Guerrero-Cazares-Hugo

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2006 – Avances en la Investigación Científica en el CUCBA 
 
XVII Semana de la Investigación Científica 
331 
ISBN 970-27-1045-6 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE RECEPTORES A DOPAMINA EN 
LAS CÉLULAS DE GLIA ENVOLVENTE DE BULBO OLFATORIO 
 
Hugo Guerrero Cázares*, Maria del Pilar Alatorre Carranza**, 
Alberto Morales Villagrán#, Vidal Delgado Rizo**, Sergio Horacio Dueñas Jiménez*, 
Graciela Gudiño Cabrera##. 
ggudinoc@cucba.udg.mx 
 
* Laboratorio de Neurofisiología, Depto. Neurociencias, CUCS. UdeG; ** Laboratorio de 
Inmunología, Depto. Fisiología, CUCS. UdeG; # Laboratorio de Neurobiología, ## 
Laboratorio de desarrollo y regeneración del sistema nervioso, Depto. De Biología celular y 
molecular, CUCBA UdeG 
 
Antecedentes 
 
Glia Envolvente del Bulbo Olfatorio (GE) 
 
 La GE (Glía Envolvente del Bulbo Olfatorio) tiene la propiedad de envolver a los 
axones, a lo largo de su trayectoria dentro del SNC, evitando su contacto con cualquier otro 
tipo de glía que no sea permisiva para la migración. (Gudino-Cabrera et al. 2000; Nieto-
Sampedro et al. 2002). La GE comparte características de astrocitos, oligodendrocitos y 
células de Schwann (Chuah et al. 2002). Además, es capaz de secretar diversas citocinas, 
como el NGF, NT4 y BDNF (Boruch et al. 2001). Y algunos otros factores difusibles que 
son capaces de inducir la arborización. (Kafitz et al. 1999; Guntinas-Lichius et al. 2001) 
 Gracias a su capacidad de conducir y permitir la regeneración axonal, la GE ha sido 
utilizada con éxito, en trasplantes para buscar la regeneración de zonas seccionadas de 
médula espinal obteniendo incluso mejores resultados al ser comparadas con las células de 
Schwann periféricas (Verdu et al. 1999; Lu et al. 2002; Pascual et al. 2002). 
 
Enfermedad de Parkinson 
 
 Clínicamente, se caracteriza por signos y síntomas motores y no motores, los 
primeros incluyen temblor en reposo, bradicinesia, rigidez e inestabilidad postural; mientras 
que los segundos, depresión, ansiedad, disfunción sexual y dificultades cognitivas. Su 
característica patológica principal es la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia 
nigra y en el locus coeruleus, lo que lleva a una disminución en los niveles de dopamina en 
el estriado y como consecuencia a los trastornos ya descritos.(M.P.F. Umberto de Girolami 
1996; Mouradian 2002) 
Actualmente el tratamiento clínico de esta enfermedad, se basa en la administración 
exógena de L-Dopa, el precursor inmediato de la dopamina, con la cual se obtiene una 
mejoría en el control motor, sin embargo, después de un periodo prolongado con este 
tratamiento, los pacientes presentan diversos efectos colaterales y disminución en la 
respuesta terapéutica (Mouradian 2002). 
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 Una de las terapias alternativas, es el uso de trasplantes celulares dopaminérgicos, 
de diversas estirpes. (Bjorklund et al. 1979; Herman et al. 1994; Tabbal et al. 1998; Hauser 
et al. 1999; Hagell et al. 2001) O bien, el uso de células manipuladas genéticamente para 
expresar Tirosina Hidroxilasa (TH) (During et al. 1994), esta enzima es la encargada de 
transformar a la tirosina en Dopa y se considera la enzima limitante en la síntesis de 
catecolaminas. El gen de la TH ha sido clonado bajo el control del promotor de la GFAP lo 
que dio como resultado el constructo Gfa2-TH. Se demostró que la transfección de células 
gliales (Células C6 y astrocitos) con el constructo Gfa2-TH inducía una mejoría conductual 
en modelos murinos de enfermedad de Parkinson. (Trejo et al. 1999; Cortez et al. 2000) 
 En estudios previos hemos demostrado que las células C6 transfectadas con Gfa2-
TH son capaces de sintetizar y liberar dopamina en respuesta a estímulos químicos in vitro. 
También hemos demostrado que estas células expresan el RNAm de los 5 subtipos de 
receptores a Dopamina y una vez transfectadas con el gen de la TH existe una aparente 
autorregulación en la respuesta a los estímulos, ejercida por la Dopamina liberada en las 
células transfectadas. 
 
