Tese sobre Leucemia Linfoblástica Aguda

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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
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Coordinación de Bibliotecas
Biblioteca Digital

La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor
ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la
Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara,
esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos
que posteriormente quiera darle a la misma.
I

Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de Ciencias de la Salud
Doctorado en Ciencias Biomédicas
Orientación en Inmunología

Efecto de la Pentoxifilina incorporada al tratamiento con
Prednisona en la expresión de genes involucrados en la apoptosis
de células leucémicas CCRF-SB y blastos de pacientes pediátricos
con Leucemia Linfoblástica Aguda

PRESENTA:

QFB Jesus Meza Arroyo

Guadalajara, Jalisco. Julio 2017
II

Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de Ciencias de la Salud
Doctorado en Ciencias Biomédicas
Orientación en Inmunología

PRESENTA:

QFB Jesus Meza Arroyo

Director de tesis:
Dr. en C. Oscar González Ramella
Co-Director de tesis:
Dr. en C. Alejandro Bravo Cuellar

Guadalajara, Jalisco. Julio 2017
III

Sede del estudio
El presente trabajó se realizó en la División de Inmunología del Centro de
Investigación Biomédica de Occidente (CIBO) del Instituto Mexicano del Seguro
Social (IMSS) en colaboración con la Unidad de Hemato-Oncología Pediátrica del
Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”. Bajo la dirección del Dr. en C.
Oscar González Ramella y la co-dirección del Dr. en C. Alejandro Bravo Cuellar.

Financiamiento
El apoyo económico fue recibido a través de la beca CONACYT otorgada QFB Jesús
Meza Arroyo. Así mismo agradecemos el financiamiento de la presente investigación
al Fondo de Investigación en Salud del IMSS FIS/IMSS/PROT/PRIO/11/015
otorgado al Dr. en C. Alejandro Bravo Cuellar.

Agradecimientos
A mis padres Javier Jesús y Ernestina gracias por su apoyo y amor incondicional en
todo momento y por inspirarme siempre a seguir adelante, por brindarme las
herramientas necesarias y hacer todo esto posible. A mis hermanos Javier y Diana,
mis compañeros de vida, gracias por crecer de la mano conmigo y brindarme tantos
momentos de alegría y aprendizaje.
A mi director de tesis, Dr. Oscar por todo el conocimiento compartido, su paciencia
y por depositar en mi la confianza para realizar este proyecto. A mi co-director de
tesis, Dr. Alejandro por abrirme las puertas de su laboratorio y ver en mi un
“potencial investigador”.
A mis sinodales, Dra. Claudia Palafox Sánchez, Dra. Adriana Aguilar Lemarroy, Dr.
Jorge Padilla Gutiérrez por todas sus aportaciones para complementar de la mejor
manera el crecimiento de este trabajo.
A todos los profesores del DCB que fungieron como parte fundamental en mi
formación, muchas gracias por su valioso conocimiento compartido. De la misma
manera a todo el equipo de investigación de la división de Inmunología del CIBO, en
especial al Dr. Pablo Ortíz Lazareno y Dr. Luis Felipe Jave Suárez por su paciencia,
colaboración y dedicación para el desarrollo óptimo de la fase experimental de este
proyecto.
A mis amigos (familia tapatía) y compañeros de laboratorio gracias por creer en mí,
motivarme e inspirarme. Principalmente a mis 4 fantásticos, Moy (mi hermano
mayor), Monse (mi cochi), Kary (maestra Jedi), Sarah (alpargata) gracias por tantos
momentos compartidos dentro y fuera del laboratorio, por ser además de amigos,
mis mentores, por compartir conmigo toda su experiencia y conocimientos. Lucy
(amore mío) y Odelie (mis neuro favoritas) Pau, Cristina (tsica maja) y Eliza (mi
roomie adorada), gracias por hacer de este viaje algo más llevadero, por inspirarme
con su implacable personalidad y mostrarme la belleza de saber y conocer.
A mis compañeros de generación por permitirme crecer académica y personalmente
día con día a lo largo de 4 años. En especial a mi amigocha Nati por tanta empatía y
comprensión, compañera incansable y tenaz gracias por tantos momentos de risas
y lágrimas compartidas siempre hombro con hombro.
Héctor gracias por todo tu apoyo y comprensión en la recta final de este largo viaje.
A mis amigos artistas Cesar (güerejo), Liliana (moryans), Cecilia (hermana sirena),
Daniel (gorda) y Yazaman (abuela sauce) porque a pesar de la distancia son amigos
fieles e incondicionales, por siempre inspirarme con su arte y mostrarme con él la
belleza de este mundo.
Sinceramente, Jesús Meza Arroyo.
II

Índice general
Contenido Página
Índice general ................................................................................................................... II
Índice de cuadros ............................................................................................................. VI
Índice de figuras ............................................................................................................. VII
Abreviaturas .................................................................................................................... IX
Resumen .......................................................................................................................... XI
Abstract.......................................................................................................................... XIII
1. Introducción .................................................................................................................. 1
2. Antecedentes ................................................................................................................ 3
2.1. Leucemia ............................................................................................................... 3
2.2. Epidemiología ....................................................................................................... 4
2.3. Fisiopatología ....................................................................................................... 5
2.4. Diagnóstico y Clasificación. ................................................................................. 6
2.4.1. Clasificación morfológica .............................................................................. 7
2.4.2. Clasificación Inmunofenotípica .................................................................... 7
2.5. Grupos de riesgo ................................................................................................. 10
2.6. Tratamiento ........................................................................................................ 12
2.6.1. Ventana esteroidea ...................................................................................... 13
2.6.1.1. Mecanismo de acción de la ventana esteroidea ..................................... 13
2.7. Apoptosis ............................................................................................................ 14
2.7.1. Vía intrínseca o mitocondrial ..................................................................... 16
2.7.2. Vía mediada por receptores de muerte o extrínseca ................................ 16
2.7.4. Supervivencia y resistencia a la quimioterapia por NF-kB ...................... 18
2.8. Pentoxifilina como agente sensibilizante .........................................................19
3. Justificación ................................................................................................................ 22
III

4. Planteamiento del problema ...................................................................................... 23
5. Hipótesis ..................................................................................................................... 24
6. Objetivos ..................................................................................................................... 25
6.1. Objetivo General ................................................................................................. 25
6.2 Objetivos Particulares ......................................................................................... 25
6.2.1. Objetivos para el estudio piloto de la ventana esteroidea ....................... 25
6.2.2. Objetivos para el estudio in vitro con línea celular CCRF-SB ................... 25
7. Materiales y Métodos ................................................................................................. 26
7.1. Tipo de estudio: .................................................................................................. 26
7.2. Sede del estudio: ................................................................................................. 26
7.3. Periodo: ............................................................................................................... 26
7.4. Diseño: ................................................................................................................. 26
7.5. Universo: ............................................................................................................. 26
7.6. Criterios de selección para el estudio piloto durante la ventana esteroidea 27
7.6.1. Criterios de inclusión .................................................................................. 27
7.6.2. Criterios de no inclusión ............................................................................. 27
7.6.3. Criterios de exclusión .................................................................................. 27
7.7. Variables............................................................................................................... 28
7.7.1. Variables dependientes ................................................................................. 28
7.7.2 Variables independientes ............................................................................... 28
7.8. Tamaño de la muestra ......................................................................................... 28
8. Metodología ............................................................................................................... 30
8.1. Diagrama metodológico ..................................................................................... 30
8.1.1. Diagrama del estudio piloto durante la ventana esteroidea .................... 30
8.1.2. Diagrama del estudio in vitro ...................................................................... 30
8.2. Proceso y grupos de estudio .............................................................................. 31
IV

8.2.1. Estudio piloto ............................................................................................... 31
8.2.2. Estudio in vitro ............................................................................................. 31
8.3. Obtención de muestras de pacientes ................................................................ 31
8.4. Cultivo Celular estudio in vitro .......................................................................... 32
8.5. Ensayo de proliferación ..................................................................................... 32
8.6. Medición de apoptosis ....................................................................................... 32
8.7. Extracción de mRNA .......................................................................................... 34
8.7.1. Extracción de mRNA de blastos leucémicos derivados de pacientes con
Leucemia Linfoblástica Aguda. ............................................................................. 34
8.7.2. Extracción de mRNA de células CCRF-SB con los tratamientos con PRDN,
PTX y PRDN+PTX. .................................................................................................. 35
8.8. Síntesis de cDNA ................................................................................................. 35
8.9. Análisis de expresión génica por microarreglos .............................................. 35
8.9.1. Análisis Bioinformático. .............................................................................. 35
8.10. Validación de expresión génica por q-PCR .................................................... 36
8.11. Operacionalización de variables ..................................................................... 37
8.12. Análisis estadísticos ......................................................................................... 37
8.13. Aspectos y consideraciones éticas .................................................................. 37
9. Resultados .................................................................................................................. 38
9.1. Resultados de la ventana esteroidea ................................................................ 38
9.1.1. Grupos de estudio ........................................................................................ 38
9.1.2. Índice de apoptosis inducida por PTX en la ventana esteroidea ............. 39
9.1.3. Enfermedad mínima residual al día 14 de haber iniciado la
poliquimioterapia .................................................................................................. 41
9.1.4. Perfil de expresión génica inducida por PTX en la ventana esteroidea .. 41
9.1.5. Vías de señalización que modifican su expresión con PTX y PRED de
forma aislada o en conjunto en pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda. 44
V

