Lemus-Villafuerte-Ximena

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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: 
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
 
TÍTULO DEL TRABAJO: 
Obtención de carotenoides con la microalga 
Scenedesmus incrassatulus en un biorreactor tipo 
airlift 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERA BIOTECNÓLOGA 
PRESENTA: 
XIMENA LEMUS VILLAFUERTE 
México, D. F. Junio 2008 
ASESORES 
Asesor externo Dra. Rosa Olivia Cañizares Villanueva 
Asesor interno Dr. Luis Fernández Linares 
 
México, D.F. Junio 2009 
RESUMEN 
 
Los carotenoides son metabolitos primarios producidos por las microalgas para que 
cumplan su función como pigmentos accesorios de la fotosíntesis y como moléculas 
fotoprotectoras. Se ha reportado la producción de carotenoides secundarios en microalgas 
en respuesta a algún tipo de estrés. En el presente trabajo se aplicaron dos condiciones de 
estrés, nutricional y lumínico, por separado y en conjunto, para inducir la carotenogénesis 
en la microalga Scenedesmus incrassatulus CLHE-Si01. Se llevaron a cabo cultivos con 
fotoperiodo y con luz continua en fotobiorreactores de 2L, en un medio mineral, con un 
flujo de aireación de 0.5 vvm y una iluminación de 400m-2 s-1. Una vez que los cultivos 
hubieron alcanzado la máxima concentración volumétrica de carotenoides totales, se aplicó 
el estrés. En caso de estrés nutricional se realizó un lavado celular y se sustituyó el medio 
mineral por agua, mientras que en el caso de estrés lumínico se agregaron 350m-2 s-1 de luz. 
Los resultados obtenidos indican que el estrés lumínico y nutricional estimularon la 
carotenogénesis y que además, la luz continua es una forma adicional de estresar a la 
célula. El crecimiento e inducción con fotoperiodo permitió obtener una mayor cantidad de 
biomasa y de carotenoides, mientras que el crecimiento con luz continua aumentó el 
porcentaje de carotenoides secundarios y la degradación de éstos. El aumento en los 
carotenoides secundarios estuvo representado por el aumento de la concentración de 
astaxantina+violaxantina. El fotobiorreactor que presentó el máximo contenido específico 
de cetocarotenoides fue el sometido a estrés nutricional con fotoperiodo (1.2%). 
 
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS 
 
 
A mi papá, por siempre alentarme a cumplir mis metas. 
 
 
A mi mamá por darme siempre su cariño y apoyo. 
 
 
A Fabi, por ser una verdadera hermana. 
 
 
A la Dra. Rosa Olivia Cañizares, por su asesoría, por permitirme realizar el 
proyecto en su Laboratorio y también aprender en él. 
 
 
Al Dr. Hugo Perales, por su asesoría y por enseñarme el amor a la 
investigación. 
 
 
A Alfredo, por ser un compañero, un asesor y un amigo. 
 
 
A mis amigos de la UPIBI, del taller de teatro de la UPIBI y de Gato 
Encerrado, por ayudarme a reír cuando más lo necesitaba. 
 
 
 
 
 
 
“One song glory, beyond the cheap colored lights… Time flies” 
[RENT] 
 
“No hay árbol que el viento no haya sacudido.” 
Proverbio hindú 
ÍNDICEÍNDICEÍNDICEÍNDICE 
 
 
Página 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Los carotenoides…………………………………………………………..…. 
1.1.1 Descripción..……………………………………………………………..…. 
1.1.2 Clasificación……………………………………………………………..…. 
1.1.3 Características químicas…………………………………………………… 
1.1.5 Importancia en la salud humana ………………………………………….... 
1.1.6 Importancia industrial……………………………………………………… 
1.2 Los carotenoides y las microalgas………………………………………… 
1.2.1 Descripción general…………………………………………… ………….. 
1.2.2 Función fisiológica…………………………………………………………... 
1.2.3 Scenedesmus…………………………………………………………………………...... 
1.2.4 Biosíntesis …………………………………………………………………......... 
1.2.5 Factores que afectan la biosíntesis……………………………………….……… 
1.3 Producción industrial: síntesis química vs. Biosíntesis………………… 
1.4 Fotobiorreactores………………………………………………………………… 
 
 
2. ANTECEDENTES………………………………………………………………. 
 
3. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS……………………………………………... 
 
4. OBJETIVOS……………………...………………………………………………… 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 
5.1 Scenedesmus incrassatulus. …….……………………………………...… 
5.2 Medio de Cultivo mineral……..………………………………………………... 
5.3 Biorreactor airlift………………………………………………………………. 
5.4 Protocolo experimental………….....……………………………………………. 
1 
1 
2 
3 
3 
7 
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9 
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21 
 
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25 
25 
27 
 
 
 
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 
6.1 Crecimiento celular con fotoperiodo (FP) y luz continua………………………… 
6.2 Fotobiorreactores con luz continua……………………………………………….. 
6.2.1 Cuantificación de clorofilas y carotenoides totales…………………………….. 
6.2.3 Contenido específico de carotenoides totales…………………………………... 
6.2.4 Análisis por HPLC-DAD………………………………………………………. 
6.2.5 Cuantificación de cetocarotenoides…………………………………………….. 
6.3 Fotobiorreactores con fotoperiodo……………………………………………….. 
6.3.1 Cuantificación de clorofilas y carotenoides totales…………………………….. 
6.3.3 Contenido específico de carotenoides totales…………………………………... 
6.3.4 Análisis por HPLC-DAD………………………………………………………. 
6.3.5 Cuantificación de cetocarotenoides…………………………………………….. 
6.4 LC y FP después de la aplicación de estrés………………………………………. 
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………. 
8. RECOMENDACIONES PARA TRABAJOS FUTUROS…………………..…….. 
 
9. REFERENCIAS…………………..………………………………………………... 
 
9. ANEXOS………………………..……………………………………………….…. 
Anexo I. Composición de algunas soluciones nutricionales para el cultivo en 
laboratorio del género Scenedesmus ………………………………………………… 
Anexo II. Método del lavado celular ………………………………………………… 
Anexo III. Metodología para la cuantificación de pigmentos con metanol caliente….. 
Anexo IV. Metodología para la cuantificación de la proporción de xantofilas 
por Cromatografía de Alta Resolución (HPLC)…………………………………….. 
Anexo V. Metodología para la cuantificación de cetocarotenoides con 
Dimetilsulfóxido (DMSO) …………………………………………………………. 
Anexo VI. Fotografía de los fotobiorreactores……………………………………….. 
Anexo VII. Cromatogramas de los fotobiorreactores……………………………….. 
 
31 
31 
33 
33 
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40 
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62 
64 
 
Índice de tablas y figurasÍndice de tablas y figurasÍndice de tablas y figurasÍndice de tablas y figuras 
 
Tabla 1. Actividades biológicas de los carotenoides en el ser humano 5 
Tabla 2. Carotenoides de mayor importancia industrial 8 
Tabla 3. Características generales de las microalgas 9 
Tabla 4. Características generales del subgénero Scenedesmus 14 
Tabla 5. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con luz 
continua 37 
Tabla 6. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con 
fotoperiodo 43 
 
 
Figura 1. Ejemplo de carotenoides: el β-caroteno 1 
Figura 2. Carotenos y xantofilas presentes en distintos organismos 2 
Figura 3. Estructura del retinol 4 
Figura 4. Carotenoides presentes en microalgas 10 
Figura 5. Esquema del transporte de electrones y el ciclo de las xantofilas 12 
Figura 6. Especie del subtipo Desmodesmus 14 
Figura 7. Especie del subtipo Scenedesmus 14 
Figura 8. Ruta del mevalonato a prenil fosfatos 15 
Figura 9. Ruta de 1-deoxixilulosa-5-fosfato a prenil pirofosfatos 16 
Figura 10. Síntesis de geranilgeranil pirofosfato (GGPP) 16 
Figura 11. Biosíntesis de carotenoides en microalgas 17 
Figura 12. Biorreactor airlift 26 
Figura 13. Diagrama de bloques del desarrollo general de cada experimento 27 
Figura 14. Cinética de crecimiento por PS y recuento celular directo en 
fotobiorreactores con FP y LC 31 
Figura 15. Cuantificaciónde pigmentos con FP y LC durante crecimiento 32 
 Figura 16. Cinética de crecimiento en experimentos con luz continua 33 
Figura 17. Recuento celular en fotobiorreactores con luz continua 34 
Figura 18. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con luz continua 35 
Figura 19. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores con 
luz continua 36 
Figura 20. Porcentajes relativos de carotenoides identificados 
por HPLC-DAD (LC) 37 
Figura 21. Cuantificación de cetocarotenoides en fotobiorreactores con luz continua 39 
Figura 22. Cinética de crecimiento de fotobiorreactores con fotoperiodo 40 
Figura 23. Recuento celular directo en fotobiorreactores con fotoperiodo 41 
Figura 24. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con fotoperiodo 41 
Figura 25. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores 
con fotoperiodo 42 
Figura 26. Porcentajes relativos de carotenoides identificados 
por HPLC-DAD (FP) 
Figura 27. Cuantificación de cetocarotenoides en experimentos con fotoperiodo 44 
Figura 28. Disminución del porcentaje de cetocarotenoides en el fotobiorreactor con FP 
después de la aplicación de estrés nutricional y lumínico 45 
 
 
 
 
 1 
1 INTRODUCCIÓN 
1.1 Los carotenoides 
1.1.1 Descripción 
Los carotenoides son pigmentos terpenoides liposolubles, compuestos por 8 unidades de de 
isopreno. Cuentan con una estructura básica lineal con dobles enlaces conjugados que 
representa el grupo cromóforo, el cual absorbe la energía luminosa en la región visible del 
espectro y le confiere a la molécula su coloración distintiva. La longitud de onda máxima a 
la que absorbe cada carotenoide depende, entre otros factores, del número de dobles enlaces 
conjugados y de la existencia de anillos cerrados en la molécula (Zechmeister, 1944, 1962), 
de tal manera que se requieren 7 dobles enlaces conjugados para que un carotenoide 
muestre un color perceptible (Meléndez-Martínez et al., 2007). Los carotenoides absorben 
luz en la región azul y verde del espectro, y reflejan las longitudes de onda de las regiones 
del amarillo, el naranja y el rojo. 
 
