SEPARACION E IDENTIFICACIÓN…………………………………………….. 19 7.2.1 CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS……………………………………….. 20 7.2.2 RMN H1……………………………………………………………………… 20 8. RESULTADOS Y DISCUSION… 9.-CONCLUSIONES……………………………………......................... 21 38 10. RECOMENTACIONES……………………………………………………………. 39 10.- LITERATURA CITADA............................................................................................... 39 CONTENIDO DE FIGURAS Pag. Figura 1. Estructura de algunos alcaloides 6 Figura 2. Distribución Eritrina nivel mundial 7 Figura 3. Esqueleto eritrinano 10 Figura 4. Estructura de los alcaloides 11 Figura 5. Estructura de los alcaloides alquenicos 11 Figura 6. Estructura de los alcaloides lactonicos 12 Figura 7. Diagrama de la metodología 19 Figura 8. Extractos alcaloideos 21 Figura 9. Placas de alcaloides 22 Figura 10. Estructura de alcaloide del gènero Erythrina 23 Figura 11. RMN 1H extracto metanolico 24 Figura 12. RMN 1H extracto hexanico 25 Figura 13. RMN1H fracción 1 26 Figura 14. Espectro IR erisodina 27 Figura 15. Erisodina 27 Figura 16. Espectro IR erisovina 28 Figura 17. Erisovina 28 Figura 18. Espectro IR erisopina 29 Figura 19. Erisopina 29 Figura 20. Espectro IR fracción 1 30 Figura 21. Cromatograma fracción 1 31 Figura 22. Cromatograma estándar de erisodina 32 Figura 23. Cromatograma estándar de erisovina 33 Figura 24. Cromatograma estándar de erisopina. 34 Figura 25. Cromatograma fracción 1 35 Figura 24. Cromatograma erisodina y fraccion 1. 36 Figura 25 . Cromatograma erisovina y fraccion 1. 37 Figura 26. Cromatograma erisopina y fraccion 1. 38 CONTENIDO DE TABLAS. Pag. Tabla 1. Rendimientos obtenidos de extracto alcaloideos 21 Tabla 2: Fracciones y sus rendimientos, obtenidos del extracto metabólico 22 Tabla 3: Tipos de alcaloides de acuerdo a los sustituyentes de grupos R 23 Tabla 4. Localización de grupos funcionales de erisodina. 27 Tabla 5. Localización de grupos funcionales de erisovina. Tabla 6. Localizacion de grupos funcionales de erisopina. 28 29 Tabla 7. Localización de grupos funcionales de acuerdo a la literatura 30 Tabla 8: Condiciones por elusión de gradientes 32 Tabla 9: Tiempo de retención erisodina 33 Tabla 10: Tiempo de retención erisovina 34 Tabla 11:Tiempo de retención erisopina 35 Tabla 12: Tiempo de retención de la fraccion1 36 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. INTRODUCCIÓN 1. ALCALOIDES Constituyen el grupo más grande de metabolitos secundarios de las plantas conociéndose alrededor de 5,500. Han sido aislados a partir de diferentes tejidos vegetales como de semillas, y a partir de diferentes tejidos vegetales como raíces, cortezas y hojas. Aproximadamente 40 familias. En este importante grupo de compuestos se incluyen principios activos dotados de actividades marcadas y/o de toxicidad. La palabra alcaloide fue utilizada por primera vez por W. Meissner en el primer cuarto del siglo XIX (1819) para designar algunos compuestos activos que se encontraban en los vegetales y que poseían carácter básico. Mas tarde, Winterstein y Trier (1910) definieron los alcaloides, en un sentido amplio, como compuestos básicos, nitrogenados, de origen vegetal o animal. Por otra parte, no debemos olvidar que los primeros pasos de la farmacología experimental se iniciaron con el estudio de alcaloides. Magendie (1783-1855) fue el primero en estudiar la actividad farmacológica de algunos de estos compuestos en animales de experimentación. Centró principalmente sus trabajos en el alcaloide aislado de la nuez vómica (Strychnos nux-vomica L.), estricnina. Este alcaloide es un estimulante neuronal muy tóxico y se utiliza todavía como raticida. Posteriormente Claude Bernard (1813-1878), continuó con los ensayos de la actividad farmacológica de otros alcaloides como los que se encuentran en el curare, la nicotina del tabaco, el opio y los alcaloides que contiene y algunos otros. En la actualidad se conocen mas de , restringidos a un número corto de familias botánicas y se continúa investigando en la búsqueda de nuevos compuestos pertenecientes a este grupo. Su distribución es abundante en Angiospermas, especialmente Dicotiledóneas, siendo familias particularmente ricas: Apocynaceae, Asteraceae, Loganiaceae, Papaveraceae, Rubiaceae, Ranunculaceae, Solanaceae, etc. Entre las Monocotiledóneas destaca su 33 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. presencia en dos familias: Amaryllidaceae y Liliaceae. Aparecen raramente en hongos, Criptógamas y Gimnospermas. Desde el punto de vista químico, todos los alcaloides son compuestos nitrogenados, estando en la mayoría de los casos el nitrógeno formando parte de un heterociclo y en algunas ocasiones formando parte de una cadena abierta. Están constituidos además por carbono e hidrógeno, muchos llevan oxígeno, lo que les confiere unas series de propiedades físicas (sólidas, cristalizables), y raramente suelen contener azufre. Los alcaloides van a poseer estructuras químicas muy diversas lo que además de dificultar su definición, explica el abanico de actividades farmacológicas que pueden presentar. Entre las diferentes actividades podemos destacar: actividad sobre el sistema nervioso central, como por ejemplo la morfina aislada de las cápsulas de adormidera y del opio, que deprime el sistema nervioso central ( SNC) y produce una marcada analgesia, o la cafeína, que por el contrario excita el SNC; otros alcaloides presentan actividad