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Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México bibliotecadigital@redudg.udg.mx - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA Coordinación de Bibliotecas Biblioteca Digital La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma. 1 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD DOCTORADO EN GENÉTICA HUMANA TESIS DE DOCTORADO “Caracterización de alteraciones cromosómicas por citogenética convencional y molecular en pacientes con trastornos linfoproliferativos crónicos de células B” Alumna: María Paulina Nava Rodríguez Tutor: D. en C. Juan Ramón González García Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social GUADALAJARA JALISCO, agosto 2020 2 Comisión Nacional de Investigación Científica: No. de registro: R-2013-785-071 Número de apoyo financiero por parte del IMSS: FIS/IMSS/PROT/PRIO/16/061 Sede del estudio: Laboratorio de Citogenética, División de Genética, CIBO, IMSS. Guadalajara Jalisco. COLABORADORES E INSTITUCIONES PARTICIPANTES: • D. en C. y Hematólogo César Borjas Gutiérrez. Hematología. UMAE-Hospital de Especialidades. CMNO-IMSS. • M. en C. y Hematólogo Lilia Beatriz Aguilar López. Hematología. UMAE-Hospital de Especialidades. CMNO-IMSS. • D. en C. María Teresa Magaña Torres. División de Genética, CIBO, IMSS. 3 Índice Tema página Resumen 9 Abstract 10 1 Introducción 11 1.1 Trastornos linfoproliferativos crónicos de células B (TLC-B) 11 1.1.1 Leucemia linfocítica crónica (LLC) 12 1.1.2 Mieloma múltiple (MM) 12 1.1.3 Linfoma no Hodgkin (LNH) 12 1.2 Epidemiología de los TLC-B 13 1.2.1 Epidemiología de LLC 13 1.2.2 Epidemiología de MM 14 1.2.3 Epidemiología de LNH 14 1.2.4 Epidemiología de los TLC-B en México 15 1.3 Diagnóstico de los TLC-B 15 1.4 Factores pronóstico y estadificación en los TLC-B 16 1.5 Factores de riesgo para el desarrollo de los TLC-B 19 1.6 Heredabilidad de los TLC-B 20 1.7 Alteraciones genéticas de los TLC-B 21 1.8 Clonas y evolución clonal 21 1.9 Citogenética de los TLC-B 24 1.10 Metodología para el estudio citogenético de los TLC-B 24 1.11 Estudio de los TLC-B por citogenética convencional 25 1.11.1 Alteraciones citogenéticas frecuentes en LLC 26 a) Translocación gen IGH 26 b) inv(14)(q11q32) y t(14;14)(q11;q32) 27 c) Cariotipos complejos 28 1.11.2 Alteraciones citogenéticas en MM 28 1.11.3 Alteraciones citogenéticas en LNH 29 1.12 Estudio de los TLC-B por citogenética molecular 29 1.12.1 Deleciones submicroscópicas en 13q14, 11q22, 17p13 y trisomía 12 29 1.12.1.1 Deleción en 17p13 30 1.12.1.2 Deleción en 11q22 31 1.12.1.3 Trisomía 12 31 1.12.1.4 Deleción en 13q14 32 4 1.13 Estudios citogenéticos de los TLC-B en México 34 2 Justificación 34 3 Planteamiento del problema 35 4 Objetivos 35 4.1 Objetivo general 35 4.2 Objetivos particulares 35 5 Material y métodos 36 5.1 Diseño de estudio 36 5.2 Universo de trabajo 36 5.3 Descripción general del estudio 36 5.3.1 Criterios de inclusión 36 5.3.2 Criterios de no inclusión 36 5.3.3 Criterios de exclusión 36 5.4 Procedimiento 37 5.5 Análisis estadístico 39 6 Aspectos éticos 39 7 Aspectos bioseguridad 39 8 Resultados 40 8.1 Características clínicas y hematológicas de las muestras estudiadas 40 8.2 Resultados obtenidos por citogenética convencional 40 8.2.1 Casos con LLC 41 8.2.2 Casos con MM 41 8.2.3 Casos con LNH 42 8.3 Aberraciones detectadas por citogenética convencional 42 8.3.1 Arreglos que afectan al gen IGH 42 8.3.2 Cariotipo complejo 42 8.3.3 Hiperdiploidía 42 8.4 Resultados obtenidos por citogenética molecular (FISH) 43 8.4.1 Cálculo de valores límite (cut off) 43 8.4.2 Deleciones de los genes RB1, DLEU, TP53, ATM y trisomía 12 43 8.4.3 Arreglos del gen IGH detectados por FISH 46 8.4.4 Arreglos del gen TCRAD detectados por FISH 47 8.5 Resultado citogenómico 48 8.6 Análisis estadístico 53 9 Discusión 56 5 9.1 Características demográficas 56 9.1.1 Edad 56 9.1.2 Estadificación 57 9.2 Variables cuantitativas y cualitativas 57 9.3 Observaciones obtenidas por citogenética convencional 59 9.3.1 Detección de clonas anormales 59 9.3.2 Arreglos cromosómicos no reportados 59 9.3.3 Aberraciones en el gen IGH 60 9.3.3.1 Casos con t(IGH) 60 9.3.3.2 Casos con inv(14)(q11q32) 61 9.3.4 Estudios adicionales realizados para definir algunas particularidades 62 9.3.4.1 Caso 2 62 9.3.4.2 Caso 5 62 9.3.4.3 Caso 7 63 9.4 Hallazgos obtenidos por citogenética molecular 66 9.4.1 Comparación de frecuencias 66 9.5 Alteraciones cromosómicas detectadas por FISH y estadificación 68 9.6 Deleción 13q14 68 9.7 Deleciones bialélicas parciales 69 9.7.1 Deleción bialélica parcial de RB1 y DLEU 70 9.7.2 Deleción bialélica parcial de TP53 70 9.8 Resultado citogenómico 71 10 Conclusiones 72 11 Perspectivas 73 12 Bibliografía 74 13 Anexos 82 Anexo 1 Toma de muestra 82 Anexo 2 Cultivo de linfocitos 83 Anexo 3 Cosecha 84 Anexo 4 Método de bandeo GTG 86 Anexo 5 Hibridación fluorescente in situ 87 Anexo 6 Determinación de cut off en Nuc ish 90 Anexo 7 Carta de consentimiento 97 Anexo 8 Datos clínicos, hematológicos y diagnóstico 99 6 Anexo 9 Resultados citogenómicos descritos de acuerdo a la nomenclatura ISCN 2016 102 Anexo 10 Caso 2 Genomic instability in a chronic lymphocytic leukemia patient with mono-allelic deletion of the DLEU and RB1 genes. Mol Cytogenet 2019, 12:2 doi: 10.1186/s13039-019-0417- 5 105 Índice de tablas página Tabla 1 Clasificación de los TLC-B y su inmunofenotipo característico 13 Tabla 2 Incidencia y mortalidad estimadas de los TLC-B en EUA 15 Tabla 3 Sistemas de clasificación en grupos pronóstico 19 Tabla 4 Alteraciones cromosómicas más comunes para cada TLC-B detectadas por citogenética convencional 26 Tabla 5 Valor pronóstico de las alteraciones cromosómicas detectadas por citogenética molecular 29 Tabla 6 Características clínicas y hematológicas de los casos de LLC y MM 40 Tabla 7 Valores de cut off calculados 44 Tabla 8 Anormalidades observadas en los estudios de FISH con las sondas RB1/subtel(13q), DLEU/subtel(13q), TP53/ATM y MDM2/D12Z1. 46 Tabla 9 Anormalidades observadas en los estudios de FISH con las sondas IGH/BCL2 dual fusión e IGH breakapart 47 Tabla 10 Anormalidades observadas por FISH con la sonda TCRAD breakapart 47 Tabla 11 Casos con resultado citogenómico COMPLEJO 50 Tabla 12 Casos con resultado citogenómico ANORMAL 51 Tabla 13 Casos con resultado citogenómico INCOMPLETO 52 Tabla 14 Comparación de parámetros hematológicos y clínicos en pacientes con LLC 53 Tabla 15 Comparación de parámetros clínicos y hematológicos en pacientes con MM 54 Tabla 16 Valores de los parámetros clínicos y hematológicos de los pacientes categorizados por sexo 54 Tabla 17 Valores de los parámetros clínicos y hematológicos de los pacientes categorizados por el resultado citogenómico 55 Tabla 18 Frecuencias poblacionales de las alteraciones comunes en pacientes con LLC 66 Tabla 19 Frecuencias de alteraciones cromosómicas comunes en pacientes con MM 67 Tabla 20 Número de casos complejos, anormales, normales y sin resultado obtenidos por citogenética convencional y resultado citogenómico 71 Tabla 21 Tipos de sonda utilizados 88 7 Tabla 22 Lectura de hibridación en controles para determinación de cut off en Nuc ish 90 Tabla 23 Definicióndel cut off para las sondas RB1/subtelómero13q, TP53/ATM, DLEU/subtelómero13q y MDM2/D12Z1 93 Tabla 24 Distancia (micras) entre la señal roja y verde en un control sano (100 mediciones) 95 Índice de Figuras página Fig. 1 Esquematización de la evolución clonal 23 Fig. 2 Esquema de las deleciones 13q14 tipo I y tipo II 33 Fig. 3 Diagrama de flujo 38 Fig. 4 Resultado de cariotipo obtenido por citogenética convencional 41 Fig. 5 FISH con las sondas WB y RUNX1/RUNX1T1 en células del caso 6 43 Fig. 6 Resultado del análisis de las deleciones RB1, DLEU, TP53, ATM y de la trisomía 12 por FISH 44 Fig. 7 Distribución de las anormalidades detectadas por FISH con las sondas RB1/subtel(13q), DLEU/subtel(13q), TP53/ATM y MDM2/D12Z1. 45 Fig. 8 Resultados citogenómicos obtenidos por la combinación de ambos métodos 49 Fig. 9 Resultado citogenómico en los casos de LLC y MM 49 Fig. 10 Caso 5 Célula en metafase con el análisis GTG y FISH 63 Fig. 11 Caso 7 Célula analizada por bandas GTG y FISH 64 Fig. 12 Caso 18 Células analizadas por bandas GTG 65 Fig. 13 Número de casos mostrando las anormalidades detectadas por FISH según la estadificación de la enfermedad 69 Fig. 14 Esquema de hibridación de las sondas RB1/subtelómero13q, TP53/ATM, DLEU/subtelómero 13q, D12Z1, IGH/BCL2, TCRAD breakapart y IGH breakapart 89 Fig. 15 Mediciones para determinar el valor de cut off de la sonda TCRAD breakapart 94 8 Abreviaturas utilizadas CRC CLL Research Consortium (Consorcio de Investigación en Leucemia linfocítica crónica) FISH Hibridación Fluorescente in situ LLC Leucemia linfocítica crónica LNH Linfoma No Hodgkin MM Mieloma Múltiple MGUS Gammapatía monoclonal de significado incierto Nuc ish Hibridación in situ Fluorescente nuclear PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate PWM Pokeweed mitogen TLC-B Trastornos linfoproliferativos crónicos de células B 9 RESUMEN Los trastornos linfoproliferativos crónicos de células B (TLC-B) son neoplasias que se originan en los linfocitos B maduros y se caracterizan por su acumulación en médula ósea, sangre y tejidos linfoides. Los TLC-B más comunes son la Leucemia Linfocítica Crónica (LLC), el Mieloma Múltiple (MM) y el Linfoma No Hodgkin (LNH) y se presentan con mayor frecuencia después de los 60 años. La presencia de alteraciones cromosómicas adquiridas es un evento frecuente en estos pacientes. Analizamos 40 casos de pacientes diagnosticados con TLC-B (20 casos MM, 18 casos LLC y 2 casos LNH) mediante citogenética convencional; también, realizamos la detección molecular de las aberraciones cromosómicas reportadas en otras poblaciones como las más frecuentes: la trisomía 12 y las deleciones de los genes DLEU, TP53 y ATM; además, realizamos la detección de la deleción del gen RB1 e hicimos la búsqueda de anormalidades en los genes IGH y TCRAD. Con la combinación de metodologías, encontramos un resultado citogenómico complejo (definido por la presencia de ≥3 anormalidades) en el 27.5% (11/40) de los casos, un resultado citogenómico anormal (≤2 anormalidades) en 50% (20/40) y el 22% restante (9/40) lo catalogamos como incompleto dado que no se pudo realizar el 100% de los análisis. La aplicación de las dos metodologías incrementó la tasa de detección de anormalidades a 77%, así como el incremento de detección de resultados complejos. Incorporamos al análisis por FISH, el estudio de los genes RB1, IGH y TCRAD. Esto nos permitió identificar a la deleción 13q14 tipo II (deleción simultánea de los genes DLEU y RB1) como la alteración más frecuente en nuestros casos de LLC, lo que cataloga a nuestra población como de alto riesgo. Además, la inversión inv(14)(q11q32) se detectó en algunos casos donde no se pudo analizar el cariotipo. Este trabajo es el primer estudio donde aborda de manera integral los TLC-B en población mexicana y sienta un precedente para futuras investigaciones de esta neoplasia. 