Nubia-NoemA-Cob-CalAín

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LIPOPÉPTIDOS PRODUCIDOS POR Bacillus spp.: 
ANÁLISIS GENÉTICO, ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA E 
INTERACCIÓN CON LA b-TUBULINA 
 
 
TESIS 
 
Que presenta: 
Nubia Noemi Cob Calan 
 
Como requisito parcial para obtener el grado de: 
Doctora en Ciencias en Agricultura Tropical Sustentable 
 
Director de tesis: 
Dr. Esaú Ruíz Sánchez 
 
 
Conkal, Yucatán, México 
Diciembre, 2020 
 
 
 
 
Dr. Emanuel Hernández Núñez 
Co-director de Tesis 
 
 
Conkal, Yucatán, México, a 7 de Diciembre de 2020. 
El comité de tesis del candidato a grado: Nubia Noemi Cob Calan, constituido por 
los CC. Dr. Esaú Ruíz Sánchez, Dr. Emanuel Hernández Núñez, Dr. Filiberto Ortiz 
Chi, Dr. Arturo Reyes Rámirez, Dr. Jairo Cristóbal Alejo, y Dr. Jóse Luis Cabellos 
Quiroz, habiéndose reunido con el fin de evaluar el contenido teórico-metodológico 
y de verificar la estructura y formato de la tesis titulada: Lipopéptidos producidos 
por Bacillus spp. : Análisis genético, Actividad antifúngica e interacción con 
la b-tubulina, que presenta como requisito parcial para obtener el grado de Doctora 
en Ciencias en Agricultura Tropical Sustentable, según lo establece el Capítulo 2, 
inciso 2.13.3, de los Lineamientos para la Operación de los Estudios de Posgrado 
en el Sistema Nacional de Institutos Tecnológicos, dictaminaron su aprobación para 
que pueda ser presentada en el examen de grado correspondiente. 
ATENTAMENTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dr. Jairo Cristóbal Alejo 
Asesor de Tesis 
 
Dr. Esaú Ruíz Sánchez 
Director de Tesis 
 
Dr. Filiberto Ortiz Chi 
Asesor de Tesis 
 
 
Dr. Arturo Reyes Ramírez 
 Asesor de Tesis 
 
 
Dr. José Luis Cabellos Quiroz 
Asesor de Tesis 
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Conkal, Yucatán a 7 de Diciembre de 2020. 
 
 
DECLARATORIA DE PROPIEDAD 
 
Declaro que la información contenida en las secciones de materiales y métodos, resultados 
y discusión de este documento, es producto del trabajo de investigación realizado durante 
mi estudio de posgrado y con base en los términos de la Ley Federal del Derecho de Autor 
y la Ley de la Propiedad Industrial le pertenece patrimonialmente al Instituto Tecnológico de 
Conkal. En virtud de lo manifestado reconozco que los productos intelectuales o desarrollos 
tecnológicos que se deriven de lo correspondiente a dicha información son propiedad de la 
citada institución educativa. 
 
 
 