sobre el sistema nervioso autónomo, como por ejemplo la pilocarpina de las hojas de jaborandi, con propiedades parasimpaticolíticas, la atropina aislada de las hojas de belladona con actividad anticolinérgica, o la efedrina de las sumidades de efedra útil como vasoconstrictor en casos de asma por sus propiedades simpaticomiméticas; en algún caso como por ejemplo la cocaína aislada de las hojas de coca, la actividad es anestésica local (hoy prácticamente este alcaloide no tiene utilidad en terapéutica, pero sí un extenso comercio como droga de abuso); actividad sobre el corazón, como la quinidina aislada de las cortezas de quina, con propiedades antiarrítmicas; la colchicina, alcaloide que se encuentra en el cólchico y presenta actividad la enfermedad gota ; alcaloidescomo vincristina o vinblastina del Catharanthus roseus, con actividad antitumoral que han resultado de gran eficacia en el tratamiento de determinado tipos de cáncer; etc.( Raffauf, 1970). Dada la actividad/toxicidad tan marcada en muchos de estos compuestos, en bastantes ocasiones no se emplean las plantas que contienen alcaloides sino los 4 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. alcaloides aislados de las mismas, bien controlados y dosificados. Su clasificación es compleja pudiéndose acometer desde distintos puntos de vista. En el momento actual parece ser la clasificación biogenética la de elección, es decir, según su origen o formación en el vegetal. Esta clasificación está bastante relacionada, en la mayoría de los casos, con la clasificación química que venía siendo la utilizada en tiempos anteriores ( Bruneton, 1996). Así, puesto que una gran parte de los alcaloides derivan de unos pocos aminoácidos, bien de cadena abierta o aromática, la clasificación puede realizarse de la siguiente forma: I. Alcaloides derivados de ornitina y lisina: tropánicos, pirrolizidínicos, piperidínicos y quinolizidínicos. II. Alcaloides derivados del ácido nicotínico. III. Alcaloides derivados de fenilalanina y tirosina feniletilamínicos e isoquinoleínicos. IV. Alcaloides derivados del triptófano: indólicos y quinoleínicos. V. Alcaloides derivados de la histidina: imidazólicos. VI. Alcaloides derivados del ácido antranílico. VII. Alcaloides derivados del metabolismo terpénico: diterpénicos y esteroídicos. VIII. Alcaloides del género Erythrina. IX. Otros alcaloides: bases xánticas. 5 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. O N OH H O OH O CH3 N O O CH3 O H a) Senecionina b) Cocaína N N N NO CH3 O CH3 CH3 N CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 c) Cafeína d) Benciltetrahidroisoquinolinas H OH CH3 H NH CH3 e) (-) Efedrina Figura1: Estructuras de algunos alcaloides a) quinolizidínicos, b) pirrolizidínicos, c) bases xánticas, d) y e) fenilalanina y tirosina 6 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 2.-Erythrina EI género Erythrina pertenece a la subfamilia Papilionidae de la familia de las Leguminosas (Fabaceae), éste género a su vez se encuentra dividido en 5 sub- géneros y 26 secciones , con base en las características de sus flores (Krukoff y Bameby , 1974 ; Neill ,1988). Se conocen cerca de 113 especies con una gran variedad morfológica y ecológica (Neill, 1993), este género se distribuye en regiones tropicales y subtropicales y en general en zonas templadas a nivel mundial , aunque la mayor parte de las especies se encuentran en el continente Americano (fig. 2). En México se conocen 27 especies que se distribuyen en zonas tropicales y algunas en zonas xerófitas y/o templadas (Musálem, 1992) . Desde la primera descripción del género Erythrina hecha por Linneus en 1753, varios investigadores han caracterizado al género por todo el mundo. Así Krukoff 1974, realizó una revisión del género donde describe 108 especies y 9 híbridos. 70 Especies en América Figura 2: Distribución Erythrina nivel mundial (Tomado de Mu 12 Especies en Asía y Oceanía 30 Especies en Africa sálem, 1992) 7 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. El fruto de Erythrina es una legumbre, con estrangulamientos que limitan a los lóculos donde se alojan las semillas, las cuales son de color rojo vivo, escarlata o naranja como las flores, su testa es lisa y brillante.(Raven, 1974 , Martínez, 1959). El nombre de Erythrina deriva del griego Erythros hace referencia al color rojo de sus flores, también se le ha asignado diferentes nombres según cada región, así el género o alguna especie en particular es conocido con otros nombres como coral trees (en ingles), jiquemite, lakatila, equemite (Puebla), coralina (Baja California) bucare, mulungu, elequeme, colorín (Tlaxcala), chocolín, demti,-chontal, cochoquelite, chicolote, quemite (Hidalgo), madre del cacao, madre del chontal, madera coral, madre brava, madre manza, majañu (Tabasco), pipal (Chiapas), moté, patol, pito (Veracruz), Zompantli (Estado de México, Guerrero y Tlaxcala) cosquelite, chakmolche, xoyo (maya, Yucatán),entre otros (Aguilar y Zolla, 1982). 