10 ABSTRACT B-cell chronic lymphoproliferative disorders (B-CLD) are neoplasms that originate in mature B lymphocytes with their accumulation in bone marrow, blood and lymphoid tissues. The most common B-CLD are Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), Multiple Myeloma (MM) and Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) and occur more frequently after age 60. The presence of acquired chromosomal abnormalities is a frequent event in these patients. We analyzed 40 cases diagnosed with B-CLD (20 MM cases, 18 CLL cases and 2 NHL cases) by conventional cytogenetics; also, we perform the molecular detection of the chromosomal aberrations reported in other populations as the most frequent: trisomy 12 and deletions of the DLEU, TP53 and ATM genes; in addition, we performed the detection of the deletion of the RB1 gene and searched for abnormalities in the IGH and TCRAD genes. With the combination of methodologies, we found a complex cytogenomic result (defined by the presence of ≥3 abnormalities) in 27.5% (11/40) of cases, an abnormal cytogenomic result (≤2 abnormalities) in 50% (20/40) and the remaining 22% (9/40) we classify it as incomplete since 100% of the analyzes could not be performed. The application of the two methodologies increased the abnormality detection rate to 77%, as well as the increase in the detection of complex results. With the incorporation of the RB1, IGH and TCRAD genes in the FISH analysis we could identify the 13q14 type II deletion (simultaneous deletion of the DLEU and RB1 genes) as the most frequent alteration in our cases of CLL, which catalogs our population as high risk. In addition, inversion inv (14) (q11q32) was detected in some cases where the karyotype could not be analyzed. This work is the first study where it deals comprehensively with the B-CLD in the Mexican population and sets a precedent for future research on this neoplasm. 11 1.- Introducción 1.1 Trastornos linfoproliferativos crónicos de células B (TLC-B) Los linfocitos B son células involucradas en la inmunidad adquirida de tipo humoral, la cual se caracteriza por la producción y liberación de anticuerpos dirigidos a antígenos específicos. Los linfocitos B contienen en su superficie receptores de células B (BCR por sus siglas en inglés). Estos receptores están conformados por inmunoglobulinas de membrana, las cuales, se unen específicamente a un determinante antigénico. Los linfocitos B se originan y maduran en la médula ósea, después se ubican en los ganglios linfáticos donde, en presencia de un agente extraño, se activan. Una parte de las células B que proliferan en respuesta a un determinado antígeno se diferencia a células plasmáticas, éstas se localizan en los cordones medulares de los nódulos linfáticos, bazo y médula ósea; su función es sintetizar y secretar anticuerpos (Cano y Lopera, 2013). Los TLC-B son neoplasias de células B que se caracterizan por la acumulación de linfocitos maduros en sangre, médula ósea y tejidos linfoides. Estas células tienen características morfológicas e inmunofenotípicas determinadas, con una baja capacidad de proliferación y una alta capacidad de sobrevivencia. La sintomatología clínica se debe a la acumulación celular, principalmente en médula ósea, donde se interfiere con la producción de eritrocitos, plaquetas y linfocitos funcionales; estas células neoplásicas se acumulan en sangre periférica y se infiltran en nódulos linfáticos, bazo e hígado (Kipps et al, 2017). Las células B dan lugar a diversos tipos de neoplasias, cuyos nombres se basan en la etapa en la cual el desarrollo de las células B se detiene y se transforman en células cancerosas. El análisis de inmunofenotipo de las células monoclonales de nódulos linfáticos, sangre o de médula ósea caracteriza los diferentes tipos de TLC-B y se basa en la presencia de ciertas moléculas marcadoras en la superficie celular conocidas como cluster of diferenciation(CD). El porcentaje de la población celular que exprese determinado marcador debe ser > 20% para ser considerado como población clonal. El análisis de expresión de CDs distingue células normales o reactivas y células monoclonales. Tres grupos de TLC-B sobresalen de los demás por su frecuencia y son: la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma no Hodgkin (LNH) y el mieloma múltiple (MM) (Smith et al, 2011). 12 En la tabla 1 se muestra la clasificación de los TLC-B más comunes y el inmunofenotipo característico para cada uno de ellos. 1.1.1. Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) Es una enfermedad neoplásica caracterizada por una acumulación de linfocitos B CD5+ y CD23+, de aspecto maduro en sangre, médula ósea y tejidos linfoides. Su incidencia en hombres es dos veces mayor que en mujeres, pero no se ha demostrado que las hormonas tengan un rol en el desarrollo de la LLC (Kipps, 2001). Los pacientes con LLC tienen cierto grado de inmunodeficiencia debido a que los linfocitos B presentan baja expresión de receptores de las células B y son anérgicos (no presentan respuesta inmunológica a antígenos); la síntesis de las inmunoglobulinas decrece en el 85% de los pacientes y más del 50% sufren infecciones recurrentes. Además, el riesgo de autoinmunidad se incrementa con la progresión de la enfermedad, debido a la estimulación inmune crónica de células B (Kipps, 2001; Rodrigues et al, 2016). La enfermedad puede comenzar como una condición benigna, llamada linfocitosis monoclonal benigna, y progresar a LLC. Del 5 al 10% de los casos de LLC adquieren el síndrome de Richter, que consiste en la transformación de LLC en un linfoma agresivo (la mayoría de las veces linfoma difuso de células B largas) (Rodrigues et al, 2016). 1.1.2. Mieloma múltiple (MM) El MM es un desorden neoplásico que se caracteriza por la proliferación de una clona de células plasmáticas derivadas de linfocitos B; estas células se diferencian de una célula B activada o normal con un inmunofenotipo característico: CD19-/CD56+. La clona de células plasmáticas se acumula en médula ósea e invade el hueso adyacente, produciendo destrucción esquelética, dolor y fracturas (Ruiz-Argüelles et al, 2004; Rastgoo et al, 2017). La enfermedad puede comenzar como una condición benigna llamada gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), la cual se considera como una fase premaligna que puede evolucionar a MM. 1.1.3 Linfomas no Hodgkin (LNH) Los LNH son un grupo heterogéneo de tumores sólidos que se originan de la transformación neoplásica de linfocitos B maduros (85%) y una minoría proviene de células T. La mayoría de los LNH se originan y diseminan en sitios linfoides proliferativos, tejidos asociados a 13 ganglios linfáticos, piel o bazo. Un linfoma puede involucrar linfocitos B (los más frecuentes), linfocitos T o células NK. Los linfomas pueden ser nodales y extranodales, ya que es común la infiltración secundaria a otros órganos (Cerhan et al, 2014). Los distintos tipos de LNH se agrupan en grupos predictivos de acuerdo a la agresividad del tumor no tratado: a) linfomas de bajo grado (indolentes): linfoma folicular y linfoma de zona B marginal; b) de grado intermedio (agresivos): linfoma de células de Manto; y c) de grado alto (muy agresivos): linfoma difuso de células B largas (Difusse large B-cell diffuse lymphoma: DLBCL). Los DLBCL son un grupo de malignidades de células B, heterogéneos histopatológica, biológica y clínicamente; son el LNH más frecuente con una ocurrencia de 40% (Foon y Fisher, 2001). Tabla 1. Clasificación de los TLC-B y su inmunofenotipo característico TLC-B Inmunofenotipo Leucemia linfocítica crónica (LLC) CD19 +, CD20+, CD23+, CD5-/+ Mieloma de células plasmáticas o Mieloma Múltiple (MM) CD38+, CD56+, CD45+, CD138+, CD19- Linfoma No Hodgkin (LNH): Linfoma esplénico de zona marginal CD27+, CD103+ Linfoma linfoplasmático CD43+, CD138-/+ Linfoma folicular CD10-/+, Bcl 6+, CD23-/+ Linfoma difuso de células largas CD20+, CD5-, CD10+, BCL6+ Leucemia de células peludas CD43+, CD103++; Ciclina D1+/- Linfoma de células de Manto (MCL) CD5+, CD43+, Ciclina D1 + Linfoma MALT CD23-/+, CD43-/+, + = >90% positivo; +/- = > 50% positivo; -/+ = < 50% positivo; - = < 10% positivo. (Jeon y Cho, 2016; Campo et al, 2008, Harris et al, 2001) 1.2 Epidemiología de los TLC-B 1.2.1 Epidemiología de LLC: Es una de las malignidades de células B más comunes en individuos con ancestros europeos, con una frecuencia de 2 a 6 por cada 100,000 habitantes. En países occidentales, la leucemia diagnosticada en adultos afecta a aproximadamente el 2% de la población. La LLC es la forma más común del total de las leucemias diagnosticadas en adultos, de 25 a 30% (Labardini et al, 2011-a). 