 
_________________________ 
M.C. Nubia Noemi Cob Calan 
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Agradecimientos
Al Programa para el Desarrollo Profesional Docente (PRODEP)
DSA/103.5/16/10039) por el financiamiento a través del programa “Apoyos Conven-
cional Nacional para Estudios Doctorado”.
Al consejo Nacional de Ciencia y Tecnoloǵıa (CONACYT) por el proyecto de Cien-
cia Básica (CB-2015-01)25431 con nombre“Diseño, śıntesis y evaluación biológica de
entendidas qúımicas basadas en fármacos para diabetes, hipertensión y antiparasita-
rio”.
Agradecemos el apoyo al HPC JUCHIMAN (CONACyT, U0003-2015-7-26609) por
la generosa asignació de los recursos informáticos para la realizació de este trabajo de
investigación.
Agradecemos el apoyo a la Coordinación General de Tecnoloǵıas de la Información y
las Comunicaciones (CGSTIC) de CINVESTAV por proporcionar los recursos HPC en
la Supercomputadora Clúster Hı́brida “Xiuhcoatl” del nodo LANCAD CINVESTAV y
ABACUS: Laboratorio de Matemática Aplicada y Cómputo de Alto Rendimiento del
Departamento de Matemáticas, que han contribuido a los resultados de investigación
reportados en este trabajo.
Agradecemos el apoyo al HPC XIBALBA adquirido por el Dr. Emanuel Hernández
Núñez donde se realizaron los cálculos numéricos de esta tesis.
Al Instituto Tecnológico Superior de Calkińı por el apoyo brindado en estos 4 años
mientras me encontraba cursando el posgrado.
Al Instituto Tecnológico de Conkal por el apoyo recibido.
A Dios y a la Virgencita Maria, roca que me sostiene y me da el aliento cada d́ıa.
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Al Dr. Esaú Rúız Sánchez, por darme la oportunidad de trabajar bajo su dirección
y por sus invaluables lecciones a nivel profesional, comentarios y sugerencias durante el
transcurso del trabajo.
Al Dr. Emanuel Hernández Núñez, por el tiempo dedicado, numerosas contribucio-
nes y apoyo incondicional en la co-dirección de este trabajo. Muchas gracias también
por tu infinita preocupación y paciencia.
Al Dr. Filiberto Ortiz Chi, por su invaluable ayuda a nivel profesional y personal.
Gracias por servirme de ejemplo de autoexigencia, trabajo riguroso, tenaz y constante.
Muchas gracias por su tiempo y comentarios en la redacción final de este trabajo, a
pesar de sus arduas ocupaciones en el trabajo.
Al Dr. José Luis Cabellos Quiroz, por su ayuda en el avance de mi trabajo, por
facilitarme algunos recursos necesarios para el desarrollo de mi investigación.
Al Dr. Daniel Cerqueda Garćıa, por la ayuda brindada y su paciencia en el apoyo
de los análisis bioinformáticos.
Al Dra. Reyna Cristina Colli Dula, gracias por sus acertados consejos, que fueron
la base fundamental en el equilibrio emocional de mi persona y brindarme ánimo para
ir superando metas d́ıa a d́ıa.
Al Dr. Jorge Abraham Tamayo Cortés, muchas gracias por haber confiado en mı́ du-
rante estos trece años y haberme formado en mis inicios en el maravilloso mundo de
la ciencia, por todos sus consejos, enseñanzas y por sus palabras de aliento en todo
momento y sobre todo por la formación humana y cient́ıfica que, aún a la distancia, me
brinda a través de los años.
Al Dr. Arturo Reyes Ramı́rez, por darme la oportunidad de realizar los experimentos
en el Instituto Tecnológico de Conkal (ITA Conkal), particularmente, en el Laboratorio
de Bioloǵıa Molecular, por sus enseñanzas, apoyo brindado.
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A todos los investigadores del ITC-DEPI, por sus enseñanzas y sugerencias durante
mi formación, por mostrarme que existen muchas posibilidades en la vida. Al Dr. Jairo
Cristóbal Alejo y al Dr. José Tun Suárez, por sus enseñanzas y amistad. Muchas gracias
a Lina y a Jenny por el gran apoyo en trámites administrativos y su amabilidad hacia
mi persona.
A mis compañeros de generación Zulemy, Roćıo, Mónica, Benigno y Roberto, por
su amistad y por toda la ayuda prestada en el transcurso de mi estancia en el ITA, en
especial a Zulemy, Benigno y Roberto, por las pláticas y anécdotas en el cub́ıculo, por
los ánimos en los ratos dif́ıciles, por mostrarme que debemos disfrutar todo lo que nos
toque vivir.
A mis amigos, Rosa Inés Parra, Daniel Dzib, Wilberth Hernández, Josué Manrique
y Guadalupe Cardoso, gracias por acompañarme y apoyarme en este camino.
A mi familia Poĺıtica en especial a la Sra. Elsa González Pech y al Sr. Santos Puc
y Cohuo por formar uno de los pilares fundamentales en el cuidado y educación de mis
hijas mientras me encontraba fuera de casa.
Y al final pero sin lugar a duda para mı́ lo más importante mi familia Cob Calan,
no soló por su aporte en mi trabajo durante este tiempo lejos de casa, sino en mi
vida. Gracias por su apoyo incondicional, por animarme a cumplir mis metas, por la
paciencia durante las ausencias y entender la razón de siempre “porque teńıa trabajo en
el laboratorio”, que fue constantemente todos estos años de posgrado. A mis hermanos
Elmer, Georgina, Argentina, Oscar, Erika, Guillermo y Zazil, muchas gracias por su
amor y su infinito apoyo.
A mis sobrinos, Bárbara, Soleyli del Mar, Karla Mia, Jesús, Elmer, Darren, Iker,
Erick, Naty, y a todos los que vendrán, pequeños seres de luz y amor que nos alegran
la existencia con tan solo una sonrisa.
Y sobre todo a mis compañeras de batallas y alegŕıas, gracias Ana Valeria y Valen-
tina Noemi, por estar siempre a mi lado en todo momento estos años, por aguantar las
horas de madrugada en que me la pasaba escribiendo,por los d́ıas en que las actividades
familiares se desarrollaban inmersas a mis actividades académicas. Gracias por todo el
amor que me brindan y por enseñarme a amar y a formar una familia, pero sobre todo
gracias por siempre estar junto a mı́, las amo infinitamente.
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Dedicatoria
A mis padres, Basilio Cob y Ana Maŕıa Calan.
A mis hermanos.
A mis pequeñas Valeria y Valentina.
Todos son mis héroes personales y el motor que me
impulsa d́ıa a d́ıa a la superación profesional,
gracias por su amor infinito y apoyo incondicional.
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Indice General
Hoja de firmas I
Declaratoria de propiedad II
Agradecimientos III
Dedicatoria VI
Indice General VII
Lista de Figuras X
Lista de Tablas XI
Resumen XII
Abstract XIV
1. Introducción General 1
1.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1. Generalidades: Bacillus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.2. Lipopéptidos producidos por Bacillus spp. . . . . . . . . . . . . 3
1.2.3. Genes de lipopéptidos en Bacillus spp. . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.4. Sitio de acción de los lipopéptidos y su posible interacción con la
�-tubulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.5. Evaluación de nuevos sitios de acción para fungicidas mediante
interacción molecular in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.5. Procedimiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
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2. Lipopéptidos producidos por Bacillus spp.: Detección de genes en
cepas nativas y metanálisis de su actividad en hongos fitopatógenos 21
2.1. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.3. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.1. Cepas en estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2. Extracción del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.3. Detección y análisis de secuencia de genes de la biośıntesis de
lipopéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3.4. Análisis de las secuencias de los genes . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.5. Recopilación de datos para el metanálisis de actividad antifúngica
de lipopéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.6. Tamaño del efecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.7. Análisis de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.4. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.4.1. Detección y análisis de genes de la biośıntesis de lipopéptidos . . 30
2.4.2. Actividad biológica de los lipopéptidos en hongos fitopatógenos 31
2.4.3. Efecto de los lipopéptidos en la inhibición de crecimiento fúngico
in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.4.4. Efecto de los lipopéptidos en la severidad de daño al tejido vegetal 35
2.5. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.6. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3. Estudio conformacional de los compuestos iturina A, surfactina y fen-
gicina 45
3.1. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.3. Metodoloǵıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4. Resultados y Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.4.1. Búsqueda conformacional de los lipopéptidos . . . . . . . . . . 50
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3.4.2. Estimación de la reactividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.5. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4. Molecular Docking and Dynamics Simulation of Protein �-Tubulin
and Antifungal Cyclic Lipopeptide 66
4.1. Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.3. Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.3.1. Homology Modeling of �-Tubulin . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.3.2. Active Site Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.3.3. Molecular Docking Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.3.4. Molecular Dynamics (MD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4. Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.1. Domain Identification and Template Search . . . . . . . . . . . 77
4.4.2. Conformational Search of the Lipopeptides . . . . . . . . . . . . 77
4.4.3. Validation of Active Site . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.4. Molecular Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.4.5. Molecular Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.5. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Conclusiones Generales 86
A. Material suplementario del Caṕıtulo 4 S88
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Lista de Figuras
1.1. Esquema de un microtúbulo y los sitios de unión de tres agentes estabi-
lizantes (MSAs). El taxol y el zampanolida se unen en el mismo sitio de
unión lumenal, mientras que el pelorusida se une a un sitio activo ubi-
cado en el exterior del microtúbulo. Un esquema del d́ımero muestra la
posición de los nucléotidos de los sitios N y E. El esquema de dos d́ımeros
muestra las distancias entre los nucleótidos a los que nos referimos en la
f́ıgura como intrad́ımero e interd́ımero. También se muestra la estructura
molecular del taxol utilizado en este estudio. . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2. Estrategia experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1. Tamaño del efecto (media e intervalo de confianza del 95%) de los li-
popéptidos en la inhibición de crecimiento fúngico emphin vitro paras
las categoŕıas iturina, surfactina y fengicina. Los tamaños del efecto se
consideraron significativos si los intervalos de confianza del 95% no se
superponen con cero. Los tamaños del efecto dentro de los análisis se
consideraron diferentes entre śı, si su intervalo de confianza del 95% no
se superponen. n: tamaño de la muestra; nfs: número de seguridad; *:
indica la robustez estad́ıstica de nfs. El tamaño medio del efecto E++ =
4.0395 (= 2.2811 to 9.3650, sesgo 95%). . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.2. Tamaño del efecto (media e intervalo de confianza del 95%) de los li-
popéptidos en la inhibición in vitro de crecimiento fúngico y en la su-
presión de la severidad de daño foliar causado por hongos fitopatógenos.
El número de muestras de puntos utilizados para calcular cada media
se muestra para cada análisis. Las medias con intervalos de confianza
no se superponen con cero se consideraron significativas.n: tamaño de la
muestra; nfs: número de seguridad;*: indica la robustez estad́ıstica de
nfs. El tamaño medio del efecto E++ = -0.9829 (IC = -1.7811 a -0.6883,
sesgo 95%). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
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2.3. Tamaño del efecto (media e intervalo de confianza del 95%) de los li-
popéptidos (iturina, fengicina y surfactina) en la severidad de daño al
tejido vegetal para las categoŕıas iturina, surfactina y fengicina. Los ta-
maños del efecto se consideraron significativos si los intervalos de con-
fianza del 95% no se superponen con cero. Los tamaños del efecto dentro
de los análisis se consideraron diferentes entre śı si su intervalo de con-
fianza del 95% no se superponen. n: tamaño de la muestra; nfs: número
de seguridad; *: indicar la robustez estad́ıstica de nfs. El tamaño medio
del efecto E++ = -1.1017 (IC = -1.8703 a -0.8299, sesgo 95%) . . . . 36
3.1. Representación estructural 2D (a) y grafo molecular (b) de la iturina A. 59
3.2. Representación estructural 2D (a) y grafo molecular (b) de la fengicina. 60
3.3. Representación estructural 2D (a) y grafo molecular (b) de la surfactina. 61
3.4. Búsqueda estocástica (método kick) de los rotámeros de menor enerǵıa
para la iturina A, fengicina y surfactina. En la parte izquierda se presen-
tan las enerǵıas de cada isómero rotaciones, ordenadas y referenciadas al
rotámero de menor enerǵıa. En la parte derecha se representa el corres-
pondiente rotámero de menor enerǵıa obtenido para cada caso, aśı como
su enerǵıa absoluta al nivel semiemṕırico PM7. . . . . . . . . . . . . . 62
3.5. Búsqueda mediante el algoritmo genético de los rotámeros de menor
enerǵıa de las moléculas (a) iturina A, (b) fengicina y (c) surfactina.
En el eje horizontal n denota el número de optimizaciones locales uti-
lizadas en cada caso. La diferencia de enerǵıa en el eje vertical, �E,
está referenciada a la menor enerǵıa obtenida mediante el método kick
(ĺınea punteada). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.6. Representación 3D de la iturina A, fengicina y surfactina, estructuras
optimizadas globalmente al nivel semiemṕırico PM7 mediante una meta-
heuŕıstica evolutiva descrita. En paréntesis se muestra la enerǵıa absoluta
correspondiente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.7. Representación tridimensional de las funciones de Fukui, f� y f+, para
los tres lipopéptidos estudiados. Las nubes en azul denotan las zonas con
mayor probabilidad de un ataque nucleof́ılico, mientras que las nubes
en verde las regiones propensas a ataques electrof́ılicos. Las esferas en
azul, rojo, gris y blanco corresponden a los átomos de Ni, O, C y H,
respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
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4.1. Alignment of the peptide sequence from the four fungal species with
the template sequence of �-tubulin (1JFF) obtained from the PubChem.
Highly conserved regions are indicated in blue. . . . . . . . . . . . . . 70
4.2. Ligand-binding site of �-tubulin protein with co-crystalized native taxol
(blue) and taxol as posed by the Autodock Vina program (pink). . . . 71
4.3. Three-dimensional structural representation of (a) iturin A, (b) fengycin,
and (c) surfactin calculated by a homemade code interfaced to Persis-
tence of Vision Ray-tracer (POVRAY). . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.4. Molecular docking simulation showing the interaction of (a) iturin A, (b)