2.1 ETNOBOTÁNICA. Ciertas especies de Erythrina contienen propiedades medicinales por lo que han sido utilizadas en diversas regiones y etnias del mundo para curar algunos padecimientos. Así en Veracruz, las hojas de E. americana son aplicadas para úlceras y abscesos y son administradas como bebidas para curar las picaduras causadas por diversos insectos; los frutos molidos son aplicados en inflamaciones de brazos, piernas, cabeza y ojos. En la región Huasteca del noreste de México, la corteza es hervida y tomada 40 días después del nacimiento de los niños como anticonceptivo. En esta región también se emplea una infusión de las flores inmaduras contra el insomnio. En Guerrero la planta es usada contra la malaria (Rivera, 1943). En Durango, las semillas de E. flabelliformis son utilizadas como un remedio contra el dolor de muelas y la infusión de las hojas es usada por los Indios Seri de Sonora para curar la diarrea. E. Standleyana es empleada por ésta etnia para detener las hemorragias nasales y contra el dolor de muelas (Hastings, 1990). 8 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 2.2 QUIMIOTAXONOMÍA. Los alcaloides han sido propuestos como posibles marcadores taxonómicos en varias especies de angiospermas y esto ha ayudado a la resolución de algunos problemas taxonómicos. Su limitada distribución hace que éstos no puedan ser empleados en los niveles altos de clasificación taxonómica, sólo en aquellos órdenes y clases donde se hallen representados. Así, la quimiotaxonomía de los alcaloides se encuentra bien documentada, pero sólo para ciertas familias de angiospermas que los contienen. En el caso de las plantas de Erythrina se ha estudiado el contenido de alcaloides en aproximadamente la mitad de las especies conocidas y la relación entre éstas se refleja en la presencia de una serie de alcaloides con anillo eritrinano. (Hegnauer, 1965). Se ha encontrado que la cantidad de alcaloides varía inversamente proporcional al contenido de aminoácidos, es decir, a mayor cantidad de contenido de aminoácidos, menor es la cantidad de alcaloides (Romeo y Bell, 1974). Aunque el perfil de los alcaloides en este género es característico su concentración varía. Hargreaves et al., 1974, .mencionan que entre las especies del continente Americano, la proporción de alcaloides difiere ampliamente. Los resultados indican que en el género los alcaloides diénicos, erisodina, erisovina y erisopina son los más abundantes y ampliamente distribuidos. En las especies americanas los alcaloides generalmente no contienen funciones oxigenadas en el C-11, quizá por la incapacidad enzimática para hidrolizar esa posición.( Aguilar et al.,1981) señalan que en E. americana es típico encontrar alcaloides lactónicos. En E. folfersii, se han encontrado alcaloides del tipo 1,6 diénico y en E. salviflora los del tipo alquénico. Ghosal (citado por Dyke y Quessy, 1981) señala que la erisotrina es el mayor alcaloide aislado en la corteza de E. Variegata var orientalis, pero también se ha identificado a la erisodina en menores cantidades, mientras que Sing (citado por 9 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTASDEL GENERO Erythrina. Dyke y Quessy, 1981) menciona que solamente encontró erisodina en la corteza de la misma especie. Se han encontrado alcaloides del tipo 1,6 diénico en E. folkesii, mientras que en E. Salviflora son comunes los del tipo alquénico. En algunas especies es frecuente encontrar alcaloides que contienen funciones oxigenadas en las posiciones C-8 y C-11 del esqueleto eritrinano. Desde hace tiempo los alcaloides del genero Erythrina han sido estudiados desde varios aspectos, sobre todo han sido de interés su biosíntesis y farmacología, así como en la elucidación de nuevas estructuras. 2.3. ESTRUCTURAS. Los alcaloides de Erythrina poseen un esqueleto base el cual se ha denominado eritrinano (Fig.3), estructuralmente se trata de una espiroamina tetracíclica. Figura3: Esquleto Eritrinano Considerando las características de esqueleto, los alcaloides han sido clasificados en tres grupos: 10 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. a) Alcaloides diénicos: contienen un sistema dieno conjugado en los anillos A y B (Fig.4). N (R) R4 X R1O R2O R3O R3 C A B D Figura 4: Estructura de los alcaloides b) Alcaloides alquénicos: presentan una instauración 1,6 en el anillo A (Fig.5). N (S) R4 X R1O R2O CH3O R3 Figura5: Estructura de los alcaloides alquénicos Alcaloides lactónicos: los cuales posen una lactona insaturada en lugar del anillo aromático D (Fig.6). 11 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. O NO X CH3O Figura 6: Estructura de los alcaloides lactónicos También se han encontrado alcaloides que no corresponden a estos tres, es el caso de la hipaforina, la N-nororientalina y la eribidina. En 1951 Carmack y colaboradores, identificaron la estructura del esqueleto eritrinano, posteriormente se identifico la existencia de otros dos grupos de alcaloides, el primero en donde se encuentran los que poseen un anillo lactónico y otro donde se ubican los que tienen un anillo aromático, en lugar del lactónico. 