9.1.6. Modificación de la expresión de genes implicados en apoptosis durante
la ventana esteroidea al incorporar PTX al tratamiento con PRED de pacientes
con Leucemia Linfoblástica Aguda. ...................................................................... 49
9.1.7. Validación de genes....................................................................................... 49
9.2. Resultados del estudio in vitro en la línea celular CCRF-SB. ........................... 53
9.2.1. Índice de apoptosis ....................................................................................... 53
9.2.2. Expresión génica en células CCRF-SB ............................................................ 57
10. Discusión ................................................................................................................... 62
11. Conclusiones ............................................................................................................. 70
12. Perspectivas .............................................................................................................. 71
Bibliografía ...................................................................................................................... 72
Productos ........................................................................................................................ 78
Anexos ............................................................................................................................ 80

Índice de cuadros
Cuadro 1. Mutaciones más frecuentes presentes en leucemia linfoblástica aguda. Modificada
de PDQ (Physician Data Query) National Cancer Institute .................................................... 6
Cuadro 2. Principales factores tomados en cuenta para la clasificación de riesgo ................... 12
Cuadro 3 Tratamientode inducción a la remisión del protocolo Total XV ................................ 12
Cuadro 4. Oligonucleótidos utilizados para la cuantificación de la expresión de mRNA por
qRT-PCR ...................................................................................................................................... 36
Cuadro 5. Datos clínicos de los pacientes por grupos en estudio para la ventana esteroidea 39
Cuadro 6. Porcentaje de células en apoptosis en cada paciente por grupo de estudio ............ 40
Cuadro 7. Vías más significativamente moduladas por PRED al compararse con LLA s/tx en
pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda analizadas con Wikipathways ................... 44
Cuadro 8. Vías más significativamente moduladas por PTX al comparar ambos grupos de
tratamiento en pacientes con LLA y analizadas con Wikipathways ................................... 45
Cuadro 9. Vías mas significativamente moduladas por PRED+PTX en pacientes con LLA y
analizadas con Wikipathways ................................................................................................. 45
Cuadro 10. Expresión relativa en veces de cambio de genes involucrados en apoptosis
inducida por PRD, PTX y PRD+PTX ......................................................................................... 49

VII

Índice de figuras
Figura 1 Los sellos del cáncer. Modificado de Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Hallmarks of
cancer: the next generation. Cell, 2011 .................................................................................... 1
Figura 2. Linajes hematopoyéticos. PDQ (Physician Data Query) National Cancer Institute .... 3
Figura 3 Muertes por cáncer en la población pediátrica en México al 2010. (Modificado de
International Agency for Research on Cancer) ....................................................................... 5
Figura 4 Modelo de diferenciación linfocitaria de LLA. Tomado de Atienza, A.L., Leucemias.
Leucemia linfoblástica aguda. Pediatría Integral, 2008 ...................................................... 10
Figura 5 Desregulación de apoptosis en cáncer. Modificado de Wong, R. S. "Apoptosis in
cancer: from pathogenesis to treatment." J Exp Clin Cancer Res 30.1 (2011) .................. 14
Figura 6. Balance entre proteínas pro y anti-apoptóticas. Modificado de Strasser, A., S. Cory,
and J.M. Adams, Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of
cancer and other diseases.2011 .............................................................................................. 15
Figura 7. Vía extrinseca e intrínseca de apoptosis. Ratkovich-González , y col. "Evaluación de
los niveles sericos de CD95L soluble en población joven” Gdl, Jal, 2014. Diseño de Mana
de Alba ........................................................................................................................................ 17
Figura 8. Vía canónica de activación de NF-kB. Activation of NF-kB via the canonical pathway.
In MBInfo Wiki, Retrieved 10/21/2014 from
http://mbinfo.mbi.nus.edu.sg/figure/activation-of-nf-kb-via-the-canonical-pathway/19
Figura 9. Diagrama de estrategia de análisis para la selección poblacional a evaluar índice de
apoptosis en blastos de pacientes con LLA en tratamiento con PRED y en células CCRF-
SB tratadas con PRDN en combinación con pentoxifilina .................................................... 34
Figura 10. Porcentaje de apoptosis en blastos de los diferentes grupos de tratamiento ........ 41
Figura 11. Comparaciones del perfil de expresión génica global ................................................ 42
Figura 12. Número de genes constantes y variables entre los grupos de tratamiento PRED,
PTX y PRED+PTX. ...................................................................................................................... 43
Figura 13. Esquema de vías apoptóticas moduladas por PRED+PTX durante la ventana
esteroidea de tratamiento de pacientes con LLA. Modificado del esquema obtenido del
análisis por Wikipathways ....................................................................................................... 48
Figura 14. Análisis de la expresión a nivel de mRNA de RIPK1 Y MS4A1 en pacientes con LLA
antes y después del tratamiento con PRD y PRD+PTX. ........................................................ 50
Figura 15. Análisis de la expresión a nivel de mRNA de BCL11A, BNIP3L, GIMAP5, GZMB Y
TNFAIP3 en pacientes con LLA antes y después del tratamiento con PRD y PRD+PTX. .. 51
Figura 17. Análisis de la expresión a nivel de mRNA de CASP8, LTA Y PMAIP1 en pacientes
con LLA antes y después del tratamiento con PRD y PRD+PTX. ......................................... 52
Figura 18. Análisis de la expresión a nivel de mRNA de CFLAR, BIRC3 Y TRAF3 en pacientes
con LLA antes y después del tratamiento con PRD y PRD+PTX. ......................................... 52
Figura 18. Curvas de inducción de apoptosis por diferentes concentraciones de prednisolona
(PRDN) a las 24, 48 y 72 horas (h) de tratamiento. .............................................................. 53
Figura 19. Curvas de inducción de apoptosis por diferentes concentraciones de pentoxifilina
(PTX) a las 24, 48 y 72 horas (h) de tratamiento. ................................................................. 54
Figura 20. Comparación del porcentaje de apoptosis inducido por las diferentes
combinaciones de prednisona con pentoxifilina a las 24, 48 y 72 horas de tratamiento.
...................................................................................................................................................... 55
Figura 21. Representación del índice de apoptosis inducido por el tratamiento con
prednisolona, pentoxifilina y la combinación de ambos fármacos en células CCRF-SB a
las 48 horas de exposición. ...................................................................................................... 56
Figura 22. Porcentajes de necrosis, apoptosis temprana, apoptosis tardía y células viables
observado en células CCRF-SB después de 48 hrs de tratamiento con prednisolona y
pentoxifilina y sus combinaciones. ......................................................................................... 57
VIII

Figura 23. Determinación de cambios en la expresión de genes involucrados en apoptosis
extrínseca de células CCRF-SB después de 4hrs de tratamiento con PTX, PRDN y sus
combinaciones. .......................................................................................................................... 58
Figura 24. Determinación de incremento en la expresión de genes involucrados en apoptosis
intrínseca de células CCRF-SB después de 4, hrs de tratamiento con PTX y PRD. ............ 59
Figura 25. Determinación de alteracionen la expresion de genes involucrados en apoptosis
intrínseca de células CCRF-SB no propios de la incorporación de PTX al tratamiento. .. 60
Figura 26. Expresión de FOXO3A en células CCRF-SB tratadas con PRDN y PTX. ..................... 61
Figura 27. Expresión relativa de BCL2 en células CCRF-SB tratadas con PRDN y PTX durante 4, 24 y 48
hrs. ................................................................................................................................................ 61

Abreviaturas
• A.Td: células en apoptosis
tardía
• A.Tp.: células en apoptosis
temprana.
• ABL1: del inglés Abelson
murine leukemia viral oncogene
homolog 1
• ALL: del ingles Acute
Lymphoblastic Leukemia
• Anx-FITC: Anexina acoplada a
fluoresceina
• Apaf-1: del inglés Apoptosis
protease-activating factor-1
• Bad: del inglés BCL2 associated
agonist of cell death
• Bak: del inglés BCL2
antagonist killer
• Bax: del inglés BCL2 associated
X
• Bcl2: del inglés B-cell
lymphoma 2
• Bcl2-A1: del inglés BCL2
related protein A1
• Bcl2-L1: del inglés BCL2 like 1
• Bcl2-L10: del inglésBCL2 like
10
• Bcl2-L11: del inglés BCL2 like
11
• Bcl2-L14: del inglés BCL2 like
14
• Bcl2-L2: del inglés BCL2 like 2
• Bcl-XL: del inglés B-cell
lymphoma-extra large
• BCR: del inglés breackpoint
cluster región
• Bid: del inglés BH3 interacting
domain death agonist
• Bik: del inglés BCL2 interacting
killer
• Bnip3: del inglés BCL2
interacting protein 3
• Bnip3l: del inglés BCL2
interacting protein 3 like
• Bok: del inglés BCL2 ovarian
killer
• CALLA: del inglés common
acute lymphoblastic leukemia
antigen
• CASP8: caspasa 8
• CD: grupo de diferenciación
del inglés Cluster
Diferentiation
• CFLAR: del inglés CASP8 and
FADD like apoptosis regulator
• cIg: Inmunoglobulina M
citoplasmática
• DED: del ingles death effector
domain
• DISC: del inglés dead induced
signal complex
• EMR: Enfermedad mínima
residual
• ETV6: del inglés E26
transformation-specific variant
6
• FAB del inglés French,
American and British
Association
• FACSA: del inglés
Fluorescence-activated cell
sorting
• FADD: del ingles Fas-
associated death domain
• FISH: del inglés fluorescent in
situ hibridation
• FITC: isotiocianato de
fluoresceina
• FOXO3: del inglés forkhead O 3
• FSC-A: Detector frontal de
área, del inglés Forward
Scatter area
• FSC-H: Detector frontal de
altura, del inglés Forward
Scatter high;
• GC: glucocorticoide
• GIMAP5: del inglés GTPase,
IMAP family member 5
• GNL: grupo no leucémico
• GZMB: granzima B
• h: hora
X

