SIERRA-ATANACIO-ERIKA-GABRIELA

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T E S I S 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO 
P R E S E N T A: 
ERIKA GABRIELA SIERRA ATANACIO 
 
Directoras: 
Dra. Silvia Giono Cerezo 
Dra. Rosa González Vázquez 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
Tipificación de aislados 
clínicos de Klebsiella 
pneumoniae por la técnica de 
 “Multilocus Sequence Typing” 
CIUDAD DE MÉXICO, SEPTIEMBRE DE 2016 
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LUGAR DE REALIZACIÓN 
 
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de 
Bacteriología Médica del Departamento de Microbiología de 
la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN; bajo la 
dirección de la Dra. Silvia Giono Cerezo y 
de la Dra. Rosa González Vázquez. 
 
Forma parte de los proyectos 
Análisis genético de algunas especies productoras de infecciones intrahospitalarias 
resistentes a carbapenemes del grupo Eskape, formación de biopelículas, zona de 
plasticidad en Helicobacter pylori, inhibidores de marcador Lc-3 en autofagia de 
Haemophilus, modelo in vitro de inflamasoma en ppt y rpm. Clave SIP: 20151821 
 
 
Infecciones nosocomiales resistentes a antibióticos, biopeliculas in vitro en: 
Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, Staphylococcus spp, Helicobacter pylori, PFGE, 
enzimas multilocus, adherencia, autofagia. Inflamación e infección en parto pretérmino PT 
ruptura RPM. Clave SIP: 20160618 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
ÍNDICE 
Índice de figuras 
Índice de tablas 
Resumen 
1.0 Introducción 
1.1 Generalidades y taxonomía 
1.1.1 Taxonomía de K. pneumoniae 
1.1.2 Generalidades 
1.2 Factores de virulencia. 
1.2.1 Cápsula 
1.2.2 Adhesinas 
1.2.3 Resistencia a anticuerpos y lipopolisacáridos 
1.2.4 Sideróforos 
1.3 Importancia de infecciones nosocomiales (HAI) 
1.3.1 K. pneumoniae en infecciones nosocomiales (HAI) 
1.4 Resistencia a antibióticos 
1.4.1 Antibióticos β-lactámicos 
1.5 β-lactamasas 
1.5.1 β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’s) 
1.5.2 Clasificación de las enzimas β-lactamasas 
1.5.3 Métodos para detectar susceptibilidad a antibióticos 
1.6 Métodos de evaluación de diversidad genética para 
K. pneumoniae 
1.6.1 Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE) 
1.7 Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST) 
1.8 Antecedentes de MLST 
2.0 Justificación 
3.0 Objetivos 
3.1 Objetivo general 
3.2 Objetivos particulares 
4.0 Material y métodos 
4.1 Esquema general de trabajo 
4.2 Material biológico 
4.3 Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae 
4.4 Conservación de aislados clínicos 
4.5 Perfil de resistencia a antibióticos 
4.5.1 Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 
4.6 Tipificación molecular por MLST 
4.6.1 Obtención de DNA 
4.6.2 Amplificación de los genes constitutivos por PCR 
4.6.3 Purificación del amplicón 
4.6.4 Secuenciación 
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“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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4.6.5 Análisis bioinformático 
4.6.5.1 Genotipificación por MLST 
4.6.5.2 Asignación de los complejos clonales (CC) 
4.6.5.3 Medición de la clonalidad 
4.6.5.4 Análisis de las secuencias 
4.6.5.5 Relación filogenética 
5.0 Resultados 
5.1 Determinación de la frecuencia del aislamiento de K. pneumoniae 
 de diferente origen clínico 
5.2 Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae 
5.3 Perfil de resistencia a antibióticos 
5.3.1 Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 
5.4 Tipificación molecular por MLST 
5.4.1 Amplificación de los genes constitutivos por PCR 
5.5 Análisis bioinformático 
5.5.1 Genotipificación por MLST 
5.5.2 Asignación de los complejos clonales (CC) 
5.5.3 Medición de la clonalidad 
5.5.4 Análisis de las secuencias 
5.5.5 Relación filogenética 
6.0 Discusión 
7.0 Conclusiones 
8.0 Bibliografía 
9.0 Anexo 
 
 
 
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 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Morfología de Klebsiella pneumoniae. 
Figura 2. Representación esquemática de los factores de virulencia en 
. K. pneumoniae 
Figura 3. Representación de la evasión de la fagocitosis 
Figura 4. Estructura de los principales grupos de antibióticos β-lactámicos. 
Figura 5. Mecanismo de acción del β–lactámico 
Figura 6. Hidrolisis del anillo β-lactámico 
Figura 7. Prueba confirmatoria de Doble Disco para la presencia de 
. BLEE´s. 
Figura 8. Esquema representativo de la electroforesis de campos pulsados 
Figura 9. Procedimiento resumido del análisis por MLST 
Figura 10. Esquema general de trabajo 
Figura 11. Distribución geográfica de los 93 aislados de K. pneumoniae en 
. los diferentes hospitales de la CDMX 
Figura 12. Numero de aislados clínicos de K. pneumoniae 
Figura 13. Morfología colonial característica de K. pneumoniae ATCC 
 700603 
Figura 14. Pruebas bioquímicas para la identificación de los aislados 
. clínicos de K. pneumoniae 
Figura 15. Porcentaje de resistencia a diferentes antibióticos de los 93 
 aislados clínicos de K. pneumoniae 
Figura 16. Prueba control para la confirmación de BLEE´s. 
Figura 17. Prueba confirmatoria de 56 aislados clínicos positivos a 
. BLEE´s. 
Figura 18. Electroferograma de la amplificación por PCR de los genes 
 constitutivos de K. pneumoniae ATCC 700603 
Figura 19. Porcentaje de ST´s. 
Figura 20. Población “snapshot” de K. pneumoniae, análisis comparativo 
. eBURST. 
Figura 21. Árbol filogenético obtenido mediante el programa START 2 
. v.0.9.0, por el método “Neighbor-joining”. 
Figura 22. Búsqueda de la secuencia de K. pneumoniae correspondiente 
. al alelo 1 del gen gapA. 
Figura 23. Visualización de la secuencia con el programa FinchTv. 
 
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“Multilocus Sequence Typing” 
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Figura 24. Creación del archivo de los genes secuenciados para su . 
. análisis. 
Figura 25. Visualización de ambas secuencias con el programa ClustalX 
. versión 1.83. 
Figura 26. Visualización de las secuencias en el programa BioEdit 
. Sequence Alignment Editor. 
Figura 27. Edición de nucleótidos con los programas FinchTV versión 
. 1.4.0 y BioEdit Sequence Alignment Editor. 
Figura 28. Secuencia editada del gen gapA. 
Figura 29. Introducción de la secuencia analizadaen la base de datos. 
Figura 30. Obtención de la secuencia tipo de K. pneumoniae ATCC 
. 700603 a partir del perfil alélico. 
 
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“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Taxonomía de K. pneumoniae 
Tabla 2. Diferenciación por pruebas bioquímicas de las dos especies de 
. relevancia médica de Klebsiella spp. 
Tabla 3. Criterios simplificados para la vigilancia de las infecciones 
. nosocomiales 
Tabla 4. Infecciones nosocomiales causadas por K. pneumoniae 
Tabla 5. Clasificación de las β-lactamasas. 
Tabla 6. Genes constitutivos de K. pneumoniae para MLST 
Tabla 7. Componentes de la mezcla de reacción para la PCR convencional 
Tabla 8. Programa de amplificación para los genes constitutivos de 
. K. pneumoniae 
Tabla 9. Programa de amplificación para la secuenciación para los genes 
. constitutivos de K. pneumoniae 
Tabla 10. Aislados clínicos de K. pneumoniae positivas a la prueba 
. confirmatoria de doble disco para la detección de BLEE’s 
Tabla 11. Asignación de la secuencia tipo a partir de los perfiles alélicos. 
Tabla 12. Características y polimorfismo de los genes “housekeeping” de los 
. aislados de K. pneumoniae 
Tabla 13. Frecuencia de alelos empleados en MLST para K. pneumoniae 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
RESUMEN 
Introducción. Klebsiella pneumoniae es un microorganismo oportunista asociado a 
infecciones nosocomiales (HAI) como neumonías, septicemias, además de 
infecciones de vías urinarias (IVU). La técnica de “Multilocus Sequence Typing” (MLST) 
se emplea en estudios epidemiológicos, de evolución y tipificación molecular, que 
permiten establecer la relación genética en aislados clínicos asociados a brotes 
nosocomiales. 
Objetivo. Establecer las relaciones genéticas de aislados clínicos de diferente origen 
de K. pneumoniae resistentes (BLEE’s) y sensibles a β-lactámicos de espectro 
extendido a través de la técnica de MLST. 
Métodos. Se estudiaron 93 aislados clínicos de K. pneumoniae de origen diferente. 
Se realizó la identificación por métodos convencionales de bacteriología, el 
antibiograma se obtuvo por el sistema automatizado Vitek®; lo cual permitió la 
agrupación en multidrogo-resistente (MDR), extremodrogo-resistente (XDR) y 
pandrogo-resistente (PDR), las cepas BLEE’s positivas fueron confirmadas por la 
prueba de doble disco. Se amplificaron, purificaron y secuenciaron los genes 
constitutivos de 48 aislados clínicos de K. pneumoniae de diferente origen clínico, se 
obtuvo el perfil alélico de cada aislado en la base de datos de Pasteur para MLST. 
Resultados. Se aislaron e identificaron 93 cepas clínicas de K. pneumoniae, a partir 
de urocultivos (49.5%, 46/93), seguidas de hemocultivos (21.5%, 20/93). La 
resistencia a antibióticos determinó que el 46% (43/93) fueron MDR, 17% (16/93) 
XDR y 1% (1/93) PDR, el 96% (89/93) fue resistente a ampicilina, 60% (59/93) 
fueron positivas en la prueba confirmatoria BLEE´s. Se empleó la técnica de MLST 
con siete genes constitutivos (rpoB, gapA, mdh, pgi, phoE, infB, y tonB) de K. 
pneumoniae. Se obtuvieron 30 secuencia tipo (ST) (incluyendo a K. pneumoniae 
ATCC 700603), y prevalecieron seis ST´s. El algoritmo de eBURST arrojó que la 
población “snapshots” a nivel mundial es de tipo clonal. El análisis filogenético 
determinó la relación entre las ST´s encontradas en el estudio. 
Conclusión. Los aislados ST25, ST36, ST392, ST405 y ST551 se asociaron a 
brotes nosocomiales debido a su prevalencia en el ambiente hospitalario; las ST405 
y ST551 se encontraron en muestras clínicas y de superficie. La ST1088 solo fue 
encontrada en superficies inertes, lo que representa un peligro para los pacientes 
debido a que están inmunocomprometidos. 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.0 INTRODUCCIÓN 
1.1. Generalidades y taxonomía 
 