Todos los carotenoides se derivan de la estructura C40H56, la cual al sufrir reacciones de: 
hidrogenación, dehidrogenación, ciclización y oxidación, da lugar a diferentes compuestos 
de este tipo. Como ejemplo se puede mencionar al β caroteno, (Fig. 1) el cual cuenta con 
dos anillos en los extremos de su molécula. 
 
 
 
Figura 1. Ejemplo de carotenoides: el β-caroteno (Eonseon, 2003) 
 
Se han aislado alrededor de 600 carotenoides a partir de fuentes naturales. Los carotenoides 
son sintetizados por una gran variedad de organismos, incluyendo las plantas, los hongos, 
las bacterias y las algas (Fig. 2). Se estima que en la naturaleza se producen anualmente 
más de 100.000.000 de toneladas de carotenoides (Meléndez-Martínez et al., 2004). La 
mayor parte de esta cantidad se encuentra en forma de fucoxantina (en diversas algas) y en 
los tres principales carotenoides de las hojas verdes: luteína, violaxantina y neoxantina. 
 
 
 
 
 2 
1.1.2 Clasificación 
De acuerdo a su composición química, los carotenoides se dividen en dos tipos: 
 Carotenos o compuestos hidrocarbonados 
 Xantofilas u oxicarotenos, que presentan oxígeno generalmente en los anillos 
terminales de su estructura 
 
Otro criterio de clasificación implica la forma en la que los carotenoides son sintetizados en 
los organismos, y de acuerdo con esto, los carotenoides primarios son aquellos sintetizados 
bajo condiciones normales y que favorecen el crecimiento, mientras que los carotenoides 
secundarios se producen bajo condiciones especiales de estrés, principalmente estrés 
nutricional, tal como la deficiencia de nitrógeno (Britton, 1988). 
 
 
Figura 2. Carotenos y xantofilas presentes en distintos organismos (Umeno, 2005) 
 3 
1.1.3 Características químicas 
Debido a su naturaleza, los carotenoides son insolubles en agua y solubles en disolventes 
no polares. Su grado de solubilidad dependerá de los grupos funcionales sustituyentes de la 
molécula. Los carotenos son muy solubles en éter de petróleo y hexano, mientras que las 
xantofilas se disuelven mejor en metanol o etanol. La solubilidad de los carotenoides es una 
característica muy importante, puesto que influye directamente en la extracción y 
purificación en los procesos industriales. 
 
Otras propiedades de los carotenoides son: sensibilidad a la luz, el oxígeno, compuestos 
ácidos y a temperaturas elevadas. Su mayor degradación se produce por reacciones de 
oxidación. Dichas propiedades se reflejan en otras características como la atenuación del 
nivel energético o “quenching” de los singuletes de oxígeno y el bloqueo de las reacciones 
mediadas por radicales libres, también llamado “scavenging” o “trapping”. 
 
Los carotenoides, en general, son más estables en sistemas con alto grado de insaturación 
como los fotosistemas, ya que este tipo de sistemas acepta más fácilmente oxígeno y 
radicales libres antes que el carotenoide. Por el contrario, en sistemas con lípidos saturados, 
los carotenoides presentan mayor inestabilidad. En consecuencia estos compuestos pueden 
actuar como prooxidantes o antioxidantes dependiendo del sistema donde se encuentren. 
(Olmedilla et al., 2001) 
 
Por lo anterior, se recomienda trabajar con los carotenoides en una atmósfera inerte 
(nitrógeno), a baja temperatura (20ºC), en oscuridad o luz difusa, en condiciones libres de 
ácido y con solventes libres de peróxido. (Pfander, 1992). 
 
1.1.4 Importancia en la salud humana 
Algunos carotenoides, además de otorgar un color atractivo a los distintos organismos 
fotosintéticos, tienen la propiedad de presentar actividad como provitamina A, lo que 
incrementa su importancia a nivel fisiológico y nutricional. 
 
 4 
La vitamina A resulta esencial para la visión nocturna, y necesaria para mantener sanos la 
piel y los tejidos superficiales. Puede suministrarse como tal, llamándose entonces retinol 
(Fig. 3), como algunos análogos menos activos o como sus precursores, los carotenoides. 
 
Figura 3. Estructura del retinol (Olmedilla et al., 2001) 
 
No todos los carotenoides son precursores de la vitamina A, por lo que se encuentran 
carotenoides tanto provitamínicos como no provitamínicos. El número de carotenoides 
precursores de vitamina A oscila entre 50 y 60, destacando los carotenos (α, β - y γ-
caroteno) y algunas xantofilas (β-criptoxantina). La capacidad de los carotenos para actuar 
como provitamina A depende de su conversión a retinol por los animales, así como de la 
presencia de β-ionona. Los carotenos que contienen como mínimo un anillo de β-ionona 
pueden convertirse en retinol. Desde este punto de vista, el carotenoide más importante es 
el β-caroteno, que contiene dos anillos de β-ionona. 
 
Actualmente, el término provitamina A se usa para todos los carotenoides que presentan 
cualitativamente actividad de β-caroteno. En cuanto a éste, su actividad dependerá a su vez 
de la cantidad en la que esté presente en los alimentos. La FAO/WHO (1991) establece que 
la cantidad de β-caroteno equivalente a 1 µg de retinol es de 4 mg, 6 mg o 10 mg, 
dependiendo de la cantidad de β-caroteno presente en la comida. 
 
Además de su importante papel en la visión, la vitamina A es reconocida como un factor de 
gran importancia en la salud infantil y la supervivencia (WHO, 1998). (Tabla 2) 
 5 
 
Tabla 1. Actividades biológicas de los carotenoides en el ser humano 
(Olmedilla et al., 2001) 
 
La actividad antioxidante que tienen los pigmentos relacionados con el presente trabajo 
depende de una serie de factores, como su estructura química (tamaño, número de 
sustituyentes, configuración cis o trans, etc.), su concentración, la presión parcial de 
oxígeno o su interacción con otrosantioxidantes, como las vitaminas C y E. El mecanismo 
de la actividad antioxidante del β-caroteno, está relacionado con su carácter hidrofóbico y 
con su capacidad para "retirar" el oxígeno singulete y desactivar radicales libres. También 
se ha demostrado que otros carotenoides, como la astaxantina, luteína, zeaxantina, 
cantaxantina y el licopeno funcionan como antioxidantes. Es importante mencionar que se 
ha demostrado la actividad antioxidante de estos compuestos pero también se han obtenido 
resultados que demuestran lo contrario. Así, por ejemplo, algunos ensayos indican que la 
actividad antioxidante de la astaxantina es superior a la de otros carotenoides, mientras que 
en otros estudios se llega a la conclusión inversa (Meléndez-Martínez et al., 2004). 
 
Se ha evaluado el papel protector de diversos antioxidantes como el β-caroteno, α-tocoferol 
y el ácido ascórbico para las células humanas frente a la radiación ultravioleta, llegándose a 
la conclusión de que el primero es el más eficiente, probablemente debido a su localización 
en la membrana celular. La luteína y la zeaxantina (referidos como pigmento macular —
Acciones (respuestas, benéficas o adversas; fisiológicas o farmacológicas ante la 
administración de estos compuestos; no se considera esencial) 
-Antioxidantes 
-Inmunopotenciadores 
-Inhibición de mutagénesis y transformación 
-Inhibición de lesiones premalignas 
-Protección frente a la fotosensibilización 
 
Asociaciones (correlaciones entre los carotenoides y algún aspecto o finalidad 
fisiológica o médica que puede o no mostrar una relación causal) 
-Cataratas 
-Degeneración macular 
-Diversos tipos de cáncer 
-Enfermedades cardiovasculares 
 6 
PM—), pueden prevenir el daño oxidativo inducido por la luz en la retina, al atenuar la luz 
azul que entra en ella, y por tanto proteger frente al deterioro asociado a la edad, causante 
de la degeneración macular senil. 
 
Hay estudios que relacionan la aparición de algunos tipos de cáncer con la carencia de 
ciertos carotenoides en la dieta, por lo que estos compuestos son considerados 
anticancerígenos. Diversas investigaciones epidemiológicas han demostrado que el riesgo 
de padecer cáncer es inversamente proporcional al consumo de vegetales y frutas ricos en 
carotenoides. No obstante que muchos de estos estudios se han centrado en el β-caroteno, 
existen otros carotenoides eficaces en la prevención de esta enfermedad, como son la β-
criptoxantina, zeaxantina, astaxantina e incluso el carotenoide no coloreado fitoeno. En un 
estudio reciente, se propuso una relación inversa entre el consumo de alimentos ricos en 
luteína (como espinaca o lechuga) y el cáncer de colon, tanto en hombres como en mujeres. 
De igual forma, se ha demostrado que los carotenoides típicos del pimiento rojo (Capsicum 
annuum L.) como la capsantina y sus ésteres, y la capsorrubina, entre otros, son agentes 
antitumorales efectivos. La protección de los pigmentos carotenoides frente al cáncer y a 
otras enfermedades crónicas, podría atribuirse además de a sus propiedades antioxidantes, a 
efectos como la inhibición de la proliferación celular, a la mejora de la diferenciación 
celular, a la estimulación de la comunicación intercelular y a la filtración de la luz azul, 
entre otros. 
 
Desde hace tiempo se ha postulado que los carotenoides actúan como potenciadores 
positivos de la respuesta inmune, y se ha encontrado que elevadas dosis de β -caroteno 
aumentan la relación entre los linfocitos CD4 y CD8, que suele ser muy baja en pacientes 
seropositivos. 
 
Se ha estimado que el consumo promedio de vitamina A oscila entre los 744 y 811 
equivalentes de retinol por día en los hombres y los 530 y 716 equivalentes de retinol por 
día en las mujeres. Tomando como base los equivalentes de retinol, se estima que 
aproximadamente un 26% y un 34% de la vitamina A consumida por hombres y mujeres, 
respectivamente, es proporcionada por los carotenoides provitamínicos. 
 7 
1.1.5 Importancia industrial 
La importancia de los carotenoides en la salud humana, repercute en la generación 
industrial de productos como vitaminas y complementos. Sin embargo, los carotenoides 
tienen otras aplicaciones en este ámbito (Tabla 3), siendo una de las más importantes su 
función como pigmento en la industria alimentaria, puesto que se considera que hay 
seguridad en su consumo. 
 