fengycin, and (c) surfactin (green and blue) with active site residues of
�-tubulin (grey). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.5. Time evolution of (a) the ligand root means square deviation (RMSD),
(b) the interface (IRMSD), (c) the number of H-bonds between the pro-
tein and ligand, and (d) the distance between the ligand and tubulin-
binding site. Analysis was performed by Gromacs. . . . . . . . . . . . 76
S1. Interaction of docking molecular with active site �-tubulin-iturin A. . . 91
S2. Interaction of docking molecular with active site �-tubulin-fengycin. . 92
S3. Interaction of docking molecular with active site �-tubulin-surfactin. . 93
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Lista de Tablas
1.1. Actividad de lipopéptidos en la inhibición del crecimiento de fitopatóge-
nos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2. Grupos de genes implicados en la śıntesis no ribosómica de lipopéptidos
y policétidos en los genes de B. amyloliquefaciens FZB42 y B. subtilis
168. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.1. Oligonucleótidos utilizados para la detección de genes de la biośıntesis
de lipopéptidos (Ramarathnam et al. 2007). . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2. Resumen general de las fuentes de datos para Metanálisis. . . . . . . . 28
2.3. Detección de genes de lipopéptidos de Bacillus spp. nativos. . . . . . . 30
2.4. Análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes de la
śıntesis de lipopéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.5. Estad́ısticas de heterogeneidad para cada modelo en el análisis de fre-
cuencia de inhibición de crecimiento fúngico in vitro y severidad de daño
al tejido vegetal por hongos fitopatógenos expuestos a los lipopéptidos
iturina, fengicina y surfactina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.1. Búsqueda del mı́nimo global para la fengicina y surfactina mediante el
algoritmo genético (GEGA) al nivel PM7. En ambos casos el resultado
del método kick se toma como referencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.1. Binding a�nity for the molecular coupling in the �-tubulin protein com-
plex with taxol and the test lipopeptides. . . . . . . . . . . . . . . . . 72
S1. Identification of the tubulin-B subunit in the fungal species studied. . . S88
S2. Preserved domains of the �-tubulin in the fungal species studied . . . . S88
S3. Validation of �-tubulin (PDB=1JFF) as a receptor using Autodock-vina. S89
S4. A�nity of the molecular coupling of the best protein complexes-�-
tubulin-lipopeptides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S90
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Resumen
La presente tesis tuvo como objetivo fundamental caracterizar los genes de los li-
popéptidos iturina A, fengicina y surfactina, producidos por Bacillus spp., aśı como
evaluar su actividad antifúngica y su interacción con la �-tubulina. El trabajo está di-
vidido en cuatro caṕıtulos:
Para cumplirlos, en primer lugar, se realizó la caracterización molecular para la
detección y análisis de genes para la biośıntesis de los lipopéptidos iturina, fengicina y
surfactina, aśı como el metanálisis de su actividad (Caṕıtulo 2), el cual se realizó me-
diante la amplificación utilizando iniciadores espećıficos reportados por Ramarathnam
2007. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 1% mediante la
tinción con SYBR™ Green. Para el análisis de las secuencias de los genes, los productos
de PCR se mandaron a secuenciar a la empresa MacrogenUsa, (Maryland). En este
estudio se usaron 20 cepas de Bacillus spp reportadas con actividad antagónica contra
diversos hongos fitopatógenos. Para detectar la presencia de genes involucrados en
la śıntesis de lipopéptidos, se amplificaron (mediante la PCR) los genes ituA para
iturina A, fenD para fengicina y srfA para surfactina. Mediante análisis nBLAST,
se observó un rango del 98 al 100% de identidad con genes correspondientes en
varias especies de Bacillus. En cuatro cepas de Bacillus CBRF5, CBRF15, CBSN67 y
CBRM9 se observó la presencia de al menos un gen. En la cepa CBRF6 se observó la
presencia de dos genes, fabD y srfAD. Por su parte, el metanálisis de estudios realizados
sobre la actividad antifúngica de los lipopéptidos, mostró que iturina, fengicina y
surfactina reducen de manera significativa el crecimiento de hongosfitopatógenos in
vitro. Aśı mismo, estos lipopéptidos aplicados al tejido vegetal reducen la severidad del
daño producido por hongos fitopatógenos. Los lipopéptidos producidos por Bacillus
spp. podŕıan contribuir al desarrollo de fungicidas naturales para su uso en manejo de
hongos fitopatógenos.
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En el caṕıtulo 3 se aborda el estudio conformacional de los compuestos iturina A,
fengicina y surfactina, cuyas estructuras iniciales fueron obtenidas de la base de da-
tos PubChem para posteriormente realizar una exploración de la superficie de enerǵıa
potencial de cada una de ellas, considerando combinaciones en las rotaciones de sus
ángulos torsionales sin perder su conectividad. Para ello se utilizó un algoritmo de
búsqueda heuŕıstica robusto y capaz de encontrar los rotámeros de menor enerǵıa de
forma eficiente. Espećıficamente, se desarrolló un Algoritmo Genético (AG) para la
búsqueda de los individuos mejor adaptados, obteniendo soluciones del mı́nimo global
putativo en sistemas orgánicos con más de 30 grados de libertad torsional. Además, el
algoritmo genético utilizado ha demostrado ser superior a las estrategias estocásticas al
requerir menos evaluaciones para igualar e incluso obtener mejores soluciones. Para los
isómeros rotacionales de menor enerǵıa, obtenidos para los compuestos iturina A, fen-
gicina y surfactina, se realizó el cálculo de su reactividad en términos de nucleofilicidad
y electrofilicidad.
Por último, en el caṕıtulo 4 se describe la búsqueda de un posible sitio de interacción
mediante una técnica basada en métodos de docking a ciegas. Este método consiste
en la definición de un espacio conformacional de búsqueda que abarca la totalidad
de la protéına con el objeto de encontrar una región en la protéına con un mayor
número de soluciones que converjan en una menor enerǵıa de interacción relativa a
la función de evaluación del programa. En este caso se eligió el programa AutoDoc-
Vina versión 3.1, debido a su rápida convergencia gracias a la implementación de un
algoritmo genético reconocido por ser una excelente herramienta para la resolución de
complejos problemas de optimización de soluciones como es el caso de la predicción
de modos de interacción. Para elucidar las interacciones entre los lipopéptidos ćıclicos
antifúngicos, como la iturina A, fengicina y surfactina, y la protéına �-tubulina se
utilizó la estructura de la tubulina co-cocristalizada con taxol tomada del Protein Data
Bank (PDB=1JFF) y las estructuras de los lipopéptidos ćıclicos de la base de datos
PubChem. Los análisis de similitud y homoloǵıa de la estructura �-tubulina con las de
los hongos mostraron que los dominios conservados compart́ıan un 84% de similitud y
que la desviación cuadrática media de la ráız (RMSD) era inferior a 2 Å. Aśı mismo el
acoplamiento y la simulación de la dinámica molecular demostraron las interacciones
de los lipopéptidos iturina A, fengicina y surfactina con la �-tubulina, reportando que
los residuos Pro274, Thr276 y Glu27 de la �-tubulina son responsables de la formación
de 2 a 3 puentes de hidrógeno. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la iturina A