1.1.1. Taxonomía de K. pneumoniae 
El género Klebsiella fue descrito por primera vez por Von Frisch en 1881, quien 
observó, en muestras de pacientes con rinoescleroma la presencia de este bacilo 
capsulado; el nombre del género fue dado por por Trevisan en 1885, en honor al 
microbiólogo alemán Edwin Klebs (Martínez et al., 2004). 
En 1888 Friedlander describió a K. pneumoniae causante de neumonía. Esto se 
dió mientras analizaba cultivos obtenidos en pacientes con neumonía lobar; 
observó una bacteria Gram negativa única a la que se le nombro inicialmente 
“bacilo de Friendlander” (Ledermann, 2007). 
La clasificación de especies de Klebsiella (Tabla 1), se basó inicialmente en sus 
características patógenas o de origen. Posteriormente, las claves taxonómicas 
incluyeron: la utilización de sustratos y las actividades enzimáticas del 
microorganismo. Pertenece a la familia de las enterobacterias y de acuerdo a los 
criterios de Edwards y Edwin corresponde a la tribu Klebsielleae (Tabla 1.) (Kanki, 
2002). 
Tabla 1. Taxonomía de K. pneumoniae 
Dominio: Bacteria 
Phylum: Proteobacteria 
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales 
Familia: Enterobacteriaceae 
Género y especie: Klebsiella pneumoniae 
Tomado de Koneman, 2008. 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.1.2. Generalidades 
Las especies del género Klebsiella spp. son microorganismos saprófitos, las 
cuales pueden estar presentes como biota normal, principalmente en el tracto 
respiratorio, es por ello que K. pneumoniae se considera un patógeno oportunista 
responsable de causar infecciones nosocomiales, afectando a pacientes 
inmunocomprometidos (Arenas et al., 2009). 
K. pneumoniae es bacilo Gram negativo, catalasa (+), oxidasa (-), las colonias son 
de consistencia mucoide, en gelosa MacConkey estas colonias son lactosa 
positivas (Figura 1) (Koneman, 2008). 
 
 
Figura 1. Morfología de Klebsiella pneumoniae. a) Morfología microscópica por tinción 
de Gram vista en microscopio electrónico; b) Morfología Colonial en MacConkey, 
colonias lactosa positivas (Tomado de Laboratorio de Bacteriología de ENCB). 
 
 
 
a) b) 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Existen varias especies del género Klebsiella spp.; sin embargo, las especies de 
interés medico son: K. pneumoniae y K. oxytoca, es por ello que su identificación a 
través de la prueba bioquímica de indol es de suma importancia (Tabla 2). Otras 
especies del género son: K. granulomatis, K. variicola K. alba, K. aerogenes, K. 
senegalensis, K. singapurensis y K. milletis según la clasificación 
taxonómica actual del Genebank (Pumarola et al., 1991; Izquierdo, 2003). 
Tabla 2. Diferenciación por pruebas bioquímicas de las dos especies de 
relevancia médica de Klebsiella spp. 
Prueba bioquímica K. pneumoniae K. oxytoca 
Indol - + 
Lisina + +Ornitina - - 
Fermentación de lactosa + + 
Voges-Proskauer + + 
Rojo de Metilo - - 
Producción de gas + + 
Citrato de Simmons + + 
Urea + + 
ONPG + + 
KCN + + 
Movilidad - - 
ONPG: o-nitrofenil- β D-galactopiranósido; KCN Cianuro de potasio. Tomado de 
(Koneman, 2008). 
 
1.2. Factores de virulencia 
Los principales factores de virulencia asociados a K. pneumoniae son: 
adhesinas, polisacáridos capsulares, sideróforos y lipopolisacáridos (LPS) para la 
evasión de las células inmunes del huésped (Figura 2) (Vargas, 2010). 2010) 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Figura 2. Representación esquemática de los factores de virulencia en 
K. pneumoniae. Se señala los cinco factores de virulencia que presenta K. pneumoniae: 
capsula, adhesinas, lipopolisacáridos (LPS), resistencia a anticuerpos y sideróforos 
(Vargas, 2010). 
) 
1.2.1. La cápsula 
La cápsula está compuesta de polisacáridos y ácidos complejos (ácido urónico), 
existen 77 tipos serológicos. Las cápsulas son esenciales para la virulencia 
(Highsmith y Jarvis, 1985). Los tipos capsulares más virulentos descritos son: 4 
(K1, K2, K4 y K5). La virulencia asociada a la cápsula está relacionada con el 
contenido de manosa, estos residuos son reconocidos por lectinas de superficie 
de los macrófagos, lo cual modula la fagocitosis de forma independiente de 
anticuerpos y estimula la unión del complemento (Yu et al., 2007). La presencia 
de la cápsula favorece la evasión de la fagocitosis por células polimorfonucleares 
(PMN) y evita la muerte por anticuerpos y complemento. En la figura 3, se observa 
la inhibición de la activación o la absorción de los componentes del complemento, 
especialmente C3b (Ullmann y Podschun, 1998; Vargas, 2010). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 3. Representación de la evasión de la fagocitosis. La cápsula cubre al 
complemento C3b, el cual evita que este sea reconocido por su receptor, evade la 
fagocitosis (URL 1, 2015). 
 
1.2.2. Adhesinas 
Las propiedades adhesivas están mediadas generalmente por diferentes tipos de 
pili; que son proyecciones filamentosas no flagelares sobre la superficie de la 
bacteria. Estas estructuras son de hasta 10 µm de largo y tienen un diámetro de 
1 a 11 nm; constan de subunidades de proteínas globulares poliméricos (pilina) 
con una masa molecular de 15 al 26 kDa. Hay dos tipos predominantes en 
K. pneumoniae: el tipo 1 pili (Hemaglutinina manosa sensible, MSHA, por sus 
siglas en inglés) y el tipo 3 pili (Hemaglutinina resistente a manosa, MR/K-HA, por 
sus siglas en inglés) (Sahly et al., 2008). El tipo 1 promueve la adherencia del 
microorganismo a las células del tracto respiratorio, ocasiona la proliferación de 
bacterias patógenas produciendo neumonía, principalmente en pacientes con 
ventilación mecánica a largo plazo, también se encuentra asociada a infecciones 
de vías urinarias (IVU) y pielonefritis. El tipo 3, interviene en la adherencia a las 
células endoteliales del tracto respiratorio y urinario además de su probable 
participación en la formación de biofilm o biopelículas en superficies inertes 
(Ullmann y Podschun, 1998; Vargas, 2010). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.2.3. Resistencia a anticuerpos y lipopolisacáridos 
La acción bactericida del suero es mediada principalmente por proteínas, en 
particular las proteínas del complemento C5b-C9 que se acumulan en la superficie 
del microorganismo formando un poro, por el cual se lleva a cabo un influjo de 
Na+ que provoca lisis osmótica de la bacteria (Ramm et al., 1983). La porción “O” 
del Lipopolisacárido (LPS) protege a la bacteria contra la muerte mediada por el 
complemento, las cadenas laterales de la porción “O” del LPS pueden atravesar 
la capa de la cápsula y ser expuestas al entorno exterior de la cápsula (Ullmann y 
Podschun, 1998; Vargas, 2010). 
 
1.2.4. Sideróforos 
Los sideróforos son moléculas orgánicas de bajo peso molecular con una alta 
afinidad por los iones Fe3+. El hierro es esencial en las bacterias para: crecer, 
sobrevivir, y sintetizar factores de virulencia (cápsula, adhesinas, toxinas) (Reyes, 
2005). 
 