En la avicultura, la luteína resulta un complemento de gran importancia, pues la coloración 
de la carne de aves es uno de los parámetros de calidad y también un atractivo. El consumo 
mundial de luteína es de aproximadamente 350 000 kg anuales. México consume alrededor 
de 180 000 kg, Estados Unidos 70 000 kg y Europa alrededor de 100 000 kg anuales (Agro 
2000, 2001), de tal forma que la industria avícola mexicana consume más del 50 por ciento 
de los pigmentos naturales a base de luteína. 
 
En la acuacultura, la astaxantina principalmente, y la cantaxantina en segundo lugar, son 
utilizadas como complementos alimenticios para animales como salmones y crustáceos, los 
cuales no son capaces de sintetizar estos pigmentos y los absorben normalmente de su 
medio marino, donde son sintetizados por el fitoplancton. Cuando estos organismos son 
criados por el hombre en estanques aislados, es necesario suministrarles dicho pigmento en 
la dieta. La ventaja de producir astaxantina a partir de microalgas o de cualquier otro 
organismo vivo, es que no es necesaria su purificación posterior, ya que es asimilable tal 
cual por el pez o crustáceo en cultivo. La ausencia de astaxantina como suplemento, daría 
como resultado carne pálida y poco atractiva a la vista. El precio elevado de los pigmentos 
hace que sea uno de los insumos que más incide en los costos de producción de la industria 
salmonera, representando entre un 18% a 22% (Pokniak y Bravo, 2000). 
 
 
 
 
 
 
 8 
Tabla 2. Carotenoides de mayor importancia industrial 
Carotenoide Utilidad comercial 
Licopeno 
(ψ, ψ caroteno) 
Medicamentos contra enfermedades cardiovasculares, cáncer 
de próstata 
Preparaciones cosméticas 
β-caroteno 
(β, β caroteno) 
Agente anticancerígeno, fuente de vitamina A 
Colorante de alimentos 
Fotoprotector 
Preparaciones cosméticas 
Astaxantina 
(3,3’-dihidroxi-β,β-4,4’, 
diona) 
Complemento alimenticio principalmente en acuacultura 
Colorante de alimentos 
Luteína 
(3R, 3’R, 6’R-β,ε-caroteno-
3,3’-diol) 
Prevención de la degeneración macular senil (AMD por sus 
siglas en inglés) 
Preparaciones cosméticas 
Zeaxantina 
(3R, 3’R-β,β-caroteno-3,3’-
diol) 
Prevención de la degeneración macular senil (AMD por sus 
siglas en inglés) 
(Bhosale, 2004) 
 
 9 
1.2 Las microalgas y los carotenoides 
1.2.1 Descripción general 
Las microalgas son organismos eucariotes microscópicos que contienen clorofila y que 
llevan a cabo fotosíntesis oxigénica. En la tabla 4 se presentan sus características generales. 
 
 
Tabla 3. Características generales de las microalgas 
Característica Descripción 
Tipo de 
organización 
celular 
Unicelular, colonial o filamentosa 
 
Motilidad Pueden tener o no motilidad, durante toda su existencia o solamente en 
alguna etapa de su crecimiento 
Reproducción Sexual o asexual 
Nutrición Auxótrofos, mixótrofos, heterótrofos facultativos u obligados 
Dependencia de 
la luz 
Existe una gran cantidad de especies fotótrofas obligadas, es decir, que 
no pueden crecer en ausencia de luz 
Pigmentación Distintos colores. A pesar de que todas las microalgas tienen clorofila 
se encuentran algas de color rojo o marrón, atribuyéndose este color a 
la presencia de pigmentos que enmascaran el color verde de la 
clorofila 
Ambiente Generalmente ambientes acuáticos como los lagos, los estanques y el 
mar, sin embargo, también se les puede encontrar viviendo sobre todo 
tipo de tierra. La mayoría vive libremente, mientras que algunas viven 
en relación simbiótica con otros organismos 
 
 
Lasalgas y especialmente las microalgas sintetizan una gran variedad de carotenoides 
(Fig. 4), incluyendo aquellos sintetizados por las plantas, tales como las xantofilas 
violaxantina, neoxantina y luteína. También sintetizan exclusivamente carotenoides como 
diatoxantina, diadinoxantina y fucoxantina. 
 10 
 
 
Figura 4. Carotenoides presentes en microalgas (Eonseon, 2003) 
 
1.2.2 Función fisiológica 
Los carotenoides tienen dos principales funciones en las microalgas: la primera es como 
pigmento accesorio en la fotosíntesis y la segunda es la fotoprotección. 
 
Como pigmentos accesorios, es importante recalcar que si bien las clorofilas son los 
pigmentos que reciben la mayor cantidad de energía, la luz que incide en el 
microorganismo está compuesta por varias longitudes de onda, y la presencia de pigmentos 
 
 11 
con distintas propiedades de absorción, como los carotenoides, asegura que un mayor 
porcentaje de los fotones incidentes estimule la fotosíntesis. 
 
Por otro lado, una de las funciones más importantes de los pigmentos carotenoides, es 
extraer el exceso de energía de las moléculas excitadas de clorofila y disiparla como calor. 
De no ser absorbido este exceso de energía, la clorofila basal se activaría y transferiría esta 
energía al oxígeno. Entonces se produciría una forma ultrarreactiva de oxígeno sencillo 
(1O*) ó singulete, la cual puede destruir moléculas biológicas y causar la muerte celular. 
Los carotenoides disipan el radical peróxido y también la clorofila excitada adquiriendo el 
estado triplete, que a su vez se disipa desprendiendo calor al medio. 
 
 El ciclo de las xantofilas: fotoprotección 
En casi todos los eucariotes fotosintéticos, la mayoría de las xantofilas están ligadas junto 
con las clorofilas a los Complejos de Captura de Luz (LHC por sus siglas en inglés), los 
cuales absorben y transfieren energía de excitación a los centros de reacción. Las xantofilas 
no participan como parte funcional del complejo, sino como elemento estructural, teniendo 
una labor importante en la fotoprotección (Fig. 5). 
 
En la fotosíntesis el transporte de electrones por los portadores de la membrana tilacoidal 
como el NADP, implica el bombeo de protones desde el estroma cloroplástico al lumen 
tilacoidal. La acumulación de los protones en el lumen tilacoidal, tiene como consecuencia 
una baja en el pH, causando un disparo en la activación de la enzima violaxantina de-
epoxidasa. Esta enzima, localizada en la cara interna de los sacos tilacoidales, transforma 
el diepóxido violaxantina (V) en zeaxantina (Z) deepoxidada a través del intermediario 
monoepoxidado anteraxantina (A). La zeaxantina es capaz de recibir la energía 
directamente de la clorofila excitada, disipándola posteriormente en forma de calor. El 
proceso se invierte cuando la luz desaparece, disminuye su intensidad progresivamente o 
cuando los protones pasan a través de la ATPasa. La conversión de zeaxantina a 
violaxantina es realizada por la enzima zeaxantina epoxidasa, resultando en una 
acumulación de zeaxantina. 
 
 12 
 
 
Figura 5. Esquema del transporte de electrones y el ciclo de las xantofilas (Manrique, 
2003) 
 
Es importante mencionar que el ciclo de las xantofilas es un proceso estimulado no sólo por 
la existencia y/o intensidad de la luz, sino también a otros factores ambientales como la 
temperatura extrema y la deficiencia de nutrientes (Demmig-Adams et al. 1996). 
 
1.2.3 Género Scenedesmus 
La microalga utilizada en el presente trabajo fue Scenedesmus incrassatulus, perteneciente 
al subgénero Scenedesmus que a su vez es parte del género Chlorophyta. 
 
Las Chlorophyta o algas verdes, son abundantes en la naturaleza; incluyen organismos 
macro y microscópicos de agua dulce. Poseen clorofila a y b, y distintos carotenoides. 
Tienen almidón como producto de reserva, el cual, a diferencia de otras algas, se forma en 
el cloroplasto. Su pared celular es celulósica aunque algunas especies carecen de ésta. Los 
cloroplastos pueden contener pirenoides. 
 
La explotación comercial de las microalgas verdes comprende principalmente los géneros 
Chlorella, Dunaliella y Haematococcus. Dunaliella spp., habitante de ambientes 
hipersalinos, ha sido estudiada extensivamente debido a su producción de β -caroteno. 
 13 
 
El subgénero Scenedesmus se caracteriza por formar cenobios o conformaciones de 2, 4, 8 
ó hasta 16 células. Incluye más de 200 especies, las cuales comparten las características 
señaladas en la tabla 4. El subgénero se subdivide a su vez en: 
 
Figura 7. División de Scenedesmus 
 
Las especies del subtipo Scenedesmus (Fig. 7) tienen paredes celulares en arreglo de 
multicapas. La capa interna contiene celulosa embebida en una matriz de hemicelulosa, 
mientras que la capa externa (con tres subcapas) consiste en el politerpeno esporopolenina. 
 
Por otra parte, el subtipo Desmodesmus (Fig. 6) se caracteriza por una pared celular más 
complicada, con una capa adicional de esporopolenina que rodea a todo el cenobio. 
 