2.4. ACTIVIDAD FISIOLÓGICA Y FARMACOLÓGICA DE LOS ALCALOIDES DEL GÉNERO Erythrina. Como consecuencia de su origen botánico y bioquímico, los alcaloides muestran una gran variedad en su estructura química, por esta razón, cuando se administran a animales, los efectos fisiológicos que producen y su acción farmacológica varia de un alcaloide a otro, lo que ha determinado que la gran mayoría de estas sustancias desempeñe un papel destacado en las industrias química y farmacéutica (Evans, 1991). Algunos de ellos estimulan el sistema nervioso central, otros causan parálisis, otros mas elevan la presión sanguínea, otros la disminuyen. Ciertos alcaloides actúan como potenciadores analgésicos, antiamebianos, anticolinérgicos, antidepresivos, antimalaricos, antitumorales, 12 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. estimulantes nerviosos, anestésicos locales, anestesícos narcóticos, tranquilizantes o relajantes musculares (Pelletier, 1983). Los alcaloides con efecto curarizante han sido utilizados en neurobiologia para disminuir la contracción de músculos en varios problemas de cerebro y espina dorsal (Burman, 1940 en Pick, 1946) y, particularmente en la practica quirúrgica moderna, cada vez es más común su uso para incrementar la relajación muscular durante la inhalación de un anestésico ligero, para lograr la insensibilidad al dolor y mantener al paciente en un estado de inconciencia que evite los peligros de la anestesia profunda durante !as narcosis inducidas por barbitúricos (Pick, 1946, Solomons, 1992, Hill y Kolb, 1999). Por otro lado, durante los años cuarenta y cincuenta, el género Erythrina llamo la atención de los investigadores por el efecto farmacológico observado de los alcaloides sobre el sistema nervioso periférico como relajante muscular (Lehman, 1937). Los alcaloides de Erythrina han sido conocidos por sus efectos similares al curare (Lehman ,1937) describe los efectos paralíticos del extracto alcohólico de las semillas de Erythrina americana Subsecuentemente, diversos alcaloides se han extraído a partir de semillas de plantas del genero Erythrina con propiedades curativas y se ha señalado que los isómeros α y β del alcaloide eritroidina así como el dihidroderivado (dihidro- β - ertroidina) también presentan efectos semejantes a los del curare siendo el dihidro- β -eritroidina el alcaloide más potente (Megirian et al., 1955). Recientemente se ha señalado que además de sus efectos semejantes a los del curare, este alcaloide es un antagonista competitivo de los receptores nicotínicos acetilcolinergicos neuronales (Wiiliams y Robinson, 1984). La administración de fracciones alcaloideas del alcaloide β-eritroidina y su derivado dihidro-β-eritroidina, obtenidos de semillas de E americana, disminuyeron la conducta agresiva de ratas (Garín-Aguilar et a!, 2000, García-Mateos et al., 2000). Decker y colaboradores (1995) mostraron que erisodina alcaloide obtenido de semillas de Erythrina tiene mucho más afinidad a receptores acetilcolinérgicos 13 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. nicotínicos de tipo neuronal que la dihidro- β -eritroidina, indicando que la erisodina tuvo siete veces mas afinidad para el sitio de enlace nicotínico de alta afinidad marcado por la citisina que la dihidro- β -eritroidina Este sitio parece corresponder al subtipo α4 β2 del receptor acetilcoinérgico nicotínico, el principal sitio de enlace de la nicotina de alta afinidad en el cerebro de roedores (Flores et al. 1992,Whiting et al , 1992). En el sistema nervioso de los mamíferos, los receptores colinergicos de los ganglios autónomos y los de la unión neuromuscular son nicotínicos. Los receptores colinérgicos de los órganos efectores del SNA (Sistema Nervioso Autónomo) son muscarínicos. En el SNC (Sistema Nervioso Central) se encuentran ambos tipos de receptores colinérgicos. La médula espinal contiene receptores nicotínico (Guyton, 1992). Los receptores nicotínicos presinapticos están presentes en diversas neuronas de regiones corticales, de hipocampo y de cerebelo (Araki, 2002), estos receptores también predominan en el cerebro, pero hay también allí algunos receptores muscarínicos (Nicoll et al, 1990). Se conoce que los receptores nicotínico están implicados en varias funciones cognitivas complejas, tales como la atención, el aprendizaje y la consolidación de la memoria, la percepción sensorial y el control de la actividad locomotora, percepción del dolor, regulación de la temperatura corporal (Kieman, 1998). Se ha sugerido que la activación de los receptores nicotínicos formados por α4 β2 que son predominantes en el SNC, intervienen en los procesos de aprendizaje y memoria. La enfermedad de Alzheimer ha sido asociada con la disminución de los receptores nicotínicos α4 β2 (Arthur & Levín, 2002) y en la cognición (Levin, 2002). Los cambios bioquímicos relacionados con la enfermedad de Alzheimer (EA) han sido examinados en las neuronas colinérgicas básales del cerebro anterior. Los inhibidores de la colinesterasa aumentan la liberación de acetilcolina vía estimulación de receptor nicotínico en muestras de cerebro de la EA (Riekkinen et al., 1993). Riekkinen et al., (1993) sugieren que algunos de los receptores nicotínico pueden localizarse en las terminaciones nerviosas presinápticas y regular la liberación de acetilcolina. 14 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 3. TÉCNICAS PARA EXTRACCION DE ALCALOIDES. Son diversos los métodos empleados para obtener los alcaloides en forma pura de la planta que los contiene, pues los compuestos poseen diferentes grados de solubilidad, pero en todos ellosse aprovecha su carácter básico, algunas técnicas para extraerlos son: Método Cain Material vegetal secado y pulverizado se extrae en Soxhlet con metanol, y el solvente se evapora en vacuo al estado seco. La mezcla se revuelve con una barra de cristal por 10 minutos para alcanzar la disolución completa de los alcaloides, que, debido a su carácter básico, paso a la solución acuosa ácida como sales. Un extracto claro se obtiene generalmente después de la filtración, pero la centrifugación es a veces necesaria. Al residuo sólido se agrega HCl 1 N y la operación se repite. Los líquidos filtrados