1.3. Importancia de infecciones nosocomiales (HAI) 
Las Infecciones Nosocomiales (“Healthcare associated infections”, HAI, por sus 
siglas en inglés), actualmente llamadas infecciones asociadas a la atención de la 
salud (IAAS), son un problema relevante de salud pública de gran trascendencia 
económica y social, por lo que constituyen un desafío para las instituciones de 
salud y el personal médico responsable de su atención. Las HAI se asocian con 
altas tasas de morbilidad y mortalidad, lo que se traduce no solo en un incremento 
en los días de hospitalización sino en los costos de atención (RHoVE, 2015). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Las HAI son infecciones que se adquieren 48 h posteriores al ingreso del paciente 
en una unidad hospitalaria, en el cual la infección no se había manifestado ni 
estaba en período de incubación en el momento de ingreso del mismo; afectan 
principalmente a pacientes inmunocomprometidos (OMS, 2003). D. Siegel, 2007) 
La Norma Oficial Mexicana NOM-EM-002-SSA2-2003, para la vigilancia 
epidemiológica, prevención y control de las infecciones nosocomiales y la NOM-
045-SSA2-2005, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de las 
infecciones nosocomiales definen a una infección nosocomial como la 
multiplicación de un patógeno dentro del cuerpo del paciente y que puede o no dar 
sintomatología y que fue adquirido durante la hospitalización. 
Una encuesta de prevalencia realizada en el 2003 por la OMS en 55 hospitales de 
14 países representativos de 4 Regiones de la OMS (Europa, el Mediterráneo 
Oriental, el Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental) mostró que en promedio el 
8,7% de los pacientes hospitalizados presentaba HAI (OMS, 2003). 
Las infecciones más frecuentes de HAI son: neumonía (vías respiratorias), IVU 
(infecciones de vías urinarias), septicemia, heridas (quemaduras) y aquellas 
adquiridas en terapia intensiva La prevalencia de infecciones nosocomiales ocurre 
en unidades de cuidados intensivos (UCI) y en pabellones quirúrgicos y 
ortopédicos de atención de enfermedades agudas, la principal preocupación con 
las HAI es la resistencia a los antibiótico causando que la infección sea más 
severa (Jane, 2007; OMS, 2003). 
En los años 2006 y 2007, datos de “National Healthcare Safety Network” (NHSN, 
por sus siglas en inglés) demostraron que Escherichia coli y Pseudomonas 
aeruginosa fueron los microorganismos Gram-negativos más frecuentemente 
aislados en HAI, entre otros microorganismos también mencionados son: 
K. pneumoniae, especies de Enterobacter, Acinetobacter baumannii, y K. oxytoca 
(Hidron et al., 2008). 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
En un estudio de prevalencia de HAI realizado en México durante el 2011 por la 
Secretaría de Salud en hospitales generales de las principales instituciones 
públicas de salud en el país, se encontró que el 21% de los pacientes 
hospitalizados presentaban HAI, lo cual es más del doble de los estándares 
internacionales (RHoVE, 2015). 
Los procedimientos invasivos juegan un papel importante en el desarrollo de HAI, 
además de las condiciones predisponentesdel huésped que evidentemente son 
relevantes. Las condiciones que predisponen a la adquisición de HAI son: la 
inmunosupresión, ya sea por fármacos o por la enfermedad de base; los 
trastornos de la deglución que acompañan al paciente que ha sufrido un accidente 
vascular cerebral, situación que comporta un elevado riesgo de infección 
respiratoria por aspiración, aquellas relacionadas con la colonización 
por Staphylococcus aureus, frecuente en pacientes con insuficiencia renal crónica 
(IRC), cirrosis hepática o diabetes mellitus, y que suponen un riesgo elevado de 
infección por dicho microorganismo durante el ingreso hospitalario (Paterson et 
al., 2004).(Paterson 
Se han establecido criterios para identificar las HAI en determinados sitios del 
organismo (Tabla 3). Las cuales derivaron de las definiciones publicadas por los 
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en los Estados 
Unidos de América o durante conferencias internacionales, los cuales se usan 
para la vigilancia de las mismas (OMS, 2003). 
 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Tabla 3. Criterios simplificados para la vigilancia de las infecciones nosocomiales 
Tipo de infección nosocomial Criterios simplificados 
Infección del sitio de una 
intervención quirúrgica 
Cualquier secreción purulenta, absceso o celulitis difusa en el 
sitio de la intervención quirúrgica en el mes siguiente a la 
operación 
Infección urinaria Cultivo de orina con resultados positivos (1 ó 2 especies) al 
menos con 105 bacterias/ml con síntomas clínicos o sin ellos. 
Infección respiratoria Síntomas respiratorios con manifestación de por lo menos 
dos de los siguientes signos durante la hospitalización: tos, 
esputo purulento, nuevo infiltrado en la radiografía del tórax, 
compatible con infección. 
Infección del sitio de inserción de 
un catéter vascular 
Inflamación, linfangitis o secreción purulenta en el sitio de 
inserción del catéter. 
Septicemia Fiebre o escalofrío y por lo menos un cultivo de sangre con 
resultados positivos. 
Tomado de (OMS, 2003) 
Las HAI también pueden considerarse endémicas o epidémicas. Las infecciones 
endémicas son las más comunes, se dan dentro de la unidad hospitalaria y 
permanecen durante un tiempo determinado en un lugar concreto, que afecta a 
un número importante de personas y son consideradas: bacteriemia relacionada 
con catéter, neumonía asociada a ventilación mecánica, infección de la herida 
quirúrgica y la infección de vías urinaria (UVI) asociada a catéter vesical. Mientras 
que, las infecciones epidémicas están relacionado con brotes, definidos 
epidemiológicamente como un aumento inusual del número de casos de una 
determinada enfermedad en una población específica, en un periodo de tiempo 
determinado. El primer brote investigado por el CDC se publicó en 1956, y a partir 
de este momento y especialmente en las últimas 2 o 3 décadas han existido 
brotes epidémicos en los hospitales de la mayoría de los países del mundo y se 
considera actualmente como un problema creciente. Las técnicas basadas en 
Biología Molecular son de gran ayuda en la diferenciación de brotes epidémicos y 
distingue dentro de un problema endémico (Horcajada y Padilla, 2013) 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
10 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.3.1. K. pneumoniae en infecciones nosocomiales (HAI) 
K. pneumoniae es un patógeno oportunista relacionado con infecciones 
nosocomiales en unidades de cuidado intensivo y salas de pediatría, empleando 
como tratamiento el uso β-lactámicos sin embargo, se aíslan cada vez con más 
frecuencia cepas productoras de BLEE´s, el problema es aún mayor, ya que al 
ser más difíciles de tratar aumenta la tasa de mortalidad (Sanchez et al., 
2011).(Isabel Sánchez-Romero, 2011) 
K. pneumoniae se describe como el cuarto patógeno causante de HAI y ha sido 
asociada a un 2-5% total de las mismas y el 36% fueron productores de BLEE´s, 
cuya resistencia a cefalosporinas de tercera generación se ha incrementado 
significativamente (Morones et al., 2016). 
Vargas y cols., 2010, determinaron cuales son los principales tipos de infección 
nosocomial, Tabla 4 (Vargas, 2010). (Merino S, 1992) 
Tabla 4. Infecciones nosocomiales causadas por K. pneumoniae 
Infección % De las infecciones causadas por 
Klebsiella 
Unidad de Terapia Intensiva (UTI) 6-17 
Neumonía 7-14 
Septicemia 4-15 
Infecciones de herida 2-4 
Otras infecciones nosocomiales en 
pacientes de la unidad de cuidados 
intensivos (UCI) 
4-17 
Septicemia neonatal 3-20 
Tomado de Vargas, 2010 
 
Los datos proporcionados por la RHoVE demuestran un incremento en la 
resistencia a antibióticos entre los principales géneros son: Klebsiella spp., 
Acinetobacter spp., y Pseudomonas spp., presentan un problema hospitalario, por 
lo que es importante estudiar su epidemiología (Sydnor y Trish, 2011). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
11 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.4 Resistencia a antibióticos 
La aparición de resistencia a múltiples antibióticos en bacterias patógenas se ha 
convertido en una amenaza significativa para la salud pública. Los antibióticos 
para enterobacterias se clasifican en 17 categorías, el cual contiene agentes 
antimicrobianos. Magiorakos y cols, 2012 propusieron la agrupación en 
multidrogo-resistente (MDR “multidrug-resistant”), extremodrogo-resistente (XDR 
“extensively drug-resistant”) y pandrogo-resistente (PDR “pandrug-resistant”), para 
Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Enterobacterias, Pseudomonas 
aeruginosa y Acinetobacter spp. En las enterobacterias, se describe a una cepa 
MDR; como aquellas que presenten resistencia en un agente de al menos 3 
categorias de antibióticos o más; XDR, son las cepas que tienen resistencia a un 
agente de todos las categorias de antibióticos o menos 2 categorias; PDR, son 
aquellas que tienen resistencia a todos los agentes de todas las categorias 
(Magiorakos et al., 2012). 
 
1.4.1 Antibióticos β-lactámicos 
Los β-lactámicos son un grupo de antibióticos inocuos para el hombre ya que, 
actúan sobre la pared celular de los microorganismos, porque bloquean a las 
enzimas biosintéticas de la pared que sintetizan a los peptidoglicanos que solo se 
encuentran en las células procariotas y no tiene homólogo en las células animales 
eucariotas (Reyes, 2005). 
Los antibióticos β-lactámicos presentan en su estructura química un anillo 
β-lactámico que puede fusionarse con otros anillos y tener distintos sustituyentes, 
dando lugar a cuatro grandes grupos de antibióticos: penicilinas, cefalosporinas, 
carbapenémicos y monobactámicos (Figura 4) (Paterson y Bonomo, 2005). 
(Paterson D, 2005) 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
12 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 4. Estructura de los principales grupos de antibióticos β-lactámicos. 
Presentan el anillo β-lactámico con sus distintos sustituyentes (Paterson y Bonomo, 
2005). 
 
Los antibióticos β-lactámicos son agentes bactericidas que producen su efecto 
principalmente a través de 2 mecanismos: inhibición de la síntesis de la pared 
bacteriana e inducción de la autolisis bacteriana (Suárez y Gudiol, 2009). 
El anillo β-lactámico presenta una similitud estructural con la región del 
pentapéptido al que se unen las enzimas PBP (“penicillin binding protein”, proteína 
de unión a penicilina), de forma covalente e impide la formación de la pared 
celular, por lo tanto la bacteria muere debido a cambios en la presión osmótica. 
Para que actúen los β-lactámicos, es preciso quela bacteria se encuentre en fase 
de multiplicación, ya que éste es el momento en el que se sintetiza la pared celular 
(Figura 5) (Suárez y Gudiol, 2009). (Suárez, 2009) 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
13 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 5. Mecanismo de acción del β–lactámico. El β-lactámico inhibe la formación 
de la pared celular causando la inestabilidad en la bacteria y ocasiona su muerte 
(Paterson y Bonomo, 2005). 
 
