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Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México bibliotecadigital@redudg.udg.mx - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA Coordinación de Bibliotecas Biblioteca Digital La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma. 1 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA División de Desarrollo Biotecnológico Maestría en Ciencias con orientación en Ciencias Biológicas y Agropecuarias Evaluación citotóxica de polisacáridos en suplementos alimenticios de Aloe vera Presenta: IBQ. Michelle Nicole Salazar Zúñiga Directora: Dra. Zaira del Rocío López López Co-director: Dr. Peter Knauth Ocotlán, Jalisco, marzo 2020 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA DIVISIÓN DE DESARROLLO BIOTECNOLÓGICO MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS ORIENTACIÓN: BIOTECNOLOGÍA MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS ORIENTACION: BIOTECNOLOGIA PRESENTA: IBQ. Michelle Nicole Salazar Zúñiga DIRECTORA: Dra. Zaira del Rocío López López CO-DIRECTOR: Dr. Peter Knauth COMITÉ DE SEGUIMIENTO: Dr. Rayn ClarencAarland Dr. Javier Gustavo Acevedo Hernández TESIS PARA OBTENCIÓN DE GRADO Evaluación citotóxica de polisacáridos en suplementos alimenticios de Aloe vera Este trabajo fue realizado gracias al apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) con el otorgamiento de la beca CVU 887258, al laboratorio de Biología Celular del Centro Universitario de la Ciénega (CUCI) y al laboratorio de Ingeniería Química de la Universitat de les Illes Balears (UIB). Dedicatoria Este trabajo es dedicado a Dios por permitirme estar para realizar una de mis metas y darme la fortaleza de enfrentar los retos diarios. A mi familia que siempre están ahí para apoyarme, a mita por su amor y mi crianza, a mi chiqui por su amor y apoyo que como equipo afrontamos las distintas circunstancias, a mis amigos y a la vida porque siempre me recuerde que “dejar de luchar es comenzar a morir” y que nunca debo abandonar mis metas y sueños. Agradecimientos Para la realización de este trabajo de tesis quiero agradecer primeramente a la Dra. Zaira López por su enseñanza, confianza y paciencia durante el proceso de selección y durante el proceso de maestría, al Dr. Peter Knauth por todas sus enseñanzas y paciencia en el laboratorio y en las materias impartidas. A la Dra. María Eugenia Sánchez por su guía y apoyo durante el proceso de maestría, y a todos mis maestros que me impartieron clases durante el posgrado y que con sus enseñanzas, experiencias y conocimiento enriquecieron mis conocimientos y habilidades. Así como a la coordinación de maestría liderada por el Dr. Melesio Lomeli. Quiero agradecer también a todas aquellas personas que hicieron de mi estancia una experiencia maravillosa y gratificante la cual me ayudo a crecer de manera profesional y personal en distintos aspectos de mi vida, a los Drs. Antoni Femenia, Carmen Rosello, Susana Simal , Valeria Eim que aparte es una gran amiga y Esperanza Dalmau, que siempre me acogieron, me dieron su apoyo y enseñanza, a mis compañeras de laboratorio que también se convirtieron en amigas: Cristina Reche que siempre contagiaba su a alegría y conocimiento, Monica Umaña que en el laboratorio fue una maestra, a Beatriz Rayo y Carme Molinas por su apoyo en el laboratorio. A Dios por permitirme estar, cursar esta maestria y finalizarla. A mi familia que en todo momento han estado, a mi chiqui por no siempre apoyarme, a mis amigos por su amistad y relajación. Y a los que no están pero me dieron un amor incondicional y formaron parte de lo que hoy soy: Mi papá Martin, mi abue Maca, mi amiga y hermana Hatty y mi conejo Darwin. A la experiencia de realizar una maestría que a pesar de lo difícil y complicado del proceso, fue una experiencia llena de aprendizaje y pasión, a este tema que le dedique tiempo y esfuerzo y que me hizo enamorarme aún mas de “los porqué de la vida”. ¡Gracias totales! 1 ÍNDICE Índice de figuras .............................................................................................................................. 4 Índice de tablas ................................................................................................................................ 6 Antecedentes ....................................................................................................................................... 8 Introducción ...................................................................................................................................... 11 Clasificación Botánica............................................................................................................... 