• HLA-DR: del inglés Human
Leukocyte Antigen - antigen D
Related
• IgM: Inmunoglobulina M
• IKK: IκB cinasas del inglés
inhibitor of nuclear factor
kappa-B kinase
• IκB cinasas (IKK-)
• IκB nuclear)
• IκB: Inhibidor de factor
nuclear k-B del inglés factor of
kappa light polypeptide gene
enhancer in B-cells inhibitor.
• kg: kilogramo
• LLA: Leucemia linfoblástica
aguda
• LMA: leucemia mieloide aguda
• LTA: linfotoxina alfa
• MAPK: del inglés Mitogen-
Activated Protein Kinases
• Mcl-1: del inglés myeloid cell
leukemia 1
• mg: miligramo
• MLL: del inglés mixed-lineage
leukemia
• MLL-AF4: del inglés mixed-
lineage leukemia- AF4/FMR2
family member 1
• mRNA: RNA mensajero
• MS4A1: del inglés membrane
spanning 4-domains A1
• N: células en necrosis
• NCBI National centre for
biotechnology information
• NF-kB: factor nuclear
potenciador de las cadenas
ligeras kappa de las células B
activadas
• ng: nanogramo
• NIK: del ingles nuclear factor
kappa B inductor kinase
• PBX1: del inglés pre B cell
leukemia homeobox 1
• PDQ: del inglés Physician Data
Query
• PI: yoduro de propidio
• Pmaip1: del inglés phorbol-12-
myristate-13-acetate-induced
protein 1
• PRDN: Prednisolona
• PRED: Prednisona
• PTX: Pentoxifilina
• qRT-PCR
• QT IT: quimioterapia
intratecal
• QT: quimioterapia
• RIPK1: del inglés receptor
interacting serine/threonine
kinase 1
• RPMI: del ingles Roswell Park
Memorial Institute
• RT-PCR del inglés retro
transcriptor-polimerase chain
reaction
• RUNX1: del inglés runt related
transcription factor 1
• Ser: Serina
• SNC: sistema nervioso central
• t: traslocación
• TCF3: del inglés transcripcional
factor 3
• TdT: nucleotidil transferasa
terminal del inglés terminal
deoxynucleotidyl transferase
• TNFAIP3: del inglés TNF alpha
induced protein 3
• TRAF3: del inglés TNF receptor
associated factor 3
• V: células vivas
• VO: Vía oral
• WNT: del inglés wingless-int1

Resumen
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es una enfermedad hemato-oncológica
caracterizada por una proliferación maligna de células linfoides bloqueadas en una
etapa temprana de la diferenciación linfoide. Pentoxifillyina (PTX) tiene
propiedades antitumorales in vivo e in vitro y puede sensibilizar a las células a la
apoptosis. En un estudio piloto se evaluaron los efectos de PTX sobre la apoptosis
de células leucémicas durante la ventana de esteroides como parte de la fase
terapéutic de la inducción a la remisión en pacientes pediátricos con LLA.
Los pacientes con LLA fueron divididos en dos grupos de acuerdo al tratamiento
empleado como parte de la inducción a la remisión: grupo PRED y grupo PRED+PTX.
Se observó un mayor índice de apoptosis después del tratamiento en pacientes
tratados con prednisona (PRED) y PTX que los que recién recibieron sólo PRD. Se
evaluó el mecanismo molecular de PTX que sensibilizan a las células leucémicas a
morir por apoptosis.
Realizamos un ensayo piloto controlado fase 1 piloto para evaluar la expresión
génica modificada por PTX durante la ventana de esteroides de inducción a la fase
de remisión en los pacientes con ALL recientemente diagnosticado. Se aisló el ARNm
de las células en cada aspirado de médula ósea (BMA) antes y después del
tratamiento y posteriormente se analizó el perfil de expresión génica de la apoptosis
por microarrarreglos y q-PCR. Para analizar el posible efecto de la PTX sin la PRD se
utilizaron células leucémicas de la línea celular CCRF-SB, las cuales fueron tratadas
con PTX, PRED y la combinación de ambos fármacos. Se cuantificó el índice de
apoptosis, así como la expresión de genes involucrados con la inducción de muerte
celular por q-PCR.

Los tratamientos experimentales inducen amplios cambios en el perfil de expresión
génica. Los pacientes del grupo control (grupo PRED) sobre-expresaron 377 genes
y se subexpresaron 344 en contraste con los pacientes tratados con (PRED + PTX)
que mostraron sobreexpresión de 1319 y subexpresaron de 1594. El análisis
bioinformático mostró que una de las principales vias de señalización regulada es la
XII

apoptosis. Los genes más importantes que se modifican en esta vía son aquellos con
actividad proapotótica, la mayoría de ellos sobreexpresados. El tratamiento con
PRED+PTX induce la expresión de genes pro-apoptóticos como: TNFAIP3, RIPK1,
BNAIP3L, FOX3A, MS4A1, GIMAP5 y GZMB. Otros genes regulados implicados en la
apoptosis que se encontraron sobre-expresados tanto por el tratamiento con PRED
como PTX por separado fueron CASP8, CFLAR, LTA y NOXA. De la misma manera se
encontró la regulación de la vía mitocondrial en la línea celular CCRF-SB

En conclusión, la adición de PTX al tratamiento con PRED durante la ventana de
esteroides en pacientes con LLA modifica importantemente el perfil de expresión
génica y cambia diferentes vías de señal de la célula leucémica. La combinación de
ambos fármacos sinergiza la actividad antileucémica de cada fármaco. Esto pudiese
representar una alternativa terapéutica apropiada en al futuro para potenciar la
terapia antileucémica.
.

XIII

Abstract
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a hemato-oncological disease characterized
by a malignant proliferation of lymphoid cells blocked at an early stage of lymphoid
differentiation. Pentoxifillyine (PTX) has anti-tumor properties in vivo and in vitro
and it may sensitize cells to apoptosis. In a pilot study, we evaluated the effects of
PTX on apoptosis of leukemic cells during treatment with Prednisone (PRD) within
induction to remission in pediatric patients with ALL. As well as in the leukemic cell
line CCRF-SB in treatment with Prednisolone (PRED)
Patients with ALL were divided into two groups according to the treatment used as
part of induction to remission: PRED group and PRED + PTX group. We observed a
higher apoptosis index after treatment in patients with Prednisone (PRD) and PTX
compared to those that just received only PRD. Actually, we evaluated the molecular
mechanism of PTX that sensitize leukemic cells to die by apoptosis.
We conducted a pilot phase 1 controlled randomized trial to evaluate the gene
expression modified by PTX during the steroid window of induction to remission
phase in new diagnosed ALL patients. We isolated mRNA from each bone marrow
aspiration (BMA) before and after treatmentand analyze apoptosis gene expression
profile by microarrays and sq-PCR. To study the effect of PTX alone, leukemic cells
from the CCRF-SB cell line were treated with PTX, PRED and the combination of both
drugs. The apoptosis index as well as the expression of genes involved with the
induction of cell death were quantified by q-PCR.
Experimental and control treatments induce wide changes in the gene expression
profile. Patients from control group (PRED group) up regulate 377 genes and down
regulate 344 in contrast with patients treated with experimental treatment
(PRED+PTX) that showed up regulation of 1319 and down regulation of 1594. By
bioinformatic analysis we found that one important signaling pathway modified is
apoptosis. The most important genes that are modified in this pathway are those
with proapototic activity, most of them over expressed. Treatment with PRED + PTX
induces the expression of pro-apoptotic genes such as TNFAIP3, RIPK1, BNAIP3L,
FOX3A, MS4A1, GIMAP5 and GZMB. Other regulated genes involved in apoptosis
that were overexpressed by both PRED and PTX treatment were CASP8, CFLAR, LTA
XIV

and NOXA separately. Likewise, we found regulation of mitochondrial pathway in
cell line CCRF-SB
Then the addition of PTX to the treatment with PRED during steroid window in
patients with ALL modifies the gene expression profile and changes different signal
pathways of the leukemic cell. The combination of both drugs synergizes the
antileukemic activity of each drug. This might represent a novel therapeutic
alternative to potentiate the antileukemic therapy.