14 1.2.2 Epidemiología de MM: La incidencia de MM es más alta en las poblaciones de ascendencia africana en comparación con poblaciones caucásicas o asiáticas, donde la incidencia es menor. En poblaciones caucásicas, el MM constituye el 1% de todos los tipos de malignidades y del 10 al 15% de todas las malignidades hematológicas (Ruiz-Agüelles et al, 2004). 1.2.3 Epidemiología de LNH: Se estima una incidencia de 385,700 casos nuevos y 199,700 muertes en todo el mundo (Torre et al, 2015). En los países desarrollados el número de casos nuevos de LNH en el año 2012 fue de 190,400 y en países en desarrollo fue de 115,800 (Torre et al, 2015). Los LNH son más comunes en países desarrollados, la mayor incidencia se presenta en países como Australia, en el norte y oeste de Europa, Canadá y Estados Unidos. En Europa y EUA la tasa de incidencia de DLBCL varía de 3.1 a 5.7/100,000 con una media de edad en la sexta década de vida (Cerhan et al, 2014). La incidencia en países en desarrollo se incrementa en algunas poblaciones debido, en parte, a la epidemia de SIDA. El LNH se clasifica como una enfermedad adquirida en el SIDA. Los pacientes con SIDA tienen un riesgo 100 veces mayor de desarrollar LNH que la población general, debido a que la infección por VIH se asocia con varias alteraciones inmunológicas, como defectos funcionales y cuantitativos de células T CD4+ y la estimulación crónica antigénica de linfocitos B; esto es causante de la expansión y activación de células B, lo que contribuye al desarrollo de hiperplasia de células B en tejidos linfoides (Torre et al, 2015; Foon y Fisher, 2001). Además, otras enfermedades que implican estimulación inmune crónica (como enfermedades autoinmunes activadoras de células B y seropositividad a virus de hepatitis C) incrementan el riesgo a desarrollar LNH (Cerhan et al, 2014). En la tabla 2 se muestra la incidencia y muertes estimadas de LLC, LNH y MM en EUA. 15 Tabla 2: Incidencia y mortalidad estimadas de los TLC-B en EUA LNH MM LLC Incidencia EUA (casos nuevos/100,000/año) * 19.6 6.9 4.9 Casos nuevos estimados EUA (año 2019) 74,200 32,110 20,720 Muertes estimadas EUA (año 2019) 19,970 12,960 3.930 % de todas las muertes por cáncer 3.3 2.1 0.6 % sobreviviendo 5 años** 72 52.2 85.1 (National Cancer Institute SEER program. USA) https://seer.cancer.gov/statfacts/) *Datos del año 2012 al 2016 ** Datos del año 2009 al 2015. 1.2.4 Epidemiología de los TLC-B en México La incidencia de los TLC-B en población mexicana es menor que en otras poblaciones. Se estima que la frecuencia de LLC-B corresponde del 6.9 al 9% de todas las leucemias diagnosticadas en adultos (Ruiz-Argüelles et al, 1999; Labardini et al, 2011-a). El MM corresponde a <7.7% de todas las malignidades hematológicas (Ruiz-Argüelles et al, 2004). Los LNH tienen una incidencia en hombres de 4.5/100,000 y en mujeres de 3.3/100,000 (Labardini et al, 2011-b). 1.3 Diagnóstico de los TLC-B La edad de presentación de los TLC-B oscila aproximadamente entre los60 y 70 años. El cuadro clínico es muy variable ya que del 70 al 80% de los pacientes son asintomáticos. Algunos pacientes presentan una rápida progresión de la enfermedad y requieren de tratamiento inmediatamente después de recibir el diagnóstico; otros pacientes cursan con una enfermedad indolente que no requiere tratamiento por varios años (Zhang y Kipps, 2014). La sintomatología puede ser muy ambigua, con síntomas tales como debilidad, febrícula, diaforesis. Algunos síntomas que indican progresión de la enfermedad son pérdida de peso no intencional (>10% del peso dentro de 6 meses), fiebre >38°C y sudores nocturnos durante más de 1 mes, sin evidencia de infección. En las etapas avanzadas se observa adenomegalia, síndrome anémico y esplenomegalia (Zhang y Kipps, 2014; Jeon y Cho, 2016; Harris et al, 2001; Campo et al, 2008). 16 La expansión clonal de células B se hace evidente después de la detección de leucocitosis en una biometría hemática (≥10,000 leucocitos /µL) persistente por más de 3 meses, el recuento diferencial de leucocitos indica una linfocitosis (≥35% y puede llegar hasta 90%); los linfocitos son de aspecto maduro; la morfología típica de la LLC se caracteriza por linfocitos pequeños, con cromatina madura y mínimo citoplasma, sin nucleolo y <10% de prolinfocitos (De Braekeleer et al, 2016). Los linfocitos comparten el mismo inmunofenotipo CD5+ y CD23+, y expresan niveles variables de inmunoglobulinas de superficie, los cuales pueden ser normales, altos o bajos (Jeon y Cho, 2016; Harris et al, 2001; Campo et al, 2008). En los pacientes con MM no se detecta una linfocitosis en la biometría hemática, sin embargo, el aspirado de médula ósea muestra una acumulación de células plasmáticas (plasmocitosis hasta 90%). Para realizar el diagnóstico de MM se requiere la presencia de ≥10% de células plasmáticas clonales en la médula ósea CD19-/CD56+ y un pico monoclonal de la proteína M, la cual es la inmunoglobulina monoclonal secretada por las células plasmáticas, en la electroforesis de proteínas séricas. (tabla 1) (Cano et al, 2008; Kipps et al, 2017). El diagnóstico de MM requiere de la colaboración entre numerosas disciplinas (ortopedia, radiología, medicina nuclear, hematología y oncología). Los síntomas para MM son dolor óseo, presente en 60% a 80% de los casos, que se manifiesta principalmente en columna vertebral, esternón, costillas, y zona proximal de extremidades; fracturas patológicas, lesiones líticas óseas, osteoporosis grave y neuropatías periféricas; en los estudios por imágenes se observan huecos óseos por el crecimiento del tumor, además de daño renal debido a la filtración de fragmentos de la proteína M a través del riñón a la orina (proteína Bence-Jones) y anemia. Frecuentemente, los pacientes refieren dolor de espalda seguido de un trauma menor (Ruiz-Argüelles et al, 2004). En los casos indolentes, existen entre 10 y 60% de células plasmáticas en médula ósea, además de la presencia de la proteína M en sangre, pero sus recuentos sanguíneos son normales, así como su función renal y no hay daño en huesos. 1.4 Factores pronóstico y estadificación en los TLC-B El primer consenso en LLC de la Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología, Epidemiología, Diagnóstico y Tratamiento recomienda aplicar sistemas de estadificación de 17 pacientes en grupos pronósticos. Para cada uno de los TLC-B más frecuentes se aplica un sistema de estadificación, como se describe a continuación: LLC: Las clasificaciones de Rai y de Binet son el estándar para definir el pronóstico de la LLC, éstos se basan en los valores de hemoglobina, leucocitos, linfocitos, plaquetas, y presencia de organomegalia (Cano et al, 2008). LNH: El sistema utilizado para el LNH es el sistema Ann Arbor, basado en el número de ganglios afectados y su infiltración secundaria a otros órganos (Cerhan et al, 2014). MM: El sistema para la estadificación del MM fue el Durie Salmon staging (DSS), basado en los niveles inmunoglobulinas, hemoglobina y calcio, además del número de lesiones óseas; posteriormente el International Staging System (ISS) que incorporó los niveles de β2 microglobulina y albúmina (Döhner et al, 2000; Palumbo et al, 2015). Estos sistemas son ampliamente utilizados desde los años 70’s para estadificar a los pacientes en grupos pronósticos según ciertas características clínicas y bioquímicas (tabla 3) (Cano et al, 2008; Kipps et al, 2107). Los estadios van desde bajo riesgo a riesgo alto y se correlacionan con una media de supervivencia (años o meses) desde el diagnóstico la cual va disminuyendo conforme avanzan los estadios (Cano et al, 2008). Estos sistemas para definir el pronóstico se han utilizado cerca de 40 años, pero presentan ciertas desventajas, por ejemplo, existe heterogeneidad clínica significativa entre pacientes dentro de cada categoría en etapa Rai y Binet. Además, los grupos Rai0/Binet A son etapas que no estadifican exactamente el riesgo de progresión, por lo que ninguno de estos sistemas son un fuerte predictor del pronóstico. Por esta razón se han realizado numerosos estudios para buscar marcadores de pronóstico confiables, útiles para predecir la progresión y el desenlace de la enfermedad. Algunos parámetros pronósticos que se han utilizado, en los casos de LLC, son la cuenta absoluta de linfocitos, el tiempo en que se dobla la cuenta de linfocitos, llamado LDT por sus siglas en inglés (lymphocyte doubling time) o ciertos marcadores en suero como la β2 microglobulina, donde valores >3.5 mg/L se asocian con una sobrevivencia más corta, en los casos de MM; sin embargo, estos marcadores no informan acerca de las características biológicas de las clonas de los TLC-B (Parikh y Shanafelt, 2016). En cuanto a marcadores basados en la citometría de flujo, encontramos para casos de LLC, la positividad al marcador de superficie CD38 (≥30% de células) y positividad a ZAP70, (≥70% de células). Sin embargo, la positividad a CD38 y a ZAP70 no son suficientes para 18 predecir con suficiente precisión el pronóstico individual de pacientes con TLC-B (Parikh y Shanafelt, 2016). Otro marcador pronóstico que se utiliza actualmente es el estado mutacional de los genes que codifican la región variable