11 Propiedades terapéuticas de A. vera .............................................................................................. 14 Estudios sobre actividad biológica de extractos crudos de A. vera ............................................... 15 Estudios sobre actividad biológica de productos procesados de A. vera ...................................... 16 Procesos industriales usados para la deshidratación de productos naturales................................. 17 Influencia del calor en compuestos bioactivos .............................................................................. 19 Influencia del calor en polisacáridos ............................................................................................. 21 Caracterización biológica de los polisacáridos de A. vera ............................................................ 23 Justificación ....................................................................................................................................... 24 Hipótesis ............................................................................................................................................ 24 Objetivo general ................................................................................................................................ 25 Objetivos específicos .................................................................................................................... 25 Metodología ...................................................................................................................................... 25 1.1 Obtención y preparación de muestras ..................................................................................... 26 1.1.1 Obtención de muestras crudas .......................................................................................... 26 1.1.2 Deshidratación de muestras .............................................................................................. 26 1.1.3 Muestras deshidratadas e industriales .............................................................................. 27 1.2 Caracterización química de muestras deshidratadas e industriales ......................................... 28 1.3 Microscopía (SEM) ................................................................................................................. 28 1.4 Obtenciónde residuo insoluble en alcohol (AIR) ................................................................... 29 1.5 Obtención de azúcares neutros ................................................................................................ 30 1.5.1 Hidrólisis .......................................................................................................................... 30 1.5.2 Reducción y acetilación ................................................................................................... 31 1.5.3 Análisis por GC-FID ........................................................................................................ 31 2 1.5.4 Análisis de ácidos urónicos .............................................................................................. 32 1.5 Grado de metil esterificación de las pectinas (DME) .............................................................. 33 1.6 Determinación del grado de acetilación del acemanano por RMN ......................................... 34 1.7 Propiedades funcionales .......................................................................................................... 34 1.7.1 Hinchamiento (Swelling (SW)) ........................................................................................ 35 1.7.2 Capacidad de retención de agua (WRC) .......................................................................... 35 1.7.3 Capacidad de retención de aceite (FAC) .......................................................................... 35 2 Estudios in vitro ......................................................................................................................... 36 2.1 Crecimiento celular ................................................................................................................. 36 2.2 Condiciones de cultivo para HT29 (células humana adenocarcinoma colorrecteral) ............. 36 2.3 Preparación de muestras de A. vera ........................................................................................ 36 2.4 Viabilidad celular .................................................................................................................... 