1. Introducción

El cáncer es un padecimiento que se debe a alteraciones en los mecanismos que
controlan el crecimiento y la proliferación celular, los cuales son mediados por el
control genético que regula el ciclo celular en respuesta a señales de proliferación e
inhibición. La pérdida de la regulación celular que da origen a la mayoría de los tipos
de cáncer se debe, primordialmente al daño en dos grupos de genes: los
protooncogenes y los genes supresores tumorales [1].
Dichas alteraciones se dan progresivamente en las células al transitar de un estado
normal a un estado neoplásico, durante el cual van adquiriendo diferentes
características que le permiten convertirse en células tumorales o malignas, todo
esto debido a mutaciones o modificaciones en el material genético de la propia
célula. Las características adquiridas por estas células le posibilitan de dividirse más
rápido de lo habitual debido a señales sostenidas de proliferación; aunado a esto,
desarrollan mecanismos de evasión de la muerte celular programada. Por otro lado,
las células tumorales, sobre todo en tumores sólidos, desarrollan la capacidad de
inducir angiogénesis lo cual favorece la invasión y metástasis a otros órganos y
tejidos. Además pueden evadir la respuesta inmune e inducir un estado inflamatorio
que promueve el crecimiento y desarrollo tumoral (Figura 1)[2].

Figura 1 Los sellos del cáncer. Modificado de Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Hallmarks of cancer: the
next generation. Cell, 2011
2

Por su parte la evasión de los mecanismos de muerte inducido por la
quimioterapia representa un gran problema en el tratamiento de neoplasias
linfoproliferativas, y este mecanismo pudiera estar directamente implicado en el
establecimiento de la resistencia al tratamiento y por ende en futuras recaídas de la
enfermedad.[3]

2. Antecedentes
2.1. Leucemia
Las leucemias son un grupo muy heterogéneo de enfermedades malignas
derivadas de la transformación en algún punto de la diferenciación de las células
madre hematopoyéticas, con la consecuente proliferación y propagación de células
transformadas o malignas a la sangre, médula ósea y otros tejidos [4, 5]. Las
leucemias pueden ser de origen linfoide o mieloide, de acuerdo a la célula
progenitora neoplásica desencadenante; o bien se pueden clasificar en agudas y
crónicas, en función de la etapa de maduración en la que se encuentre la célula
neoplásica transformada (Figura 2) [6].

Figura 2. Linajes hematopoyéticos. PDQ (Physician Data Query) National Cancer Institute

Las neoplasias linfocíticas pueden originarse a partir de células que se
encuentran en una fase temprana de la diferenciación linfoide; o a partir de células
ya comisionada en etapas diversas de la maduración celular. Así, leucemias
linfocíticas agudas surgen de una célula progenitora linfoide temprana que puede
dar lugar a células con fenotipo B, T o asesinas naturales (NK -Natural Killer). Por
otra parte, la leucemia linfocítica crónica surge de un progenitor más maduro de
4

linfocitos T o B, y estas leucemias son generalmente propias de la población adulta
[4, 7].
Las traslocaciones, deleciones o inversiones de los cromosomas pueden
resultar en la expresión de genes que codifican proteínas de fusión oncogénicas o la
sobreexpresión y/o subexpresión de genes que codifican moléculas críticas en el
control del ciclo celular, apoptosis u otras vías reguladoras [4].
La LLA se caracterizan por la proliferación y acumulación de células
hematopoyéticas linfoides inmaduras en medula ósea así como en sangre periférica
principalmente, sin embargo también puede ocurrir a ganglios linfáticos, riñones,
piel y bazo; dicha proliferación resulta en la expansión de la carga tumoral y el
desplazamiento de la hematopoyesis normal de la médula ósea a otro órgano [5, 8].
Mediante el uso de análisis de citogenética convencional y molecular, las
leucemias agudas se han reconocido como una enfermedad genética muy variable,
resultado de una serie de mutaciones adquiridas o heredadas en la estructura de
ciertos genes. Estas mutaciones se transmiten de la célula progenitor original
transformada a sus descendientes clonales [8]. La mayoría de las aberraciones
genéticas se dividen en clases genéricas de desregulación funcional que alteran los
programas normales de desarrollo hematopoyético mediante la elusión del control
del ciclo celular, la inhibición de la diferenciación y la resistencia a apoptosis
terapéutica [9].
2.2. Epidemiología
El cáncer infantil constituye un problema de salud a nivel mundial. En México
según reportes del Sistema Nacional de Información en Salud, el cáncer, en
particular la leucemia, es la segunda causa de muerte infantil después de los
accidentes, en la edad pediátrica por arriba del mes de vida (Figura 3)[10].
La leucemia es a la vez, el cáncer más común en la niñez, representando un
30% de todas las neoplasias diagnosticadas en niños menores de 15 años [5, 11, 12].
Dentro de esta población, la LLA se manifiesta 5 veces más frecuente que la
Leucemia Mieloide Aguda (LMA) y supone aproximadamente el 75% de los
diagnósticos de leucemia en la niñez [4]. La LLA afecta tanto a niños como adultos,
sin embargo es más frecuente en la infancia con un pico máximo de incidencia en
edades de 2 a 5 años [12, 13].
5

Figura 3 Muertes por cáncer en la población pediátrica en México al 2010. (Modificado de International
Agency for Research on Cancer)
En años recientes, gracias a los avances y el impacto de la quimioterapia, se ha
logrado una mayor supervivencia principalmente en niños con este padecimiento,
alcanzando hasta un 90% en niños entre 1 y 9 años de edad a diferencia de los
mayores de 10 años los cuales presentan una supervivencia entre un 70% y 80% y
los menores de una año en los cuales la supervivencia alcanza sólo un 50 a 60% [14,
15]. En comparación con los adultos, los niños presentan una mayor incidencia a
desarrollar LLA, de la misma forma los adultos poseen una menor supervivencia
global, así como tasas de remisión muchos más inferiores en comparación a las que
se logran en la edad pediátrica [16].

2.3. Fisiopatología
Se desconocen las causas precisas que participan en la fisiopatologíade esta
enfermedad y sólo el 5 % de los casos se asocia con síndromes hereditarios como
Down, Bloom y Nijmegen, la ataxia-telangiectasia; con radiaciones ionizantes o la
exposición previa a fármacos quimioterapéuticos específicos. Estas enfermedades
de carácter hereditario, se caracterizan por un defecto en la reparación del DNA,
aneuploidía o anormalidades cromosómicas.[11, 17]. Así mismo, existen casos
aislados con ciertos factores que incrementan el riesgo para adquirir LLA entre los
que se encuentran el desarrollo e industrialización de las ciudades, la edad
México (2010)
Número de muertes: ambos sexos, edad 0-14 años (total: 1592)
6

reproductiva de la madre, los hábitos alimenticios de los padres, uso de alcohol y
drogas durante el embarazo y exposición a solventes y pesticidas[13].
Dentro de las alteraciones genéticas más comunes en la LLA se reconocen
principalmente las traslocaciones cromosómicas las cuales activan factores de
transcripción y genes de fusión que pueden controlar en muchos casos la
diferenciación y proliferación celular. Estas alteraciones (resumidas las más
comunes en el Cuadro 1) son consideradas, entre otros factores, para la asignación
de grupos de riesgo[13, 18].

Cuadro 1. Mutaciones más frecuentes presentes en leucemia linfoblástica aguda. Modificada de PDQ
(Physician Data Query) National Cancer Institute
Anomalía genética Gen implicado o de fusión Pronostico
t(12;21) ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) Bueno
t(9;22) BCR-ABL1 Desfavorable
t(4;11) (11q23) MLL Fracaso al tratamiento
t(1;19) TCF3-PBX1 Recaída al SNC
Tirotomías 4,10 y 17 - Bueno
Mutaciones en NOTCH - Bueno
Mutaciones en IKZF1 - Desfavorable
PDQ: Physician Data Query; t: traslocación; IKZF1: IKAROS family zinc finger; ETV6: E26 transformation-specific variant 6;
RUNX1: runt related transcription factor 1, BCR: breakpoint cluster region; ABL1: Abelson murine leukemia viral oncogene
homolog 1; MLL: mixed-lineage leukemia; TCF3: transcriptional factor 3; PBX1: pre B cell leukemia homeobox 1.
2.4. Diagnóstico y Clasificación.
Para la planeación adecuada del protocolo terapéutico de quimioterapia que
se utilizará, se requiere de un óptimo diagnóstico así como de un amplio número de
estudios de laboratorio y gabinete, entre los cuales destacan: la simple microscopía,
inmunofenotipo, citogenética molecular y estudio genético [7]. El diagnóstico de
LLA se basa históricamente en la determinación de blastos en médula ósea (aunque
desde el diagnóstico se pudieran encontrar blastos en la sangre periférica o en el
líquido cefalorraquídeo). Para realizar el diagnóstico morfológico se requieren más
de 25 a 30% de blastos del total de las células no eritroides en la médula ósea. [19,
20]. El inmunofenotipo de marcadores celulares permitió el análisis de subgrupos
de linfocitos, y más recientemente la evaluación cromosómica e identificación
genómica han hecho que el sistema de clasificación se perfeccione para permitir el
mejor tratamiento de este grupo tan heterogéneo de enfermedades [7].
Los fenotipos de células T, células B maduras y precursores de células B son
de relevancia para designar el grupo de riesgo y para posteriormente diseñar un
7

plan terapéutico adecuado. La expresión antigénica asociada a la línea mieloide
(también llamada expresión aberrante o bifenotípica) en una clona de origen
linfoide o viceversa, puede ser detectada en muchos de los casos de LLA o LMA,
aunque estas aberraciones antigénicas parecen no tener implicaciones pronósticas
si pueden ser usados para distinguir blastos leucémicos de células progenitoras
normales.[13, 21]
El análisis por cariotipo sigue siendo un componente integral para el
abordaje al diagnóstico de LLA, así como reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa (qPCR- quantitative-polimerase chain reaction), hibridación
fluorescente in situ (FISH- fluorescent in situ hibridation) y la citometría de flujo, para
detectar ganancia o pérdida del contenido de ácido desoxirribonucleico (DNA-
desoxiribonucleic acid), deleciones o traslocaciones (t) cromosómicas de relevancia
pronóstica. [13]