y la fengicina tienen mayor afinidad de unión que la surfactina al sitio cataĺıtico de la
�-tubulina.
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Abstract
The objective of the present thesis project is to characterize the genes of the lipopep-
tides iturin A, fengycin and surfactin produced by Bacillus spp., as well as to evaluate
their antifungal activity and their interaction with the �-tubulin. The work was divided
into three sections. In the first section the molecular characterization and analysis of
genes for the biosynthesis of iturin, fengycin and surfactin lipopeptides were performed,
in addition, a metanalysis of the activity of the three lipopeptides was also analyzed
(Chapter 2). Molecular characterization of genes was carried out using specific primers
reported by Ramarathnam 2007. The PCR products were analyzed on 1% agarose gels
by SYBR™ Green staining. For gene sequence analysis, the PCR products were sent to
Macrogen USA (Maryland) for sequencing. To detect genes involved in the synthesis of
the lipopeptides, the ituA, fenD, and srfA genes were amplified by PCR. A range from
98 to 100% of identity with the corresponding genes was observed in various strains of
Bacillus species through an nBLAST analysis. In Bacillus strains CBRF5, CBRF15,
CBSN67 and CBRM9, at least one of the gene in study was observed. Moreover, in the
Bacillus strains CBRF6, the presence of two genes (fabD and srfAD) was observed.
The meta-analysis showed that iturin, fengycin, and surfactin significantly reduce the
in vitro growth of phytopathogenic fungi. Likewise, when sprayed to plant tissues, these
lipopeptides reduced significantly the damage produced by phytopathogenic fungi. The-
se lipopeptides produced by Bacillus spp. may contribute to the development of natural
fungicides to manage phytopathogenic fungi. Chapter 3 deals with the conformational
study of the compounds iturin A, fengycin, and surfactin, whose initial structures we-
re obtained from the PubChem database to subsequently explore the potential energy
surface of each of them, considering combinations in rotations of its torsional angles
without losing its connectivity. A robust heuristic search algorithm was used to do
this, capable of finding the low-lying energy rotamers e�ciently. Specifically, a Genetic
Algorithm (GA) was developed to search for the best-adapted individuals, obtaining
solutions of the putative global minimum in organic systems with more than 30 degrees
of torsional freedom. Furthermore, the genetic algorithm used is superior to stochastic
strategies by requiring fewer evaluations to match and even obtain better solutions.
For the low energy rotational isomers obtained, a reactivity analysis was performed in
terms of nucleophilicity and electrophilicity.
The search for a possible interaction of the lipopeptides with the target site was un-
dertaken in Chapter 4, using a technique based on blind docking methods. This method
consists of defining a conformational search space that encompasses the entire protein
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to find a bounded region with a more significant number of solutions that converge
respect to the program’s evaluation function. In this case, the AutoDoc-Vina program
was chosen, due to its rapid convergence thanks to implementing a genetic algorithm re-
cognized for being an excellent tool for solving complex solution optimization problems
such as the prediction of modes of interaction. Cyclic lipopeptide structures for the
iturin A, fengycin, and surfactin were taken from the PubChem database. The tubulin
structure co-crystallized with Taxol was taken from the Protein Data Bank (PDB =
1JFF). The similarity and homology analysis for the �-tubulin structure, with fungi,
showed that the conserved domains shared 84% similarity and that the root means
square deviation (RMSD) was less than 2 Å. Likewise, the coupling and simulation of
molecular dynamics demonstrated that the interactions of the iturin A, fengycin, and
surfactin lipopeptides with �-tubulin, reporting that the Pro274, Thr276, and Glu27
residues of �-tubulin are responsible for the formation of 2 to 3 hydrogen bonds. There-
fore, these results suggest that iturin A and fengycin have higher binding a�nity than
surfactin to the catalytic site of �-tubulin.
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Caṕıtulo 1
Introducción General
1.1. Introducción
Los lipopéptidos son compuestos ćıclicos o lineales, sintetizados a partir de complejos
multienzamáticos largos. Su estructura qúımica comprende una parte ćıclica constitui-
da por un único ácido graso que tiene ligados de 7 a 10 ↵-aminoácidos (Akpa et al.
2001). Estos compuestos se sintetizan de manera no ribosómica (Pengnoo et al.2000,
Roongsawang et al. 2010). Debido a sus caracteŕısticas anfipáticas, el mecanismo de ac-
ción antagónica de los lipopéptidos se basa en su interacción con la membrana celular,
formación de poros y canales iónicos en las membranas de la bicapa liṕıdica (Deleu
et al. 2005). Los lipopéptidos exhiben una variedad de actividades antibacterianas, an-
tifúngicas, antivirales, antiinflamatorias y anticanceŕıgenas, lo que indica que tienen
altas potencialidades de aplicación en las industrias qúımica, agŕıcola, farmacéutica y
alimentaria (Meena & Kanwar 2015, Lee et al. 2017, Wang et al. 2018).
Dentro del género Bacillus, las especies B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis y B.
amyloliquefaciens, han sido reportados como los principales productores de lipopépti-
dos (Zhao et al. 2017, De Souza et al. 2018, Basit et al. 2018, Lawrance et al. 2014).
En base a sus estructuras, los lipopéptidos producidos por Bacillus spp. se clasifican
principalmente en tres categoŕıas: iturinas, fengicinas y surfactinas. Las iturinas son
ciclopéptidos compuestos de ácidos grasos �-amino y heptapéptidos de aminoácidos
C14-C17. Los efectos antagonistas de los péptidos ćıclicos iturina son el resultado de su
interacción con la membrana celular y la formación de poros (Maget-Dana & Peypoux
1994). Las fengicinas consisten en cadenas de ácido graso �-hidroxi y decapéptidos,
que forman anillos ćıclicos de lactona. Dentro de esta familia de lipopéptidos también
se incluye la plipastatinas. Las fengicinas son espećıficamente activas contra hongos
filamentosos (Koumoutsi et al. 2004, Hu et al. 2007). Las surfactinas contienen ani-
llos ćıclicos de lactona que consisten en ácidos grasos �-hidroxilados C13-C16 y hep-
tapéptidos (Yang et al. 2015). Se comporta como un biosurfactante poderoso y posee
1
actividades biológicas interesantes, principalmente al alterar la integridad de la mem-
brana como consecuencia de interacciones con los constituyentes de la membrana de
fosfoĺıpidos (Ahimou et al. 2000, Carrillo et al. 2003).
La mayoŕıa de las especies de Bacillus puede producir un tipo de lipopéptido y unos
pocos pueden producir dos o tres tipos de (Toral et al. 2018, Chen et al. 2017, Kim
et al. 2017). Por ejemplo se ha reportado que algunas cepas de B. amyloliquefaciens y B.
subtilis, exhiben una fuerte actividad antifúngica, ya que contiene los genes biosintéticos
para ocho agentes antimicrobianos, incluyendo lipopéptidos de la surfactina, fengicina e
iturina, aśı como macrolactina, dificidin, bacillaene, bacilisina y bacilibactin (Arguelles-
Arias et al. 2009).
Para la biośıntesis del lipopéptido iturina, se ha reportado que el operón consta de
cuatro marcos de lectura abierto llamados ituD, ituA, ituB e ituC, para iturina A en la
cepa B. subtillis RB14 (Tsuge et al. 2001). Para fengicina consta de un operón con cinco