1.5 β- lactamasas 
Las β-lactamasas son enzimas codificadas cromosomalmente en el DNA o por 
plásmidos. Interactuan con los antibióticos β-lactámicos, hidrolizan el anillo β- 
lactámico dan como producto una molécula con un grupo carboxilo inactivando al 
antibiótico y no puede ejercer su acción, como se observa en la figura 6. (Suárez y 
Gudiol, 2009). 
 
Figura 6. Hidrólisis del anillo β-lactámico. Al actuar la enzima β-lactamasa rompe el 
enlace C-N, evitan que el antibiótico β-lactámico ejerza su acción (Suárez y Gudiol, 
2009). 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
14 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.5.1 β-lactamasas de espectro extendido (BLEE’s) 
Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE, por sus siglas en inglés) son un 
grupo de rápida evolución que comparten la capacidad de hidrolizar cefalosporinas 
de tercera, cuarta generación y el aztreonam; son inhibidas por el ácido 
clavulánico. Las cepas productoras de BLEE’s tienen mayor potencial de 
patogenicidad que las no productoras. En la última década se han generado 
infecciones de K. pneumoniae multiresistentes (Rocha, 2006). El primer informe 
de plásmidos que codifican para β-lactamasas que hidrolizan las cefalosporinas de 
amplio espectro se publicó en 1983 (Knothe et al., 1983). 
La primera β-lactamasa mediada por plásmidos se denominó TEM-1, la cual fue 
descrita en 1965 en E. coli, dicha enzima es capaz de hidrolizar ampicilina a una 
velocidad mayor que las β-lactamasa codificadas en el DNA y tiene una actividad 
insignificante contra cefalosporinas de amplio espectro. La enzima TEM-2 descrita 
posteriormente y tiene el mismo perfil hidrolítico de TEM-1 sin embargo, difiere de 
TEM-1 por tener un promotor nativo más activo y una diferencia en el punto 
isoeléctrico. En 1983, se describió la β-lactamasa SHV-1 (sulfridrilo variable) la 
cual es producida por la gran mayoría de cepas de Klebsiella pneumoniae. 
(Paterson y Bonomo, 2005; Pérez et al., 2007). 
 
1.5.2 Clasificación de las enzimas β-lactamasas 
Las β-lactamasas se clasifican de acuerdo a dos esquemas: clasificación 
molecular de Ambler y la clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros. La 
clasificación de Ambler las divide en cuatro clases de β-lactamasas (A-D). 
Basandose en la homología que presentan las proteínas. Las clases A, C y D son 
serin-β-lactamasas y la clase B son metalo-β-lactamasas (Ambler, 1980; Bush y 
Jacoby, 2010). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
15 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
La clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros también consta de cuatro grupos así 
como diversos subgrupos la cual se muestra en la tabla 5. Esta clasificación se 
basa en las características funcionales, de las enzimas además de tomar en 
cuenta diversos criterios tales como las propiedades bioquímicas (peso molecular 
y secuenciación de nucleótidos), las propiedades físicas (punto isoeléctrico), el 
espectro de hidrólisis, de inhibición y la codificación (plasmídica o cromosómica). 
Esta clasificación es mucho más importante en el diagnóstico microbiológico de 
laboratorio; ya que considera los substratos y los inhibidores de las β-lactamasas 
clínicamente relevantes (Bush, 1995; Bush y Jacoby, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
16 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Tabla 5. Clasificación de las β-lactamasas. 
Grupo funcional 
De Bush, Jacoby-
Medeiros 
Tipo 
molecular 
De Ambler 
Inh 
AC 
Atributos de las Beta-lactamasas en el grupo funcional 
Grupo Subgrupo 
1 C - 
Amp C β -lactamasas en bacterias Gram-negativas. 
Los genes a menudo son cromosómicos pero pueden 
ser plásmido-codificados. Confiere resistencia a todos 
los tipos de β –lactámicos, excepto las carbapenasas, 
no son inhibidas por el ácido clavulánico. 
2 
2a A + 
Incluyen penicilinasas estafilocócica y enterocóccica. 
confiere alta resistencia a las penicilinas 
2b A + 
B-lactamasas de amplio espectro, incluyen TEM-1 y 
SHV-1, primordialmente de bacterias Gram negativas. 
2b,c A + 
Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) 
confieren resistencia a las penicilinas, oxyimino-
cefalosporinas y monobactámicos (aztreonam) 
2br A +/- 
β- lactamasas tipo TEM y una tipo SHV que son 
resistentes a los inhibidores. 
2c A + Enzimas que hidrolizan la carbenicilina 
2d D +/- 
Enzima que hidrolizan la cloxacina (oxacilina):inhibidas 
moderadamente 
2e A + cefalosporinasas 
2f A + 
Enzimas que hidrolizan los carbapenemes con serina 
en la zona activa. 
3 3a,3b,3c B - 
Metalo-beta-lactamasas que confieren resistencia a los 
carbapenemes y todos los tipos de beta-lactámicos 
excepto los monobactámicos. No inhibidas por el ácido 
clavulánico. 
4 ND - 
Penicilinasas que no caben en otro grupo. No son 
inhibidas por el ácido clavulánico. 
Inh: inhibidores; AC: ácido clavulánico Tomado de Bush y Jacoby, 2010 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
17 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.5.3 Métodos para detectar susceptibilidad a antibióticos 
El “estándar de oro” para el estudio de la resistencia a antibióticos es la 
determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI o MIC por sus siglas en 
inglés) la cual se hace por la técnica de dilución en caldo o en agar sin embargo, 
debido a que su realización es poco práctica en la rutina diaria del laboratorio de 
Microbiología se ha recurrido a técnicas como la prueba de difusión con disco y los 
métodos de microdilución en caldo, empleados en los sistemas de identificación 
automatizados y en estudios de sensibilidad antimicrobiana, en nuestro país 
principalmente por las marcas comerciales automatizados: Vitek® (BioMerieux), 
Phoenix® (Becton Dickinson) y MicroScan® (DadeBehring) (Vargas, 2010; CLSI, 
2014). 
Los resultados arrojan la sensibilidad de los antibióticos, lo cual permite evaluar si 
la cepa presenta BLEE´s, para ello se realiza la prueba confirmatoria de doble 
disco (DD) según las recomendaciones de la CLSI, 2014. A partir de una 
suspensión bacteriana ajustada al 0.5 de la escala McFarland, se siembra 
masivamente en medio Mueller- Hinton (MH), se colocan los discos de: cefotaxima 
(CTX) 30µg y CTX + ácido clavulánico 30µg/10µg; ceftazidima (CAZ) 30µg, CAZ + 
Acido clavulánico 30µg/10µg, a una distancia de 20-30 mm de centro a centro. El 
resultado será positivo si se observa un incremento en el diámetro del halo de 
inhibición (≥5 mm), alrededor del sensidisco CTX ó CAZ más ácido clavulánico, en 
comparación del que no tiene ácido clavulánico (Figura 7) (CLSI, 2014). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
18 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 7. Prueba confirmatoria de Doble Disco para la presencia de BLEE´s. Se 
observa un aumento en el halo de inhibición cuando se combina cefalosporina + ácido 
clavulánico en relación a cuando solo se usa la cefalosporina (URL 2, 2016). 
 
1.6 Métodos de evaluación de diversidad genética para K. pneumoniae 
 
1.6.1 Electroforesisen Gel de Campo Pulsado (PFGE) 
La técnica de PFGE se basa en la separación de las moléculas, en función a la 
capacidad de corrimiento en un gel de agarosa que es sometido a un campo 
eléctrico pulsante, de tal manera que la velocidad de los mismos será 
directamente proporcional a su tamaño (Vimont et al., 2008). Los dos ángulos de 
los campos eléctricos se encuentran cerca a la perpendicularidad, no son 
uniformes en la intensidad de campo y cambian de manera alterna (pulsos) 
(Cardozo et al., 2013). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
19 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
En un gel de forma rectangular un campo es homogéneo y genera así dos filas 
de electrodos de puntos ubicados paralelamente y en lados opuestos del gel; el 
otro campo no es homogéneo y es generado por una fila de electrodos de puntos 
como cátodo y un electrodo de punto al lado opuesto como ánodo, figura 8 
(Cardozo et al., 2013). 
 
Figura 8. Esquema representativo de la electroforesis de campos pulsados. Del lado 
izquierdo se observa el corrimiento electroforético a diferentes ángulos, del lado derecho 
el gel revelado; en donde se observan las bandas de corrimiento (Cardozo et al., 2013). 
 