37 2.4.1 WST-1 .............................................................................................................................. 38 2.4.2 Técnica de Absorción de Rojo Neutro (NRU) ................................................................. 38 2.4.3 Necrosis ............................................................................................................................ 39 2.4.4 Azul de tripán o de tripano (trypan blue en inglés) .......................................................... 39 3. Resultados ..................................................................................................................................... 40 3.1 Rendimiento de muestras deshidratadas.................................................................................. 40 3.2 Viabilidad de la línea celular HT-29 frente a las muestras deshidratadas e industriales ......... 40 3.2.1 HT-29 expuesta a A60 ...................................................................................................... 41 3.2.2 HT-29 expuesta a A60(b) ................................................................................................. 42 3.2.3 HT-29 expuesta a A80 ...................................................................................................... 44 3.2.4 HT-29 expuesta a A100 .................................................................................................... 45 3.2.5 HT-29 expuesta a ILL ...................................................................................................... 46 3.2.6 HT-29 expuesta a ILF ...................................................................................................... 48 3.2.7 HT-29 expuesta a muestras no deshidratadas sometidas a diferentes temperaturas ......... 48 3.3 Morfología estructural de las muestras deshidratadas e industriales....................................... 50 3.3.1 SEM en muestras de A60, A80 y A100 ........................................................................... 50 3.3.2 SEM muestras ILF e ILL ................................................................................................. 51 3 3.3.3 Obtención del residuo insoluble en alcohol (AIR) ........................................................... 52 3.3.4 Determinación de monosacáridos .................................................................................... 53 3.3.4.1 Determinación de monosacáridos en muestras deshidratadas ....................................... 53 3.3.4.2 Análisis de azúcares en muestras de AIRs .................................................................... 54 3.3.5 Determinación del grado de metil esterificación .............................................................. 56 3.3.6 Determinación del grado de acetilación del acemanano por RMN .................................. 56 3.3.7 Determinación de las propiedades funcionales ................................................................ 58 3.3.7.1 Determinación de hinchamiento (Swelling, Sw) ........................................................... 58 3.3.6.2 Determinación de la capacidad de retención (WRC) .................................................... 59 3.3.6.3 Determinación de la capacidad de retención de aceite (FAC)....................................... 59 3.4 HT-29 expuesta a los polisacáridos ......................................................................................... 60 3.4.1 HT-29 expuesta a AA60 ................................................................................................... 60 3.4.2 HT-29 expuesta a AA80 ................................................................................................... 62 3.4.3 HT-29 expuesta a AA100 ................................................................................................. 64 3.4.4 HT-29 expuesta a AILF .................................................................................................... 66 4. Discusión ....................................................................................................................................... 69 4.1 Rendimiento y modificaciones entre las muestras deshidratadas ........................................... 69 4.2 Efecto celular frente a componentes modificados en el gel de A. vera ................................... 69 4.3 Exposición a polisacáridos ...................................................................................................... 71 Conclusiones ..................................................................................................................................... 73 Referencias ........................................................................................................................................ 