marcos de lectura, fenA - E (o pps A - E ) (Steller et al. 1999) y el operón de surfactina
contiene cuatro marcos de lectura abierto ORF que codifican tres protéınas multifun-
cionales SrfA - C y una enzima externa tioesterasa / aciltransferasa SrfD (Chen et al.
2009). Los lipopéptidos en la actualidad son una alternativa antifúngica. Su sitio de
acción documentado incluye a la membrana celular y al ergosterol. Sin embargo, la
protéına �-tubulina puede ser un sitio blanco para los lipopéptidos (Chatterji et al.
2011, Downing 2000). Existen funguicidas qúımicos comerciales que actúan sobre la �-
tubulina al inhibir el ensamblaje de heterod́ımeros de ↵ y �-tubulina en microtúbulos
que son vitales para diversos procesos celulares tales como la señalización celular, la
motilidad celular, la división celular y la mitosis (Vindya et al. 2015). Los agentes que
se dirigen a la �-tubulina pueden unirse a la protéına en cualquiera de los cuatro sitios:
laulimalida, taxano / epotilona, alcaloide de la vinca y sitios de colchicina (Chatterji
et al. 2011, Downing 2000). Estos sitios de unión interactúan con compuestos activos ba-
sados en la hidrofobicidad y el tamaño de la molécula. La búsqueda de nuevas moléculas
candidatas, incluida la �-tubulina, en hongos fitopatógenos se ha vuelto más eficiente
con la ayuda de estudios de acoplamiento molecular simulados por computadora.
Por lo anterior en este trabajo se realizó la detección de genes biosintéticos para
los lipopéptidos iturina A, fengicina y surfactina en cepas de Bacillus spp. También se
analizó su actividad antifúngica mediante un metánalisis de estudios publicados y la
interacción in silico de los lipopéptidos con la �-tubulina.
2
1.2. Antecedentes
1.2.1. Generalidades: Bacillus spp.
El género Bacillus pertenece al phylum Firmicutes y pertenece a la familia Baci-
llaceae. Este género comprende al menos 180 especies de fenotipos muy diferent y sus
caracteŕısticas son: bacilo Gram-positivo, catalasa-positivo, aerobio estricto (aún que
puede crecer en v́ıa anaeróbica), productor de endosporas, de antibióticos y matriz
extracelular (biofilm) que comúnmente se encuentra en el suelo.
Bacillus tiene capacidad para producir una amplia gama de moléculas bioactivas,
que muestran fuertes propiedades antifúngicas, junto con una baja toxicidad, alta bio-
degradabilidad y caracteŕısticas amigables con el medio ambiente en comparación con
los pesticidas qúımicos (Chen et al. 2008). Adicionalmente, la capacidad para formar
endosporas, le proporciona un alto nivel de resistencia a condiciones ambientales extre-
mas, hace que estas bacterias sean buenas candidatas para el desarrollo de bioproductos
(Errington 2003, Ongena et al. 2009).
Bacillus spp. se ha utilizado durante décadas para la elaboración de suplementos
alimenticios (probióticos) para animales y humanos, aśı como de medicinas (Cutting
2011). Actualmente, un gran número de cepas de Bacillus spp. y sus metabolitos como
enzimas son usadas a nivel comercial en la elaboración de productos biológicos de uso
agŕıcola y para biorremediación (Ongena & Jacques 2008). En agricultura el géne-
ro Bacillus representan aproximadamente la mitad de los bioplaguicidas disponibles
comercialmente en el mercado mundial (Fravel 2005).
1.2.2. Lipopéptidos producidos por Bacillus spp.
Varias especies de Bacillus, como B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis y B. amylo-
liquefaciens han sido reportados como los principales productores de lipopéptidos (Zhao
et al. 2017, De Souza et al. 2018, Basit et al. 2018, Lawrance et al. 2014). Los com-
puestos producidos por Bacillus spp. son moléculas bioactivas de naturaleza qúımica
compleja que tienen una fuerte capacidad antibiótica y antifúngica (Ongena & Jacques
2008). Los grupos principales están constituidos por antibióticos como zwiterrmicina
(He et al. 1994, Hsieh et al. 2008), kanosamina (Stabb et al. 1994) y lipopéptidos
(Ongena & Jacques 2008). De estos tres grupos, los lipopéptidos son los compuestos
más estudiados por su alta actividad biocida, potencial biotecnológico y las posibles
aplicaciones en biocontrol (Chen et al. 2008).
3
Los lipopéptidos ćıclicos son protéınas sintetizadas a partir de complejos multien-
zamáticos largos, péptidos sintetasa no ribosomales (NRPSs). Su estructura qúımica
comprende una parte ćıclica constituida por un único ácido graso que tiene ligados de
7 a 10 ↵-aminoácidos (Akpa et al. 2001). Están agrupados en tres familias: iturinas,
fengicinas y surfactinas. La familia de las iturinas (principalmente iturina A y C, baci-
lomicina D, F, L y Lc y micosubtilina) son heptapéptidos con un ácido graso �-amino
de C14 a C17 de largo, que tienen actividad antifúngica e inhibitoria del crecimiento
contra una amplia gama de patógenos del suelo, foliares y postcosecha (Romero et al.
2007). La familia de las fengicinas (principalmente fengicina A y B) son decapéptidos
con un anillo lactona en la fracción pept́ıdica y un ácido graso �-hidroxilode C14 a
C18 que pueden ser saturados o insaturados. Las fengicinas mantienen una actividad
fungitóxica fuerte, especialmente contra los hongos filamentosos (Vanittanakom et al.
1986, Romero et al. 2007). Las fengicinas interactúan fácilmente con componentes prin-
cipales de la membrana del patógeno como es el ergosterol alterando la estructura y
la permeabilidad de forma dosis dependiente (Vanittanakom et al. 1986, Touré et al.
2004); y otros estudios demuestran que actúan de manera sinérgica con las iturinas (Liu
et al. 2011), y la familia de las surfactinas son heptapéptidos que tienen un ácido graso
�-hidroxilo con una cadena de carbonos de 13 a 16. Son surfactantes con excepcionales
propiedades emulsificantes y espumantes usados en biorremediación y en biotecnoloǵıa
(Jacques 2010).
En cuanto a su actividad antifúngica, se ha reportado que los lipopéptidos, iturina,
fengicina y surfactina tienen actividad contra diversas especies de hongos patógenos de
plantas dentro de los grupos Deuteromycota, Basidiomycota y Ascomycota (Chan et al.
2009, Meena & Kanwar 2015). La acción antifúngica incluye el daño y la disfunción de
membranas y organelos, alteraciones en el potencial de membrana mitocondrial, estrés
oxidativo y condensación de cromatina (Aranda et al. 2005, Gong et al. 2006, Meena
& Kanwar 2015)
Aśı mismo, varios estudios han demostrado que los lipopéptidos producidos por
Bacillus spp. reportaron actividad antagónica contra una amplia gama de patógenos
fúngicos importantes desde el punto de vista agronómico (Tabla 1.1).
4
Tabla 1.1: Actividad de lipopéptidos en la inhibición del crecimiento de fitopatógenos.
Phylum Fitopatógeno Lipopéptido Referencia
Oomycotaseudohongo Pythium ultimum Iturina/fengicina (Ongena et al. 2005)
Ascomycota Podosphaere fusca Iturina/fengicina (Romero et al. 2007)
Ascomycota Botrytis cinerea Fengicina (Ongena et al. 2005)
Ascomycota Fusarium graminearum Fengicina (Liu et al. 2005)
Zigomycota Rhizopus stolonifer Fengicina (Tang et al. 2014)
Ascomycota Aspergillus niger Fengicina (Zhang & Sun 2018)
Zigomycota Mucor rouxii Fengicina (Zhang & Sun 2018)
Proteobacteria Pseudonomas syringae Surfactina (Bais et al. 2004)
Proteobacateria Xanthomonas axonopodis Surfactina (Preecha et al. 2010)
Ascomycota Sclerotinia sclerotiorum Surfactina/fengicina (Alvarez et al. 2012)
Fuente: Modificado de Mena y Kanwar (2015).
1.2.3. Genes de lipopéptidos en Bacillus spp.
El genoma de Bacillus spp. alberga numerosos grupos de genes involucrados en la
śıntesis de metabolitos secundarios. La śıntesis y ensamblaje de lipopéptidos antifúngi-
cos como las iturinas, fengicinas y surfactinas requieren de la expresión de varios genes