combinados se dividen en tres porciones y cada uno se colocan en un tubo de prueba pequeño. Entonces, dos o tres gotas de los reactivos Mayer, Bouchardat y Dragendorff. Una prueba positiva es indicada por la formación de un precipítado coloreado: blanco (Mayer), naranja (Dragendorff), y marrón (Bouchardat). El resultado es registrado como abundante(+++), moderado (++).escaso (+) y negativo (-). Extracción con éter de petróleo El polvo vegetal se extrae en Soxhlet con el éter de petróleo, 60-80 °C, para eliminar los lípidos y los carotenoides. Luego, se extrae con etanol, y el solvente se quita en vacuo debajo de 50 °C para obtener el extracto etanolico. Esto se extrae con 0.5 N HCl, que quita las bases como sales solubles. La solución ácida es basificada con NaOH del 15% a pH 10, y las bases libres se extraen en el cloroformo (alcaloides secundarios y terciarios). La solución acuosa puede tener alcaloides solubles en agua (alcaloides cuaternarios), que son determinados por los reactivo de la precipitación. 15 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. La solución acuosa residual, libera de CHCl3 y enfriado en un baño del hielo, se acidifica con 2 N HC1 a pH 2-2.5. El reactivo de Reinecke se agrega a una muestra de 2 ml de la solución de la adición; si hay un precipitado, el reactivo de Reinecke se agrega a la solución acuosa total, y el control de la precipitación completa se realiza en una muestra 2-mL de corresponder se centrifuga el líquido. Después de ser mantenido de noche en el refrigerador, el precipitado es filtrado por Buchner y lavado con agua fría (3 x 5 ml) hasta que una reacción negativa al rojo de Congo se obtenga. El producto se seca al peso constante en la temperatura ambiente y en la oscuridad. Conversión al cloruro del alcaloide La sal de Reineckate se disuelve en la acetona, seguida por la dilución con metanol. La solución se pasa a través de una columna de intercambio de aniones en la forma del cloruro, lavada previamente con la acetona:metanol (1:1). Después de que el paso sea completo, la columna se lava con acetona : metanol (1:1); os eluyentes de la evaporación dan los cloruros cuaternarios (Betty Maldoni ,1991). 4. TÉCNICAS DE IDENTIFICACION DE ALCALOIDES . Debido a la diversidad de estructuras que pueden presentar los alcaloides, el tener como referencia la planta (familia y género) del cual se ha aislado reduce el problema de identificación a un número menor de probabilidades y clasifica dentro de un determinado tipo; la posterior aplicación de pruebas de cromatografía de capa delgada, en combinación con reacciones específicas de coloración hace posible en muchos casos la identificación de un alcaloide conocido; esto puede ser comprobado y complementado con un registro de espectrofotometría de luz ultravioleta (U.V) y de infrarrojo (I.R). En el caso de compuestos desconocidos, otros métodos espectrales son indispensables como 1HRMN y 13CRMN. (Redha, F.M.J.M 1983).Con estas técnicas puede conocerse la estructura de un alcaloide desconocido, aún la más compleja. A diferencia de las épocas pasadas donde las únicas herramientas 16 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. disponibles eran los métodos químicos de y las estructuras eran determinadas completamente a través de reacciones de formación de derivados y de reacciones de degradación. Cualquier investigación encaminada a determinar la estructura de un alcaloide requiere en primer lugar la separación de la base libre o de una sal de ella en estado puro, para así calcular la fórmula empírica con los datos obtenidos en el análisis elemental. 5. JUSTIFICACIÓN. Especies del genero Erythrina tienen propiedades medicinales por lo que han sido utilizadas en diversas regiones y etnias del mundo para curar algunos padecimientos. Los alcaloides de las plantas de Erythrina tienen un efecto sobre el SNC, este tipo de alcaloides tienen un efecto antagonista competitivo de los receptores nicotínicos acetilcolinergicos neuronales dichos receptores están involucrados en las enfermedades neurodegenerativas. Por lo que es importante caracterizar los alcaloides contenidos en especies de Erythrina. 6.OBJETIVOS. 6.1Objetivo general Aislamiento, purificación y caracterización de alcaloides de plantas del genero Erythrina. 6.2 Objetivos específico 6.2.1. Obtención de los extractos alcaloideos hexánico, metanólico e hidrolizados de semillas Erythrina . 6.2.2. Separación y purificación por técnicas cromatográficas de los alcaloides presentes en dichos extractos. 6.2.3. Caracterización fisicoquímica de los alcaloides aislados. 17 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 7. METODOLOGÍA En la fig. 7, se presenta el diagrama general de la metodología para la obtención, purificación e identificación de los alcaloides de plantas del genero Erythrina. COLECTA DE SEMILLAS DESINFECCION Y MOLIENDA OBTENCION DE EXTRACTOS ALCALOIDEOS CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (revelado con reactivo Dragendorff) OBTENCION DE ALCALOIDES (columna ,HPLC) IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION IR , HRMN,13CRMN a Figura7: Diagrama de Metodologí INDENTIFICACIÓNDE LA PLANTA 18 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 7.1 EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES. La obtención de los extractos alcaloideos hexánico y metanólico realizó a partir de semillas de acuerdo al método descrito por Games, et