de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (IGHV). Está reportado que el estado mutacional influye en la variabilidad del cuadro clínico de la enfermedad; por ejemplo, en aproximadamente el 40% de los casos, las células neoplásicas expresan inmunoglobulinas codificadas por genes IGHV no mutados, los cuales se asocian con una enfermedad más agresiva (media de sobrevivencia de aproximadamente 8 años); en contraste, los pacientes cuyas células neoplásicas expresan inmunoglobulinas codificadas por genes IGHV mutados, generalmente presentan una enfermedad indolente y una media de sobrevivencia mayor a 20 años (Zhang y Kipps, 2014). Las alteraciones genéticas son los mejores predictores de la progresión de la enfermedad y sobrevivencia, las anormalidades citogenéticas reflejan la composición genética de las células neoplásicas, por lo que su detección es útil para: definir un pronóstico más exacto en cada paciente al momento del diagnóstico, seleccionar el momento de inicio de tratamiento, decidir si puede recibir un tratamiento convencional y determinar la frecuencia del seguimiento terapéutico. Las características citogenéticas como la del(17p), del(11q) o cariotipo complejo (presencia de tres o más aberraciones cromosómicas), son predictores de una pobre respuesta al tratamiento de quimioterapia convencional. La terapia convencional consiste de una combinación de quimioterapia: ciclofosfamida, fludarabina, con un anticuerpo monoclonal como el rituximab (FCR), pero para pacientes con la del(17)p deben considerarse medicamentos como el alemtuzumab, ibrutinib o venetoclax. Los pacientes conestas deleciones generalmente no responden a la quimioterapia convencional, la supervivencia es corta y se debe considerar otras alternativas como el trasplante alogénico de células hematopoyéticas. Por otra parte, los pacientes con un cariotipo normal tienen una respuesta positiva al tratamiento, al contrario de los pacientes con cariotipos anormales, especialmente los complejos (Huang et al, 2017; Palumbo et al, 2015; Labardini et al, 2011-a y 2011-b; Sonneveld et al, 2016). 19 1.5 Factores de riesgo para el desarrollo de TLC-B A la fecha, no se han identificado claramente factores de riesgo para el desarrollo de TLC- B; sin embargo hay algunos factores que probablemente aumenten el riesgo, como: la edad, a mayor edad existe un riesgo mayor para desarrollar algún TLC-B; el sexo, los TLC-B son un poco más frecuentes en hombres que en mujeres; la raza, en el caso del MM es más frecuente en individuos con ascendencia africana, mientras que la LLC es más frecuente en población caucásica; antecedentes médicos, como tener un diagnóstico previo de linfocitosis monoclonal benigna, o gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), los cuales son desórdenes premalignos que pueden progresar a LLC o a MM respectivamente; tener diagnóstico de SIDA, en el caso de la predisposición para Tabla 3. Sistemas de clasificación de pacientes con TLC-B y valores pronóstico (Cano et al, 2008; Kipps et al, 2017) Etapas Datos clínicos Supervivencia (años) Riesgo LLC Rai 0 Linfocitosis sin adenomegalia, esplenomegalia o hepatomegalia; con recuentos de glóbulos rojos y plaquetas casi normales. >10 Bajo I Linfocitosis y adenomegalia. Los recuentos de glóbulos rojos y plaquetas son casi normales. Aprox. 7 Intermedio II Linfocitosis, esplenomegalia, y posible hepatomegalia, con o sin adenomegalia. Los recuentos de glóbulos rojos y de plaquetas son casi normales. Aprox. 7 Intermedio III Linfocitosis más anemia, con o sin adenomegalia, hepatomegalia y esplenomegalia. El recuento de plaquetas es casi normal. 1.5-3 Alto IV Linfocitosis más trombocitopenia (muy pocas plaquetas), con o sin anemia, adenomegalia, esplenomegalia y hepatomegalia. 1.5-3 Alto MM ISS I Microglobulina B2 sérica <3.5mg/L Albúmina sérica >3.5 g/dL 5 Estándar II Microglobulina B2 sérica 3.5mg/L – 5.5mg/L Albúmina sérica <3.5 g/dL 3.5 Intermedio III Microglobulina B2 sérica >5.5 mg/L 2.5 Alto LNH Ann Arbor I Región de un solo ganglio Bajo II Dos o más ganglios del mismo diafragma Intermedio III Regiones ganglionares en ambos lados del diafragma Alto IV Órganos y regiones extra ganglionares Alto 20 desarrollar LNH; tener historia familiar de trastornos linfoproliferativos; además de los factores ambientales como el tabaquismo, radiación, exposición a sustancias químicas como pesticidas o fertilizantes, y la obesidad (Labardini et al, 2011-b). 1.6 Heredabilidad de los TLC-B La mayoría de los casos de TLC-B son esporádicos, solamente el 10% de los pacientes tienen una historia familiar de LLC, MM o de un desorden linfoproliferativo relacionado. LLC: En familias con múltiples miembros afectados con LLC, los parientes de primer grado tienen un riesgo 3 veces mayor que la población general para desarrollar esta u otras neoplasias linfoides. Los individuos afectados dentro de tales familias presentan la enfermedad a una edad más temprana que la mayoría de los pacientes. Los factores genéticos que contribuyen a un incremento de la incidencia de LLC familiar son desconocidos. Setlur et al, (2010) identificaron alteraciones en la región cromosómica 14q1, en donde se ha descrito variaciones en número de copias (CNVs); dichas variantes pueden estar asociadas con susceptibilidad a desarrollar LLC familiar con un pronóstico favorable. Slager et al, (2013) identificaron 25 SNP’s de 22 loci, la mayoría involucrados en las vías tumorigénicas (reparación de ADN, apoptosis, etc.), lo que puede explicar aproximadamente el 17% de la heredabilidad de la LLC. MM: En estudios familiares de casos índice de MM se encontró que hay variaciones genéticas heredadas que pueden predisponer al desarrollo de MGUS; estas familias tienen un riesgo de 2 a 4 veces mayor para desarrollar la condición premaligna. Al investigar a estas familias, con estudios de epidemiología molecular, se identificaron loci genéticos (DNMT3A, DTNB, ULK4, TRAK1, DNAH11, CDCA7L) que incrementan levemente el riesgo de desarrollar MM (Prideaux et al, 2014). LNH: El riesgo para desarrollar LNH es 3.6% mayor en parientes de primer grado de un paciente con LNH. Estudios de asociación genómica amplia (GWAS) con microarreglos de SNP’s, en estudios familiares de linfomas, han identificado nuevos loci asociados a DLBCL en individuos con ancestros europeos: 6p25.3 (EXOC2), 6p21.33 (HLA-B), 2p23.3 (NCOA1) y 8q24.21 (PVT1 y MYC); de éstos, sólo EXOC2, PVT1 y HLA-B se encontraron asociados en poblaciones asiáticas (Cerhan y Slager, 2015). 21 1.7 Alteraciones genéticas de los TLC-B: de la condición premaligna a la neoplasia reconocida LLC: Aproximadamente 3.5% de individuos sanos, mayores de 45 años y sin historia familiar de LLC tienen expansiones oligoclonales/monoclonales de células B, condición conocida como linfocitosis monoclonal benigna de células B. La linfocitosis monoclonal benigna es una condición hematológica asintomática, caracterizada por una expansión poblacional de células B monoclonales ≥10%. La edad es un factor determinante, en el cual, la probabilidad de desarrollar linfocitosis monoclonal de células B a los 90 años, se estima del 61%. Los hombres tienen un riesgo significativamente mayor para desarrollar linfocitosis monoclonal de células B (19.5%) que las mujeres (15.2%). Esta linfocitosis se clasifica en dos grupos según la cuenta absoluta de células B: cuenta normal y linfocitosis presente. Los individuos con cuenta normal tienen un riesgo muy bajo de progresión, mientras que del 1 a 2% de los individuos con linfocitosis, desarrollan LLC al año (Kipps, 2001, Kipps et al, 2017). MM: Se reconocen 4 fases clínicas del mieloma. La primera fase es la gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS); esta fase premaligna, asintomática e indolente, se caracteriza por la existencia de una población clonal pequeña de células plasmáticas dentro de la médula ósea (<10%), su prevalencia es de 4% en la población caucásica > 50 años y su riesgo de progresión a MM es de 1% al año. La segunda fase es el mieloma latente; es una fase asintomática, donde la población de células neoplásicas en médula ósea es >10% y el riesgo de progresión a MM es de 10% al año. La tercera fase es MM reconocido, donde las clonas malignas causan daño a los órganos. Y la cuarta fase es la leucemia de células plasmáticas, la cual es una enfermedad de fase terminal, caracterizada por la presencia de clonas extramedulares y por una supervivencia muy corta (Prideaux et al, 2014). 