Las variaciones se pueden presentar en el voltaje, la concentración del gel de 
agarosa, el tiempo, los pulsos, la fuerza iónica del amortiguador y la temperatura. 
Los resultados permiten distinguir entre cepas idénticas con 100% de similitud y 
cepas relacionadas con 80% de similitud (Vimont et al., 2008). 
Los perfiles de DNA (pulsotipos) presentan entre 10 y 30 fragmentos de DNA con 
un tamaño variable, que oscila entre 10 y 800 kb. La interpretación de los 
pulsotipos se realiza aplicando los criterios de Tenover y cols, 1995. Esta técnica 
permite la separación de fragmentos de mayor tamaño (hasta 1.000 kb); es 
altamente reproducible y tiene un poder de discriminación elevado (Tenover et al., 
1995; Cardozo et al., 2013) 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
20 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.7 . Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST) 
La secuencia de multilocus (MLST) es un método basado en la amplificación y 
secuenciación de genes denominados “housekeeping” (genes constitutivos), que 
caracteriza a aislados bacterianos. La secuencia de DNA de cada gen tiene un 
tamaño aproximado de 450-500 pb. Las secuencias analizadas pueden asignarse 
como alelos, cada uno de los siete loci elegidos, definen un perfil alélico o 
secuencia tipo (ST “sequence type”), figura 9. La gran ventaja de la MLST es que 
los datos de las secuencias se almacenan y se pueden comparan con una base 
de datos central, a través de Internet en contraste con la mayoría de los 
procedimientos de tipificación que implican la comparación de tamaños de los 
fragmentos de DNA en geles de agarosa (Vázquez y Berrón, 2004; URL 3). 
La aplicación de la MLST es descubrir variantes alélicas en varios genes 
conservados generalmente se estudian siete genes, para la caracterización de 
cepas bacterianas. MLST examina múltiples genes de limpieza que codifican 
proteínas con funciones escenciales; por lo que la variación observada en estas 
secuencias es, por tanto, neutra o casi neutra (Maiden et al., 1998). 
Las características de cada gen “housekeeping”, así como de los fragmentos 
internos de éstos, se utiliza en métodos de diversidad genética y debe ser 
realizada para cada especie bacteriana de forma individual. Los genes utilizados 
deberán estar lo mas repartidos posible a lo largo del cromosoma bacteriano, no 
deberán estar flanqueados en ninguno de sus extremos por genes codificantes de 
proteínas sometidas a presión selectiva; se seleccionan los siete genes que 
ofrezcan un mayor grado de polimorfismo. 
El análisis de los resultados MLST se realiza vía internet, existen bases de datos 
para cada microorganismo (http://mlst.net) y que permite al usuario realizar 
consultas de alelos, perfiles alélicos, de aislados específicos con objeto de 
conocer su relación con otros aislados incluidos en la base (URL 4). 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
21 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
La secuencia del análisis de los resultados es la siguiente (URL 4): 
1. Amplificación y posterior secuenciación de los fragmentos variables de los siete 
genes previamente seleccionados. La secuencia de cada uno de los loci se alinea 
con las ya existentes en una base de datos centralizada. Si la secuencia coincide, 
el programa asigna uno de los alelos ya identificados; en caso contrario, asigna un 
nuevo número a ese nuevo alelo. La asignación de los alelos se realiza de forma 
inequívoca al secuenciar ambas hebras de DNA, por lo que las variaciones en la 
secuencia de DNA son de esta forma "autentificadas". 
2. Una vez asignado un número a cada alelo, se genera un perfil alélico que será 
producto de la combinación de los siete alelos ya asignados. 
3. Después de la designación de los perfiles alélicos se realiza una comparación 
entre cepas. 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
22 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 9. Procedimiento resumido del análisis por MLST. Se señalan los pasos 
indispensables para la aplicación de la técnica de MLST (Vázquez y Berrón, 2004). 
 
MLST es un método adecuado para la investigación a largo plazo de la población 
bacteriana con una alta tasa de recombinación genética. Aunque su desventaja es 
ser una técnica muy laboriosa y costosa (Vázquez y Berrón, 2004). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
23 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
1.8 Antecedentes de MLST 
La técnica de MLST es empleada en diversas bacterias y levaduras: Bacillus 
cereus, Bartonella henselae, Borrelia burgdorferi, Burkholderia pseudomallei, 
Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Enteroccocus faecalis, E. faecium, 
Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter. pylori, Leptospira spp., 
Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, Propionibacterium acnes, Salmonella 
enterica, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, 
S. pneumoniae, S. pyogenes, S. suis, Vibrio vulnificus, Candida albicans, 
C. glabrata, C. krusei, Cryptococcus neoformans var grubii (URL 4). 
La MLST fue desarrollado originalmente para cepas de N. meningitidis; causante 
de meningitis y septicemia a nivel mundial.se emplearon fragmentos internos de 
los siguientes genes: abcZ (transportador ABC), adk (adenilato kinasa), aroE 
(sikimato deshidrogenasa), fumC (fumarato hidratasa), gdh (glucosa-6-fosfato 
deshidrogenasa), pdhC (piruvato deshidrogenasa), pgm (fosfoglucomutasa). La 
MLST proporcionó diferencias significativas entre las cepas debido a eventos 
mutacionales o de recombinación, lo cual permitió hacer el reconocimiento 
confiable de aislados hipervirulentos de N. meningitidis (Maiden et al., 1998). 
Los trabajos previos sobre análisis de poblaciones bacterianas en S. pneumoniae 
indicaban que el microorganismo presentaba procesos de recombinación 
frecuentes, describiendo así, clonas virulentas en 16 de los más de 90 serotipos 
que causan más del 90% de las enfermedades invasivas. Enright y cols.,1998, 
emplearon la técnica de MLST en aislados de S. pneumoniae donde utilizaron los 
genes constitutivos siguientes: aroE (shikimato deshidrogenasa), gdh (glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa), gki (glucosa quinasa), recp (transcetolasa), spi (señal 
peptidasa I), xpt (xantina fosforribosil transferasa) y ddl (D-alanina-D-alanina 
ligasa), y encontraron 12clonas virulentas. Por lo tanto, fue posible hacer la 
identificación correcta de estas clonas y además de que permite conocer con gran 
http://pubmlst.org/bcereus/
http://pubmlst.org/bcereus/
http://bhenselae.mlst.net/
http://borrelia.mlst.net/
http://bpseudomallei.mlst.net/
http://pubmlst.org/campylobacter/
http://chlamydia.mlst.net/
http://efaecalis.mlst.net/
http://efaecium.mlst.net/
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/
http://haemophilus.mlst.net/
http://pubmlst.org/helicobacter/
http://leptospira.mlst.net/
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/
http://pubmlst.org/neisseria/
http://pacnes.mlst.net/
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/
http://sepidermidis.mlst.net/
http://pubmlst.org/sagalactiae/
http://sdse.mlst.net/
http://spneumoniae.mlst.net/
http://spyogenes.mlst.net/
http://ssuis.mlst.net/
http://pubmlst.org/vvulnificus/
http://calbicans.mlst.net/
http://cglabrata.mlst.net/
http://pubmlst.org/ckrusei/
http://cneoformans.mlst.net/
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
24 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
precisión el grado de dispersión a nivel mundial así como la posible adquisición de 
nuevos determinantes de resistencia por las mismas (Enright y Spratt, 1998). 
Enright y cols, 2000 demostraron la utilidad del método mediante la identificación 
de las clonas de MRSA (S. aureus resistente a meticilina) y MSSA (S. aureus 
sensible a meticilina) en aislamientos de pacientes con HAI. El esquema de MLST 
utilizo fragmentos internos de siete genes constitutivos: arcC (carbamato quinasa), 
aroE (shikimato deshidrogenasa), glp (glicerol cinasa), gmk (guanilato quinasa), 
pta (fosfato acetiltransferasa), tpi (isomerasa triosafosfato) y yqiL (acetil CoA 
acetiltranferasa). El desarrollo de MLST permitió definir con precisión cómo las 
cepas sensibles a meticilina pertenecian generalmente a las mismas clonas que 
las cepas MRSA “Meticilin resistent S.aureus” (Enright et al., 2000). 
La primera publicación que describe a un microorganismo diferente fue realizado 
por Bougnoux y cols., 2002, usaron 7 genes housekeeping de C. albicans (Hongo 
diploide): AAT1a, ACC1, ADP1, MPIb, SYA1, VPS13 y ZWF1b. Observaron 
cambios a pequeña escala en las frecuencias alélicas, acuñando el término 
"microvariación" para describir la secuencia de cambios de los genes individuales 
(Bougnoux et al., 2002; Odds y Jacobsen, 2008). 
Diancourt y cols., 2005 reportaron el primer trabajo sobre MLST en cepas 
nosocomiales de K. pneumoniae. Los genes se seleccionaron: de acuerdo a su 
localización en el cromosoma (lejano uno de otro), con base a la disponibilidad de 
los inicidores y para tonB, basado en la variación de nucleótidos conocida 
(Tabla 6). Artículo en el que está basado nuestro trabajo de investigación 
(Diancourt et al., 2005). 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
25 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Tabla 6. Genes constitutivos de K. pneumoniae para MLST 
Loci Función Iniciadores Secuencias 5´---------3´ Talla 
pb 
rpoB 
Subunidad β 
de la ARN 
polimerasa 
Vic3 GGCGAAATGGCWGAGAACCA 
501 
Vic2 GAGTCTTCGAAGTTGTAACC 
mdh 
Malato 
deshidrogenasa 
mdh130 CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG 
477 
mdh867 CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG 
pgi 
Fosfoglucosa 
isomerasa 
pgi1F GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGG 
432 
pgi1R CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT 
pgi2F(seq) 
CTG CTG GCG CTG ATC GGC AT 
 
pgi2R(seq) TTA TAG CGG TTA ATC AGG CCG T 
phoE Fosforina E 
phoE604. ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG 
420 
phoE604. TGATCAGAACTGGTAGGTGAT 
infB 
Factor de 
iniciación de la 
traducción 
infB1F CTCGCTGCTGGACTATATTCG 
318 
infB1R CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC 
infB2F(seq) 
ACT AAG GTT GCC TCC GGC GAA 
GC 
gapA 
Gliceraldehído 
3-fosfato 
deshidrogenasa 
gapA173 TGAAATATGACTCCACTCACGG 
450 
gapA181 CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT 
tonB 
Transductor de 
energía 
Periplasmica 
tonB1F CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT 
414 
tonB2R ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG 
Tomado de Diancourt et al., 2005. 
 