al. (1974). El material vegetal pulverizado se desengrasó con solventes orgánicos durante 48 horas utilizando un aparato de Soxhlet. El extracto se concentró a presión reducida en el rotavapor y posteriormente, se lavó con H2SO4 al 2%, el residuo se filtró y se extrajo con diclorometano (3x100), para después ajustar el extracto orgánico a un pH de 8 usando NaHCO3. Finalmente, se realizó otra extracción con diclorometano (3 x 100), evaporándose el disolvente para obtener la fracción de alcaloides.El material vegetal se secó a temperatura ambiente para eliminar el disolvente. En los extractos metanólico y hexanico se extrajeron con sus respectivos solventes (metano y hexano). Para obtener el extracto alcaloideo hidrolizado la fase acuosa de la extracción anterior se acidificó hasta obtener un pH de 2 con HC1 concentrado y se mantuvo en reflujo durante 3 horas a una temperatura de 60-70°C para hidrolizar los alcaloides esterificados. Posteriormente, la solución se basificó llevándola a un pH de 8 con bicarbonato de sodio y se extrajo con diclorometano (3x100), el disolvente se eliminó y el residuo constituyó la fracción de alcaloides liberados o hidrolizados solubles en metanol. 7.2 SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN. Para identificar los alcaloides presentes en cada extracto se realizaron las siguientes técnicas: Cromatografía en capa fina (CCF); para este caso se emplearon placas de gel de sílice y se usó una mezcla de diclorometano: metanol (9:1), como eluyente. Una vez corrida la cromatografía las placas fueron reveladas con el reactivo de Dragendorff, la coloración naranja indico la presencia de alcaloides. Los alcaloides de lasextracciones se separaron mediante cromatografía en columna (CC). Cada fracción de alcaloides crudos fue disueltas en diclorometano 19 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. y se le adicionó silica gel para columna (gel de sílice 70-230 mallas), hasta evaporar el disolvente y formar un polvo fino. Este polvo se agregó a una columna cromatográfica de vidrio y la elución se efectúo con diclorometano:metanol iniciando con proporciones de 100:0 hasta 80:20. Se recogieron fracciones de 15 ml cada una y cada una fue analizada por cromatografía en capa fina, visualizándolas con luz ultravioleta de onda corta y larga, para después revelarlas con el agente cromogénico Dragendorff. Se combinaron las fracciones que cromatográficamente fueron similares, se les eliminó el disolvente y el residuo resultante se pesó. 7.2.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Para analizar los componentes de las fracciones de alcaloides separados en la columna cromatográfica, los extractos crudos obtenidos fueron analizados usando un equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) Los alcaloides fueron separados usando una columna Supelco Discovery C-18 (5 um) de 250 mm x 4.6 mm (i.d.) usando una fase móvil lineal de 1 ml/min y un gradiente programado de tres disolventes: A (0.1% de acetato de amonio), B (metanol) y C (acetronitrilo), de la siguiente manera: t = 0 min., 75% A, 20% B, 5% C; t = 10 min., 50% A, 45% B, 5% C; t = 15 min. 50% A, 45% B, 5% C. 7.2.2 RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN-H1 ). Para identificar a los alcaloides puros, éstos se analizan en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear Mercury NMR300 usando como disolvente CDC3 y como referencia interna agua o DMSO. 20 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la tabla 1 se presentan los porcentajes de cada una de las fracciones alcaloideas obtenidas. Los extractos obtenidos metanólico, hexánico e hidrolizados se muestran en la fig.8. . Figura 8: Extractos alcaloideos Tabla 1: Rendimientos obtenidos solo de extractos alcaloideos Fracciones Rendimiento (%) hidrolizados 0.4133% hexánica 0.2247% metanólica 0.5232% Estos extractos fueron sometidos a una primera partición cromatografíca en columna donde se utilizó Silica gel (malla 70-230) como fase estacionaria y diferentes polaridades de diclorometano-metanol como eluyentes Del extracto metanólico se obtuvieron 50 fracciones por cromatografía en columna y en la tabla 2 se muestran algunas de ellas con sus respectivos rendimientos. Las fracciones en las que se obtuvo mayor rendimiento fueron la 1 y la 4. 21 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Tabla 2: Fracciones y sus rendimientos, obtenidos del extracto metanólico Fracciones Rendimiento parcial (%) Rendimiento total(%) 1 15.62% 0.081 2 0.14% 0.0007 4 18.85% 0.098 5 6.79% 0.035 14 3.43% 0.017 15 0.91% 0.0004 16 6.79% 0.035 17 2.38% 0.012 18 0.70% 0.00036 19 1.06% 0.0055 En la figura 9 se presentan los resultados cualitativos de la cromatografía en capa fina, para algunas de la fracciones obtenidas, el revelado de las placas con el reactivo de Dragendorff indicó la presencia de alcaloides. Cuando se obtenían manchas con igual Rf se juntaban las fracciones para proceder a la separación por segunda vez por medio de cromatografía en columna. La mayor cantidad de alcaloides se obtuvo con la mezcla de elusión 97:3 diclorometano-metanol. Figura 9: placas de alcaloides 22 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Con ayuda del equipo RMN se obtuvieron espectros de protón de cada uno de los extractos alcaloideos, esto se hizo con la finalidad de detectar la presencia de hidrógenos aromáticos, alifáticos y vinílicos característicos de las estructuras moleculares