codificados en el genoma bacteriano que intervienen en su formación, principalmente
de tipo sintetasas.
La presencia de genes que codifican para la biośıntesis de iturina A, se ha reportado
que posee cuatro marcos de lectura abiertos (ORF), ituD, ituA,ituB e ituC. Donde
el gen ituD exhibe homoloǵıa con la protéına malonyl CoA-transacilasa FAbD, que
participa en la śıntesis de ácidos grasos. El segundo gen, ituA , codifica una protéına
de 449 kDa que tiene tres módulos funcionales homólogos a la sintetasa de ácidos
grasos, la transferasa de aminoácidos y la sintetasa de péptidos. El tercer gen, ituB, y el
cuarto gen, ituC, codifican sintetasas pept́ıdicas de 609 y 297 kDa que forman cadenas
pept́ıdicas en el precursor de la ituA.
Con respecto a los genes que participan en la biośıntesis de fengicina en un fragmen-
to de ADN de 37 kb se ha reportado cinco genes que son fenC, fenD, fenE, fenA y fenB.
Entre estos genes fenC codifica una fengicina sintetasa de 2560 aminoácidos de largo con
una masade 287 Kda. Esta protéına contiene dos módulos de activación de aminoácidos,
que son la FenC1 y FenC2, que activan el ácido L-glutámico y la L-ornitina, respecti-
vamente. Mientras que fenB activa la L- isoleucina. Esta enzima también contiene un
dominio de tiosterasa, lo que indica que fenB participa en la terminación de la śıntesis
de fengicina (Lin et al. 1998).Las protéınas codificadas por genes pps son fengicinas
sintetasas (Tosato et al. 1997), mientras que la śıntesis de plipastatina, un antibiotico
similar a la fengicina, mostró que los genes que codifican para la fengicina sintetasa,
piplastatina y pps son altamente homólogos (Steller et al. 1999).
5
En cuanto a la biośıntesis de la surfactina lipoheptapéptida por Bacillus subtilis
está codificada por el operón srf que comprende cuatro (ORF) que codifica los compo-
nentes proteicos srfA-D del sistema multienzimático de surfactina sintetasa (Nakano
et al. 1991, Cosmina et al. 1993). Se ha demostrado que la śıntesis libre de células de
este lipopéptido se logra mediante la interacción de tres fracciones enzimáticas desig-
nadas como E1 y E2 (surfactina sintetasa), y E3 (enzima aciltransferasa). La fracción
E1 contiene a la enzima surfactina sintetasa SrfA y SrfB, cada una de las cuales com-
prenden tres módulos de activación de aminoácidos. SrfA tiosterifica a la L-Glu y dos
residuos de leucina, mientras que SrfB incorpora L-Asp, L-Val y la L-Leu como tioéste-
res, aśı mismo srfB contiene los genes comP y com A que comprenden un sistema de
traducción de señales involucrados en la v́ıa del desarrollo de competencias y es necesa-
rio para la transcripción de srfa (Nakano & Zuber 1989, Weinrauch et al. 1989, Nakano
et al. 1991). SrfC es una enzima de un módulo que contribuye al residuo de L-Leucina
del C-terminal. En cuanto el papel de la enzima tioesterasa externa SrfD (SrfTE -II)
esta codificado por el cuarto marco de lectura abierto srfD del srf -operón (Cosmina
et al. 1993), infiriendo que srfD funciona como la enzima tioesterasa/aciltransferasa en
el proceso de iniciación previamente postulado por Menkhaus et al., mejorando aśı la
formación de surfactina (Menkhaus et al. 1993).
Tabla 1.2: Grupos de genes implicados en la śıntesis no ribosómica de lipopéptidos y policétidos en los
genes de B. amyloliquefaciens FZB42 y B. subtilis 168.
Molécula B. amyloliquefaciens Tamaño B. subtilis 168 Identidad
FZB42 (kb)
Fengicina fenABCDE 38.2 ppsABCDE 60-65%
Surfactina srfABCD, aat, 334, ycx 32.0 srfAA, AB, AC, AD 73-83%
Cycx, sfp, yczE ycxB, ycxC, ycxD
Bacilomicina bmyCBAD 39.7 - 0
Péptido putativo nrsABCDEF 15.0 - 0
Bacilibactina dnbABCDEF 12.8 dhbABCDEF 60-80%
Bacilisina/anticapsin bacABCD, ywfG 6.9 ywfBCDEFG 84-93%
Macrolactina mlnABCDEFGHI 53.9 - 0
Bacillaene baeBCDE, acpK 74.3 pksBCDE, acpK 52-83%
baeGHIJLMNRS pksGHIJLMNRS
Dificidin difAYXBCDEFGHHIJKLM 71.1 - 0
Todas las śıntesis dependen del sfp, excepto la bacilisina. Debido a una mutación de cambio de marco
en la sfp, no hay expresión de los cinco grupos de genes presentes en el genoma de Bacillus subtilis168.
6
1.2.4. Sitio de acción de los lipopéptidos y su posible interac-
ción con la �-tubulina
El papel esencial de los microtúbulos en la división celular y la capacidad de los
fármacos que interactúan con la tubulina para interferir con el ciclo celular han conver-
tido a la tubulina en un objetivo exitoso para aplicaciones médicas, fúngicas y herbi-
cidas (Downing 2000). Aśı mismo, se han reportado estudios que señalan el potencial
antifúngico que tiene el acoplamiento del sitio activo de la tubulina con compuestos de
acción fúngicos de uso agŕıcola, tal es el caso del combrestatina A-4 y sus derivados y
el 2-4 Di-ter-butilfenol (Dharni et al. 2014, Ma et al. 2016).
Los microtúbulos son vitales para diversos procesos celulares como la señalización
celular, la muerte celular y la mitosis (Vindya et al. 2015).
Figura 1.1: Esquema de un microtúbulo y los sitios de unió de tres agentes estabilizantes (MSAs).
El taxol y el zampanolida se unen en el mismo sitio de unión lumenal, mientras que el pelorusida
se une a un sitio activo ubicado en el exterior del microtúbulo.Un esquema del d́ımero muestra la
posición de los nucléotidos de los sitios N y E. El esquema de dos d́ımeros muestra las distancias
entre los nucleótidos a los que nos referimos en la f́ıgura como intrad́ımero e interd́ımero. También
se muestra la estructura molecular del taxol utilizado en este estudio. Fuente: (Kellogg et al. 2017)
7
Los fungicidas actúan sobre la �-tubulina al inhibir el ensamblaje de heterod́ımeros
de ↵- y �-tubulina en los microtúbulos. Muchas de estas actividades están asociadas con
la reestructuración dinámica del citoesqueleto de microtúbulos, por ejemplo, el alarga-
miento y acortamiento de microtúbulos individuales, o incluso el desmontaje completo
de los microtúbulos. En todas estas funciones, los microtúbulos interactúan con una
gran cantidad de protéınas y ligandos que actúan estabilizando o desestabilizando los
procesos dinámicos que vaŕıan entre los tipos de células y con el ciclo celular. Las pro-
téınas asociadas a los microtúbulos (MAP) se conocen desde hace algún tiempo que
estabilizan o agrupan los microtúbulos (Andrade-Monteiro & Martinez-Rossi 1999).
Recientemente se han reportado que los MAP, promueven la despolimerización de mi-
crotúbulos (Jourdain et al. 1997).
Actualmente hay tres sitios de unión de fármacos bien establecidos en la �-tubulina:
el alcaloide de la vinca, el de taxanos y el sitio de la colchicina (Downing 2000, Chat-
terji et al. 2011). Estos sitios hidrofóbicos interactúan con compuestos basados en la
hidrofobicidad y el tamaño de la molécula. Los sitios de unión del taxano interactúan
con moléculas de alto peso molecular, caracteŕıstica que abre nuevas v́ıas para explo-
rar compuestos como potenciales sitios blancos. Los compuestos que se unen al taxano
tienen una estructura qúımica similar a los lipopéptidos ćıclicos en relación al número
de carbonos en el anillo (Oxberry et al. 2001, George et al. 2015, Lone et al. 2017).
1.2.5. Evaluación de nuevos sitios de acción para fungicidas
mediante interacción molecular in silico
En las últimas décadas, las estrategias para el diseño de fármacos asistido por
computadora, como el acoplamiento molecular, han tenido un impacto significativo en
el descubrimiento de nuevos y prometedoras entidades qúımicas con potencial actividad
biológica (Taylor 2015). Muchos grupos de investigación han reportado el uso del méto-
do de acoplamiento molecular para encontrar nuevos compuestos con probabilidades de
éxito contra diversas enfermedades (Xue et al. 2014).
El modelado molecular es un término genérico que se refiere a los métodos teóricos,