2.4.1. Clasificación morfológica.
El sistema de clasificación morfológica de la asociación francesa, americana
y británica (FAB- French, American and British Association) divide la LLA en tres
tipos. Esta clasificación tras la llegada del inmunofenotipo, ha dejado de tener
importancia clínica a excepción de la variedad L3 [22]:
L1 – Variante de linfocitos pequeños con células uniformes pequeñas con una
apariencia más “madura”.
L2 – Tamaño celular variable con células pequeñas y grandes, con vacuolas
intracitoplasmáticas y cromatina dispersa. En adultos tiene un peor pronóstico.
L3 – Leucemia/Linfoma tipo Burkitt con blastos linfoides pequeños e
uniformes con vacuolas citoplasmáticas que contienen glucógeno y figuras mitóticas
denotando rápido crecimiento. La presencia de la t (8;14) y el proto-oncogen c-myc
son frecuentes. Otras menos frecuentes son la t (2;8) y t (8;12), estas variantes
presentan peor pronóstico [19].

2.4.2. Clasificación Inmunofenotípica.
El inmunofenotipo se ha hecho parte esencial en el diagnóstico de LLA y ha
contribuido a una clasificación más precisa y biológicamente orientada de la
enfermedad [22]. La clasificación de la LLA se basa en el linaje B, T o NK, que a su
8

vez se dividen en subgrupos de acuerdo a inmunofenotipo [19]. Las LLA de linaje B
expresan los grupos de diferenciación (CD-cluster of diferentiation) CD19, y/o
CD79α, y/o CD22, y/o antígeno leucocitario humano relacionado a antígeno D (HLA-
DR- Human Leukocyte Antigen - antigen D Related) y/o nucleotidil transferasa
terminal (TdT- terminal deoxynucleotidyl transferase) y se subdividen como se
muestra a continuación (Figura 4).

2.4.2.1. Leucemias de linaje B
• LLA Pro–B o (B–I): sin expresión de otros antígenos de diferenciación
de célula B. Muestra generalmente morfología FAB L1 ó L2. Expresa
CD19 y TdT. No expresa CD10 (también llamado CALLA +, de sus
siglas en inglés common acute lymphoblastic leukemia antigen). Se
asocia a cuenta leucocitaria elevada, leucemia inicial en sistema
nervioso central (SNC), pseudodiploidía, re-arreglos del gen de
leucemia de linaje mixto (MLL- mixed-lineage leukemia) y a la t (4; 11)
y t (9; 22), así como a un pronóstico desfavorable [4, 22, 23].
• LLA Común (B–II): es CD10 +, CD19+, HLA-DR y TdT, muestra
generalmente una morfología FAB L1 ó L2. Representa
aproximadamente dos tercios de las LLA en la niñez. Se asocia a
cuenta leucocitaria baja, hiperdiploidía, 6q-, deleción 12p y a un
pronóstico más favorable. La mayoría de los blastos son CALLA +, sin
embarto esta expresión parece no determinar desfavorablemente el
pronóstico.
• LLA Pre–B (B–III): expresa inmunoglobulina M (IgM) citoplasmática,
CD10, CD19 y TdT. Presenta morfología FAB L1. Se presenta en cerca
del 20% de las LLA pediátricas. Se asocia a cuenta leucocitaria alta,
pseudodiploidía, t (9; 22) y mal pronóstico. La presencia de cIg está
asociado con una anormalidad citogenética no aleatoria, la t (1; 19)
(q23; q13). La presencia de esta traslocación es la que determina el
mal pronóstico.
• LLA B madura (B – IV): expresa IgM citoplasmática y de superficie de
cadenas pesadas κ o λ. También CD19+, CD22+, CD79+y TdT-.
Presenta casi siempre una morfología FAB clasificada como L3. Se
9

presenta en aproximadamente el 1% de los casos pediátricos.
Predomina en varones, se asocia a t (8; 14), t (2; 8), t (8; 22) y se asocia
a un pronóstico favorable [4, 5, 22].

2.4.2.2. Leucemias de linaje T
Por otro lado, la LLA de células T representa aproximadamente el 15% de las
todas las LLA pediátricas. Es rara en menores de 1 año. Se presenta con más
frecuencia en varones y se asocia a cuenta leucocitaria elevada al diagnóstico. Existe
masa mediastinal en 50-60%de los pacientes, y la incidencia de infiltración a
sistema nervioso central (SNC) es mayor que en los otros tipos de LLA [5]. Las LLA–
T expresan CD3 citoplásmico y de membrana; y se subdividen en:
• Pro–T (T–I): CD7+. Se asocia a resistencia a quimioterapia (QT)
convencional y pobre supervivencia.
• Pre–T (T–II): CD2+, y/o CD8+ y/o CD5+.
• T–Cortical (T–III): CD1a+.
• T–Madura (T–IV): CD3 de membrana, CD1a-.
• LLA T α/β + (grupo a): anti- TCR α/β +.
• LLA T γ/δ + (grupo b): anti-TCR γ/δ + [22].

Además de la clasificación ya mencionada, se reconoce también la leucemia aguda
de células NK las cuales expresan CD3+ y CD56+, sin embargo no son consideradas
dentro de las leucemias de células T, mientras puede o no expresar CD16, aunque es
un tipo de leucemia muy rara y se asocia a un pronóstico muy precario [6, 21].

Figura 4 Modelo de diferenciación linfocitaria de LLA. Tomado de Atienza, A.L., Leucemias. Leucemia
linfoblástica aguda. Pediatría Integral, 2008

2.5. Grupos de riesgo
La clasificación del riesgo es uno de los factores diagnósticos y pronósticos
que permite categorizar e individualizar el tratamiento para cada uno de los
pacientes con LLA. La enfermedad se clasifica de acuerdo a diferentes características
clínicas y de laboratorio que se describirán a continuación. Los pacientes con LLA
pueden ubicarse en una de las siguientes clasificaciones de riesgo: bajo, intermedio
y alto (Cuadro 2)[7]. Los factores que influyen directamente el riesgo de la
enfermedad son:
1) Cuenta leucocitaria al diagnóstico: es el marcador clínico más fácil de
establecer. Un número de blastos mayor o igual a 50 x 109/L en la biometría
hemática al momento del diagnóstico es catalogado con un factor de mal
pronóstico [7]. Los pacientes con cuentas leucocitarias altas y LLA de células
T tienen mayor riesgo de recaída a SNC y una menor supervivencia global en
comparación con los pacientes con leucemias de células B [5]. Una extrema
hiperleucocitosis (mayor a 100 x 109/ L) representa un riesgo alto de
complicaciones tempranas (como lo son el síndrome de estasis leucocitaria y
síndrome de lisis tumoral) que aumenta la morbilidad y mortalidad al inicio
del tratamiento, así como incrementa el índice de recaídas tempranas o
tardías. [13, 18]
11

2) Estirpe celular de la leucemia: la LLA de estirpe B se categorizan en general
con un mejor pronóstico a comparación de la LLA de estirpe T o NK[7].
3) Edad: la supervivencia a largo plazo es 1.5 veces mayor en pacientes entre
los 2 y 6 años de edad en comparación con los pacientes menores de 2 años
y mayores de 10 años. Los pacientes menores de 6 meses tienen una menor
supervivencia[7, 24].
4) Género: los varones tienen mayor riesgo de recaída que las mujeres debido
primordialmente que el testículo es un órgano santuario, es decir un órgano
en donde la quimioterapia llega con dificultad[25]. Muchos grupos ya no
toman al género como un factor de riesgo[24, 26].
5) Etnia: los pacientes hispanos y negros tienen peor pronóstico comparados
con blancos. La razón pudiera ser debida a algunos polimorfismos en genes
involucrados con el metabolismo de los agentes quimioterapéuticos, factores
sociales, económicos entre otros [24].
6) Obesidad: pacientes mayores de 10 años obesos tienen una supervivencia
inferior comparada con pacientes no obesos [5].
7) Factores genéticos (Cuadro 1): además, las clasificaciones modernas
incluyen a los factores biológicos relacionados con el pronóstico,
principalmente hiperdiploidia (>50 cromosomas), ETV6-RUNX1 (E26
transformation specific varian 6- runt related trasncription factor) y t
(1;19)/TCF3-PBX1 (transcripcional factor 3-pre B cell leukemia homeobox 1)-
así como trisomía 4, 10 y 17 se asocian a un pronóstico favorable; mientras
que la t(9;22)/BCR-ABL (breackpoint cluster región-Abelson murine leukemia
viral oncogene homolog 1)ó t(4;11)/MLL-AF4 (mixed-lineage leukemia-
AF4/FMR2 family member 1) y en general el cromosoma filadelfia e
hipodiploidia (<44 cromosomas) se asocia con un mal pronóstico [13].
8) Factores de respuesta al tratamiento: la respuesta temprana al tratamiento
es el factor pronóstico más importante en la actualidad y es evaluado
mediante la medición de la enfermead mínima residual (EMR) al día 14 y por
medio de una biometría hemática el día 7 [27]. Por esta razón es relevante
considerar la respuesta al tratamiento a los primeros 7 días iniciales de
tratamiento con corticoide y a los 14 días de iniciar con la poliquimioterapia,
es decir una rápida entrada en la fase de remisión; ya que se ha documentado
12

tal día como factor determinante para la clasificación de riesgo[28, 29]. Los
pacientes que entran más pronto en remisión tienen un muy buen pronóstico
en comparación con los que no entran en remisión después de la fase de
inducción[30]. Adicionalmente el monitoreo de EMR ayuda a predecir
probable recaída a SNC así como a médula ósea [28, 31].