 
Scenedesmus 
Desmodesmus 
Scenedesmus 
Acutodesmus 
Scenedesmus 
 14 
Tabla 4. Características generales del subgénero Scenedesmus 
(Kessler, 1982) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Especie del subtipo Desmodesmus 
 
 
Figura 7. Especie del subtipo Scenedesmus 
- Presencia de hidrogenasa, mostrando que al ser iluminadas, son capaces de liberar H2 
a bajas presiones parciales de O2 y de H2, y de reducir CO2 con H2, H2S o algún otro 
donador orgánico de hidrógeno 
- Formación de carotenoides secundarios, tales como astaxantina y cantaxantina, cuando 
crecen en deficiencia de nitrógeno, fósforo o de fierro 
- Liberación de proteasas extracelulares, revelado por la licuefacción de gelatina 
- Liberación de amilasas extracelulares, indicado por la hidrólisis de almidón 
- Como organismos de agua dulce, muestran una baja tolerancia a la sal 
- El cambio de oscuridad a luz provoca la sincronización celular (Simmer y Sodomkova, 
1967) 
- Baja tolerancia a los ácidos 
- La propagación de Scenedesmus suele ser por autocenobios, aunque también se ha 
observado la producción de gametos biflagelados en S. obliquus. (Trainor y Burg, 1965) 
 15 
 
1.2.4 Biosíntesis de carotenoides 
Originalmente, se creyó que la ruta de biosíntesis de carotenoides de las microalgas era la 
del acetato/mevalonato, sin embargo, últimamente se ha establecido la ruta del 
piruvato/gliceraldehido 3-fosfato para algas verdes (Schwender et al., 1996). En la figura 
2, se muestran las dos rutas: 
 Ruta del mevalonato a prenil fosfatos 
El mevalonato se forma a a partir del acetil-CoA y conduce a la formación de isopentenil 
pirofosfato (IPP), que es la unidad formadora de terpenoides. 
 
 
Figura 8. Ruta del mevalonato a prenil fosfatos (Sandmann, 2000) 
 
 Ruta de 1-deoxixilulosa-5-fosfatro a prenil pirofosfatos 
También llamada ruta de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato (Fig. 9) por ser éste el primer 
producto que se convierte a prenil pirofosfato. No todos los pasos de esta ruta han sido 
identificados. 
 
Partiendo de piruvato y 3-P gliceraldehido se forma una unidad de dos carbonos, y 
subsecuentes reacciones conducen al 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato. Se sospecha 
que la síntesis de este producto es el punto en el que se bifurca la ruta, ya sea para formar 
IPP o dimetilalil pirofosfato (DMAPP). 
 
 16 
 
 
Figura 9. Ruta de 1-deoxixilulosa-5-fosfato a prenil pirofosfatos (Sandmann, 2000) 
 
Los terpenoides se sintetizan a partir de los prenil pirofosfatos, que son formados por 
diferentes prenil transferasas después de la isomerización del IPP a DMAPP, y de 
condensaciones sucesivas 1’-4 con moléculas de IPP. El enlace se forma entre el C-1 del 
IPP y el C-4 del DMAPP (para plantas) o del farnesil pirofosfato (para bacterias). El 
producto resultante es el geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Fig. 10).Figura 10. Síntesis de geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Figura tomada de Carothenoid 
biosynthesis and biotechnological application, 2000) 
 17 
 
Para la formación de un caroteno de 40 carbonos se parte del fitoeno. La condensación de 
dos moléculas de GGPP con un ciclopropilcarbonil entre el carbono 1 del primer GGPP y 
los carbonos 2 y 3 del segundo GGPP dan lugar al prefitoeno pirofosfato. Al eliminarse el 
pirofosfato, el 15-cis fitoeno restante es convertido a licopeno. 
 
El licopeno sufre distintas reacciones de desaturación, hidroxilación, epoxidación, 
glicosilación, o-metilación, transferencia de grupos acilo y fenilo, ciclidación para formar 
los distintos carotenoides existentes en la naturaleza. La figura 5 muestra algunas de estas 
reacciones y sus productos. 
 
Las enzimas implicadas en la biosíntesis de carotenoides están asociadas a membranas o se 
encuentran integradas en ellas. 
 
La biosíntesis de carotenoides en microalgas se lleva a cabo como se describió 
anteriormente, hasta llegar al licopeno. Posteriormente, las células siguen la ruta descrita en 
la figura 11. 
 
Figura 11. Biosíntesis de carotenoides en microalgas (Jin et al., 2003) 
 18 
1.2.5 Factores que afectan la biosíntesis de carotenoides en microalgas 
La eficiencia de la biosíntesis de carotenoides implica principalmente dos cuestiones: las 
condiciones de cultivo, y el nivel y actividad de las enzimas biosintéticas de carotenoides. 
En ausencia de herramientas de biología molecular que mejoren la actividad de las enzimas 
implicadas, las condiciones de cultivo son la variable a manipular en la mayoría de los 
casos. 
 
A continuación se enumeran los factores más importantes de los cultivos de microalgas que 
tienen como objetivo la sobreproducción de carotenoides: 
 
*Luz 
En las microalgas, la producción y la acumulación de carotenoides se ve afectada 
positivamente por la irradiación con luz blanca, sin embargo, la intensidad, el horario y el 
tiempo en que ésta es administrada, varía con el microorganismo. La teoría de la 
fotoinducción abarca dos aspectos importantes. El primero es que el mejoramiento de la 
producción volumétrica (mg ml-1), está asociado al mejoramiento del crecimiento. El 
segundo aspecto es que la acumulación celular (mg g-1) de los carotenoides está asociada al 
aumento de la actividad de las enzimas implicadas en su ruta biosintética. Por ejemplo, la 
microalga Dunaliella sp., hiperproductora de β-caroteno, para crecer y sintetizar 
carotenoides, requiere de alta intensidad luminosa, de un estrés causado por sales y de 
limitación de nutrientes. 
 
*Temperatura 
La temperatura es uno de los principales parámetros a controlar en un cultivo. De hecho, en 
los cultivos de Dunaliella y Haematococcus, es el factor a controlar más importante. En un 
experimento realizado por Orset y Young (1999), con Dunaliella, los niveles de caroteno 
(excepto para el α-caroteno), disminuyeron cuando la temperatura varió de 34 a 17 ºC. Sin 
embargo, cuando la radiación luminosa fue de 1,000 µmol m2 s-1 a 19ºC, los niveles de β-
caroteno se incrementaron. 
 
 
 19 
*Iones metálicos 
 El papel biológico de algunos iones metálicos en los microorganismos se desconoce, sin 
embargo se han hecho estudios al respecto en el caso de la producción de carotenoides. En 
los experimentos de Kobayashi et al. (1992), la producción de astaxantina por H. pluvialis 
mejoró cuando el medio se enriqueció con una sal ferrosa. Tjahjono et al. (1994) dedujeron 
que esto se debía a la generación del radical hidroxi, el cual estimula la síntesis de 
carotenoides por la reacción de Fenton (H2O2 + Fe 
2+ → Fe 2+ +HO− +HO*). 
 
*Deficiencia de nitrógeno 
El nitrógeno es un constituyente esencial de las proteínas estructurales y funcionales de las 
células algales, representando del 7-10% del peso celular seco. En general, las microalgas 
tienen una capacidad limitada para producir materiales de reserva de nitrógeno, con 
excepción de la cianoficina y ficocianica en cianobacterias, las cuales en condiciones 
limitadas de nitrógeno, degradan los ficobilisomas. Entonces, el flujo de carbono es 
conducido a la síntesis de lípidos o carbohidratos, en vez de a síntesis de proteínas. 
Numerosos estudios indican que la biosíntesis y la acumulación de lípidos en forma de 
triacilglicerol se ve beneficiada por la limitación de nitrógeno en el medio. (Thompson, 
1996). 
 
La acumulación de carotenoides secundarios, es una característica importante de muchas 
algas cuando son cultivadas con deficiencia de nitrógeno; esto es comúnmente acompañado 
por una disminución en el contenido celular de clorofila. Ben-Amotz et al. (1982) 
demostraron que la producción de β-caroteno se ve aumentada en células de Dunaliella 
crecidas con deficiencia de nitrógeno en el medio. De igual forma, Borowitzka et al. (1991) 
demostraron que una baja concentración de nitrógeno, es uno de los factores más 
importantes para estimular la síntesis y acumulación de astaxantina, Zhekisheva et al. 
(2002) reportaron que bajo condiciones limitantes de nitrógeno, Haematococcus pluvialis 
produjo 5 picogramos de ácidos grasos por cada picogramo de astaxantina, sugiriendo que 
estos dos procesos podrían estar relacionados, de tal manera que los glóbulos de aceite 
mantuvieran el alto contenido de los ésteres de astaxantina. 
 
 20 
1.4 Producción industrial de carotenoides: síntesis química vs. biosíntesis 
La producción de carotenoides se realiza por síntesis química o por biosíntesis. 
 
Entre las ventajas de la síntesis química, destaca la pureza de los compuestos obtenidos, su 
consistencia, y bajo costo de producción. Por otro lado, también presenta ciertas 
desventajas: la complejidad de la síntesis de algunos carotenoides. Si bien se pueden 
utilizar procesos similares para producir distintos carotenoides, normalmente la síntesis de 
un nuevo carotenoide requiere el desarrollo de toda una nueva ruta química. Otro gran 
inconveniente que presenta la síntesis química de carotenoides, es la producción de mezclas 
de estereoisómeros, algunos de los cuales no se encuentran en la naturaleza y no son tan 
activos como los presentes en ella, por lo que quedan inhabilitados para el consumo por sus 
efectos secundarios indeseables. 
 
Con relación a la biosíntesis de carotenoides, ésta presenta varias ventajas. Considerando 
que existen más de 600 carotenoides en la naturaleza, se puede encontrar una gran 
capacidad biosintética en ella, sin tener que desarrollar procesos complejos de síntesis 
química. A diferencia de ésta, al saber la ruta de biosíntesis de un carotenoide se puede 
tener conocimiento de la biosíntesis de varios carotenoides. De igual manera, la producción 
de estos pigmentos por medio de organismos vivos, evita la formación de estereoisómeros 
perjudiciales para la salud. Finalmente, la capacidad biosintética de organismos 
sobreproductores puede ser mejorada gracias a la tecnología del DNA recombinante y otras 
herramientas de biología molecular. 
 
Sin embargo, resulta prudente también mencionar las desventajas de la biosíntesis de 
carotenoides. Los sistemas biológicos suelen producir una mezcla de carotenoides, lo que 
hace indispensable aplicar un proceso de purificación y extracción, el cual aumenta los 
costos de producción. Otro inconveniente es que estos pigmentos son componentes 
intracelulares, y que por lo tanto no son secretados al medio en un proceso de fermentación, 
volviendo imprescindible su extracción a partir de la célula y en consecuencia, aumentan 
los costos de producción. 
 21 
1.5 Fotobiorreactores 
En general, los fotobiorreactores son reactores especiales que, a diferencia de los reactores 
comunes, reciben luz de manera que se satisfagan las necesidades de un microorganismo 
fotosintético. Asimismo, dependiendo del microorganismo, estos pueden ser sistemas 
abiertos o cerrados. Los sistemasabiertos se usan para cepas que crecen a gran velocidad o 
a condiciones extremas de pH y salinidad. Para asegurar que se les suministre suficiente 
luz, son puestos al aire libre, de manera que reciban la luz solar. 
 