En el 2008 Vimont y cols., compararon ante la técnica de PFGE y la de MLST en 
cepas de K. pneumoniae en donde se concluyó que la caracterización por 
diferentes métodos tuvo concordancia; sin embargo, el método MLST fue el más 
apropiado para determinar la filogenia y la epidemiología a gran escala (Vimont 
et al., 2008). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
26 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Kitchel y cols., 2009, examinaron la epidemiología molecular de cepas productoras 
de carbapenemes en K. pneumoniae provenientes del Centro para el Control y 
Prevención de Enfermedades (CDC), a las cepas que presentaron un patrón de 
PFGE ≥80% de similitud se aplicó MLST, dando una ST258. Sin embargo, el 
poder discriminatorio de MLST fue menor que el de PFGE, lo cual representa una 
ventaja en la identificación de complejos clonales internacionales (Kitchel et al., 
2009). 
En el año 2013 en Beijing Wang y cols., determinaron la diversidad genética de 
175 aislados de K. pneumoniae procedentes de HAI, el 63,8% (n=104) fueron 
MDR, se detectaron 70 ST´s; 37 ST´s correspondia a una única cepa, mientras 23 
ST´s fueron encontradas de 2 a los 17 aislados. Concluyeron que las clonas 
resistente a fármacos son las mayormente transmisibles, causando HAI (Wang et 
al., 2013). 
 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
27 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
2.0 JUSTIFICACIÓN 
K. pneumoniae es un microorganismo oportunista asociado a infecciones 
nosocomiales (HAI) como neumonía, septicemia además de infección de vías 
urinarias (IVU). 
El incremento de la multiresistencia en las cepas, es relevante principalmente por 
la resistencia a β-lactámicos y la producción de β-lactamasas de espectro 
extendido (BLEE´s). 
La técnica de Multilocus Sequence Typing (MSLT) se emplea en estudios 
epidemiológicos, de Evolución y tipificación molecular de aislados clínicos 
asociados a brotes nosocomiales, en este estudio se aplicará para establecer la 
relación genética y determinar la estructura poblacional de aislados de 
K. pneumoniae provenientes de pacientes nosocomiales y ambulatorios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
28 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
 
3.0 OBJETIVOS 
3.1. Objetivo general 
 
Establecer las relaciones genéticas de aislados clínicos de diferente origen de 
K. pneumoniae resistentes (BLEE’s +) y sensibles a β-lactámicos a través de la 
técnica de MLST. 
 
3.2. Objetivos particulares 
 
1. Determinar la frecuencia de aislados clínicos de K. pneumoniae de diferente 
origen clínico. 
2. Determinar el perfil de resistencia a antibióticos y seleccionar grupos 
BLEES (+) Y BLEES (-). 
3. Aplicar la técnica de MLST a aislados clínicos de K. pneumoniae y analizar 
el perfil alélico para establecer su relación genética. 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
29 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.0 MATERIAL Y MÉTODOS 
4.1. Esquema general de trabajo 
La figura 10 presenta un diagrama general de la metodología siguiendo los 
lineamientos de Diancourt et al., 2005. 
 
Figura 10. Esquema general de trabajo. 
Genes constitutivos: 
rpoB (subunidad β de la RNA 
polimerasa) 
gapA (gliceraldehído 3-fosfato 
deshidrogenasa) 
mdh (malato deshidrogenasa) 
pgi (fosfoglucosa isomerasa) 
phoE (fosforina E) 
infB (factor de iniciación de la 
traducción) 
tonB (Traductor de energía 
periplasmica) 
 Tipificación de aislados clínicosde Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
30 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.2. Material biológico 
Los 93 aislados clínicos de K. pneumoniae, provinieron de diferentes unidades 
médicas, las cuales se denominaran como: I (65/93), II (11/93), III (5/93) y IV 
(12/93) procedentes de diferentes zonas de la Ciudad de México. 
Las cepas de referencia utilizadas en este estudio fueron: 
K. pneumoniae ATCC 700603 
E. coli ATCC 25922 
 
4.3. Aislamiento e identificación de cepas clínicas de K. pneumoniae 
La identificación de los aislados clínicos se hizo a partir de la morfología 
microscópica, y la morfología colonial se determinó en los medios BHI y 
MacConkey así como el uso de pruebas bioquímicas convencionales como: 
catalasa, oxidasa, TSI, citrato de Simmons, MIO, LIA, RM/VP, se incubaron a 
37°C por 24h (Giono, 2005). 
 
4.4. Conservación de aislados clínicos 
La conservación de los aislados se realizó mediante la siembra masiva en 
placas de BHI (37°C/ 24 h); posteriormente el crecimiento se cosechó en 
criotubos con caldo BHI y 15% de glicerol. Los criotubos se conservaron a -20°C 
(Giono, 2005) 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
31 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.5. Perfil de resistencia a antibióticos 
La sensibilidad a antibióticos se determinó a través del sistema automatizado 
Vitek2®, que se basa en la determinación de la Concentración mínima inhibitoria 
(CMI) (CLSI, 2014). Los antibióticos probados fueron: ampicilina (AMP), cefazolina 
(CFZ), trimetropin/sulfametoxazol (SXT), ampicilina/sulbactam (SAM), cefepime 
(FEP), ceftriaxona (CRO), aztreonam (ATM), tobramicina (TOB), gentamicina 
(GM), nitrofurantoina (FD), ciprofloxacino (CIP), piperaciclina/tazobactam (TZP), 
amikacina (AMK) ceftazidima (CAZ), moxifloxacina (MFX), levofloxacino (LVX), 
cefoxitina (FOX), meropenem (MEM), imipenem (IM) y ertapenem (ETP) (CLSI, 
2014). 
Los aislados fueron clasificados de acuerdo al antibiograma en multidrogo-
resistente (MDR “multidrug-resistant”), extremodrogo-resistente (XDR “extensively 
drug-resistant”) y pandrogo-resistente (PDR “pandrug-resistant”), considera los 
criterios de clasificaciòn para enterobacterias (Magiorakos et al., 2011). (A.-P. 
Magiorakos1, 2011) 
4.5.1. Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 
La confirmación de cepas BLEE´s se realizó con la prueba de doble disco (DD) 
según las recomendaciones de la CLSI, 2014, a partir de una suspensión 
bacteriana ajustada al 0.5 de la escala McFarland, se sembró masivamente en 
medio Mueller Hinton (MH), se colocaron los discos de: cefotaxima (CTX) 30µg y 
CTX + ácido clavulánico 30µg/10µg; ceftazidima (CAZ) 30µg, CAZ + ácido 
clavulánico 30µg/10µg, a una distancia de 20-30 mm de centro a centro (CLSI, 
2014). 
El resultado fue positivo al observarse un incremento en el diámetro del halo de 
inhibición (≥5 mm), alrededor del sensidisco CTX ó CAZ más ácido clavulánico, en 
comparación del que no tiene ácido clavulánico (CLSI, 2014). 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
32 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.6. Tipificación molecular por MLST 
4.6.1 Obtención de DNA 
La obtención de DNA se hizo a partir de la siembra masiva en medio BHI (37°C 
por 24 h). Posteriormente, se aplicó el método de Tiocianato-Guanidina (TG) para 
la obtención del DNA cromosomal. La visualización del DNA se realizó por un 
corrimiento electroforético en gel de agarosa al 0.7%, a 100V por 45 min, se reveló 
en bromuro de etidio (0.5 µg/mL) durante 5 min (Sambrook, 1989). (ANEXO I.I) 
 
4.6.2 Amplificación de genes constitutivos por PCR 
El análisis de MLST se hizo solo a 48 aislados que fueron seleccionados, donde 
se consideró los siguientes criterios: centro hospitalario, origen de la muestra 
(principalmente urocultivo y/o hemocultivo), año de aislamiento y presencia o 
ausencia de BLEE’s. La amplificación de los genes constitutivos “houskeeping”: 
gapA, infB, mdh, pgi, phoE, ropB y tonB, se realizó por PCR individual; en la tabla 
7 se describe los componentes y concentraciones de la mezcla de reacción. 
Tabla 7. Componentes de la mezcla de reacción para la 
PCR convencional 
Reactivo Volumen (µL) 
Regulador 1x (Tris-HCl pH 8.5, KCl 50 
mM) * 
2.5 
MgCl2 (2.0 mM) * 2.0 
Iniciador 
(20pM) 
Foward 2.0 
Reverse 2.0 
Mezcla de dNTP´s (200mM) * 2.0 
DNA bacteriano (1:2) 2.0 
Agua desionizada 13.3 
Taq Polimerasa (0.5U) * 0.2 
Volumen total 25 µL 
*Reactivo de Invitrogen® tomada y modificado de Diancourt et al., 2005. 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
33 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
El programa de amplificación que se empleó para cada gen (gapA, infB, mdh, pgi, 
phoE, ropB y tonB) se muestra en la tabla 8. 
Tabla 8. Programas de amplificación para los genes constitutivos de 
K. pneumoniae 
Etapa Número de ciclos Temperatura (°C) Tiempo (min) 
Desnaturalización 
inicial 
1 94 5 
Desnaturalización 30 94 1 
A
lin
e
a
m
ie
n
to
 gapA 
30 
50 
1 
rpoB 50 
mdh 50 
pgi 50 
phoE 50 
infB 50 
tonB 45 
Extensión 30 72 1 
Extensión final 1 72 5 
Tomado de Diancourt et al., 2005. 
 