que se aplican a través de técnicas computacionales para simular el comportamiento
de las moléculas. La caracteŕıstica común de estas técnicas es la descripción a nivel
molecular de los sistemas modelados, lo que provee información detallada de los mismos.
Estos métodos hoy en d́ıa son utilizados de forma rutinaria para investigar la estructura,
la dinámica y la termodinámica de los sistemas biológicos. Una de sus ventajas es que
reduce la complejidad de los sistemas, además de proponer mecanismos moleculares que
explican los resultados experimentales de las diferentes interacciones. Adicionalmente,
8
esta técnica permite la comparación con los datos experimentales para hacer conjeturas
racionales (Sousa et al. 2006).
El acoplamiento molecular es un procedimiento computacional que intenta prede-
cir la unión no covalente de macromoléculas, de una macromolécula (receptor) y una
molécula pequeña (ligando) de manera eficiente, comenzando con sus estructuras no uni-
das, estructuras obtenidas de simulaciones de dinámica molecular (MD) u homoloǵıa.
El objetivo es predecir las interacciones y la afinidad de unión (Sousa et al. 2006).
Este proceso de reconocimiento molecular, tiene lugar tanto entre fármacos y recep-
tores, sustratos y enzimas o entre las llamadas moléculas huéspedes y hospederos que
han abierto nuevas perspectivas en la denominada qúımica supramolecular, por lo que
de forma general nos referimos a los complejos ligando-receptor. En consecuencia, el re-
ceptor debe ser contemplado como un sitio capaz de distinguir entre posibles ligandos,
y moléculas que no poseen afinidad de unión (Lehn 1988).
La simulación de interacción de un ligando con su receptor es un problema en el
que se hallan implicados muchas fuerzas de asociación intermolecular: hidrofóbicas, de
dispersión o de Vander Waals, enlaces de puente de hidrógeno y electrostáticas. Las
fuerzas que más participan en la unión parecen ser las interacciones hidrofóbicas, pero
la especificidad en la unión parece estar controlada, fundamentalmente por los enlaces
de hidrógeno y las interacciones electrostáticas.
La técnica manual de modelado de complejos ligando-receptor trata inicialmente a
este último como si fuera ŕıgido, mientras que la orientación del ligando se va ajustando
tanto por movimientos de traslación y rotación, como mediante giros de enlaces rotables
dentro del ligando. Esta maniobra de acoplamiento se denomina docking, por su analoǵıa
con el anclaje de los buques en el puerto.
En el proceso de docking de un ligando en su receptor, se intenta imitar el curso
natural de la interacción del ligando con su receptor a través de la ruta de mı́nima
enerǵıa. Normalmente, el receptor se representa ŕıgido, mientras que el ligando se le
permite cambios conformacionales. En casos favorables las dos moléculas pueden ser
aproximadas por los planos que contienen los centros de interacción, y luego mover
los planos mientras se calculan las enerǵıas de interacción. Las moléculas se aproximan
f́ısicamente la una a la otra y la conformación preferida en el encaje de las dos moléculas
se minimiza (Kuntz et al. 1982)
Localizar los complejos de mı́nima enerǵıa ligando-receptor, presenta sobre todo el
problema de que los receptores poseen formas complicadas y ajustables y de que existen
muchas formas de encajar un ligando flexible dentro de ellos.
9
Existen diversos métodos que tratan de resolver este rompecabezas de forma auto-
matizada y que se pueden agrupar en dos categoŕıas: a) los métodos de superposición,
que están basados en la complementariedad y b) los métodos basados en la enerǵıa. En
ellos se combina un método de exploración conformacional para el ligando con el cálculo
de potenciales de afinidad, en los puntos de una malla tridimensional en la que se en-
cuentra incluida la macromolécula. El ejemplo más conocido es el programa Autodock
(Goodsell et al. 1996), una técnica de docking flexible.
Este trabajo se realizó mediante el programa de uso libre Autodock-Vina (Trott &
Olson 2010), debido a que explora una variedad de enfoques estocásticos de optimi-
zación global, incluidos al algoritmo genético, optimización de enjambre de part́ıculas,
recocido simulado entre otros, combinados con varios procedimientos de optimización
local especiales para acelerar la optimización.
1.3. Hipótesis
1. Los genes para la biośıntesis de la iturina A, fengicina y surfactina, están invo-
lucrados en la biośıntesis de lipopéptidos producidos por cepas de Bacillusspp.,
su identificación molecular es posible con iniciadores espećıficos para cada uno de
ellos.
2. Los métodos de búsqueda Kick y GEGA son capaces de encontrar los rotámeros
de menor enerǵıa para los lipopéptidos, para posteriormente estimar sus sitios de
mayor reactividad qúımica mediante cálculos de densidad electrónica.
3. El acoplamiento y la dinámica molecular de los lipopéptidos iturina A, fengicina
y surfactina esta dado por las interacciones del sitio cataĺıtico en la �-tubulina
(PDB=1JFF) por los residuos de aminoácidos; con interacciones de puentes de
hidrógeno, fuerzas de Vander Waals, interacciones de London, momentos dipolares
y repulsiones hidrofóbicas..
10
1.4. Objetivos
Objetivo GeneralCaracterizar los genes de los lipopéptidos iturina A, fengicina y surfactina produci-
dos por Bacillus spp., y predecir su efecto antifúngico y su interacción con la �-tubulina.
Objetivos espećıficos
a) Identificar molecularmente los genes para la biośıntesis de los lipopéptidos en cepas
de Bacillus spp.
b) Predecir el efecto de los lipopéptidos contra hongos fitopatógenos mediante un meta-
análisis, asociado con la inhibición del crecimiento micelial y la supresión del daño
en tejidos vegetales.
c) Determinar in silico la estructura más estable de los lipopéptidos mediante un algo-
ritmo genético.
d) Estudiar la interacción molecular in silico de los lipopéptidos con la protéına �-
tubulina como sitio de acción.
11
1.5. Procedimiento experimental
Etapas
Etapa 1
Caracteriación molecular
y actividad biológica
de los lipopéptidos
Detección de genes
• Extracción del
material genético
• Amplificación de
genes por PCR
• Análisis de
secuencias
(CAP3 & BLAST)
Metanálisis
• Búsqueda de
estudios
publicados
• Extracción de
datos para
análisis
• Metanálisis e
interpretación
Etapa 2
Elucidación estructural
y estimación de la
reactividad in sillico
de los lipopéptidos
Búsqueda
conformacional de
rotámeros
• Método kick
• Implementación
de un algoritmo
genético
• Análisis de
desempeño
Análisis de la reactividad
local en las estructuras
terciarias
• Cálculo de las
funciones de Fukui
• Identificación de
los sitios nucleof́ılicos
y electrof́ılicos
Etapa 3
Evaluación in sillico
de la interacción
lipopéptido-� tubullina
Homoloǵıa
• Identificación
de homológos
• Conservación
de dominios
Acoplamiento
Molecular
• Preparación
del ligando
• Preparación
del receptor
• Interacción
Ligando-receptor
Dinámica
Molecular
• Preparación
del ligando
• Preparación
del receptor
• Equilibrio
ligando-receptor
Figura 1.2: Estrategia experimental.
La estrategia experimental se dividió en tres partes principales: la primera parte
consistió en la caracterización molecular y la actividad biológica de los lipopéptidos
producidos por Bacillus spp. En la segunda parte se realizó una búsqueda conforma-
cional de los rotámeros de menor enerǵıa de cada uno de los lipopéptidos en estudio
y finalmente la tercera consistió en la interacción de los lipopéptidos con el sitio de
unión de la �-tubulina propuesto en este trabajo como un mecanismo de acción de los
funguicidas.
12
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