Por otro lado, los sistemas cerrados pueden incluir reactores de columna burbujeada, tipo 
airlift, es decir, reactores que garanticen una alta transferencia de masa y bajos tiempos de 
circulación, además de una aireación eficiente y bajo esfuerzo de corte. 
 
 
2. ANTECEDENTES 
La producción de carotenoides por microalgas del género Scenedesmus no ha sido 
ampliamente estudiada. Si bien es cierto que miembros de este género han sido muy 
utilizados como organismos modelo en el campo de la limnología, tecnología y manejo del 
agua, alimentación de zooplankton y efecto de sustancias químicas en su crecimiento 
(Wiltshire, 2000), la producción de carotenoides como tal, a la fecha ha sido el objetivo de 
pocos experimentos con este género. El ejemplo más reciente y representativo de dichos 
experimentos es el artículo publicado en la revista Process Biochemistry, “Acumulación y 
metabolismo de astaxantina en Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae)” de Qin et al., 
2008, en el que se describe el cultivo de S. obliquus en un sistema en dos etapas. En la 
primera etapa, la microalga se cultivó bajo condiciones de inducción (incubación a 30ºC e 
iluminación de 180 µmol m2 s-1) por 48 horas. Se analizó la composición de los 
carotenoides obtenidos y se identificaron 7 cetocarotenoides. En la segunda etapa, realizada 
bajo condiciones normales (25ºC e iluminación de 80 µmol m2 s-1) por 72 horas, la 
concentración de carotenoides disminuyó del 59.84% al 6.57%. Los resultados sugieren que 
la biosíntesis de astaxantina y los otros carotenoides puede ser controlada con las 
condiciones de cultivo. 
 
 22 
En el Laboratorio de Biotecnología de microalgas del Departamento de Biotecnología y 
Bioingeniería del CINVESTAV previo al presente estudio, se realizó un proyecto 
relacionado con los carotenoides producidos en especies del género Scenedesmus: 
“Carotenogénesis en Scenedesmus acutus” (Castelblanco, 2007), mientras que en la 
Facultad de Estudios Superiores de Iztacala se llevó a cabo el proyecto: “Caracterización 
fisiológica de Scenedesmus incrassatulus durante la síntesis de pigmentos” (Vega, 2006). 
 
En el trabajo “Carotenogénesis en Scenedesmus acutus” se realizó un seguimiento de la 
producción de carotenoides y en su correlación con el consumo de nutrientes y 
metabolismo. Se cultivó la microalga en un fotobiorreactor tipo columna burbujeada con un 
volumen de trabajo de 2 L, a 25 ºC, 200µmoles m-2 s-1. Se observó que S. acutus creció en 
forma exponencial durante los primeros siete días, con una µmax= 0.49 d
-1 y alcanzando una 
concentración máxima de biomasa de 2.0 g L-1 a los 39 días de cultivo. Al día 11 de 
cultivo el consumo de nitratos y fosfatos fue de 97% y 98%, respectivamente. A los 7 días 
hubo una disminución del contenido de clorofilas totales y de carotenoides totales, los 
cuales fueron identificados por HPLC-DAD como: β-caroteno, luteína, violaxantina y 
neoxantina. La luteína fue el carotenoide presente en mayor concentración, con un valor 
que disminuyó de 160.8 µg g-1 PS a 40.9µg g-1 PS en el día 29. 
 
En “Caracterización fisiológica de Scenedesmus incrassatulus durante la síntesis de 
pigmentos” se describieron los procesos metabólicos de Scenedesmus incrassatulus durante 
la síntesis de carotenoides. S. incrassatulus fue cultivado en medio mineral (Perales, 2004) 
en frascos de 1 L por 30 días, a 25 ºC, una densidad de flujo fotónico de 250 µmoles m-2 s-1 
con periodo de luz/oscuridad de 14/10 hr y un flujo de aire de 0.5 vvm, partiendo de un 
inóculo de 1.3* 106 cel mL-1 provenientes de un cultivo sincronizado. En el trabajo se 
menciona que la disminución de la actividad metabólica de S. incrassatulus a un nivel basal 
de mantenimiento se encuentra estrechamente relacionada con la limitación de nutrientes 
como fósforo y nitrógeno en el medio de cultivo, la alta densidad celular, el aumento de la 
concentración de carotenoides totales y la disminución en el contenido de clorofilas 
almacenadas en el espacio citoplasmático; la carotenogénesis está relacionada con la 
inhibición del metabolismo respiratorio y fotosintético. Asimismo, se determinó que en las 
 23 
condiciones experimentales utilizadas, la microalga en cuestión sintetizó isozeaxantina, 
zeaxantina, astaxantina y cantaxantina como pigmentos secundarios. Se observó que 
durante la carotenogénesis, S. incrassatulus experimentó cambios morforlógicos en su 
ultraestructura como aumento en el tamaño celular, acumulación de materiales 
electrodensos en la pared celular y aparición y desaparición de estructuras celulares. 
 
El reactor utilizado en el presente trabajo fue caracterizado por Vega-Estrada et al. 
(2005).con un cultivo de Haematococcus pluvialis. El biorreactor cuenta con un kLa entre 
10 y 32 h-1. 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
Los carotenoides se destacan por cumplir numerosas funciones en el ser humano. La 
principal de ellas, su actividad provitamínica A, junto con su desempeño como 
antioxidantes y su consecuente prevención del cáncer, como inmunopotenciadores en caso 
de enfermedades como el VIH y como compuestos que ayudan a prevenir la degeneración 
macular senil, hace de estos pigmentos unos de los compuestos más importantes para 
mejorar la salud. 
 
Asimismo, la importancia comercial de los carotenoides en áreas como la acuacultura y la 
avicultura, la industria de los cosméticos, etc., hace necesaria su obtención en forma 
natural, cuestión que orienta a la biosíntesis, pues la síntesis química en varias ocasiones 
está acompañada de estereoisómeros no naturales que perjudican la salud. La biosíntesis 
comercial de carotenoides está dominada por especies como Dunaliella salina (β-caroteno), 
Haematococcus pluvialis (astaxantina), Phaffia rhodozyma (astaxantina) y Tagetes erecta 
(luteína). 
 
En los casos anteriores, cada organismo presenta cualidades y desventajas. Por ejemplo, en 
el caso de H. pluvialis, su alta productividad (4% del peso celular seco) resulta atractiva, sin 
embargo, la extracción de este pigmento resulta complicada, debido a su acumulación en 
quistes. Este problema no se presenta en la levadura P. rhodozyma, sin embargo, su baja 
 24 
productividad (0.3% por peso seco) provoca que el proceso sea incosteable para muchos 
productores. 
 
Por otra parte, la luteína es únicamente extraída con fines comerciales de la flor mexicana 
Cempasúchil o flor de muerto, pero al igual que en H. pluvialis, la dificultad de su 
extracción vuelve la producción de luteína un proceso costoso. 
 
Los usos de los carotenoides son tan diversos que se espera que su mercado global sea de 
919 mdd para el año 2015. En el año 2007, el mercado de los carotenoides fue de 766 mdd, 
considerándosele un mercado con crecimiento anual del 2.3% para los siguientes 8 años. 
 
El β-caroteno es el pigmento que ocupa el mayor porcentaje del mercado, alcanzando 
ventas de 247 mdd por su consumo como complemento alimenticio. La astaxantina ocupa 
el segundo lugar en el mercado con 219 mdd en el mismo año, por sus usos en la 
acuacultura. 
 
Por las consideraciones anteriormente expuestas, es imprescindible buscar fuentes naturales 
de carotenoides con alta productividad y facilidad de obtención, que satisfagan las 
necesidades humanas, tanto de salud como comerciales. En el presente trabajo se investigó 
la producción de carotenoides por la microalga Scenedesmus incrassatulus, pues no se ha 
caracterizado su producción, aunque se sabe de su capacidad para producir carotenoides 
bajo condiciones de estrés, lo cual la convierte en una productora potencial de dichos 
pigmentos. 
 
HIPÓTESIS 
La aplicación de estrés nutricional y lumínico inducirá la carotenogénesis en lamicroalga 
Scenedesmus incrassatulus. 
 
 
 
 
 25 
4. OBJETIVOS 
Objetivo general 
Caracterizar la producción de carotenoides por la microalga Scenedesmus incrassatulus en 
cultivo por lote utilizando un reactor tipo airlift 
 
Objetivos específicos 
• Inducir la producción de carotenoides en la microalga Scenedesmus incrassatulus 
por eliminación de nutrientes del medio de cultivo y aplicación de estrés lumínico 
en fotobiorreactores con fotoperiodo y con luz continua. 
 
• Extraer, identificar y cuantificar los carotenoides presentes en la microalga 
Scenedesmus incrassatulus después de inducir la carotenogénesis 
 
 
 
 
 
 26 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1 Scenedesmus incrassatulus 
La cepa que se usó fue S. incrassatulus CLHE-Si01, donada por el Laboratorio de 
Hidrobiología experimental de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto 
Politécnico Nacional. 
 
5.2 Medio de cultivo mineral libre de EDTA (Anexo I) 
El medio de cultivo empleado en el presente trabajo ha sido usado en trabajos previos para 
el crecimiento de diversas cepas del género Scenedesmus (Perales, 2007). El hecho de que 
este medio sea libre de EDTA evita la quelación de iones importantes como el Fe, el cual 
no puede ser asimilado con la misma facilidad cuando está quelado que cuando se 
encuentra libre en el medio de cultivo (Soeger y Hegewald, 1988). 
 