74 4 Índice de figuras Figura 1.- Aloe vera (Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry) .......................................... 12 Figura 2.-Partes del A. vera (Modificado de Power of Aloe vera) ................................................... 13 Figura 3.-Diagrama de flujo general de la metodología. ................................................................. 25 Figura 4.-Proceso previo a la deshidratación, donde A muestra el plantío de A. vera, en B se pueden observar las hojas cortadas y lavadas, mientras que el proceso de fileteo se observa en C y finalmente las bandejas con A. vera cortado en cubos (D). .............................................................. 27 Figura 5.-Deshidratación de A. vera en horno eléctrico (A), mientras que en B se observa el homogeneizado del deshidratado obtenido utilizando un mortero. .................................................. 27Figura 6.-Disco con muestras para observación de SEM. ............................................................... 28 Figura 7.-Proceso para la obtención de AIR .................................................................................... 29 Figura 8.-Muestras en proceso de hidrólisis. ................................................................................... 31 Figura 9.-Patrones para GC-FID. .................................................................................................... 32 Figura 10.-Celdas de ácidos urónicos. ............................................................................................. 33 Figura 11.-Tubos Wilmad con muestras para RMN. ........................................................................ 34 Figura 12.-Tubos con muestra para propiedades funcionales. ........................................................ 35 Figura 13.-Ejemplo de placas PS tanto de 12 pocillos (A) como de 96 pocillos (B). ....................... 36 Figura 14.- Placa de 12 pocillos con indicaciones de preparación. ................................................ 37 Figura 15.- El color de estas muestras deshidratadas fue cambiando conforme a la temperatura, dando un color más claro a 60 °C (A60 figura 15A) y oscureciendo hasta llegar a pardo en 100 °C (A100 figura 15C) mientras que las muestras industriales ILF e ILL mostraron un color amarillento (ILF figura 15D). ............................................................................................................................. 40 Figura 16.-Actividad metabólica de HT-29 tratada con A60, determinada por WTS.1.. ................. 41 Figura 17.-Células HT-29 expuestas a A60 después de 24h a la concentración de 3x (A) y 1x(B), con la técnica de TB cualitativa, objetivo 10X. ................................................................................. 42 Figura 18.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a A60 (b) determinada por WST-1. ............... 43 Figura 19.-Células HT-29 expuestas a A60(b) por 24 h, a concentraciones de 3x (A) y 0.3x (B), determinadas mediante la técnica TB con objetivo 10X. .................................................................. 43 Figura 20.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a A80 determinada por WST-1. .................... 44 Figura 21.-Células HT-29 expuestas a A80, después de 24 h de exposición, donde A y B fueron sometidas a concentraciones de 1x, objetivos de 10 y 40X respectivamente, observando crecimientos irregulares (B). Mientras que C fueron células HT-29 expuestas a concentraciones 0.1x, objetivo 10 X. Todas mediante técnica TB. .............................................................................. 45 file:///C:/Users/ROJO/Downloads/TESIS%20MNSZ_maestria(4)-ZL.doc%23_Toc34305400 5 Figura 22.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a A100 por 24h y determinada por WST-1. .. 45 Figura 23.-Células HT-29 expuestas a A100 durante 24 determinación con TB y objetivo 10X. (A) control positivo células HT-29 sin tratamiento (happy cells), (B) control negativo células tratadas con H2O2 (exposición durante 2 h), (C) células HT-29 expuestas a A100 a 0.3x y (D) células HT- 29 expuestas a A100 en concentraciones de 3x. ............................................................................... 46 Figura 24.-Actividad metabólica de células HT-29 expuestas a ILL durante 24 h, determinada por WST-1. ............................................................................................................................................... 47 Figura 25.