de los alcaloides de las especies de Erythrina (erisovina, erisodina y erisopina), por lo que se esperaba que aparecieran las señales que se muestra en la fig.10 y en la tabla 2 N R2O R1O A B CD OH3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Figura 10: Estructura Alcaloide del género Erytrhina ALCALOIDE R1 R2 ERISOPINA H H ERISODINA H Me ERISOVINA Me H Tabla 3: Tipos de alcaloides de acuerdo a los sustituyentes de grupos R. Con esta estructura se esperaría encontrar señales para los hidrógenos aromáticos en una región 6-7 del espectro de resonancia, para los alifáticos en la región 2-4 y para los vinílicos en la región 5-6. En la figuras 11 y 12 se muestra los espectros de los extractos metanólico y hexánico en donde se corrobora que aparecen las señales antes mencionadas, pero se observa también la presencia 23 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. se otras señales que nos indican que hay muchas impurezas, lo que es lógico por que es un extracto crudo en donde se encuentran muchas sustancias. Figura 11: RMN 1H extracto metanólico 24 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Figura 12 : RMN 1H extracto hexanico El espectro de resonancia de la mezcla obtenida de la fracción 1 se presenta en la figura 13, en donde se observan las señales características de protones aromáticos, alifáticos y vinílicos característicos de las estructuras moleculares de los alcaloides de interés. 25 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Figura 13 : RMN 1H fracción 1. Con la finalidad de elucidar la estructura del alcaloide obtenido se utilizaron alcaloides puros obtenidos con anterioridad en el laboratorio, y se le determinaron sus propiedades fisicoquímicas. En las figuras 14, 15 y 17, se presentan los espectros de IR para los alcaloides erisodina, erisovina y erisopina, se pueden observar las señales características de los grupos funcionales que se encuentran en cada uno de estos alcaloides, en la tabla 4, 5 y 6 se presentan los intervalos que caracterizan los grupos funcionales de las substancias puras (Skoog et al., 2003, Silverstein, 1999). 26 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Figura 14: Espectro IR de erisodina. Tabla 4: localización de grupos funcionales de erisodina N MeO HO A B CD OH3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Grupo cm-1 Anillo aromático(A) 1615-1525 Anillo(B) 1620-1585 Anillo (C) 1470-1430 Anillo (D) 1615-1520 MeO- anillo (A) 2980-2920 Figura 15: Erisodina. 27 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. En la fig. 14 se muestra el espectro infrarrojo del estándar de erisodina de acuerdo a la literatura (Silverstein, 1999) se dedujo las regiones de algunos grupos funcionales significativos de la molécula que se muestran en la tabla 4. Figura 16: Espectro IR de erisovina N HO MeO A B CD OH3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 a Figura 17: erisovina. Tabla 5: localización de grupos funcionales de erisovin Grupo cm-1 Anillo aromático(A) 1615-1525 Anillo(B) 1620-1585 Anillo (C) 1470-1430 Anillo (D) 1615-1520 MeO- anillo (A) 2980-2920 MeO-Anillo (D) 1500-1400 28 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Figura 18: Espectro IR de erisopina Tabla 6: localización de grupos funcionales de erisopina N HO HO A B CD OH3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 Grupo cm-1 Anillo aromático(A) 1615-1525 Anillo(B) 1620-1585 Anillo (C) 1470-1430 Anillo (D) 1615-1520 MeO- anillo (A) 2980-2920 MeO-Anillo (D) 1000-1200 Figura 19 : erisopina De acuerdo al la figura 18 se determinó el espectro infrarrojo del estándar de erisopina como también se muestran los intervalos en donde aparecen los grupos funcionales mas importantes de la molécula en la tabla 6. 29 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. También se determinó el especto de IR para la fracción 1, ver figura 20, a partir de este espectro se identificaron lo intervalos en los que se encuentran los grupos funcionales característicos de los alcaloides de Erythrina (tabla 7), sin embargo, también aparecen otras señales que no corresponden a los grupos funcionales característicos de los alcaloides puros. Figura 20: Espectro IR fracción 1 Tabla 7: localización de grupos funcionales de acuerdo a la literatura. Grupo cm-1 Anillo aromatico(A) 1615-1525 Anillo(B) 1620-1585 Anillo (C) 1470-1430 Anillo (D) 1615-1520 MeO- anillo (A) 2980-2920 30 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Debido a que los datos obtenidos de los espectros de RMN 1H y de IR indican la presencia de otras señales de hidrógeno y/o grupos funcionales distintos a los alcaloides típicos de las especies de Erythrina, se consideró necesario implementar la técnica de HPLC para lograr la purificación de los alcaloides presentes en la fracción 1, se decidió que este método es más exacto y es posible la obtención de mejores rendimientos. Para la estandarización del método cromatográfico se inició el análisis con la utilización de una mezcla de agua- metanol 50:50 para dicha fracción (figura 21). Figura 21 :Cromatograma fracción 1. Como se puede observar en el cromatograma de la figura 21, no hay una buena separación entre señales obtenidas que permita identificar cada uno de los alcaloides, por lo que se decidió utilizar la condiciones mostradas en al tabla 8, que corresponden a un método de elusión por gradiente. Así mismo, se realizaron las determinaciones en HPLC para los estándares puros de los alcaloides erisodina, erisovina y erisopina, con la finalidad de obtener los tiempos de retención característicos. 