4.6.3 Purificación del amplicon 
La purificación de los amplicones previo a la secuenciación se realizó a partir de 
un gel de agarosa 1.7% con el kit comercial “PureLink Quick Gel Extraction and 
PCR Purification combo kit (Invitrogen®)”, así como a partir del producto de PCR 
con los kit´s “Montáge life ciencia kits GENOMICS (Millipore®)”, “EZ-10 Spin 
Column PCR purification kit (BioBasic®)”,”Gene JET-PCR Purification kit (Thermo 
Scientific)” siguiendo las instrucciones del fabricante (ANEXO I.II). 
 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
34 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.6.4. Secuenciación 
La secuenciación se hizo con el kit “ABI PRISM® Big dye® Terminator v3.1 Cycle 
Sequencing Kits”. La reacción se realizó a un volumen final de 10µL (2µL de Big 
Dye, 2µL buffer, 1µL iniciador forward, 1µL DNA y 4µL agua inyectable). El 
programa de amplificación se muestra en la tabla 9 (Diancourt et al., 2005). 
Tabla 9. Programa de amplificación para la secuenciación para los genes 
constitutivos de K. pneumoniae 
Etapa Número de ciclos Temperatura (°C) Tiempo 
Desnaturalización 
inicial 
1 96 5 min 
Desnaturalización 25 96 10 seg 
A
lin
e
a
m
ie
n
to
 gapA 
25 
50 
5 seg 
rpoB 50 
mdh 50 
pgi 50 
phoE 50 
infB 50 
tonB 45 
Extensión 25 60 4 min 
Enfriamiento 1 4 - 
Tomado y modificado de Diancourt et al., 2005. 
Posterior a la obtención del amplicón se realizó la purificación con columnas de 
Sephadex G-50 (poro fino) por centrifugación 2min a 2800 rpm; seguido del 
secado del gen en el concentrador a 45°C por 30 min (Sambrook, 1989) (ANEXO 
I.III). 
La lectura de la reacción de secuenciación se realizó con el Instituto de Biología 
de la UNAM, Laboratorio de Biología Molecular a cargo de la M. en C. Laura M. 
Márquez Valdelamar, el cual cuenta con un equipo automatizado “ABIPRISM 
3730XL de Applied Biosystems”; a la muestra seca se le agregó 15µL de 
formamida HD y se colocó en los capilares del equipo para su lectura. 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
35 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.6.5 Análisis bioinformático 
 
4.6.5.1. Genotipificación por MLST 
Las secuencias obtenidas se analizaron para verificar la identidad de las mismas 
por medio del análisis de alineamiento múltiple BLAST (“Basic Local Alignment 
SearchTool”) disponible en la página de la NCBI (“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”). 
La edición de las secuencias se realizó con los programas: FinchTV v 1.4.0 
(FinchTV 1.4.0 Geospiza), ClustalX v 2.1 (Larkin et al., 2007) y Bioedit v 7.2.5 
(Hall, 1999). Las secuencias editadas se enviaron a una base de datos 
internacional PUBMLST de K. pneumoniae (“http://pubmlst.org/”), para obtener el 
número de alelo de cada gen, posteriormente se obtuvo el perfil alélico el cual 
considera los siete genes constitutivos, y cada perfil alélico fue definido como 
secuencia tipo (ST) (ANEXO I.IV). 
 
4.6.5.2. Asignación de los complejos clonales (CC) 
El programa eBURST v3 se empleó para identificar los diferentes complejos 
clonales (CC). Los CC se definieron como dos o más aislados independientes que 
comparten alelos idénticos, al menos en seis o más loci. Los complejos fueron 
nombrados de acuerdo a la secuencia tipo fundadora (Feil et al., 2004). Los datos 
de los 2317 ST´s de K. pneumoniae previamente reportadas fueron obtenidos de 
la base de datos para MLST del Instituto Pasteur (www.pasteur.fr). 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
36 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
4.6.5.3. Medición de la Clonalidad 
La determinación del índice de asociación IA (cuantificaciòn de la tasa de 
recombinación entre el grupo de secuencias y la detección de asociación de los 
alelos de diferente loci) de los siete genes se calculó con el programa START2 v 
0.9.0 (Jolley et al., 2001). 
 
4.6.5.4. Análisis de las secuencias 
La determinación de las mutaciones sinónimas (ds) y no sinónimas (dn), así como 
de los polimorfismos de los 7 genes empleados en el estudio se hizo con base a 
los cambios nucleotídicos, a través de los programas START2 v 0.9.0 (Jolley et 
al., 2001) y DnaSP v5.10 (Librado y Rozas, 2009). La traducción amiácidica de 
las secuecias de cada gen se hizo emplendo la plataforma ExPASy 
(www.expasy.org), para estabecer el marco de lectura abierto de la proteína . 
 
4.6.5.5. Relación filogenética 
El análisis filogenético se realizó con en el programa START2 v 1.0.5 
(http://pubmlst.org/software/analysis/start2/). La construcción del árbol se hizo con 
base al método de Neighbor-joining basado en el criterio de mínima evolución 
(BME: balanced minimum evolution) en el alineamiento de las secuencias 
concatenadas de los siete genes empleados en MLST con 1000 replicas 
("bootstrap”) (Jolley et al., 2001). 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
37 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
5.0 RESULTADOS 
5.1. Determinación de la frecuencia del aislamiento de K. pneumoniae de 
diferente origen clínico. 
Los 93 aislados clínicos de K. pneumoniae provenientes de diferentes unidades 
médicas se analizaron, considera el origen de la muestra: hemocultivo, urocultivo, 
punta de catéter, secreción bronquial, líquidos internos y superficie (Figura 11). 
 
Figura 11. Distribución geográfica de los 93 aislados de K. pneumoniae en los 
diferentes Hospitales de la CDMX. K. pneumoniae se aisló con mayor frecuencia en 
muestras de urocultivos. 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
38 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Los 93 aislados clínicos fueron obtenidos entre los años 2011 al 2015 excluyendo 
el 2014, fueron clasificados en: A, ambulatorios (aislados provenientes de 
pacientes no hospitalizados), I, intrahospitalarios (aislados provenientes de 
muestra de pacientes hospitalizados) y S, (superficies inertes hospitalarias) con la 
finalidad de distinguir aquellas provenientes del ambiente hospitalario (figura 12). 
La mayoría de los aislados clínicos (44/93) se obtuvieron durante el 2015. 
 
 
Figura 12. Número de aislados clínicos de K. pneumoniae. A, ambulatorias, 
I, intrahospitalarias, S, superficie. 
 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
39 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
5.2. Aislamiento e identificación de aislados clínicos de K. pneumoniae. 
La identificación de las cepas se realizó mediante el Vitek2®, seguida de la 
confirmación de la identidad por métodos convencionales, donde la morfología 
colonial se describió a partir de agar BHI: colonias con tamaño variado (2-7 mm 
de diámetro), convexas, húmedas, brillantes con consistencia mucoide y bordes 
irregulares; en el medio MacConkey se observaron colonias lactosa positivas 
(Figura 13). 
 
Figura 13. Morfología colonial característica de K. pneumoniae ATCC 700603. 
A) Crecimiento en agar BHI, colonias de color crema, B) Crecimiento en agar Mac 
Conkey, colonias lactosa positiva y consistencia mucoide. Tomadas en el laboratorio de 
Bacteriología de la ENCB-IPN 
 
 
La confirmación microbiológica de la identidad de los 93 aislados clínicos se 
realizó por métodos convencionales de Bacteriología: microscópica (Tinción de 
Gram, forma, agrupación, afinidad tintorial), pruebas bioquímicas: oxidasa, 
catalasa, TSI, LIA, citrato y MIO (Figura 14). 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
40 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 14. Pruebas bioquímicas para la identificación de los aislados clínicos de 
K. pneumoniae. (A) Acido; (K) Alcalino; (-) Negativo; (+) Positivo, RM: Rojo de Metilo; 
VP: Voges Proskauer. Resultados comparados de Koneman W., 2008. 
 
Las 93 cepas clínicas fueron confirmadas como: K. pneumoniae y conservadas en 
caldo BHI con glicerol al 15% y almacenadas a -20°C. 
 
5.3. Perfil de resistencia a antibióticos 
La determinación del perfil de resistencia de los aislados clínicos de 
K. pneumoniae se realizó por el sistema automatizado Vitek2®, se seleccionaron 
únicamente los aislados BLEE´s (+) para el estudio de MLST. 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
41 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
La frecuencia de resistencia a cada antibiótico se determinó a partir de los 
antibiogramas obtenidos (Figura 15); en donde el porcentaje de resistencia 
mostró: AMP (96% 89/93), CFZ (61% 57/93), SXT (60% 56/93), SAM (57% 53/93), 
FEP (56% 52/93), CRO (56% 52/93), TOB (39% 36/93), GM (35% 33/93), FD 
(27% 25/93), CIP (22% 20/93), TZP (16% 15/93), AMK (9% 8/93), MEM, ETP (2% 
2/93) e IM (1% 1/93). 
 
Figura 15. Porcentaje de resistencia a diferentes antibióticos de los 93 aislados 
clínicos de K. pneumoniae. Se observa la mayor frecuencia de resistencia con la 
ampicilina (96%) y solo una cepa presentó resistencia al imipenem. 
 
El 60% (56/93) de los aislados clínicos fueron presuntivas a BLEE´s (+), de 
acuerdo a lo reportado por el Vitek2®. 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
42 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
La clasificación de los aislados de acuerdo al antibiograma en MDR,XDR Y PDR, 
considera los criterios de Magiorakos y cols., 2011, se obtuvo que el 46% (43/93) 
fueron MDR; 24 provenientes del Hospital I, 10 del Hospital de II, 1 de III y 8 del 
IV, 17% (16/93) fueron XDR; 10 provenientes del Hospital I, 1 del Hospital II, 2 deL 
III y 3 del Hospital IV, 1% (1/93) fue PDR originaria del Hospital IV 
 
5.3.1. Determinación de la prueba confirmatoria de BLEE´s 
En la figura 16 se muestra el resultado de la prueba de doble disco (DD), con los 
controles positivo y negativo (K. pneumoniae ATCC 700603 y E. coli ATCC 
25922). 
 