-Células HT-29 expuestas a ILL después de 24 h, (A) expuesta a concentraciones 1x y (B) expuesta a concentraciones 3x, con técnica TB, objetivo 10X. ................................................... 48 Figura 26.-Viabilidad celular de HT-29 expuesta por 24h al gel de A. vera húmeda (100 ° C), determinada por la técnica WST-1. ................................................................................................... 49 Figura 27.-(A) HT-29 expuesta al gel de A. vera (60 °C) 1 x; (B) a gel de A. vera a 3x, (C) a gel A. vera (80 °C) 1x, (D) a gel de A. vera 3x; (E) a gel de A. vera (100 °C) 1x, (F) a gel de A. vera 3x. 50 Figura 28.-Micrografías de muestras obtenidas donde A60 (A) a 100X y (B) a 300X, A80 (C) a 100X y (D) a 300x, finalmente A100 (E) a 100X y (F) a 300X. ........................................................ 51 Figura 29.-Micrografías de las muestras ILF (A) a 100X, (B) a 300X, (C) a 500X e ILL (D) a 100X, (E) a 300X y (F) a 500X. ................................................................................................................... 52 Figura 30.-Espectro de RMN 1 H del acemanano en muestras AA60, AA80 y AA100. ...................... 57 Figura 31.- Espectro de RMN 1 H de acemanano en muestras AILF e ILL. ...................................... 58 Figura 32.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a la muestra AA60 determinada por WST-1. 61 Figura 33.-Células HT-29 expuestas a AA60 durante 24 h. Técnica NRU con un tiempo de exposición 2 h, a una concentración de 1x (A) y 0.1x (B), objetivo 10X. Técnica TB con exposición menor a 5 min a una concentración de 3x (C) objetivo 10X y a una concentración de 0.3x (D) con objetivo 40X. ..................................................................................................................................... 62 Figura 34.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a la muestra de AA80, determinada con la técnica WST-1. .................................................................................................................................. 63 Figura 35.-Células HT-29 expuestas a la muestra AA80 después de 24 h, a concentraciones de 1x (A) y 0.1x (B) mediante la técnica NRU, objetivo 10X. Y mediante la técnica TB a concentraciones de 3x (C) objetivo 10X y 0.3x objetivo 40X. ...................................................................................... 64 Figura 36.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a la muestra AA100, determinada por WST-1. ........................................................................................................................................................... 65 Figura 37.-Células HT-29 expuestas a la muestra AA100 después de 24 h, con técnica NRU a concentraciones de 1x (A) objetivo 40x y 0.3x (B) con objetivo 10X. Con técnica TB a concentraciones de 3x (C) objetivo 40X y a 0.1x (D) con objetivo 10X. .......................................... 66 Figura 38.-Actividad metabólica de HT-29 expuesta a AILF determinada por WST-1. .................. 67 6 Figura 39.-.-Células HT-29 expuestas a la muestra AILF durante 24 h, con la técnica NRU a concentraciones de 1x (A) y 0.3x (B) objetivo 10X, mientras que con la técnica TB a concentraciones de 3x (C) y 0.3 (D) objetivo 10X. ........................................................................... 68 Índice de tablas Tabla 1.- Producción de Aloe vera en México, modificado de (CIMMYT, 2007) .......................... 11 Tabla 2.-Principios bioactivos de Aloe vera ...................................................................................... 13 Tabla 3.- Influencia del calor sobre compuestos bioactivos. ............................................................ 19 Tabla 4.-Influencia del calor sobre A. vera y sus compuestos bioactivos. ........................................ 21 Tabla 5 .-Descripción de la muestras utilizadas. ............................................................................... 30 Tabla 6.-Muestras utilizadas en la determinación de ácidos urónicos. ............................................. 33 Tabla 7.-Concentraciones y equivalencia a las que se trabajó. ......................................................... 37 Tabla 8.-Rendimiento de muestras deshidratadas. ............................................................................40 Tabla 9.-Rendimientos de las distintas muestras de AIRs obtenidas. ............................................... 52 Tabla 10.-Cuantificación en porcentajes de los monosacáridos presentes en las muestras deshidratadas e industriales. .............................................................................................................. 53 Tabla 11.