1.8 Clonas y evolución clonal Para que una célula en estado premaligno se transforme en cancerosa, deben ocurrir cambios genéticos adicionales. Estas alteraciones genéticas ocurren como eventos primarios, que contribuyen a la inmortalización de las células, mientras que los eventos 22 secundarios, conducen a la progresión de la enfermedad y se encuentran en las etapas avanzadas de la enfermedad. Las alteraciones genéticas incluyen pérdidas de ADN que contribuyen a la malignidad, a través de la pérdida de genes supresores de tumor; mientras que las ganancias son patogénicas por la activación o sobreexpresión de oncogenes. Las ganancias o pérdidas pueden ser de un locus, una banda cromosómica, un brazo cromosómico o de un cromosoma completo. Dentro de las modificaciones epigenéticas, se encuentran los cambios en la metilación, los cuales contribuyena desestabilizar la relación estroma-clona por alteraciones en la metilación de genes involucrados en la adhesión y señalización celular, promoviendo la transición clonal a la circulación. Por otra parte, los miRNAs se expresan diferencialmente en las neoplasias, estos cambios contribuyen a la desregulación de genes y vías relevantes a la patogénesis de las neoplasias, incluyendo la progresión del ciclo celular (Prideaux et al, 2014; Zhang y Kipps, 2014; Slager et al, 2013). La población de células neoplásicas, conocida como clona, adquiere alteraciones que le proporciona ventajas en proliferación o supervivencia. Una clona se define como una población celular que se deriva de una célula progenitora, y comparte el mismo complemento cromosómico. Durante el curso de la enfermedad algunas clonas (stemline) adquieren una nueva mutación, que confiere nuevas ventajas sobre las otras células neoplásicas; a esto se le denomina evolución clonal. La clona principal (mainline) es la constitución cromosómica más frecuente de una población de células tumorales en el momento del muestreo; es un término cuantitativo que describe la clona más grande, y no indica si es la clona más básica en términos de progresión tumoral (ISCN, 2016). Una clona no es necesariamente homogénea, ya que puede haber subclonas (sideline), o también llamadas clonas secundarias, que evolucionaron durante la progresión del tumor (Greaves et al, 2012; Huang et al, 2017), lo que origina una heterogeneidad intraclonal. La heterogeneidad intraclonal añade complejidad a la progresión de los TLC-B. Las diferentes poblaciones de subclonas tienen relevancia terapéutica, ya que los genes y las vías desreguladas en la población clonal predominante no son uniformes, debido a diferentes rutas de evolución, las cuales pueden provocar resistencia al tratamiento y recaídas (Figura 1) (Prideaux et al, 2014). Kriangkum et al, (2013) reportaron un 16% de pacientes con MM que poseen una clona secundaria de células B; el tratamiento puede debilitar a la clona principal y/o alterar el nicho micro ambiental, lo que permite la expansión de otras subclonas a niveles detectables. 23 Las alteraciones cromosómicas en los TLC-B son un factor pronóstico que se correlaciona con el curso clínico y el tratamiento. Las alteraciones cromosómicas se detectan en más del 80% de los pacientes, entre las que destacan translocaciones, inversiones, trisomías, monosomías y deleciones, entre otras, lo que añade complejidad a la progresión de los TLC-B (Puiggros et al, 2014). Figura 1: Esquematización de la evolución clonal 24 1.9 Citogenética de los TLC-B El proceso normal de diferenciación de las células B incluye la recombinación de regiones génicas, proceso llamado hipermutación somática, el cual crea la diversidad de inmunoglobulinas en los centros germinales de células B, con el arreglo del locus génico de las inmunoglobulinas (Ig); este proceso incluye el arreglo de los genes de cadenas pesadas (recombinación de los segmentos D, J y V), además el arreglo de los genes de cadenas ligeras (recombinación de los segmentos V y J) (De Braekeleer et al, 2016). Las hipermutaciones somáticas pueden contribuir a la generación de neoplasias de células B, debido a que este proceso requiere de rupturas de la doble cadena de ADN, que favorecen la ocurrencia de translocaciones cromosómicas o inversiones que involucran los genes de las inmunoglobulinas (Harris et al,2001). Debido a esto, en los pacientes con TLC- B, las translocaciones cromosómicas que involucran el locus IGH (localizado en la banda cromosómica 14q32) ocurren con una frecuencia de hasta 77%; y en menor frecuencia, translocaciones que involucran los loci IGL (en la banda cromosómica 22q11) e IGK (en 2p11), en 20% y 3% de casos, respectivamente (De Braekeleer et al, 2016). 1.10 Metodologías para el estudio citogenético de los TLC-B Los pacientes presentan una acumulación progresiva de células de lenta proliferación, la mayoría de las células B neoplásicas aisladas de pacientes con TLC-B, se encuentran en fase G0/G1 del ciclo celular. Estas células presentan un bajo o nulo índice mitótico in vivo y en cultivo in vitro, lo que dificulta obtener células en metafase y su análisis por bandas GTG; debido a esto, el estándar de oro para el estudio de anormalidades cromosómicas ha sido la citogenética molecular, como la hibridación fluorescente in situ nuclear (FISH, Nuc ish). Con esta metodología, se detectan alteraciones comúnmente asociadas a los TLC-B: la trisomía 12 y las deleciones submicroscópicas 13q14, 17p13 y 11q22 (Kipps et al 2017; Kipps 2001). Sin embargo, la FISH nuclear está dirigida al análisis de regiones blanco, por lo que solo se analiza parcialmente la complejidad del cariotipo de los TLC-B (Karakosta et al, 2016). 25 Los mitógenos son estimulantes policlonales, sin especificidad antigénica, que inducen la mitosis de células B por la activación de diferentes vías. El uso combinado de mitógenos de células B, como mitógeno Pokeweed (PWM) y Phorbol Miristato de Acetato (PMA), conducen a la activación del ciclo celular, al inducir la entrada a la fase S y estimular la mitosis de células B neoplásicas. El mitógeno Pokeweed consiste de glucoproteínas extraídas de Phytolacca americana, mientras que el mitógeno PMA o también llamado TPA, induce la mitosis de células B por activación de la proteína C kinasa, que fosforila diversas proteínas blanco, las cuales controlan la proliferación celular. Existen mitógenos con mayor poder mitogénico que el PWM o el PMA, como los CpG-oligodesoxinucleótidos (CpG-ODN), que inducen la proliferación de células leucémicas, a través de la interacción con receptores Toll en las células B; su combinación con interleucina 2 (IL-2) es más eficaz para inducir la progresión del ciclo celular en células leucémicas (Heerema et al, 2010; Muthusamy et al, 2011; Karakosta et al, 2016). El uso de mitógenos en los cultivos de células de muestras de pacientes con TLC-B posibilita la obtención células en metafase, y en consecuencia, la detección de alteraciones en el número de cromosomas, translocaciones balanceadas, así como distinguir entre clonas heterogéneas que coexisten en una muestra. El análisis de bandas GTG en conjunto con el análisis de FISH nuclear, permite establecer una metodología para un abordaje integral en el estudio de estas neoplasias (Puiggros et al, 2014). 1.11 Estudio de los TLC-B por citogenética convencional Con la metodología de citogenética convencional realizada en sangre periférica en los pacientes con LLC y LNH, en médula ósea de los pacientes con MM, las alteraciones cromosómicas se detectan en el 20% al 50% de los pacientes con TLC-B con una media de 30% al 40% (Lai et al, 2012). Los hallazgos observados en los cariotipos de los pacientes con TLC-B comprenden alteraciones cromosómicas que involucran al gen IGH, localizado en la banda cromosómica 14q32. También se han reportado cariotipos complejos asociados a los TLC-B (De Braekeleer et al, 2016, Puiggros et al, 2014). En la tabla 4 se muestran las alteraciones cromosómicas detectadas por citogenética convencional más comúnmente reportadas en cada tipo de TLC-B. 26 1.11. 1 Alteraciones citogenéticas en LLC a) Translocaciones que involucran el gen IGH (14q32) Las translocaciones recíprocas balanceadas son una característica recurrente en muchos tipos de cáncer hematológico (Mitelman et al, 2020). Estos arreglos generan fusiones génicas o conducen a la activación de protooncogenes por su reposicionamiento cercano a secuencias reguladoras activas como promotores o enhancers. Las translocaciones que involucran los genes de las inmunoglobulinas, son una de las anormalidades citogenéticas que tienen implicaciones clínicas, especificidades biológicas e implicaciones en elpronóstico del paciente (De Braekeleer et al, 2016). Tabla 4: Alteraciones cromosómicas más comunes en cada tipo de TLC-B detectadas por citogenética convencional (Kipps, 2001; Barlogie et al, 2001; Foon y Fisher, 2001). TLC-B Alteraciones cromosómicas Comentarios LLC Anormalidades en 14q32 (translocaciones e inversión), del 6(q) La del(6)q se reporta del 3 al 10% de casos con LLC y otorga un pronóstico intermedio. Algunos laboratorios de diagnóstico incorporan la sonda para MYB (6q23.3) en el panel de sondas de FISH para LLC. La del(6q) es fácilmente detectada por citogenética convencional. La deleción es variable en sus puntos de ruptura, por lo que la FISH con la sonda MYB no siempre la identifica. MM Frecuencia e impacto en el pronóstico Cariotipos complejos 16%, negativo Hiperdiploidías (cromosomas 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 y 21) 60%, neutral Monosomías (monosomía 13) 50%, evento temprano en la patología Amplificación 1q21; CKS1B 35-40%, negativo Deleción 1p32, 1p22; CDKN2C 7-17%, negativo t(14;16)(q32;q23) (IGH/c-MAF) 2-3%, controversial t(4;14)(p16;q32) (FGFR3 y MMSET/IGH) 15%, negativo t(11;14)(q13;q32) (CCND1/IGH) 20%, buen pronóstico LNH t(14;18)(q32;q21) (IGH/BCL2) t(9;14)(p22;q32) (JAK2/IGH) Frecuente en linfoma difuso de células B largas, linfoma folicular y linfoma de células B de zona marginal t(11;14)(q13;q32)(BCL1/IGH) t(3;14)(q27;q32)(BCL6/IGH) t(6;14)(p25;q32) (IRF4/IGH) Frecuentes en linfoma de células de manto y en linfoma difuso de células B largas 27 El gen IGH (Inmunoglobulin Heavy Locus) se localiza en la banda cromosómica 14q32, codifica las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, las cuales son los marcadores de superficie de los linfocitos B. Las translocaciones que involucran la región cromosómica 14q32 son comunes y se detectan en 4 al 24% de los pacientes con LLC (Flanagan et al, 2008). Estos arreglos provocan la yuxtaposición del gen IGH con diversos genes. Los genes translocados (usualmente involucrados en el control de la proliferación celular y/o apoptosis) se afectan por la desregulación transcripcional, como consecuencia de su transposición dentro del locus IGH (De Braekeleer et al, 2016). En la