5.3 Biorreactor airlift 
Se utilizó un biorreactor tipo airlift, con una capacidad nominal de 2 litros, caracterizado 
anteriormente por Vega-Estrada et al. (2005). El diagrama del reactor se encuentra en la 
figura 12: 
A Tapón de hule: filtro de aire (1), salida de aire (2), electrodo de pH o sensor de O2 (3), 
alimentación de medio (4), tubo para muestreo (5), aguja (6), lámparas (7) 
B Cilindro 
C Placa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Biorreactor airlift (Vega-Estrada et al., 2005). Las 
dimensiones se muestran en cm 
 27 
5.4 Protocolo experimental 
Se observó la inducción de la carotenogénesis bajo 2 diferentes periodos de luz, fotoperiodo 
12/12 hr y luz continua, aplicando estrés lumínico o nutricional o la combinación de ambos 
de tal forma que la investigación comprendió los siguientes experimentos: 
 Con luz continua: 
-Aplicación de estrés nutricional 
-Aplicación de estrés nutricional y lumínico 
-Sin aplicación de estrés 
 
 Con fotoperiodo: 
-Aplicación de estrés nutricional 
Aplicación de estrés lumínico 
-Aplicación de estrés nutricional y lumínico 
-Sin aplicación de estrés 
 
5.4. 1 Metodología 
Cada experimento comprendió tres fases: establecimiento del cultivo de Scenedesmus 
incrassatulus, cinéticas de crecimiento de la microalga y fase de inducción de la 
carotenogénesis o aplicación de estrés. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Inoculación a partir 
de matraz semilla 
1. Sincronización 
del cultivo 
 3. Crecimiento 
 
Determinaciones 
analíticas 
 4. Aplicación de estrés 
(Perales et al., 2004) 
 
Determinaciones 
analíticas 
Figura 13. Diagrama de bloques del desarrollo general de cada experimento 
 28 
5.4.1.1 Sincronización del cultivo 
En esta fase se llevó a cabo la preparación del cultivo semilla. Para ello se realizaron 3 
resiembras en medio mineral en botellas de 500mL, una resiembra cada cuatro días, para 
asegurar que las células se dividieran al mismo tiempo, eso es de manera sincrónica. 
 
5.4.1.2 Inoculación a partir de matraz semilla 
El biorreactor de 2 L fue inoculado al 10%(v/v), equivalente a 200 mL del matraz semilla. 
 
5.4.1.3 Crecimiento 
Durante el crecimiento se mantuvieron las siguientes condiciones de cultivo: 
• Aireación: 0.5 vvm 
• Iluminación: 400 µmol m-2 s-1 
• Temperatura: 22 ºC 
• Volumen de trabajo: 2 L 
• Tipo de medio: mineral (Anexo I) 
 
5.4.1.4 Aplicación de estrés 
El tipo de estrés aplicado fue nutricional o lumínico o la combinación de ambos. La 
aplicación de estrés se hizo cuando el cultivo alcanzó su mayor crecimiento, lo cual fue 
establecido por medio de las determinaciones analíticas efectuadas a lo largo de este 
periodo. 
 
Para la aplicación de estrés nutricional se realizó un lavado de células con el fin de eliminar 
los nutrientes del medio mineral (Anexo II), mientras que para la aplicación de estrés 
lumínico se agregaron 350 µmol m-2 s-1 de luz con una lámpara Tecnolite ML-150 
teniendo cuidado en mantenerla a una distancia de aproximadamente 20 cm de manera que 
la elevación de temperatura no fuera excesiva y causara la lisis celular. 
 
Durante la aplicación de estrés el cultivo se mantuvo bajo las mismas condiciones a las que 
estaba durante el crecimiento. 
 
 29 
5.4.1.5 Determinaciones analíticas 
5.4.1.5.1 Peso seco (PS) 
Se filtraron 10 mL de cultivo a través de una membrana Millipore de 0.5 µm previamente 
puesta a peso constante. La membrana conteniendo la biomasa se colocó en un horno a 
70ºC de manera que alcanzara el peso constante. Después de 24 horas la membrana se pesó 
y la diferencia de este peso con el de la membrana antes de filtrar el cultivo determinó el 
peso seco. 
 
5.4.1.5.2 Recuento celular directo 
El conteo celular se realizó en una cámara de Neubauer, donde se contaron las células en 
todos los cuadrantes para obtener un valor promedio que fue multiplicado por un factor de 
104 para obtener el número de células mL-1. 
 
5.4.1.5.3 Clorofilas (a y b) y carotenoides totales (Anexo III). 
Se realizó una extracción con metanol caliente a 2mL del cultivo. Se determinó la 
absorbancia del extracto metanólico a 666, 653 y 470 nm. Se calculó la concentración de 
clorofilas a y b y carotenoides totales en base a las ecuaciones propuestas por Wellburn 
(1994). 
 
5.4.1.5.4 Perfil de carotenoides por HPLC – DAD (Anexo IV) 
Al final de los experimentos, se tomaron alícuotas de 25 mL de cultivo y se extrajeron las 
xantofilas totales con HEAT (Hexano: Etanol: Acetona: Tolueno; 10:6:7:7). El extracto fue 
leído en un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) marca Hewlett Packard 
series 1100. 
 
Los picos de los cromatogramas fueron identificados en base a los tiempos de retención, a 
las máximas longitudes de onda características de cada pigmento y al espectro de absorción 
desarrollado por cada pico. 
 
 
 
 30 
 
5.4.1.5.5 Concentración final de cetocarotenoides (Anexo V) 
El contenido específico de cetocarotenoides (gramos de cetocarotenoides/gramos de peso 
seco) fue determinado a partir de alícuotas de 4mL del cultivo tomadas al final de los 
experimentos, siendo a su vez determinado el peso seco. 
 
Es importante mencionar que la técnica empleada en esta determinación (Boussiba, 1992) 
fue diseñada para Haematococcus pluvialis, por lo que se considera que cuando las células 
son verdes el valor obtenido en la cuantificación se refiere a los cetocarotenoides, pero 
cuando las células de H. pluvialis forman quistes y se tornan rojas, el valor obtenido por la 
técnica se puede considerar exclusivo del cetocarotenoide astaxantina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 31 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
6.1 Crecimiento celular con fotoperiodo (FP) y luz continua (LC) 
Los cultivos con fotoperiodo tuvieron una velocidad de crecimiento de de 0.308 ± 0.065 d-1 
antes de ser estresados, la cual resultó superior a la velocidad de los crecidos con LC, donde 
ésta fue de 0.168 ± 0.056 d-1. Como se observa en la figura 14 los valores de peso seco (PS) 
en los biorreactores con FP y LC fueron similares hasta el día 8, después del cual los 
experimentos con LC presentaron una desaceleración en el crecimiento, evento que ocurre 
en los fotobiorreactores con FP hasta el día 14. En el recuento celular, los fotobiorreactores 
con LC tuvieron un número máximo (14.65*106 células mL-1) el día 6 y los 
fotobiorreactores con FP (22.05*106 células mL-1) hasta el día 11, coincidiendo en ambos 
casos con las concentracionesmáximas en cuantificación de clorofilas totales. El aumento 
de PS posterior al día en el que se alcanza el mayor contenido de células puede deberse al 
aumento del tamaño celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Cinética de crecimiento por PS y recuento celular directo en fotobiorreactores 
con FP y LC. 
 
Es importante destacar es que los experimentos realizados con FP presentaron un mayor 
número de células que los cultivados con LC. Esto se debe a que la división celular ocurre 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
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2
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* 
1
0
6
Cinética de crecimiento en base a PS ( FP) Cinética de crecimiento en base a PS ( LC)
Recuento celular (FP) Recuento celular (LC)
 
 32 
principalmente al inicio del ciclo de oscuridad, situación que en los cultivos con LC no se 
presenta y que por lo tanto no les permitió dividirse con la misma oportunidad que las 
células mantenidas con FP (Kaftan, et al, 1999). 
 
La figura 15 muestra la cuantificación de pigmentos en los cultivos con FP y LC a lo largo 
del crecimiento, en donde se observa una mayor cantidad de clorofilas totales para los 
cultivos con FP (24.21 µg mL-1 al día 11) que para los fotobiorreactores con luz continua 
(13.16 µg mL-1 al día 6). Esto es probablemente debido a que a diferencia de la LC, los 
periodos de luz/oscuridad favorecen la fotosíntesis al aumentar la actividad de la RubisCO 
carboxilasa (Rost, et al. 2006), enzima implicada en la asimilación de carbono, ocasionando 
que la relación Clorofila a: carbono aumente entre un 20 y un 15% (Gilstadt et al. 1993; 
Nielsen 1997) 
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5
Clorofilas totales fotoperiodo Clorofilas totales luz continua
Carotenoides totales fotoperiodo Carotenoides totales luz continua
Figura 15. Cuantificación de pigmentos con FP y LC durante crecimiento 
 33 
 
6.2 Fotobiorreactores con luz continua 
Los cultivos con LC alcanzaron su máximo crecimiento entre el día 7 y el día 10. Una vez 
alcanzado éste, fueron sometidos a estrés lumínico y/o nutricional. 
 
En la figura 16 se observa el crecimiento mostrado en base al PS. Los fotobiorreactores 
presentaron una tendencia similar hasta el día 8 (0.55 ± 0.04 g L-1), después del cual el 
cultivo sin estrés entró en fase estacionaria (0.605 g L-1), el reactor con estrés nutricional 
aumentó su biomasa hasta 0.875 g L-1 el día 11, mientras que el cultivo que sufrió estrés 
nutricional y lumínico empezó una desaceleración de su crecimiento (0.58 g L-1) el día 10. 
0
0.1
0.2
0.3
0.4
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1
0 5 10 15 20
t(d)
P
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 L
-1
)
Sin estrés Estrés nutricional Estrés nutricional y estrés lumínico
Figura 16. Cinética de crecimiento en experimentos con luz continua. 
 