Cuadro 2. Principales factores tomados en cuenta para la clasificación de riesgo
Factor Riesgo bajo Riesgo estándar Riesgo alto
Leucocitos al
diagnóstico
< 50 000 /uL

< 50 000 /uL

> 50 000 /uL

Estirpe celular Estirpe B Estirpe B Estirpe T
Edad 1 a 9 años 1 a 9 años Lactantes y mayores de 10
años
Factores genéticos ETV6-RUNX1,
Trisomías 4, 10 y/o 17
Sin fusión TEL-AML1 o
trisomías
T (1:19)
T(9:22)
Respuesta al
tratamiento
Remisión después de
ventana esteroidea
Remisión completa después
de inducción
Sin remisión después de la
inducción
Recaída a sistema
nervioso central
Sin recaída Sin recaída Recaída
Aneuploidía Hiperdiploidia Hiperdiploidia Hipodiploidia
EMR Sin EMR después del día 14
de tratamiento
>0.01% día 14
EMR: Enfermedad Mínima Residual; T: Traslocación; ETV6-RUNX1: E26 transformation specific variant 6- runt
related transcription factor
2.6. Tratamiento
El tratamiento de la LLA se basa en la quimioterapia con múltiples fármacos
y se divide en 3 etapas principalmente: 1) Inducción a la remisión (Cuadro 3), 2)
intensificación o consolidación y por último 3) mantenimiento para eliminar la EMR.
Además durante todo el tratamiento se incluye la terapia preventiva dirigido a
sistema nervioso central (SNC) con quimioterapia intratecal (QT IT) [13].
Cuadro 3 Tratamiento de inducción a la remisión del protocolo Total XV
Agente Dosis y vía de administración No. de dosis Esquema
Prednisona 40 mg/m2/día VO (en 3 dosis) 84 Día -7 al 21
Vincristina 1.5 mg/m2/semanal IV 4 Día 0, 7, 14, 21
Daunorrubicina 25 mg/m2/semanal IV 2 Día 0, 7
L-Asparaginasa 10,000 U/m2/dosis IM (3 dosis en 1
semana)
6 a 9 Días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16,
18
Ciclofosfamida 1000 mg/m2/dosis IV en 30 minutos 1 Día 21
Citarabina 75 mg/m2/dosis IV 8 Días 22 al 25, 29 al 32
6-Mercaptopurina 60 mg/m2/dosis VO 14 Días 22 al 31
QT- Intratecal
Metotrexato/
hidrocortisona/Ara-C
Edad (meses):
13 - 23: 8mg/16mg/24mg
24-35:10mg/20mg/30mg
>36: 12mg/24mg/36mg
2 a 4 Días 0, 7, 14, 21
Aspirado de Médula Ósea 2 Días 0, 14.

Durante la inducción a la remisión se tiene como objetivo erradicar más del
99% de la carga inicial de blastos leucémicos, así como restaurar la hematopoyesis
normal y el estado de salud. La intensidad del tratamiento durante la inducción se
13

ha incrementado en los últimos años y consiste primoridalmeten en una
combinación de cuatro medicamentos: esteroides, vincristina, antraciclina (dauno o
doxorubiina) y L-asparaginasa; fármacos que pueden inducir una tasa de remisión
completa que comprende de 85% a aproximadamente 95% [13](Cuadro 3).

2.6.1. Ventana esteroidea
La ventana esteroidea comprende los primeros 7 días de tratamiento y es de
suma importancia en la inducción a la remisión ya que con la administración de
esteroides se puede disminuir de manera considerable la cargablástica inicial [32].
El esteroide más comúnmente utilizado para el tratamiento de LLA es prednisona
(PRED), el cual se administra en una dosis de 40 mg/m2 diarios vía oral (VO)[33]. La
respuesta al tratamiento durante esta fase se ha convertido en uno de los factores
pronósticoa más importante para evaluar la respuesta al tratamiento[31].
2.6.1.1. Mecanismo de acción de la ventana esteroidea
El mecanismo común de acción del tratamiento antileucémico en general es
inducir la muerte celular programada mejor conocida como apoptosis. Dicha
apoptosis se desencadena mediante daño al DNA, componentes lipídicos y proteicos
de la membrana celular, lo cual causa un desequilibrio en la homeostasis celular
denominado estrés celular[34].
PRED es un fármaco de naturaleza glucocorticoide ampliamente utilizado
para el tratamiento de diversas condiciones médicas en la población pediátrica tales
como: asma, bronquiolitis, insuficiencia renal aguda, rinitis alérgica, dengue,
espasmos infantiles, síndrome nefrótico, leucemia aguda, púrpura
trombocitopénica inmunológica aguda y lupus eritematoso sistémico. Su amplio uso
se debe principalmente a sus propiedades antinflamatorias e inmunosupresoras
[35]. Su uso en malignidades hematológicas se debe primordialmente a su capacidad
de activar cascadas de señalización intracelulares que alteran la expresión de genes
involucrados en la progresión del ciclo celular, así como inducción de muerte
celular. Dicho fármaco, así como su metabolito principal prednisolona (PRDN),
poseen mecanismos de acción genéticos y no genéticos, por una parte, inhiben la
activación de algunos factores transcripcionales como el factor nuclear potenciador
de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-kB) y por otro lado al
14

unirse a su receptor citoplasmático se pueden traslocar al núcleo y activar la
expresión génica. [36]

2.7. Apoptosis
La apoptosis es la forma de muerte celular programada más frecuente con
importancia biológica ya que juega un papel crucial en la homeostasis del
organismo. Por su parte las células tumorales pueden desarrollan mecanismos de
evasión de apoptosis inducida por los quimioterapéuticos (Figura 5), debido a las
alteraciones y mutaciones propias de estas células. La resistencia a los mecanismos
de muerte conlleva a la resistencia al tratamiento, por lo cual es importante
sensibilizar a las células a ser blancos más susceptibles a la acción de los
quimioterapéuticos [37].

Figura 5 Desregulación de apoptosis en cáncer. Modificado de Wong, R. S. "Apoptosis in cancer: from
pathogenesis to treatment." J Exp Clin Cancer Res 30.1 (2011)
IAPs: Proteínas inhibidoras de apoptosis. Bcl-2: B cell lymphoma 2

La apoptosis es regulada por la activación secuencial de ciertas enzimas las cuales
tendrán como función degradar el material nuclear y el citoplasma. De tal forma que
el destino de la célula se rige por un fino balance en la expresión de genes tanto
proapoptóticos como antiapoptóticos miembros de la familia Bcl2 (B-cell lymphoma
2) las cuales pueden inducir o suprimir la activación de dichas enzimas (Figura 6)
[38, 39]. Este fenómeno se caracteriza por cambios morfológicos y bioquímicos
Disminución de la de
proteínas proapoptóticas
15

específicos de las células en apoptosis, incluyendo contracción celular,
condensación, fragmentación nuclear, formación de cuerpos apoptóticos, pérdida
de la adhesión a células adyacentes y a la matriz extracelular, escisión del DNA
cromosómico en fragmentos internucleosomales y externalización de la
fosfatidilserina [40].
Figura 6. Balance entre proteínas pro y anti-apoptóticas. Modificado de Strasser, A., S. Cory, and J.M.
Adams, Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of cancer and other diseases.2011

La inducción a la apoptosis por agentes quimioterapéuticos converge en la
activación de caspasas y su modificación de sustratos proteicos en el núcleo y
citoplasma. Las caspasas son cisteína-proteasas presentes en la célula como
zimógenos inactivos que parten su sustrato en residuos de ácido aspártico. La
activación de las caspasas (procaspasa-8, -9, -10) conducen a la activación
proteolítica de caspasas efectoras (caspasa -3, -6, -7) que actúan en sustratos
específicos. [41]
Existen dos vías de iniciación de apoptosis independientes previas a la
activación de estas moléculas efectoras: la interconexión de receptores de muerte
por sus ligandos conocida como vía extrínseca; y la liberación de factores
apoptóticos de mitocondrias o vía intrínseca [38].