-Azúcares principales de la pared celular. .......................................................................... 54 Tabla 12.-Contenido de fibra en muestras deshidratadas e industriales. ........................................... 54 Tabla 13.-Relación de azúcares totales en AIRs ............................................................................... 55 Tabla 14.-Azúcares estructurales en AIRs. ....................................................................................... 55 Tabla 15.-Fibra contenida en AIRs ................................................................................................... 56 Tabla 16.-Grado de metil esterificación. ........................................................................................... 56 Tabla 17.-Grado de acetilación y % de desacetilación del acemanano. ............................................ 57 Tabla 18.-Resultados de hinchamiento (Sw) de las muestras originales. .......................................... 58 Tabla 19.-Resultados de hinchamiento (Sw) de muestras de AIRs................................................... 59 Tabla 20.-Resultados WRC de muestras originales .......................................................................... 59 Tabla 21.-Resultados WRC de AIRs. ................................................................................................ 59 Tabla 22.-Resultados de retención de aceite de muestras originales. ................................................ 59 Tabla 23.- Resultados de retención de aceite de AIRs ...................................................................... 60 Tabla 24.-Comparación global. ......................................................................................................... 72 7 Índice de abreviaturas A. vera: Aloe vera APH: Altas Presiones Hidrostáticas ATCC: American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) CEI-RD: Centro de Exportación e Inversión de la República Dominicana DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle Medium ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) EtOH: Etanol FBS: Fetal bovine serum FRAP: Ferric Reducing Antioxidant Power (Capacidad reductora/antioxidante del hierro) FT-IR: Infrarrojos por Transformada de Fourier GC-MS: Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (Cromatografía de Gases acoplado a espectrometría de Masas) GEA: Gesellschaft für Entstaubungsanlagen (industria líder proveedora para industrias de alimentos y tecnología) LDH: Lactate dehydrogenase (Lactato deshidrogenasa) LN2: Nitrógeno líquido MNR: Magnetic Nuclear Resonance [Resonancia Magnética Nuclear (RMN)] NRU: Neutral Red Uptake (Absorción de rojo neutro) ORAC: Oxygen Radical Apsortion Capacity (Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno) PBS: Buffer fosfato salino PPMV-1: Pigeon Paramyxovirus type 1 (paramixovirus de paloma tipo 1) PS: Poliestireno RH: Relative humidity (Humedad Relativa, Hr) WST-1: Water Soluble Tetrazolium Salt (Sales de Tetrazolio) 8 Antecedentes Desde la antigüedad se han utilizado plantas para fines medicinales; a partir de sus extractos acuosos se han preparado pócimas para curaciones, cuyas propiedades terapéuticas fueron atribuidas de acuerdo con su forma, color o hábitat. La humanidad fue adquiriendo este conocimiento de forma empírica que ha sido transmitido de generación en generación principalmente de manera verbal (Marcano et al., 2002). Por ello, algunas plantas han mostrado una gran variedad de beneficios terapéuticos que han acaparado el mercado internacional. Aloe vera es una planta que representa ganancias económicas a nivel mundial en diferentes ámbitos, por ejemplo en 2009 los países más importantes en cuanto a la importación de Aloe vera y otras plantas, fueron Estados Unidos con el 14.2% de la importaciones mundiales (237.7 millones de dólares), Alemania con 10% (168.05 millones) y Japón con 7.8% (131.47 millones). En cuanto a exportaciones de plantas de A. vera (2009), entre los países que destacaron se encontraba China con 28.7% de la exportaciones mundiales (432.47 millones de dólares), Alemania con 7.5% (113.23 millones), y la India con 7.1% (106.27 millones). Además, cabe mencionar que en cuanto a productos procesados de A. vera se exportaron en ese mismo año 111.26 toneladas (1,182.6 millones) de jugos de Aloe vera y extractos vegetales, siendo los principales exportadores China con 25.6% (303.24 millones de dólares), Alemania con 11.2% (132 millones) y Estados Unidos con 8.9% (105.2 millones) (CEI-RD, 2011). Con estos datos podemos percatarnos que Aloe vera es una planta con grandes derrames económicos en cuanto a importaciones por