En la figura 17 se observa que el día 7 la concentración celular en los tres reactores fue de 
14.04 0.6*106 células mL-1 y pasado este tiempo, el reactor al que no se le aplicó ningún 
estrés disminuyó su número celular a 10.45*106 células mL-1 (día 10), el reactor con estrés 
nutricional continuo su crecimiento hasta el día 9 con 17.85*106 células mL-1y el reactor 
con estrés nutricional y lumínico comenzó una desaceleración. El aumento en PS un día 
después de que se llegó a la concentración celular máxima se debe a un aumento de tamaño 
de las células, situación que fue reportada antes por Vega en sus investigaciones sobre el 
metabolismo de la carotenogénesis (2006). 
 34 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12 14
t(d)
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1
0
6
Sin estrés Estrés nutricional Estrés nutricional y lumínico
Figura 17. Recuento celular en fotobiorreactores con luz continua 
 
6.2.1 Cuantificación de clorofilas y carotenoides totales 
En el caso de las clorofilas totales (Fig. 18) se observó una tendencia a disminuir después 
de la inducción y después de haber alcanzado una concentración de 7.79 mg L-1 en el 
reactor con estrés nutricional y de 13.4 mg L-1 al día 7 en el reactor con estrés nutricional y 
lumínico. 
 35 
0
2
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Sin estrés Estrés nutricional Estrés nutricional y lumínico
Figura 18. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con luz continua. Las 
flechas indican el día en que fue realizada la inducción en los fotobiorreactores (día 10). 
 
Por su parte, la cantidad de carotenoides totales (Fig. 19) varía de acuerdo al estrés 
aplicado, de tal manera que en el tratamiento sin estrés se obtuvo una concentración de 2.06 
mg L-1, mientras que en los otros tratamientos posterior a la aplicación de la condición de 
estrés hubo un aumento en la cantidad de carotenoides totales de tal forma que después de 
72 hr de iniciada la inducción el contenido de carotenoides totales alcanzó un valor de 0.91 
mg L-1 en el reactor con estrés nutricional (400 µmol m-2 s1) y de 2.15 mg L-1 en el reactor 
con estrés nutricional y lumínico (750 µmol m-2 s-1), representando esto una diferencia del 
57.7% entre los dos tratamientos y una diferencia del 4.3% entre el reactor que sufrió los 
dos tipos de estrés y el que no tuvo ninguno. 
 
 36 
0
0.5
1
1.5
2
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0 5 10 15 20 25
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Sin estrés Estrés nutricional Estrés nutricional y lumínico
Figura 19. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores con luz continua. 
Las flechas indican el día en que fue realizada la inducción en los fotobiorreactores (día 
10). 
 
6.2.2 Contenido específico de carotenoides totales 
En la tabla 5 se presenta el contenido específico máximo de carotenoides totales alcanzado 
por cada reactor. El fotobiorreactor sometido a estrés nutricional y lumínico fue el que 
presentó el mayor incremento (39.7%), mientras que el fotobiorreactor que recibió estrés 
nutricional aumentó su contenido específico de carotenoides totales en un 12.26%. Por otra 
parte, el fotobiorreactor sometido a estrés nutricional y lumínico tuvo el mayor contenido 
específico con un valor de 2.92 mg de carotenoides totales/g de peso seco, siendo éste 
27.7% superior al del fotobiorreactor que no recibió ningún tratamiento. 
 
 37 
 
Tabla 5. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con luz 
continua 
Tratamiento 
 
 
Contenido específico 
(mg de carotenoides totales g de PS-1) 
Sin estrés 2.11 (día 9) 
Estrés nutricional 
1.43 (día 10) 
1.63 (día 11) 
Estrés nutricional y lumínico 
 
1.76 (día 10) 
 2.92 (día 12) 
 
 
6.2.3 Análisis por HPLC-DAD 
El análisis por HPLC-DAD realizado en los experimentos con LC (Anexo VII) identificó la 
presencia de 3 xantofilas: luteína, astaxantina y neoxantina, lo cual concuerda con lo 
reportado anteriormente (Vega, 2006). 
 
El porcentaje relativo de cada carotenoide se muestra en la figura 20, donde se observa que 
los tres fotobiorreactores produjeron una cantidad similar de astaxantina y violaxantina y 
que el cultivo sometido a estrés nutricional no presentó neoxantina. El fotobiorreactor que 
sufrió ambos tipos de estrés fue el que presentó mayor porcentaje de astaxantina y 
violaxantina (31.88%). 
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
LC sin estrés LC con estrés nutricional LC con estrés nutricional y
estrés lumínico
Experimento
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Luteína Neoxantina Astaxantina+violaxantina
 
Figura 20. Porcentajes relativos de carotenoides identificados por HPLC-DAD (LC). 
 38 
 
La luteína ha sido reportada anteriormente como el principal carotenoide primario 
producido por especies de Scenedesmus (Bishop, 1996; Orosa et al., 2001; Qin et al., 
2008). En el caso de los tres cultivos realizados con LC la luteína fue el carotenoide 
predominante. El mayor porcentaje de luteínafue presentado por el fotobiorreactor que 
recibió estrés nutricional (80.33%), mientras que los otros dos reactores manifestaron un 
porcentaje menor, con 67.15% el fotobiorreactor que no fue sometido a ningún estrés y con 
52.28% el fotobiorreactor sometido a estrés nutricional y lumínico. La disminución que 
presenta el pigmento en el cultivo que sufrió ambos tipos de estrés probablemente se deba 
no sólo a que la luteína represente un metabolito primario en esta especie, sino también a 
que el pigmento fue degradado por el efecto de la luz. Esto sugiere que la actividad 
antioxidante de la luteína es más limitada que la de otros carotenoides, de hecho presenta 
una constante de rompimiento de oxígeno singulete (kq= 0.8*10
10 L mol-1 s-1) menor que 
otras xantofilas como la astaxantina. (kq= 2.4*10
10 L mol-1 s-1) (Di Mascio et al. 1989; Di 
Mascio et al. 1990; Di Mascio et al. 1991). 
 
Por otro lado el contenido similar de astaxantina en los tres cultivos sugiere que este 
carotenoide es producido cuando el cultivo es crecido a LUZ CONTINUA y su proporción 
se mantiene constante aún cuando después sea sometido a condiciones de estrés nutricional 
y lumínico. 
 
6.2.4 Cuantificación de cetocarotenoides 
El análisis por HPLC-DAD revela la presencia de astaxantina, de manera que los 
porcentajes presentados de cetocarotenoides se identifican principalmente como dicho 
pigmento (Fig. 21). 
 
El fotobiorreactor donde se logró el mayor porcentaje de astaxantina (0.83 %) fue el que no 
recibió ningún estrés, mientras que los otros dos reactores presentaron un porcentaje similar 
entre ellos (0.47± 0.07%). Se debe tomar en cuenta que los reactores se retiraron en 
diferentes días (a los 40 días LC con estrés nutricional, a los 25 días LC con estrés 
nutricional y lumínico y a los 15 días LC sin estrés), ya que en un principio se esperaba que 
 39 
aquellos que fueron sometidos a algún tipo de estrés desarrollaran con mayor intensidad el 
color anaranjado, lo cual implicaría un aumento en la astaxantina. A pesar de esto, el color 
no se intensificó, por lo que los posteriores experimentos se retiraron en un periodo de 
tiempo más corto. El hecho de que los cultivos sometidos a estrés hayan tenido una 
concentración inferior de astaxantina implica dos posibilidades: la primera es que las 
condiciones de estrés tuvieran un efecto contrario al esperado, es decir, que no indujeran la 
carotenogénesis. La segunda posibilidad es que al estar expuestos por mayor tiempo a estas 
condiciones la astaxantina haya alcanzado una concentración máxima y posteriormente 
fuese degradada. 
 
La primera posibilidad involucraría una disminución en el contenido específico de los 
carotenoides totales, situación contraria a la mostrada por la cuantificación de clorofilas y 
carotenoides totales. Es prudente señalar que esta última técnica pudo haber tenido una 
determinación errónea, sin embargo el incremento y la posterior disminución de 
carotenoides mostrada en el cultivo crecido sin estrés, coincidente con el cambio de 
coloración de verde a anaranjado observado en el cultivo (Anexo VI), sugiere una 
degradación de los carotenoides después de alcanzar un valor máximo. Más adelante, 
cuando se comparan los experimentos con LC y FP, se mencionan otros argumentos 
relacionados con la degradación de carotenoides. 
 
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Luz continua sin estrés Luz continua + estrés
nutricional
Luz continua + estrés
nutricional + estrés lumínico
Tratamiento
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Figura 21. Cuantificación de cetocarotenoides en fotobiorreactores con luz continua. 
 40 
6.3 Fotoperiodo (12/12) 
El lavado celular fue realizado los día 7 (estrés nutricional y lumínico), 8 (estrés lumínico) 
y 9 (estrés nutricional) para los experimentos con FP, cuando la concentración volumétrica 
de clorofilas totales empezaba a disminuir. Cabe señalar en este punto que las clorofilas 
totales en el fotobiorreactor que no recibió ningún tratamiento llegaron a su valor máximo 
(24.21µg mL-1) hasta el día 11. 
 
En cuanto al crecimiento celular los cultivos alcanzaron un PS de 0.5 ± 0.09 g L-1 al día 7, 
después del cual el cultivo que no sufrió ningún estrés creció exponencialmente hasta el día 
14, el cultivo sometido a estrés nutricional alcanzó un PS máximo el día 10 con 0.875 g L-1, 
el cultivo con estrés lumínico el valor de PS fue de 0.53 g L-1 y el reactor que sufrió ambos 
tipos de estrés se mantuvo en fase estacionaria (0.46 g L-1). 
 
0
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1.4
1.6
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2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
t(d)
P
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)
FP sin estrés FP con estrés nutricional FP con estrés lumínico FP con estrés nutricional y lumínico
Figura 22. Cinética de crecimiento de fotobiorreactores con fotoperiodo. 
 
De acuerdo a los resultados de crecimiento en base al conteo celular, la tendencia del 
crecimiento fue exponencial hasta el día 11 en el reactor que no sufrió ningún estrés, 
alcanzando una concentración de 22.05*106 células mL-1, mientras que el crecimiento 
 41 
en los otros reactores fue exponencial entre el día 7 y 8 alcanzándose una concentración 
celular máxima de 16.2*106 células mL-1 el reactor con ambos tipos de estrés y de 
11.2*106 células mL-1 el reactor con estrés lumínico. 
0
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*1
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6
Sin estrés Estrés nutricional Estrés lumínico Estrés nutricional y lumínico
Figura 23. Recuento celular directo en fotobiorreactores con fotoperiodo. 
 