2.7.1. Vía intrínseca o mitocondrial
La mitocondria es inducida a desencadenar apoptosis liberando citocromo c
en respuesta a la mayoría de agentes anticancerígenos y otras vías de estrés celular,
ya sea por la apertura de los canales en la membrana externa o por disrupción de la
permeabilidad de la membrana externa. La liberación de citocromo c al citosol
resulta en la activación del adaptador de caspasa Apaf-1 (del inglés, Apoptosis
protease-activating factor-1) y procaspasa-9, los cuales forman un complejo
enzimático denominado “apoptosoma”. La caspasa-9 activa las caspasas efectoras
(principalmente caspasa-3 y caspasa-8) lo cual resulta en la fragmentación del DNA
y apoptosis (Figura 7) [41].
La familia de proteínas Bcl-2 desempeñan un papel primordial en el control
de vía mitocondrial. En humanos se han identificado más de 20 miembros de esta
familia, incluyendo proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XL (B-cell lymphoma-extra
large), Mcl-1 (myeloid cell leukemia 1), Bcl2-A1 (Bcl2 related protein A1), Bcl2-
L2(Bcl2 like 2), Bcl2-L14 (Bcl2 like 14) y proapoptóticas Bax (Bcl2 associated X), Bak
(Bcl2 antagonist killer), Bok (Bcl2 ovarian killer), Bad (Bcl2 associated agonist of cell
death), Bid (BH3 interacting domain death agonist), Bik (Bcl2 interacting killer),
Bcl2-L11 (Bcl2like 11), Bcl2-L1 (Bcl2 like 1), Bnip3 (Bcl2 interacting protein 3),
Bnip3l (Bcl2 interacting protein 3 like), Noxa y Bcl2-L10 (Bcl2 like 10) . Estas
proteínas se traslocan a la membrana mitocondrial modulando la apoptosis
mediante permeabilización de la membrana interna y externa, ya sea permitiendo
la liberación de citocromo c o estabilizando las membranas para impedir su
liberación. Se ha sugerido el control de la apoptosis por quimioterapia inductora de
la apoptosis por Bcl-2 o Bcl-XL en múltiples estudios. [41]

2.7.2. Vía mediada por receptores de muerte o extrínseca
La segunda vía que origina la activación directa de caspasas es mediante
receptores de muerte celular de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF-
Tumor necrosis factor) como lo son CD95 (APO-1/Fas) y receptor de TRAIL (APO2L);
y sus ligandos CD95-L (APO-1-L/ Fas-L) y TRAIL respectivamente. La unión de
CD95-L y ligandos de la familia TNF a su respectivo receptor inductor de muerte
origina la trimerización del receptor y el reclutamiento de proteínas adaptadoras al
17

dominio de muerte citoplasmático. Estos complejos de señalización inductores de
apoptosis (DISC- dead induced signal complex) se enganchan al receptor. De forma
inicial las proteínas adaptadoras específicas (FADD- Fas-associated death domain)
se unen mediante su propio dominio de muerte a su respectivo receptor. FADD
contiene un dominio efector de muerte (DED- death effector domain) y recluta la
DED que contiene procaspasa-8 a DISC. A continuación, la procaspasa-8 se activa
proteolíticamente y activa diversas proteínas, incluyendo la procaspasa-3, lo que
resulta la finalización del programa de muerte celular (Figura 7).[41]
Las vías apoptóticas de caspasas están íntimamente relacionadas con la
mitocondria, así como con la vía del receptor de muerte. En condiciones diversas
estas interconexiones son mínimas y ambas vías operan independientemente una
de la otra. [41]

Figura 7. Vía extrinsecae intrínseca de apoptosis. Ratkovich-González , y col. "Evaluación de los niveles
sericos de CD95L soluble en población joven” Gdl, Jal, 2014. Diseño de Mana de Alba

2.7.3. p53 en apoptosis
Otra molécula involucrada en la apoptosis es el factor de transcripción p53
nuclear que puede gobernar principales señales apoptóticas que las mitocondrias
reciben en la vía intrínseca de apoptosis. p53 es un importante factor proapoptótico
e inhibidor tumoral, por lo tanto, numerosos fármacos antitumorales pueden actuar
en la orientación de vías de señalización relacionados con p53. Este factor de
transcripición promueve principalmente la muerte celular por apoptosis mediante
18

la activación de un número de proteínas proapoptóticas tales como Bax [40, 41]. Sin
embargo, también es de suma importancia su participación en otros procesos
celulares como senescencia.

2.7.4. Supervivencia y resistencia a la quimioterapia por NF-kB
NF-κB o factor de transcripción nuclear κB, es una clase de proteínas que ha
emergido actualmente como un mediador en diversas funciones reguladoras de la
transcripción involucradas en las respuestas al estrés, la proliferación celular,
diferenciación, apoptosis y la génesis tumoral. Este factor de transcripción se ha
visto activado de forma constitutiva en diferentes tipos de cáncer, entre ellos
desordenes linfoproliferativos como es el caso de la LLA, lo cual conduce a la
supervivencia de las células y resistencia a la quimioterapia[42].
El NF-kB se encuentra en forma inactiva en el citoplasma en forma de un
compuesto trimolecular: las proteínas p50 y p65, unidas a una familia de proteínas
inhibidoras de NF-kB (IκB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in
B-cells inhibitor). La regulación de esta última está dada por un proceso de
degradación que involucra a varias familias de proteínas citoplásmicas. Una vez que
la célula recibe un estímulo inductor de apoptosis, las vías de señalización de NF-κB
convergen en una familia de proteínas llamadas IκB cinasas (IKK- inhibitor of
nuclear factor kappa-B kinase) que incluyen a la cinasa inductora de NF-κB (NIK
nuclear factor kappa B inductor kinase). La activación de NF-κB se inicia por la
degradación inducida por señal de la proteína IκB, que se une a NF-κB actuando
como su inhibidor, lo que resulta en su inactivación[40, 43]. El complejo IKK
activado, fosforila 2 residuos conservados de serina (Ser32 y Ser36) en el dominio
N-terminal de IκB conduciendo a la inmediata poliubiquitinación de la proteína IκB
y a su degradación por el proteasoma [44]. Después de la degradación de IκB, NF-κB
se trasloca al núcleo, donde puede realizar su función de regulación de la
transcripción y activar la expresión de genes evasores de la apoptosis (Figura 8).
IKK se considera que es el principal regulador de la activación de la vía de
señalización de NF-κB; por lo tanto, IκB fosforilado se suprime por la activación de
IKK, dando lugar a la inactivación de las vías de NF-κB y promueve indirectamente
la apoptosis. La activación de la vía de señalización IKK / NF-κB conduce a la
inducción de genes diana que pueden interferir con el proceso de apoptosis. [40, 43]
19

Figura 8. Vía canónica de activación de NF-kB. Activation of NF-kB via the canonical pathway. In MBInfo
Wiki, Retrieved 10/21/2014 from http://mbinfo.mbi.nus.edu.sg/figure/activation-of-nf-kb-via-the-
canonical-pathway/
2.8. Pentoxifilina como agente sensibilizante
La pentoxifilina (PTX) es un fármaco que pertenece a la familia de las
metilxantinas, que actúa como inhibidor inespecífico de la fosfodiesterasa y es usado
ampliamente para el tratamiento de enfermedades circulatorias en la población
adulta.[45] En la población pediátrica PTX tiene indicación terapéutica mas
restringida. PTX forma parte del tratamiento integral para el síndrome de Kawasaki
en dosis de 10 a 20 mg/kg de peso al día durante 30 días; de la misma forma existen
reportes de su empleo segura con las mismas dosis para el tratamiento de nefropatía
lúpica pediátrica [46, 47].
Se ha demostrado que esta metilxantina tiene propiedades antitumorales in
vivo e in vitro ya que detiene el ciclo celular en la fase G2, en la que las células
tumorales son más sensibles a los efectos tóxicos de algunos agentes
quimioterapéuticos y la radioterapia. Esto efecto ha permitido plantear la hipótesis
de reducir la dosis de los agentes quimioterapéuticos y de esta forma mermar los
efectos adversos de los medicamentos [48].
En estudios realizados por nuestro equipo de investigación se logró
aumentar la supervivencia en un modelo experimental de linfoma murino L-5178-Y
Es
tí
m
u
lo

a un 100% con una sola droga antineoplásica y el uso concomitante de PTX. En este
modelo, el linfoma inoculado en la cavidad peritoneal de ratones de la cepa Balb/c,
causa la muerte en el 100% de estos animales a los 28 ± 3 días, la combinación de
un agente inmunomodulador (PTX) con un agente antineoplásico como adriamicina
permitió además, disminuir las dosis de éste último a la mitad de las consideradas
como terapéuticas en este modelo experimental[45]. Asimismo, es importante
mencionar que estudios piloto ex-vivo con células de leucemia linfoblástica aguda,
proveniente de pacientes, han mostrado estrictamente los mismos resultados
alentadores en los estudios morfológicos, con las mismas dosis utilizadas en
nuestros modelos experimentales in vitro con líneas celulares leucémicas humanas,
en los cuales se ha observado un aumento en la apoptosis y disminución de la
viabilidad de las células tumorales. En nuestros estudios in vitro, encaminados a
evaluar el estatus de fosforilación de la molécula reguladora IκBα por Western blot
y su relación con el estado apoptótico en las diferentes condiciones experimentales,
el grupo control sin tratamiento mostró una leve expresión de la forma
hiperfosforilada C-terminal.[45, 49]
Se ha observado que PTX es tóxica para células tumorales, pero no así para
células no tumorales, además de incrementar la apoptosis y disminuir la
senescencia en células tumorales tanto en cultivo como en ensayos in vivo, en
combinación con agentes quimoterapéuticos. Estudios realizados en líneas celulares
de cáncer ceérvicouterino HeLa y SiHa tratadas con quimioterapéuticos como
adriamicina y cisplatino más PTX revela datos importantes. La PTX per se resulta
tóxica inclusive más que el cisplatino para células neopláscicas y prácticamente
inocua o no tóxica en queratinocitos no tumorales; además de incrementar los
índices de apoptosis y disminuir la senescencia. Así mismo se observó una gran
actividad de caspasas (-3, -6, -7, -9 y -8) en células tratadas con PTX, así como
activación de genes con actividad proapoptótica como BAD, BAX, NOXA, PUMA y
DIABLO. En células tratadas con adriamicina y PTX se observa un incremento en la
proteína IκBα y una disminución en la senescencia [48, 50]
Se han reportado diferentes usos para la PTX en pacientes con cáncer. Por
mencionar algunos, disminución de efectos secundarios de QT y radioterapia,
sensibilización a radioterapia, antimetastásico (especialmente estudiado en
21