31 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Tabla 8: Condiciones por elusión de gradientes (Garín -Aguilar, et al., 2006) Tiempo(min.) A(acetato amonio) B(metanol) C(acetonitrilo) 0 75 % 20% 5% 10 50% 45% 5% 15 50% 45% 5_% En la figura.22 se muestran los picos característicos para el alcaloide erisodina, los que se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas. En la tabla 9 se presentan los tiempos de retención obtenidos para cada una de las señales. Fig. 22. Cromatograma del estándar de erisodina. 32 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Tabla 9: Tiempo de retención de erisodina. SEÑAL min. 1 1.294 2 1.417 3 1.830 4 2.375 5 4.184 En la figura 24 aparecen las señales obtenidas para la erisovina, se observa que este tiene una mejor definición de los picos el tiempo en que aparecen estas señales es de 1 min. a 5 min. En la tabla 10 de nuevo se muestran los tiempos de retención característicos del alcaloide erisodina. Figura 23: Cromatograma estándar de erisovina 33 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Tabla 10: Tiempo de retención de erisovina. SEÑAL min. 1 1.399 2 1.845 3 2.321 4 4.107 En el estándar de erisopina se puede identificar dos picos (3 y 4) que aparecen muy juntos y es difícil su separación, tal vez se trate de una mezcla polimórfica de este alcaloide. Figura 24: Cromatograma estándar de erisopina. 34 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. En la tabla 11 se presentan los tiempos de retención de la erisopina. Tabla 11: Tiempo de retención de erisopina. SEÑAL min. 1 1.458 2 1.815 3 2.054 4 2.351 5 4.137 En la figura 25 se presentan las señales para la fracción 1, los tiempos de retención se encontraron entre 1 min. a 5 min., el pico mas largo aparece en el tiempo de retención de 2.331. En el cuadro 12 se resumen los tiempos de retención obtenidos para la fracción 1 Figura 25 :Cromatograma fracción 1. 35 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. Tabla 12 : Tiempo de retención de la fracción 1. SEÑAL min. 1 1.429 2 1.870 3 2.053 4 2.331 5 3.890 En el cromatograma de la figura 26 podemos observar las señales de erisodina y la fracción 1 de alcaloides presentes en Erythrina por lo tanto se demuestra que hay una cierta similitud pero los tiempos y las señales nos indican que hay desplazamientos muy significativos para poder concluir que la fracción 1 es erisodina. Figura 26 :Cromatograma erisodina y fracción 1. 36 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. De acuerdo a la figura 27 en donde hicimos una transposición del estándar erisovina con la fracción 1, para identificar si este alcaloide esta presente en la fracción, comprobando que efectivamente la señal de la fracción 1 corresponde a al estándar del alcaloide erisovina. Figura 27: Cromatograma erisovina y fracción 1. La transposición del crormatograma obtenido para la erisopina con el obtenido con la fracción 1 indico que este alcaloide no corresponde a dicha fracción figura 28. De acuerdo a los cromatográmas se puede observar que bajo las condiciones que se trabajaron hay un mejor desplazamiento de las señales ya que presentan picos bien definidos en comparación con los demás cromatogramas iniciales donde se manejaba una proporción 50:50 metanol-agua. Al transponer los cromatogramas de los estándares con la fracción 1 se puede ver que la fracción 1 tiene otras señales que no corresponden a los alcaloides debido a que hay todavía compuestos presentes en esta, por lo tanto decimos que el 37 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTAS DEL GENERO Erythrina. estándar de erisovina es la que demuestra una mayor semejanza en cuanto a las señales y los tiempos de retención con la fracción 1. Figura 28: Cromatograma erisopina y fracción 1. 9. CONCLUSIONES Se comprobó que el rendimiento es bajo en los extractos obtenidos pero podemos concluir que hay un mayor rendimiento en el extracto metanólico. En donde se logro obtener la mayor concentración de alcaloides en cromatografía en columna fue en la mezcla de elusión 97:3 diclometano-metanol. En cuanto al análisis cromatográfico (HPLC) se demuestra que el gradiente por elusión fue mejor con respecto a la utilización de la fase móvil de 50-50 metanol- agua. Es importante hacer mención acerca del tiempo de retención, ya que siempre se obtuvieron señales iniciales 2.5 min. a 5.0 min. por lo que se puede definir que este es el intervalo donde se esperarían encontrar las señales de los alcaloides que interesa. 38 10. RECOMENDACIONES Para llevar a cabo la separación óptima y poder recuperar los alcaloides, es necesario trabajar con una columna semi-preparativa, ya que se cuenta con las condiciones estandarizadas para la separación de los alcaloides. Para trabajar con el gradiente de concentraciones es preferible preparar cada uno de las fases el mismo día que van hacer utilizadas. Es conveniente variar las concentraciones del gradiente por elusión con la finalidad de obtener señales mas separadas entre si. 39 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE PLANTASDEL GENERO Erythrina. 11. LITERATURA CITADA Aguilar, M . I.,Giral, Fy Espejo, O.1981.Alkaloids from the flowers of Erythrina americana, phytochemistry 20:2061-2062. Aguilar,C.A. y Zolla, C. 1982. 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