6.3.1 Cuantificación de clorofilas totales y carotenoides totales 
La concentración volumétrica de clorofila total en los experimentos con FP fue de 20 ± 5 
µg mL-1 (Fig. 24). Al igual que en los tratamientos con LC, hubo una disminución de la 
clorofila total después de aplicarse algún tipo de estrés. 
 
0
5
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Sin estrés Estrés nutricional Estrés lumínico Estrés nutricional y lumínico
Figura 24. Cuantificación de clorofilas totales para fotobiorreactores con fotoperiodo. 
 
 42 
Por su parte los carotenoides totales (Fig. 25) no aumentaron en los fotobiorreactores 
que sufrieron estrés nutricional y lumínico por separado, sólo el fotobiorreactor que fue 
sometido a estrés nutricional y lumínico tuvo un aumento en la concentración 
volumétrica de los carotenoides totales del 17.25%, al tercer día de la aplicación de 
estrés. A pesar de este aumento, su concentración volumétrica máxima (1.97 µg mL-1) 
fue inferior a la alcanzada por el fotobiorreactor que no recibió ningún tratamiento (3.91 
µg mL-1). 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
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5
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t(d)
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Sin estrés Estrés nutricional Estrés lumínico Estrés nutricional y lumínico
Figura 25. Cuantificación de carotenoides totales para fotobiorreactores con 
fotoperiodo. 
 
6.2. 2 Contenido específico de carotenoides totales 
En cuanto a las concentraciones específicas de los carotenoides (Tabla 6), el 
fotobiorreactor que recibió estrés nutricional presentó un aumento del 6.96%, 
probablemente debido a la disminución del PS. Por otra parte parte, el fotobiorreactor 
que recibió ambos tipos de estrés tuvo un incremento en el contenido específico de 
carotenoides del 28%, mientras que el fotobiorreactor que fue sometido a estrés 
lumínico experimentó una disminución de carotenoides totales del 20.3%, un día 
después de haberse aplicado la condición de estrés (350 µmol m-2 s-1) Al compararse 
contenido de carotenoides totales del fotobiorreactor con estrés lumínico y nutricional 
 43 
con el que no fue sometido a ningún estrés, se observó un incremento del 15.56% en 
dicho contenido en el primero de ellos. 
 
Tabla 6. Contenido específico máximo de carotenoides totales en los reactores con 
fotoperiodo 
Tratamiento 
 
 
Contenido 
específico(mg carotenoides 
totales g de PS-1) 
Sin estrés 3.58 (día 12) 
Estrés nutricional 3.36(día 10) 
Estrés nutricional y 
lumínico 4.24 (día 10) 
Estrés lumínico 1.52 (día 7) 
 
6.3.3 Análisis por HPLC-DAD 
El análisis de hizo con muestras tomadas al final de los experimentos. No se pudieron 
identificar carotenoides en los experimentos que fueron sometidos a estrés lumínico y estrés 
nutricional y lumínico (Anexo VI). 
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Fotoperiodo sin estrés Fotoperiodo con estrés nutricional
Experimento
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Luteína Neoxantina Astaxantina+violaxantina
 
Figura 26. Porcentajes relativos de carotenoides identificados por HPLC-DAD (FP). 
 
Se identificó luteína, neoxantina y astaxantina con violaxantina, representando la luteína el 
pigmento con mayor porcentaje (78.12% en FP sin estrés y 66.43% en FP con estrés 
 44 
nutricional). El experimento que sufrió estrés nutricional presentó un porcentaje de 
astaxantina y violaxantina 2.74% más que el experimento que no sufrió ningún estrés. 
 
6.3.4 Cuantificación de cetocarotenoides 
 En la cuantificación de cetocarotenoides de los experimentos con FP (Fig. 26) se observa 
que existió una mayor proporción de estos compuestos cuando se aplicó algún tipo de estrés 
(1.1± 0.1%) que cuando no fue aplicado ninguno (0.51%). 
 
En los experimentos que fueron sometidos a estrés, se tuvo una proporción similar, tanto en 
los casos que recibieron un solo tipo de estrés como en los que sufrieron ambos. Es 
probable que el estrés nutricional haya influido en mayor medida en la inducción de la 
carotenogénesis, sin embargo es necesario destacar que la proporción de carotenoides en 
los dos cultivos a los que se les aplicó estrés lumínico, fue ligeramente menor, debido 
probablemente a que fueran degradados con mayor rapidez que los que fueron sometidos 
solamente a estrés nutricional. 
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
Fotoperiodo sin
estrés 15 días
Fotoperiodo sin
estrés 40 días
Fotoperiodo +
estrés nutricional
Fotoperiodo +
estrés lumínico
Fotoperiodo +
estrés nutricional +
estrés lumínico
Tratamiento
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Figura 27. Cuantificación de cetocarotenoides en experimentos con fotoperiodo. 
 
 
 45 
6.4 LC y FP después de la aplicación de estrés 
El contenido específico de carotenoides en los experimentos con LC fue inferior a los 
obtenidos en los reactores con FP. Aún el que fue sometido a estrés lumínico y nutricional 
tuvo menor contenido específico que el obtenido por FP sin estrés. 
 
El tratamiento que presentó mayor contenido específico de carotenoides totales fue el de FP 
con estrés nutricional y lumínico con un valor de 4.24mg carotenoides totales g de PS-1. 
 
En cuanto a los porcentajes de los carotenoides presentes, se observa que S. incrassatulus 
sintetiza principalmente luteína, representando en todos los cultivos más del 50% de las 
xantofilas totales. En el caso de los tratamientos con LC sin estrés y LC con estrés 
nutricional y lumínico, el porcentaje de luteína disminuyó debido al aumento de la mezcla 
astaxantina+violaxantina. El aumento de astaxantina como carotenoide secundario se ha 
reportado anteriormente en otras especies de Scenedesmus. (Hanagata et al. 1999, Orosa et 
al. 2001, Qin et al. 2008). 
 
En comparación con los experimentos con FP, los tratamientos con LC tuvieron un mayor 
porcentaje de astaxantina + luteína, mas si se observa la altura de los picos de astaxantina + 
violaxantina en los cromatogramas, el pico más alto pertenece a FP más estrés nutricional 
con 153.79 unidades de área (AU), es decir, que si bien tuvo un menor porcentaje de 
astaxantina que los experimentos con LC, presentó una mayor cantidad de estos 2 
pigmentos. Esto concordaría con lo obtenido por la técnica de cuantificación de 
cetocarotenoides, donde el experimento con FP y estrés nutricional mostró el mayor 
porcentaje de cetocarotenoides (1.2%) de todos los experimentos realizados. 
 
La extracción de cetocarotenoides mostró un valor más alto en fotobiorreactores cuanto 
presentaban un color verde que los que viraban a un color amarillo o anaranjado, como es 
el caso de los cultivos realizados con FP (Anexo VI). Como se mencionó anteriormente, en 
un principio se consideró la posibilidad de una cuantificación deficiente, sin embargo al 
medir el contenido específico de cetocarotenoides en el fotobiorreactor sometido a estrés 
nutricional y lumínico (FP) en los días posteriores a la aplicación de estrés se observó que 
 46 
éste diminuía del día 8 al día 19 (la aplicación de estrés se realizó el día 7), probablemente 
porque después de que se aplicó el estrés los cetocarotenoides alcanzaron un valor máximo 
y después disminuyeron, tendencia igual a la mostrada por la concentración volumétrica 
obtenida por la técnica de cuantificación de cetocarotenoides totales. Esto confirmó que la 
técnica de cuantificación de clorofilas y carotenoides totales resulta apropiada para 
observar la tendencia de aumento o disminución de los pigmentos antes y después de la 
aplicación de estrés. 
 
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
Día 8 Día 10 Día 19
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Figura 28. Disminución del porcentaje de cetocarotenoides en el fotobiorreactor con FP 
después de la aplicación de estrés nutricional y lumínico. 
 
De acuerdo a la anterior, para LC el estrés más apropiado fue el estrés nutricional y 
lumínico, mientras que para FP los resultados no son concluyentes, pues la cuantificación 
por clorofilas y carotenoides totales indica que la mayor cantidad de pigmentos fue 
obtenida en el biorreactor sometido a ambos tipos de estrés (4.24 mg g de PS-1), mientras 
que el contenido específico de cetocarotenoides indica que el mayor porcentaje fue 
obtenido por el cultivo que sólo recibió estrés nutricional, aunque los otros dos tratamientos 
tuvieron una concentración semejante. Como se mencionó anteriormente, esto podría 
deberse al estrés lumínico, sin embargo si se considera que no hubo una degradación 
excesiva de carotenoides porque el cultivo se retiró aproximadamente a 7 días de ser 
 47 
sometido a estrés a diferencia de los fotobiorreactores con LC que fueron sometidos a las 
condiciones de estrés por más tiempo. (15 a 30 días después de la aplicación de estrés). 
 
Por otra parte, si bien los porcentajes de cetocarotenoides (astaxantina) obtenidos en los 
experimentos con LC y FP demuestran una carotenogénesis inmediata después de la 
aplicación de estrés, no son comparables con los porcentajes obtenidos por la microalga 
superproductora Haematococcus pluvialis, pues ésta presenta un 4% de astaxantina por PS 
mientras que la presente cepa en su máximo valor mostró 1.2% (FP con estrés nutricional). 
 
Finalmente, cabe señalar que aún cuando en los experimentos realizados con LC se obtuvo 
una menor cantidad de biomasa y de pigmentos, se debe considerar que la degradación de 
clorofilas fue más rápida y por lo tanto los pigmentos fueron mostrados con mayor rapidez. 
De esta manera, el proceso de extracción de carotenoides se facilita, pues la presencia de 
clorofilas es escasa y no resulta necesaria su separación de los carotenoides, además de que 
no es requerida una posterior eliminación del solvente. Esto representaría una disminución 
en los costos de producción, además de que es posible que se pudiera suministrar 
directamente a peces y aves de cría. 
 
 
 
 
 
 
 
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7. CONCLUSIONES 
 
Los resultados obtenidos indican que el estrés lumínico y nutricional estimularon la 
carotenogénesis y que además, la luz continua es una forma adicional de estresar a la 
célula. 
 
El crecimiento e inducción con fotoperiodo permitió obtener una mayor cantidad de