melanoma) y en tratamiento paliativo aunado a otros agentes quimioterapéuticos
[46, 51, 52].
Como agente sensibilizante a QT existen un par de reportes del uso de PTX in
vitro en líneas celulares de linfoma cutáneo de células T [53]. Existe un reporte ex
vivo sobre el uso de PRDN en células de pacientes pediátricos con LLA en el que se
postula que el uso conjunto de diferentes agentes (entre estos, PTX) podría
disminuir la resistencia a glucocorticoides. El estudio reportó que todos los agentes
utilizados aumentaban el efecto antileucémico de PRDN [54].
Con todos los antecedentes expuestos pudiéramos decir que la PTX
representa una alternativa terapéutica viable para la sensibilización de las célulastumorales durante la quimioterapia. Si tomamos en cuenta que el día 14 de la
inducción a la remisión es considerado como el factor pronóstico más poderoso para
los pacientes con LLA, el uso concomitante de la PTX en los protocolos
antileucémicos durante los primero días de tratamiento pudiera tener un impacto
directo en los índices de remisión de la enfermedad y por lo tanto mejorar la
supervivencia globlal de esta neoplasia.

3. Justificación

La leucemia al ser el cáncer más común en la niñez representa un grave problema
de salud pública. Dentro de este grupo heterogéneo de enfermedades, la LLA
constituye el 75% de los casos reportados para leucemia en niños menores de 15
años y su tasa de curación se encuentra en estos momentos entre 75 y 85%. Los
avances recientes en el tratamiento de LLA pediátrica que se basan primordialmente
en una combinación de drogas citotóxicas, permiten que la mayoría de los pacientes
alcancen remisión completa e indicies de supervivencia libre de evento altos. Pese
al buen pronóstico de esta enfermedad, la recaída tumoral representa actualmente
la principal causa de fallo al tratamiento. La medición de EMR en muestras de
medula ósea al día 14 de tratamiento, es el predictor temprano más poderoso de
recaída, aplicable a prácticamente todos los pacientes. Esta estrategia de predicción
pronóstica se utiliza en la mayoría de los protocolos quimioterapéuticos para
pacientes con LLA. De forma más precisas, y si necesidad de esperar 14 dias, se ha
observado que los pacientes que al día 7 de tratamiento presentan una EMR
negativa, tienen todavía un mejor pronóstico (tasa libre de evento a 5 años del 97
±1%) que aquellos que la consiguen al día 14 y ha creado el concepto de
respondedores rápidos en la hematología moderna [37].
La apoptosis es la forma principal de muerte celular. Ésta es activada por
acción de los diferentes agentes quimioterapéuticos. Sin embargo, las adaptaciones
celulares secundarias al tratamiento han proporcionado a las células neoplásicas, la
habilidad de evadir el efecto letal de las drogas antileucémicas. El factor de
transcripción NF-κB ha sido ampliamente estudiado como factor de quimio
resistencia celular, mediante el cual la expresión de factores antiapoptóticos,
promueve la supervivencia de las células neoplásicas. La PTX actúa inhibiendo la
activación de NF-κB por diversos mecanismos poco descritos, de esta forma, se
puede optimizar el efecto antineoplásico de los tratamientos actuales agregado este
medicamento a los regímenes de quimioterapia, al aumentar la apoptosis en los
blastos leucémicos, mejorando por lo tanto el pronóstico y la supervivencia de estos
pacientes.
23

4. Planteamiento del problema

El cáncer en la niñez, y dentro de éste, las leucemias, representan un problema de
salud pública. La tasa de incidencia de LLA es de 3 a 4 nuevos casos por año por cada
100,000 niños menores de 15 años; con un pico de incidencia de los 2 a los 5 años,
siendo esta tasa más alta en países en Latinoamérica de hasta 6 por cada 100,000
habitantes.
Las células leucémicas son el resultado de una serie de mutaciones
adquiridas o heredadas en la estructura de ciertos genes. Estas mutaciones, que se
transmiten de la célula progenitora original transformada a sus descendientes
clonales, se dividen en clases genéricas de desregulación funcional que alteran los
programas normales de desarrollo hematopoyético mediante la elusión del control
del ciclo celular, la inhibición de la diferenciación y la resistencia a apoptosis
terapéutica en blastos leucémicos, este último representa una diana importante en
el tratamiento de las mismas.
La activación constitutiva de NF-κB puede inhibir la apoptosis inducida por
varias drogas anticancerosas y por radiaciones ionizantes, resultando en una menor
respuesta al tratamiento y un peor pronóstico para los pacientes con leucemia.
La PTX es un derivado de las metilxantinas considerado un inhibidor
inespecífico de las fosfodiesterasas, que inhibe la activación del NF-κβ, favoreciendo
así, la apoptosis celular inducida por diferentes agentes.
Aunque estudios in vitro sugieren un importante papel terapéutico de la PTX,
no se conocen con precisión los mecanismos moleculares por los que podría actuar
para sensibilizar a los blastos al daño por agentes quimioterapéuticos. Por estas
razones se propone la utilización de PTX, junto con el glucocorticoide prednisona
(PRED) en pacientes pediátricos con Leucemia Linfoblástica Aguda; y su derivado
prednisolona (PRDN) en la línea celular CCRF-SB para evaluar la apoptosis y le
expresión de genes involucrados en la muerte celular.

5. Hipótesis

La administración de pentoxifilina induce la expresión de genes asociados con
apoptosis de blastos en pacientes pediátricos con Leucemia Linfocítica Aguda
durante la ventana esteroidea de tratamiento con prednisona y en la línea celular
CCRF-SB tratadas con prednisolona.

6. Objetivos

6.1. Objetivo General

Evaluar el efecto que posee la pentoxifilina adicionada al tratamiento con esteroide
en la apoptosis, así como en la expresión génica de blastos de pacientes pediátricos
con leucemia linfoblástica aguda y en las células leucémicas de la línea CCRF-SB.
6.2 Objetivos Particulares
6.2.1. Objetivos para el estudio piloto de la ventana esteroidea
1) Cuantificar el índice de apoptosis inducida por PTX, en los blastos leucémicos
de médula ósea de pacientes pediátricos con diagnóstico reciente de LLA,
antes y después del tratamiento con PRED.
2) Determinar el efecto de la PTX en la modulación de la expresión de genes
asociados a las vías de apoptosis, en blastos leucémicos de pacientes
pediátricos con LLA durante la ventana esteroidea de tratamiento con PRED.

6.2.2. Objetivos para el estudio in vitro con línea celular CCRF-SB
1) Estimar el efecto que poseen PTX en presencia o ausencia de PRDN sobre la
viabilidad de la línea celular derivada de LLA, CCRF.
2) Cuantificar el porcentaje de células en apoptosis inducida por PTX en
presencia o ausencia de PRDN, en la línea celular CCRF-SB con y sin PRDN.
3) Determinar si PTX induce cambios en la expresión a nivel del mRNA, de los
genes relacionados con apoptosis.

7. Materiales y Métodos
7.1. Tipo de estudio:
El estudio se llevó a cabo en dos fases: 1) estudio piloto durante la ventana
terapéutica esteroidea con PRED en pacientes con LLA tratados con o sin PTX; 2)
estudio experimental in vitro en la línea celular CCRF-SB tratadas con PTX en
presencia y ausencia de PRDN.

7.2. Sede del estudio:
Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro
Social. Hospital Civil de Guadalajara Dr. Juan I Menchaca, Servicio de Hematología y
Oncología Pediátrica, Centro de Investigación en Cáncer Infantil y de la
Adolescencia, Universidad de Guadalajara

7.3. Periodo:
Febrero 2013 a febrero de 2017

7.4. Diseño:
Se llevó a cabo un estudio piloto controlado, aleatorizado, abierto para evaluar el
efecto de la PTX en la apoptosis de blastos leucémicos durante la ventana esteroidea;
en segunda instancia se realizó un estudio in vitro para evaluar el efecto en la
modulación de genes involucrados en apoptosis en línea celular derivada de LLA
CCRF-SB tratadas con PTX en presencia o ausencia dePRDN.

7.5. Universo:
Para el estudio piloto se reclutaron pacientes de la Unidad de Hematología y
Oncología Pediátrica del Hospital Civil de Guadalajara con diagnóstico reciente de
LLA.
Para el estudio in vitro se trabajó con la línea celular derivada de leucemia
linfoblástica aguda CCRF-SB obtenida de American Type Culture Collection (ATCC).
Dicha línea celular pertenece al linaje de linfoblastos B, aislada de sangre periférica
de un niño caucásico de 11.5 años diagnosticado con LLA.

7.6.