Planteamiento del problema 
 
Las células C6, por su naturaleza tumoral no son candidatos a implantes crónicos en 
los modelos de enfermedad de Parkinson, por otro lado, los astrocitos implantados tienen 
una sobrevida corta y sus efectos beneficos son solo temporales. Es por lo anterior que se 
continúa la búsqueda de otras células que permitan ser manipuladas genéticamente para 
sintetizar Dopamina y que una vez implantadas sobrevivan el tiempo suficiente para 
permitir la recuperación funcional, así como la reconexión de los circuitos afectados. Dadas 
sus características regenerativas, la GE podría ser una mejor opción en el uso de implantes 
celulares en modelos de enfermedad de Parkinson. 
 
Objetivo general 
 
 Caracterizar la presencia de receptores a dopamina en las células de GE, así como la 
capacidad de estas células de modificar sus concentraciones de Ca++ intracelular en 
respuesta a estímulos químicos depolarizantes. 
 
 
Metodología 
 
Cultivo de glia envolvente de bulbo olfatorio 
 
 Los cultivos se obtuvieron de las capas glomerular y de fibras nerviosas de los 
bulbos olfatorios de ratas macho de la cepa Wistar. Las células fueron mantenidas en una 
atmosfera de 5% CO2 a 36.5º C. Se les realizó cambio de medio de cultivo cada 3er día 
(Gudiño-Cabrera G y Nieto-Sampedro M. 1996). 
 
 
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Determinación de Rnam de los receptores A dopamina 
 
 Se realizó el análisis de expresión por PCR tiempo real en un equipo Abi-Prism. Se 
 utilizó el marcador SYBR-Green para la cuantificación de la expresión. 
 
Estimulación con Kcl y cuantificación de dopamina 
 
 Una vez que las células alcanzaron una confluencia aproximada del 90% se les 
agregó KCl a una concentración final de 50mM. Se mantuvieron en presencia del 
estímulo por 24 horas, se retiro el sobrenadante y se analizó por HPLC para evaluar la 
presencia de Dopamina en el medio. 
 
Visualización de cinética de Ca++ con Fluo-3 
 
 En otro grupo de células a una confluencia aproximada de 60%, se impregnaron por 
una hora a las células con el marcador fluorescente de Ca++ intracelular Fluo-3. Se 
realizaron tomas en microscopio confocal antes y durante la estimulación con KCl. 
 
Resultados 
 
 La evaluación por PCR tiempo real demostró que la GE expresa RNAm para los 5 
subtipos de receptores a Dopamina, siendo los mas expresados los subtipos 1,5 y 4. 
 El análisis del Ca++ intracelular demostró que la depolarización con KCl de la GE 
induce un incremento en las concentraciones de Ca++ intracelular como ocurre en 
otras estirpes celulares similares. 
 La determinación de Dopamina en los sobrenadantes de cultivo de GE demostró que 
estas células no liberan dopamina en condiciones naturales. 
 
Conclusiones 
 
 Los resultados del presente trabajo demuestran que las células de la GE responden a 
estímulos despolarizantes de igual forma que lo hacen las células C6 y la presencia de 
receptores a dopamina en éstas células podría permitir un mecanismo de 
retroalimentación en la señalización dopaminérgica. Los resultados aquí presentados 
refuerzan la ídea que las células de la GE pueden ser utilizadas en modelos de 
enfermedad de Parkinson, una vez que sean transfectadas con las enzimas necesarias 
para producir dopamina. 
 