base de datos “Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer” (Mitelman et al, 2020), se reportan 336 fusiones génicas entre el gen IGH con otro gen, entre las que destacan por su frecuencia: CCND1 t(11;14)(q13;q32), FGFR/MMSET t(4;14)(p16;q32), CMAF t(14;16)(q32;q23), CCND3 t(6;14)(p21;q32), MAFB t(14;20)(q32;q11), BCL2 t(14;18)(q32;q21) y MYC t(8;14)(q24;q32) (Campo et al, 2008, Shanafelt et al, 2010, Heerema et al, 2010, Muthusamy et al, 2011, Kumar et al, 2012, Jares et al, 2012, Cultrera et al, 2012, Nedomova et al, 2012). b) Inversión inv(14)(q11q32) y translocación t(14;14)(q11;q32) En la banda 14q11 se encuentra los loci de los receptores α y δ de células T, los genes TCRA y TCRD, que comúnmente se conoce como loci TCRAD. Esta es una región, al igual que la banda 14q32, propensa a inversiones o translocaciones, ya que las células T utilizan un mecanismo similar a la recombinación génica de las inmunoglobulinas de las células B, para producir dos tipos de receptores de células T, α y δ. Como consecuencia, los arreglos observados involucran la banda 14q32 y 14q11: inversión inv(14)(q11q32) y la translocación t(14;14)(q11;q32). La ocurrencia de la inv(14)(q11q32) es una aberración cromosómica común en malignidades de células T, este arreglo cromosómico implica la fusión génica TCRA/TCL1A (Przybylski et al, 2005). Por otra parte, en malignidades de células B, la inv(14)(q11q32) representa un error en la recombinación entre los genes de los receptores α y δ de células T en 14q11.2 (segmento Joining del receptor α de células T) y el gen IGH en 14q32.3 (segmento Variable de IGH), generando la fusión génica IGVH/TCRJα (Denny et al, 1986-a y b). Debido a que los loci IGH y TCR son similares en estructura genómica, sus segmentos pueden intercambiarse para producir un gen híbrido transcripcionalmente activo IGVH/TCRJα. Además, hay otras fusiones génicas reportadas como consecuencia de este 28 arreglo, entre las que destacan IGH/CEBPE (Akasaka et al, 2007) y BCL11B/TRDC (Narducci et al, 1995). En la base de datos de Mitelman se reportan 137 casos con la inv(14)(q11q32), 60% corresponden a leucemia prolinfocítica de células T y 5% a LLC-B. Con respecto a la t(14;14)(q11;q32), la base de datos de Mitelman reporta 23 casos con este arreglo; de estos casos, el 92% corresponde a leucemia prolinfocítica de células T y leucemia linfoblástica aguda; el 8% restante corresponde a TLC-B: LLC-B y MM. c) Cariotipos complejos Los cariotipos complejos se definen por la presencia de clonas con tres o más anormalidades cromosómicas y se detectan en aproximadamente el 16% de los pacientes con TLC-B al momento del diagnóstico (Puiggros et al, 2014). Los cariotipos complejos se relacionan con un pronóstico pobre y una alta tasa de mortalidad (Heerema et al, 2010, Muthusamy et al, 2011). 1.11.2 Alteraciones citogenéticas en MM En pacientes de MM, la hiperdiploidía puede presentarse como una alteración citogenética primaria, resultante de un único evento mitótico catastrófico, con la consecuencia del aumento del número de copias de loci génicos, que promueven la sobrevivencia del tumor. Por lo tanto, es frecuente encontrar trisomías de prácticamente todos los cromosomas, además de monosomías. Por otra parte, es habitual encontrar las translocaciones que involucran la banda cromosómica 14q32 con varios cromosomas: 4, 6, 11, 16 y 20 (Prideaux et al, 2014). La ocurrencia de la monosomía 13 sugiere que esta alteración podría ser un evento temprano en la patogénesis del MM, la monosomía 13 se reporta entre 40 al 50% de los tumores MGUS y en 50% de los MM (Govindasamy et al, 2019). Algunos eventos que ocurren como cambios secundarios en la fase avanzada de MM, incluyen la translocación secundaria t(8;14) que no siempre incluye al gen IGH; esta translocación ocurre como un evento independiente de la recombinación aberrante en los centros germinales de las células B. El gen típicamente desregulado por esta translocación es c-MYC, la sobreexpresión de este oncogén se observa en un 15% de los mielomas y en el 50% de los casos con enfermedad avanzada (Prideaux et al, 2014). Otros eventos secundarios incluyen la ganancia de 1q, la deleción de 1p, y la pérdida de 17p. La amplificación de 1q21 es más prevalente que la deleción de 1p32 y se ha correlacionado con arreglos IGH y monosomía 13 (Ashok et al, 2017). 29 1.11.3 Alteraciones citogenéticas en LNH En los pacientes con LNH es frecuente observar hiperdiploidía con trisomías 3, 7 y 18, y monosomía 13, además de alteraciones estructurales como translocaciones en 14q32, deleción en 6q y duplicación 1q (Kim et al, 2013). Se han reportado translocaciones que involucran al gen IGH con oncogenes relacionados con linfoma, con los siguientes puntos de ruptura: BCL6 (3q27), IRF4 (6p25), JAK2 (9p22), BCL1 (11q13), BCL2 (18q21). 1.12 Estudio de los TLC-B por citogenética molecular 1.12.1 Deleciones submicroscópicas 13q14, 17p13, 11q22 y trisomía 12 Con un análisis de FISH nuclear (Nuc ish; también conocido como FISH en interfase, iFISH), las alteraciones cromosómicas se detectan en 70 al 90% de pacientes (Lai et al, 2012). Las alteraciones frecuentemente detectadas por FISH, en los TLC-B al momento del diagnóstico, de manera general, son la trisomía 12 y las deleciones submicroscópicas 13q14, 17p13 y 11q22 (Kipps et al, 2017). Cabe señalar que para la detección de estas alteraciones se comercializa un panel de FISH para el estudio de pacientes con TLC-B, que incluyen sondas para la identificación de estas 4 alteraciones, las cuales, se asocian con una predicción del pronóstico:las deleciones del(17p) o del(11q) que confieren un pronóstico pobre (sobrevivencia de 1.5 a 4 años); la trisomía 12 confiere un pronóstico intermedio (sobrevivencia de aproximadamente 7 años), mientras que la del(13q14) se relaciona con un pronóstico favorable (sobrevivencia mayor a 10 años) (Huang et al, 2017) (tabla 5). Tabla 5: Valor pronóstico de las alteraciones cromosómicas detectadas por FISH en pacientes con TLC-B (modificado de Kipps et al, 2017) Alteración cromosómica Pronóstico Genes afectados Frecuencia en pacientes al momento del diagnóstico LLC MM del(17p13) Pobre TP53 3-8% 5-15% del(11q22) Pobre ATM 5-20% <5% Trisomía 12 Intermedio MDM2, AICDA, HoxC4, STAT6 10-20% <5% del(13q14) Tipo I Favorable DLEU1, DLEU2, mir 15-16 >50% Monosomía 13 (40-50%) Tipo II Intermedio DLEU1, DLEU2, mir 15-16 y RB1 20% 30 La importancia de realizar el análisis de FISH en pacientes con TLC-B al momento del diagnóstico para la búsqueda de la del(17p13), del(11q22), trisomía 12, y del(13q14) (ésta última presente como única anormalidad), radica en que la media del tiempo de sobrevivencia para los pacientes en estos grupos son 32, 79, 114 y 133 meses, respectivamente. Los pacientes con la del(17p13) y la del(11q22) presentan una mayor velocidad en la evolución de la enfermedad que los pacientes de los otros grupos. Un análisis que considere la presencia o ausencia de la del(17p), del(11q), y que tome en cuenta la edad, la estadificación y los recuentos sanguíneos, proveerá de información significativa para definir el pronóstico (Döhner et al, 2000). 1.12.1.1 Deleción 17p13 El gen TP53 (tumor protein p53) se considera como un gen supresor de tumor, se localiza en la banda cromosómica 17p13 y codifica la proteína TP53. En presencia de señales de estrés celular como daño al ADN, hipoxia o señalización oncogénica, la proteína TP53 se modifica en su conformación y se libera de sus reguladores negativos, MDM2 (murine doble minute 2; E3 ubiquitin protein ligase) y MDM4 (murine doble minute 4), lo que resulta en su activación. TP53 actúa como factor de transcripción y promueve expresión génica específica para la inducción de respuestas anti proliferativas, como arresto transitorio del ciclo celular (p21, Gadd45, 14-3-3σ) en respuesta a daño al ADN y permite su reparación antes de seguir con el ciclo celular. Además, puede disparar un arresto permanente (senescencia, mediada por p21) o apoptosis, para la eliminación completa de daños considerados irreparables o de células premalignas (Garcia y Attardi, 2014). La del(17p13) se observa en aproximadamente de 3-8% de los pacientes al momento del diagnóstico y en el 30% de los pacientes tratados con quimioterapia que son refractarios al tratamiento, por lo que se le considera una de las alteraciones más frecuentemente adquiridas después de tratamiento. Los pacientes con la del(17p) tienen un pronóstico muy pobre, lo cual se explica por la desregulación del ciclo celular causado por la pérdida del gen TP53. Se ha demostrado que en más del 75% de los casos con deleción 17p13, el alelo TP53 restante contiene mutaciones que suprimen por completo la función de la proteína TP53. Estudios recientes han demostrado heterogeneidad clínica dependiente de si la deleción se encuentra al momento del diagnóstico (deleción primaria) o si es una alteración que aparece después, durante la evolución de la enfermedad (deleción secundaria). Los pacientes con la deleción primaria presentan una sobrevivencia de 4-5 años, mientras que 31 aquellos que adquirieron la deleción durante la evolución clonal, tienen un notable decremento de sobrevivencia (1-1.5 años) (Puiggros et al, 2014; Kipps et al, 2017). 