Figura 16. Prueba control para la confirmación de BLEE´s. A) Control positivoK. pneumoniae ATCC 700603, B) Control negativo E. coli ATCC 25922. El incremento 
del halo de inhibición (≥5 mm) en el sensidisco de ceftazidima (CAZ) + ácido clavulánico 
se considera un resultado positivo. Fotos tomadas en el laboratorio de Bacteriología de la 
ENCB-IPN 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
43 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
La prueba de DD se realizó a todas las cepas clínicas (Figura 17); de las cuales 56 
fueron positivas a la prueba y 37 negativas a BLEE´s; esto concordó con los datos 
obtenidos del sistema automatizado Vitek2® (tabla 10). 
 
 
Figura 17. Prueba confirmatoria de 56 aislados clínicos positivos a BLEE´s. Se 
observa un incremento ≥ 5 mm en el halo de inhibición con el sensidisco de CAZC 
(Cefazolina + ácido clavulánico), el mismo caso pasa con CTXC (Ceftriaxona + ácido 
clavulánico). Fotos tomadas en el laboratorio de Bacteriología de la ENCB-IPN 
 
 
Tabla 10. Aislados clínicos de K. pneumoniae positivas a la prueba confirmatoria 
de doble disco para la detección de BLEE’s 
 Total de 
cepas 
Numero de cepas 
presuntivas a 
BLEE´s 
Prueba confirmatoria DD 
BLEE´s (+) BLEE´s (-) 
Hospital I 65 30 30 0 
Hospital II 11 11 11 0 
Hospital III 5 3 3 0 
Hospital IV 12 12 12 0 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
44 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
5.4 Tipificación molecular por MLST 
5.4.1 Amplificación de los genes constitutivos por PCR 
La amplificación de los genes “houskeeping” se realizó con las condiciones 
mencionadas (Diancourt et al., 2005). En la figura 18 se representa el gel de 
agarosa a 1.7% empleando una corriente de 100V por 45 min., donde se observa 
la amplificación de los 7 genes constitutivos (gapA, rpoB, mdh, pgi, phoE, infB, 
tonB) de la cepa de K. pneumoniae ATCC 700603. 
 
Figura 18. Electroferograma de la amplificación por PCR de los genes constitutivos 
de K. pneumoniae ATCC 700603. Carril: 1. Marcador de talla molecular 100 pb, 2. gapA 
(670 pb), 3. infB (450 pb), 4. mdh (750 pb), 5. phoE (600 pb), 6. pgi (800 pb), 7. rpoB 
(1000 pb), 8. tonB (550 pb). Gel de agarosa 1.7 %. 
 
Los amplicones obtenidos se purificaron y secuenciaron de acuerdo a lo ya 
descrito en la metodología (3.6.3 y 3.6.4). 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
45 
Sierra Atanacio Erika Gabriela 
5.5 Análisis bioinformático 
5.5.1. Genotipificación por MLST 
La MLST se hizo para determinar la diversidad genética de los aislados de 
K. pneumoniae; en la tabla 11 se indican los resultados obtenidos: el número de 
alelo de cada gen, el perfil alélico considera los siete genes y finalmente la 
secuencia tipo (ST) de los aislados clínicos empleados en este estudio. Se 
determinó la frecuencia de alelos para cada gen, los genes que presentaron mayor 
variación fue: tonB, mdh y phoE (ANEXO II.I). Treinta secuencias tipo (ST) fueron 
identificadas (29 ST clínicas y 1 ST correspondiente a K. pneumoniae ATCC 
700603, 23 ST´s (79%) correspondieron a un solo aislado y seis ST´s (21%) 
incluyeron de dos a seis aislados. Las ST´s que predominaron fueron ST551 y 
ST405 (12.5%, 6/48 cada uno), posteriormente ST25 y ST1088 (8.3%, 4/48 cada 
uno), en seguida ST392 (6.3%, 3/48%) y por último ST36 (4.1% 2/48). Las seis 
ST´s fueron consideradas las clonas prevalentes en este estudio (figura 19). 
 
Figura 19. Porcentaje de ST´s. 23 de las ST´s solo fueron encontradas en una cepa 
La clasificación de resistencia, revelo que los aislados ST25 fueron MDR (2/4) y 
XDR (2/4); aquellas ST405, fueron MDR (2/6) y XDR (2/6), el resto fueron 
sensibles a la mayoría de los antibióticos. Las ST551 presentaron dos resistotipos: 
MDR (3/6) y XDR (3/6); los aislados ST392 y ST1088 fueron MDR (4/4; 3/3). La 
ST706 fue la única PDR. 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
Tabla 11. Asignación de la Secuencia Tipo a partir de los perfiles alélicos. 
Origen Año Cepa Perfil alélico *ST 
gapA rpoB mdh pgi phoE infB tonB 
ATCC 700603 18 52 26 71 98 22 51 489 
H
O
S
P
IT
A
L
 I
 
2011 1E 2 1 1 3 8 1 15 2015 
2E 2 1 62 3 10 4 110 405 
3E 2 1 1 1 9 4 12 23 
4E 2 1 1 6 7 4 12 496 
5E 2 1 62 3 10 4 110 405 
6E 2 1 164 1 7 4 303 1846 
2012 7E 2 9 2 1 13 1 10 309 
8E 3 1 1 1 9 4 135 551 
9E 3 1 1 1 9 4 135 551 
10E 3 1 1 1 9 4 135 551 
11E 2 1 62 3 10 4 110 405 
12E 3 1 1 1 9 4 135 551 
13E 51 1 5 1 9 4 13 491 
2015 14E 2 1 62 3 10 4 110 405 
15E 2 1 1 1 10 4 13 25 
16E 2 1 5 1 17 4 42 111 
17E 2 1 1 1 7 1 12 485 
18E 2 1 2 1 4 4 4 16 
19E 2 1 2 1 7 1 7 36 
20E 2 60 11 1 4 8 24 628 
21E 2 1 2 1 1 4 13 804 
22E 2 1 1 117 10 4 18 1726 
23E 2 1 1 1 10 4 13 25 
24E 3 3 1 1 9 1 4 1869 
25E 2 9 2 1 13 1 16 37 
H
o
s
p
it
a
l 
II
 
2013 1S 2 1 1 10 1 1 76 1088 
2S 2 1 1 10 1 1 76 1088 
3S 3 1 1 1 9 4 135 551 
4S 2 1 1 10 1 1 76 1088 
5S 2 1 2 1 213 1 7 2175 
6S 2 1 1 10 1 1 76 1088 
7S 3 1 1 1 9 4 135 551 
8S 2 1 162 3 10 4 110 405 
H
o
s
p
it
a
l 
II
I 2013 1I 2 4 2 1 7 1 12 788 
2I 3 3 1 1 13 1 79 1406 
3I 2 1 1 1 10 4 13 25 
4I 2 1 97 1 9 4 13 846 
5I 2 1 2 1 7 1 7 36 
H
O
S
P
IT
A
L
 I
V
 
2015 1Z 2 1 1 1 10 4 13 25 
2Z 2 1 62 3 10 4 110 405 
3Z 4 1 2 52 1 1 7 307 
4Z 3 4 6 1 7 4 40 392 
5Z 4 1 32 1 7 4 10 151 
6Z 3 4 6 1 7 4 40 392 
7Z 4 5 88 1 1 94 23 2080 
8Z 3 4 6 1 7 4 13 885 
9Z 2 4 1 1 7 4 4 706 
10Z 3 4 6 1 7 4 40 392 
*ST: “Sequence type” 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
5.5.2. Asignación de los complejos clonales (CC) 
El análisis filogenético se realizó con 48 aislados y las 2317 ST reportadas 
previamente en la base de datos de MLST (http://bigsdb.pasteur.fr/). El estudio se 
hizo con el algoritmo eBURST v3 el cual permite agrupar a las poblaciones 
bacterianas en grupos de aislados relacionados y CC, además predice los 
genotipos fundadores (ancestros) de cada CC. El algorítmo también permite 
visualizar a la población de forma general a través de una agrupación denominada 
“population snapshots” (Figura 19). La población “snapshots” a nivel mundial 
mostró que en el caso de K.pneumoniae, el tipo de población fue clonal. 
El programa eBURST v3 considera las 30 ST´s (incluye la cepa ATCC 700603 con 
ST489, marcada con circulo verde; y los aislados clínicos señalados con circulo 
rojo) que se identificaron en este estudio con repeticiones (1000 “bootstrap”). La 
denominación de los CC fue asignada de acuerdo a la ST fundadora de cada 
grupo, y se considera que un CC esta compuesto por aislados que tienen 6/7 loci 
idénticos. En total se generaron 183 CC, en el centro del “snapshots” se observa 
el principal complejo clonal (CC11) que presento 47 SLV, 43 DLV, 123 TLV y 688 
SLV, donde se localizaron 18 ST´s. Los siguientes CC a los que pertenecen los 
aislados son: CC147 (ST885, ST392); CC628 (ST628); CC1088 (ST1088); CC551 
(ST551); CC2054 (ST10726); CC491 (ST491); CC405 (ST405) y CC307 (ST307) . 
Las ST´s individiales (“singleton”) que no formaron parte de un CC fueron: 
ST2080, ST1846, ST489. 
 
 
 
 Tipificación de aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae por la técnica de 
“Multilocus Sequence Typing” 
(MLST).
 
 
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Sierra Atanacio Erika Gabriela 
 
Figura 20. Población “snapshot” de K. pneumoniae, análisis comparativo eBURST. 
Se identificaron las ST´s en 48 aislados clinicos de K. pneumoniae resaltadas con un 
circulo rojo y la ATCC 700603 de K. pneumoniae (circulo verde), los fundadores (azul) se 
encuentran en el centro de cada complejo clonal (CC). Las