 
Bibliografia 
 
Bjorklund, A. and U. Stenevi (1979). "Reconstruction of the nigrostriatal dopamine 
pathway by intracerebral nigral transplants." Brain Res 177(3): 555-60. 
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Boruch, A. V., J. J. Conners, et al. (2001). "Neurotrophic and migratory properties of an 
olfactory ensheathing cell line." Glia 33(3): 225-9. 
Chuah, M. I. and A. K. West (2002). "Cellular and molecular biology of ensheathing cells." 
MicroscRes Tech 58(3): 216-27. 
Cortez, N., F. Trejo, et al. (2000). "Primary astrocytes retrovirally transduced with a 
tyrosine hydroxylase transgene driven by a glial-specific promoter elicit behavioral 
recovery in experimental parkinsonism." J Neurosci Res 59(1): 39-46. 
During, M. J., J. R. Naegele, et al. (1994). "Long-term behavioral recovery in parkinsonian 
rats by an HSV vector expressing tyrosine hydroxylase." Science 266(5189): 1399-403. 
Gudiño-Cabrera G y Nieto-Sampedro M. (1996). Ensheathing cells: Large scale purification from 
adult olfactory bulb, freeze-preservation and migration of trasplanted cells in adult brain. Restor 
Neurol Neurosci; 10:25-34 
Gudino-Cabrera, G. and M. Nieto-Sampedro (2000). "Schwann-like macroglia in adult rat 
brain." Glia 30(1): 49-63. 
Guntinas-Lichius, O., D. N. Angelov, et al. (2001). "Transplantation of olfactory 
ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial 
motoneurons." Exp Neurol 172(1): 70-80. 
Hagell, P. and P. Brundin (2001). "Cell survival and clinical outcome following intrastriatal 
transplantation in Parkinson disease." J Neuropathol Exp Neurol 60(8): 741-52. 
Hauser, R. A., T. B. Freeman, et al. (1999). "Long-term evaluation of bilateral fetal nigral 
transplantation in Parkinson disease." Arch Neurol 56(2): 179-87. 
Herman, J. P. and N. D. Abrous (1994). "Dopaminergic neural grafts after fifteen years: 
results and perspectives." Prog Neurobiol 44(1): 1-35. 
Kafitz, K. W. and C. A. Greer (1999). "Olfactory ensheathing cells promote neurite 
extension from embryonic olfactory receptor cells in vitro." Glia 25(2): 99-110. 
Lu, J. and K. Ashwell (2002). "Olfactory ensheathing cells: their potential use for repairing 
the injured spinal cord." Spine 27(8): 887-92. 
M.P.F. Umberto de Girolami, D. C. A. (1996). El sistema Nervioso Central. Robbins-
Patología Estructural y Funcional. McGraw-Hill. USA, McGraw-Hill. 
Mouradian, M. M. (2002). "Recent advances in the genetics and pathogenesis of Parkinson 
disease." Neurology 58(2): 179-85. 
Nieto-Sampedro, M., J. E. Collazos-Castro, et al. (2002). "[Traumatic injuries to the central 
nervous system and their repair]." Rev Neurol 35(6): 534-52. 
Pascual, J. I., G. Gudino-Cabrera, et al. (2002). "Spinal implants of olfactory ensheathing 
cells promote axon regeneration and bladder activity after bilateral lumbosacral dorsal 
rhizotomy in the adult rat." J Urol 167(3): 1522-6. 
Tabbal, S., S. Fahn, et al. (1998). "Fetal tissue transplantation [correction of transplanation] 
in Parkinson's disease." Curr Opin Neurol 11(4): 341-9. 
Trejo, F., P. Vergara, et al. (1999). "Gene therapy in a rodent model of Parkinson's disease 
using differentiated C6 cells expressing a GFAP-tyrosine hydroxylase transgene." Life 
Sci 65(5): 483-91. 
Verdu, E., X. Navarro, et al. (1999). "Olfactory bulb ensheathing cells enhance peripheral 
nerve regeneration." Neuroreport 10(5): 1097-101.