1.12.1.2. Deleción 11q22 El gen ATM (Ataxia telangiectasia mutated) codifica una proteína serina treonina kinasa, se localiza en 11q22. La proteína ATM es un regulador de la respuesta al daño del ADN por estrés oxidativo y por rupturas de doble cadena. En presencia de daño al ADN, el complejo formado por MREII, RAD50 y NBS1 (MRN) recluta y activa a la proteína ATM en los sitios de rupturas de doble cadena de ADN para convertir las formas diméricas inactivas de ATM en formas monoméricas activas. La proteína ATM activada fosforila sustratos como H2A, la proteína de mantenimiento estructural cromosómico (SMCI) y el factor de transcripción TP53, para promover la reparación del ADN (Lee et al, 2018). La deleción del(11q22) se encuentra en 5-20% de los pacientes al momento del diagnóstico. Esta deleción puede variar en tamaño llegando a ser tan grande como 20 megabases, sin que hasta el momento se hayan descrito deleciones bialélicas. Desde el punto de vista clínico, los pacientes con la del(11q22) se caracterizan por linfadenopatías y se asocian con factores de pronóstico pobre (Puiggros et al, 2014; Kipps et al, 2017). 1.12.1.3. Trisomía 12 La trisomía 12 se presenta en 10-20% de los casos, puede estar asociada con otras alteraciones cromosómicas, incluyendo trisomías 18 y 19, deleciones en 14q, 13q, 11q o 17p y translocaciones del gen IGH; aunque en el 40 al 60% de los casos de LLC es frecuente encontrar la trisomía 12 como única alteración (Kipps et al, 2017; Puiggros et al, 2014). La sobreexpresión del gen MDM2 (murine doble minute 2), cuyo locus se encuentra en la banda cromosómica 12q15, es un mecanismo común por el cual varios tipos de cáncer anulan la expresión de TP53. La amplificación del gen MDM2 resultante de la trisomía 12 se ha detectado en el 8% de los pacientes con MM (Herrero et al, 2016). Zaprazna et al, (2019) reportaron la asociación de altos niveles de transcripción del gen citidina desaminasa (AICDA, 12p13.3), en pacientes con LLC-B y trisomía 12. Esta enzima es esencial para la hipermutación somática durante las respuestas inmunes adaptativas y su expresión aberrante se ha detectado en linfomas, leucemias y tumores sólidos. Otros genes como HOXC4 (12q13.13) y STAT6 (12q13.3) son reguladores positivos de la expresión del gen 32 AICDA, lo que pudiera explicar el efecto de la trisomía 12 en el fenotipo de la LLC (Zaprazna et al, 2019). 1.12.1.4. Deleción 13q14 La región cromosómica 13q14.3 contiene genes con probable función supresora de tumor. La pérdida de dicha función conduce al desarrollo de un fenotipo maligno en más del 50% de los casos de TLC-B. En esta región se encuentran los genes DLEU1 y DLEU2 (deleted in lymphocytic leukemia) que se transcriben en ARN largos no codificantes (lncRNA) (Garding et al, 2013); sin embargo, recientemente se descubrió que DLEU1 codifica una proteína de 78 aminoácidos cuya función no está definida. Se ha especulado que los lncRNAs codificados por los genes DLEU1 y DLEU2 pudieran regular la transcripción de genes vecinos en cis, entre los que se encuentran los que codifican los miR-15a/miR-16 (llamado grupo pro apoptótico), los que a su vez controlan la apoptosis en las células B, regulando negativamente la expresión de BCL2 (proteína anti apoptótica) a nivel postranscripcional. Por la tanto, la deleción de 13q14.3 conduce a un incremento de la resistencia anti apoptótica, con la consecuente sobrevivencia y acumulación de células leucémicas (Grygalewicz et al, 2016; Kasar 2014). Los genes DLEU 1 y 2, y miR-15a/miR-16 son algunos genes con una función hipotética de supresores de tumor en 13q14, sin embargo, la patogénesis no se ha esclarecido del todo (Dal Bo et al, 2011). La del(13q14) es la alteración cromosómica más frecuente (>50% de los pacientes con LLC) y esta alteración se considera como un evento primario en el desarrollo del tumor. Cuando se detecta al momento del diagnóstico como única alteración, el pronóstico es favorable. En los pacientes con MM y con LNH es más frecuente observar la monosomía 13 que la del(13q14). La deleción 13q14 es heterogénea en tamaño (figura 2). En estudios recientesse han propuesto dos tipos de deleciones según su tamaño: la deleción tipo I (deleción pequeña) que contiene la región MDR (minimal deleted region que incluye los genes DLEU 1 y 2, además de miR-15a/miR-16); y la deleción tipo II (deleción de mayor tamaño) que incluye MDR y al gen RB1 (localizado en la banda cromosómica 13q14.2) (Grygalewicz et al, 2016; Puiggros et al, 2014; Kipps et al, 2017). La media del tamaño de la deleción tipo I es de 1.2 33 kb (rango 381 a 2.74 kb), mientras que la media del tamaño de la deleción tipo II es de 2.3 kb (rango 889 a 18.7 kb) (Dal Bo et al, 2011). Es bien conocido el papel que juega RB1 en la transición G1-S del ciclo celular; sin embargo, investigaciones recientes han asociado la deleción de RB1 con inestabilidad cromosómica debido a que la proteína RB1 estabiliza la heterocromatina mediante su unión con proteínas que participan en la remodelación de la cromatina; también participa en la organización de la cromatina, del huso mitótico, en la progresión mitótica, en la localización del centrómero y en la cohesión de los cromosomas (Uchida, 2016; Coschi et al, 2014). Debido a estas observaciones, Dal Bo et al (2011), propusieron una subclasificación de los pacientes de TLC-B que tengan como única alteración la del(13q14): aquellos pacientes con del(13q14) que no involucre al locus RB1 (deleción tipo I) constituyen el subgrupo de pacientes con un curso clínico indolente; mientras que los pacientes con del(13q) que incluye el locus RB1 (deleción tipo II) son el subgrupo de pacientes con mayor riesgo de progresión de enfermedad y se les debe iniciar el tratamiento en un lapso más corto. Figura 2: Esquema de las deleciones 13q14 tipo I y tipo II. La deleción tipo I incluye los genes DLEU1, DLEU2, miR16-1 y 15a situados en la banda cromosómica 13q14.3. La deleción tipo II incluye además al gen RB1 en 13q14.2. Algunas de las vías de señalización alteradas en la génesis tumoral de los TLC-B son control de ciclo celular y daño al ADN (TP53 y ATM), control celular y remodelación de cromatina (RB1), regulación de la apoptosis (DLEU y miR-16 y 15a), además de que las translocaciones cromosómicas pueden activar factores de transcripción, por la reposición de oncogenes dentro del locus IGH. Además, se han identificado variantes en nucleótidos únicos que contribuyen a la tumorigénesis. En pacientes con LLC, se han identificado variantes en los genes SF3B1 y XP01, que afectan la vía celular del procesamiento del ARN ribosomal, en los genes ATM, TP53 y POT1, que afectan el control del ciclo celular y daño al ADN, en el gen NOTCH1, afectando la vía de señalización NOTCH, en los genes BIRC3 y MYD88 que afectan las 34 vías de respuesta inflamatoria, en el gen CHD2, que afecta la modificación de la cromatina, en los genes EGR2, PAX5 y IRF4, que afectan la vía de señalización de los receptores de células B, y en los genes BRAF y KRAS, que afectan la vía MAPK-ERK (Lazarian et al, 2017). En pacientes con MM, se han identificado variantes en nucleótidos únicos en los genes BRAF, KRAS y NRAS, que afectan la vía RAS-MAPK, en los genes TRAF3, CYLD y LTB que alteran la vía NF-kB, y en los genes TP53, ATM, BRCA2 y ATR, afectando el control del ciclo celular y daño al ADN (Bolli et al, 2018). 1.13 Estudios citogenéticos de los TLC-B en población del occidente de México En nuestro país no existen estudios citogenéticos previos de los TLC-B. Recientemente, nuestro grupo inició con estos estudios en población del Occidente de México (Domínguez- Cruz, 2016). Aunque la muestra estudiada fue pequeña (48 casos estudiados por citogenética convencional), se detectaron algunas anormalidades que sobresalen por su frecuencia: 15 casos con cariotipo anormal, se observaron 3 casos con translocaciones que involucran la banda cromosómica 14q32, la inversión inv(14)(q11q32) se observó en 5 casos y 5 casos mostraron cariotipos complejos. 2. Justificación En México, el 73% de las muertes se atribuyen a enfermedades no transmisibles, entre ellas, el cáncer. Los TLC-B son cánceres frecuentes en adultos mayores; según datos del Censo INEGI 2018, el 12.3% de la población total corresponde a personas mayores de 60 años. Los TLC-B son enfermedades clínicamente heterogéneas, algunos pacientes progresan rápidamente mientras que otros sobreviven por más de 10 años, lo que pudiera estar relacionado con las anormalidades genómicas que ocurren en cada tumor. En nuestra población no existen estudios previos que nos den información sobre el tipo y la frecuencia de alteraciones cromosómicas y genéticas asociadas con los TLC-B al momento del diagnóstico. La detección de esas alteraciones servirá de apoyo para el médico hematólogo, debido al impacto que tienen en la patogénesis y evolución de estos trastornos, ya que complementan los sistemas tradicionales de estadificación y posibilitan la elección de un manejo terapéutico más adecuado para cada paciente. 35 3. Planteamiento del problema El estudio de las alteraciones cromosómicas y génicas en los TLC-B en nuestra población no se ha abordado de manera integral, ya que solo hay un estudio previo que describe únicamente con citogenética convencional el estudio de 48 pacientes con TLC-B (Domínguez-Cruz, 2016). Es necesario el estudio de un mayor número de casos mediante las dos metodologías: la citogenética convencional y la molecular. Así, mediante la complementación de ambos abordajes, realizar un análisis citogenómico más completo a los pacientes con TLC-B de nuestra población. En nuestra población, hay una demanda en el desarrollo de estrategias integrales para la detección de alteraciones cromosómicas de los TLC-B, que requiere el empleo de ambas metodologías, por lo tanto, nos planteamos la siguiente pregunta de investigación: ¿cuáles son las alteraciones cromosómicas detectables por citogenética convencional y molecular en pacientes con TLC-B del occidente de México? 4.- Objetivos 4.1 General Caracterizar las alteraciones cromosómicas por citogenética convencional y molecular en pacientes con TLC-B del occidente de México. 4.2 Particulares • Describir el resultado citogenómico de los pacientes con TLC-B por métodos convencionales y basados en hibridación in situ. • Definir en los casos con inv(14)(q11q32) o translocación t(14;14)(q11;q32) la afectación en los genes de las inmunoglobulinas (IGH) o de los receptores de células T (TCRAD). • Establecer las frecuencias en nuestra población de las siguientes alteraciones cromosómicas: deleciones 13q14 (genes DLEU y RB1), 11q22 (gen ATM) y 17p13 (gen TP53), así como de la trisomía 12, en los pacientes con TLC-B al momento del diagnóstico, las cuales constituyen las alteraciones más frecuentes en otras poblaciones estudiadas. 36 • Definir la afectación en los genes de las inmunoglobulinas (IGH) en los casos sin cariotipo, debido a la alta frecuencia de translocaciones e inversiones que involucran a 14q32. 5. Material y Métodos 5.1 Diseño de estudio Estudio observacional, retrospectivo y prospectivo, descriptivo. 5.2 Universo de trabajo Partimos de muestras con diagnóstico de TLC-B previamente captadas en un estudio realizado de 2011 a 2015 (Domínguez Cruz, 2016), pero también se captaron muestras de pacientes diagnosticados a partir de junio de 2017 hasta octubre de 2019. Se realizó un muestreo no probabilístico, por inclusión consecutiva, de pacientes derivados de la consulta de hematología de la UMAE-Hospital de Especialidades del CMNO-IMSS. Los médicos hematólogos colaboradores de esta investigación fueron los responsables de realizar el diagnóstico clínico. Logramos reunir 40 casos. Los diagnósticos remitidos fueron LLC, MM y LNH. 5.3 Descripción general del estudio 5.3.1 Criterios de inclusión. Se incluyeron hombres y mujeres mayores de18 años, con diagnóstico de cualquiera de los TLC-B más frecuentes: la LLC, el MM o el LNH; que no hubieran recibido tratamiento quimioterapéutico y que autorizaron por escrito su participación mediante la firma de un consentimiento informado (anexo 7). 5.3.2. Criterios de no inclusión. Debido a las altas prevalencias de los virus Epstein Barr y Herpes en pacientes con linfoma tipo Hodgkin (Küppers et al, 2012), estos pacientes no se incluyeron en el estudio ya que se requieren condiciones de bioseguridad especiales. 5.3.3. Criterios de exclusión. Se excluyeron muestras cuyos cultivos celulares mostraron contaminación bacteriana. 37 5.4. Procedimiento En la figura 3 se muestra el diagrama de flujo del procedimiento metodológico general. Para contestar nuestra pregunta de investigación estudiamos los pacientes con TLC-B por citogenética convencional en cultivo estimulado con mitógenos específicos de células B (PWM y PMA) (Heerema et al, 2010; Muthusamy et al, 2011) y por FISH nuclear. Las muestras para este estudio se procesaron según se describe a continuación: 1. Se obtuvo el consentimiento informado (ver Anexo 7). 2. Se recolectaron del expediente médico los valores clínicos y de laboratorio de interés para contrastarlos con las observaciones citogenéticas (edad y sexo, presencia de organomegalias, concentración de hemoglobina, cuenta de leucocitos y de plaquetas, además de porcentaje de plasmocitosis en los casos de MM). 3. Se les tomó una muestra de sangre periférica conforme al anexo 1 y en el caso de diagnóstico de MM el médico hematólogo nos envió una muestra de sangre de médula ósea, debido a que la expansión de clonas de células plasmáticas ocurre en médula ósea. 4. Se realizó un cultivo de linfocitos para obtener metafases. Se buscó estimular a las células B, por lo que se utilizó la mezcla de los mitógenos Pokeweed (PWM) y phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), siguiendo el protocolo que se describe en el anexo 2. 5. Los cromosomas se obtuvieron por el proceso de cosecha de cultivos celulares estándar que se describe en el anexo 3. 6. Las preparaciones cromosómicas se tiñeron para su análisis siguiendo la técnica de bandas GTG (bandeo G con Tripsina y Giemsa) (Anexo 4). 7. Se analizaron hasta 20 metafases dependiendo de la cantidad y calidad de las metafases que se obtuvieron. La interpretación del cariotipo se ajustó a las recomendaciones del ISCN (2016). Se consideró un cariotipo exitoso cuando se detectó una clona anormal en 20 metafases o más, por caso. Se infirió que una población celular tiene un origen clonal cuando tiene al menos 2 células con el mismo arreglo estructural o la ganancia de los mismos cromosomas, y al menos 3 células con la pérdida de los mismos cromosomas (ISCN, 2016). 38 8. Se tomaron células del botón celular derivado del cultivo para realizar el estudio de FISH nuclear para la detección de la trisomía 12 y de las deleciones submicroscópicas frecuentemente asociadas a los TLC-B (17p13, 11q22 y 13q14) (anexo 5). La interpretación se ajustó a las recomendaciones del ISCN (2016) y previamente se calculó un nivel de cut off para la deleciones submicroscópicas (≥ 10%); por otra parte, para trisomía 12, alteraciones en gen IGH (IGHx3) y alteraciones en TCRAD, el nivel del cut off se estableció ≥2%, (anexo 5); el procedimiento para la determinación del cut off se describe en los anexos 5 y 6; también tomamos en cuenta las recomendaciones del Consorcio de Investigación en LLC (CLL Research Consortium) (CRC por sus siglas en inglés) (Wolff et al, 2007; El-Taweel et al, 2009; Smoley et al, 2010) (anexo 6). 9. En caso de observar en el cariotipo la inversión (14)(q11q32), o la translocación t(14;14)(q11;q32), se realizó la FISH para diferenciar la afectación de los genes IGH, TCRD o TCRA con sondas específicas para esos genes (Anexo 5). 10. En los casos donde el cultivo estimulado no produjo metafases, se realizó FISH nuclear con sondas para detectar arreglos del gen IGH. Figura 3. Diagrama de flujo del plan general. 39 5.5 Análisis estadístico Elaboramos una base de datos en el programa Excel para registrar los valores de las variables clínicas y de laboratorio. Las frecuencias de las variables cuantitativas (leucocitos, plaquetas, hemoglobina) se compararon con la prueba t de Student y las variables cualitativas (sexo, organomegalia en LLC, lisis ósea en MM) se compararon con la prueba exacta de Fisher utilizando el software estadístico SPSS versión 25. Las variables se describieron mediante estadística descriptiva, las variables cuantitativas se compararon por género, con la presencia o no de organomegalias, y con la presencia de los arreglos cromosómicos encontrados. No tomamos en cuenta las variables sociodemográficas de los pacientes, ni el inmunofenotipo, debido a que no tuvimos esta información en la totalidad de los casos estudiados. 6.- Aspectos éticos Este proyecto de investigación fue revisado y aprobado por los comités nacional de investigación en salud y de ética en investigación, del IMSS. Aunque este estudio se considera de riesgo mínimo, se solicitó carta de consentimiento informado (anexo 7) apegado al artículo 17 del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud. La carta de consentimiento cumplió con los requisitos enunciados en el artículo 14 de tal Reglamento, así como a los títulos completos quinto y quinto bis, además de los capítulos únicos de Investigación para la Salud y el Genoma Humano respectivamente de la misma Ley. La invitación a participar se formuló directamente al enfermo, si su condición clínica lo permite, o al responsable legal del enfermo (cónyuge, padres, hermanos, hijos). Se respetaron cabalmente los principios contenidos en el Código de Núremberg, el informe Belmont y la Declaración de Helsinki [http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/compi/rlgsmis.html; https://history.nih.gov/research/downloads/nuremberg.pdf; https://www.hhs.gov/ohrp/sites/default/files/the-belmont-report-508c_FINAL.pdf; http://irb.sinica.edu.tw/doc/regulation/DECLARATION%20OF%20HELSINKI%20(2013).pdf]. 7.- Aspectos de bioseguridad Se utilizó la vestimenta obligatoria del laboratorio como bata, guantes y lentes de seguridad para el manejo del PMA ya que es absorbido por la piel y es carcinogénico. Además, todas las muestras biológicas son potencialmente infecciosas por lo que se fueron manejadas y desechadas de acuerdo a la guía estándar del laboratorio de Citogenética para el manejo y desecho de material biológico-infeccioso (NOM-087-ECOL-SSA1-2002) (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html) 40 8. Resultados 8.1 Características clínicas y hematológicas de las muestras estudiadas Se estudiaron 40 casos de TLC-B: 21 hombres y 19 mujeres. El diagnóstico más frecuente fue el MM con 20 casos, seguido por la LLC con 18 casos y 2 casos con LNH. En la tabla 6 se concentran los valores clínicos y hematológicos agrupados por el tipo de trastorno. Los datos clínicos, hematológicos y de diagnóstico de cada paciente se muestran en el anexo 8. Los dos casos de LNH (casos 30 y 31) tuvieron el diagnóstico de linfoma difuso de células B largas (DLBCL) y fueron dos mujeres de 59 y 42 años respectivamente. El caso 30 estuvo estadificado en etapa IV, su valor de hemoglobina fue de 14.1 g/d/L, leucocitos 3,000 células/µL, plaquetas 83,000 células/µL; presentó adenopatías en mama, hiperplasia linfoide con infiltración a médula ósea. Por otra parte, el caso 31 se estadificó en etapa III, su valor de hemoglobina fue 11.9 g/dL, de leucocitos 7,800 células/µL, de plaquetas 268,000 células/µL, presentó tumoración en ganglios linfáticos de cuello izquierdo, lesión nodular en fondo gástrico y ovarios. Los datos de estos dos casos no se incluyeron en el análisis estadístico. Tabla
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