países que cuentan con la tecnología industrial para desarrollar productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos, que una vez que realizan el proceso se convierten en los principales exportadores de estos productos llevándolos a distintos países. Toda la producción y movilidad de Aloe vera o comúnmente conocido como sábila, se debe a las propiedades que se le atribuyen como emoliente, cicatrizante, coagulante, hidratante, antialérgico, desinfectante, antiinflamatorio, astringente, colerético, reguladora de la digestión (Saludeo, 2018) entre otras, y desde la antigüedad se le ha utilizado como tratamiento para combatir irritaciones, picaduras de insectos y quemaduras en la piel (Rodríguez-Domínguez et al., 2006). Debido a estas propiedades atribuidas se han realizado diversos estudios con extractos crudos para probar su efectividad. Dentro de los estudios más recientes fue determinar el efecto antibacterial y antioxidante (Nejatzadeh- Barandozi, 2013) con extracto etanólico al 95% de gel de Aloe, siendo la fase orgánica la de interés ya que mostraba una gran cantidad de polifenoles y alcaloides, la actividad antibacteriana fue evaluada mediante la técnica de difusión de disco con agar papa dextrosa sin embargo los organismos probados (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli) no mostraron sensibilidad ante el extracto; pero a la par se demostró que el extracto si posee capacidad antioxidante, que fue comprobado mediante los análisis ORAC y FRAP. Por otro lado, Ferro et al. (2003) demostraron susceptibilidad de dos bacterias Shigella flexneri y Streptococcus pyogenes 9 frente a extractos etanólicos al 95% de gel de A. vera, utilizando el extracto acuoso de A. vera en 30 ratones inmunizados contra el virus de hepatitis B evaluando la respuesta humoral, el tratamiento consistía en inyectarles 0.2 mg/kg de extracto de A. vera diariamente a un grupo durante 6 meses, la medición de los anticuerpos se realizó por la técnica ELISA llegando a concluir que el extracto de A. vera acuoso no tiene efecto desde el punto de vista celular sino humoral pero que conjuntamente resulta en una importante actividad antiviral. Otro estudio sobre las propiedades terapéuticas evaluadas ha sido la capacidad emoliente, Rodríguez-Domínguez et al. (2006) analizaron a 90 pacientes con distintas afecciones entre las que destacaba la psoriasis; el método utilizado era variable en tiempo, duración y evolución del tratamiento, que constaba de una preparación de A. vera en crema (concentración del 50%) que tenía que untarse 3 veces al día durante 15-60 días, obteniendo resultados de mejora de un 47% y un 45% de curación. Es importante mencionar que entre los componentesmayoritarios presentes en especies del género Aloe, se encuentran los polisacáridos, los cuales representan cerca del 20% de los sólidos totales presentes en el gel de Aloe (Hirosshi, 1986). Por ejemplo en el Aloe arborescens Miller fueron detectados glucosa (mayoritario), galactosa, arabinosa y trazas de xilosa (Larionova et al., 2004). En cuanto al gel de A. vera se han detectado y aislado varios polisacáridos (60%), incluyendo al acemanano compuesto principalmente por monómeros de manosa (T’Hart et al., 1989; Femenia et al., 1999), además de encontrar galactosa, arabinosa, sustancias pécticas y ácido glucurónico (Mandal y Das, 1980). En varios estudios la manosa se ha identificado como el monómero más importante presente en el gel de A. vera con un 52% (Rodríguez-Domínguez et al., 2006; Yagi et al., 1984), mientras que otros géneros han reportado la ausencia de éste, la composición de los polisacáridos (glucosa (26%), galactosa (3.5%), xilosa (1.3%) (Rodríguez-Domínguez et al., 2006)) también es variable según el lugar de cultivo y época del año (Ovodova, 1975), encontrando a su vez a las sustancias pécticas como el mayoritario (Ni et al., 2004). Las pectinas forman un grupo complejo de polisacáridos, que están constituidas de ácido galacturónico unidas por enlaces α (1-4) (Brandao y Andrade, 1999). Otros polisacáridos presentes en el gel de A. vera son: glucomanano y acemanano (Pasco et al., 2001); el primero es un polisacárido, del tipo heteropolisacárido, el cual presenta una estructura química compuesta por D-manosa y D-glucosa (en una relación 8:5), unidas por enlaces β (1-4) (Hu et al., 2003). Además de estar presentes un grupo pequeño de polisacáridos llamados antraquinonas entre las cuales se encuentrán presentes aloína, resistannol y barbaloin (Surjushe et al. 2008; Ferraro 2009). Las diferencias mencionadas se deben principalmente a los diferentes lugares geográficos en donde se desarrolla la planta de A. vera (Grindlay y Reynolds, 1986). Debido a la abundancia e importancia de los polisacáridos en A. vera se han realizado diversos estudios como el de Yagi en 1977 quien comprobó el efecto inhibidor del polisacárido aislado e identificado como β-D manano parcialmente acetilado de la especie Aloe arborescens, contra el sarcoma implantado en ratones 180 (Yagi, 1977). Por otro lado, en el 2001 García López et al. realizaron un estudio genotóxico con un polisacárido no específico de A. vera, demostraron que el polisacárido de gel de Aloe no fue mutagénico en 10 un sistema Salmonella/microsoma, mientras que en el ensayo in vivo no se observó respuesta genotóxica en las concentraciones estudiadas, además concluyen que pudiera ser considerado como un agente potencial en la quimioprevención del cáncer (García López et al., 2001). En otro estudio Quezada et al. (2017) evaluaron las propiedades prebióticas de dos polisacáridos de A. vera (acemananos y fructanos); el estudio fue realizado in vitro comparando la inducción del crecimiento microbiano por la de la inulina (FOS comercial) contra los acemananos y fructanos, siendo estos últimos los mejores estimulantes para la producción de microorganismos prebióticos. El resultado de la digestión anaeróbica de las heces humanas en un bioreactor demostró que los fructanos estimularon la mayor producción de Bifidobacterium spp. y ácidos grasos de cadena corta; con esto concluyeron que ambos polisacáridos de A. vera tienen potenciales prebióticas. Cabe resaltar que en muchos estudios los efectos observados pueden resultar del sinergismo de 75 componentes presentes en A. vera, ya que existen distintos estudios donde solo se ha utilizado el extracto y este presenta mayor actividad antimicrobiana que cuando se utilizan polisacáridos (Urch D. Aloe vera-Nature’s Gift. Blackdown Publications, 1999). Por otro lado Chen et al. (2003) reportaron haber utilizado células humanas de leucemia (HL-60) evaluando el efecto apoptótico frente a Aloe-emodin (1,8-dihydroxy-3- hydroxymethyl-9,10-anthracenedione) que es una hidroxiantraquinona, demostrando que a concentraciones de 20-25 µM de Aloe-emodin las células vivas se ven afectadas, para la determinación de la etapa en que se inducía la inhibición, se utilizaron el análisis de citometría de flujo y la electroforesis en gel que confirmó la fragmentación de ADN por la apoptosis inducida de Aloe-emodina en células, además observando el aumento de células en fase G2/M, mediante el análisis de inmunotransferencia se realizó la detección de ciclinas A, B1 y E; y el aumento de p27. También señalaron que, a altas concentraciones, el Aloe-emodin inducía citotoxicidad para líneas celulares de eritroleucemia (Chen et al., 2003). Este mismo compuesto en otros estudios in vitro dio como resultado la inducción de actividad mutagénica y genotóxica (Westendorf et al., 1990). Pero también se informó que la Aloe-emodina no induce citotoxicidad en L 1210 células de leucemia (Driscoll, 1974). Cabe resaltar que en la mayoría de estudios realizados con A. vera han sido analizando sus extractos crudos, sin embargo existen muy pocos estudios utilizando productos comerciales de esta planta que en esa presentación es como tienen mayor demanda por el consumidor. En un estudio reciente realizado a productos comerciales de A. vera, los resultados no fueron tan alentadores como se esperaba, esto por todas las atribuciones y usos benéficos que representa así que también cuenta con registros de daño citológico; por ejemplo López et al. (2017) evaluaron los efectos citotóxicos de suplementos alimenticios de Aloe vera en células HeLa con muestras a concentraciones de 300 μg/mL, donde el metabolismo de la célula se vio prácticamente disminuido en más del 50%. Por lo que resulta interesante el centrarse en el estudio de suplementos alimenticios de A. vera y conocer su composición y estructura, así como sus efectos bioactivos y adversos del componente principal. Ya que la deshidratación es el proceso térmico principal para obtener los suplementos alimenticios, que durante este incremento de temperatura algunos 11 constituyentes sufren modificaciones que pueden estar generando productos que pueden afectar el metabolismo celular. Introducción México no aparece como uno de los principales productores a nivel mundial de A. vera pero el tamaño de producción no es nada despreciable, ya que en 2006 su producción total fue de 70 762 toneladas (CIMMYT, 2007), destacando Tamaulipas con el 70% como uno de los principales estados productores a nivel nacional (tabla 1). Tabla 1.- Producción de Aloe vera en México, modificado de (CIMMYT, 2007) Estado % Tamaulipas 70.0 Yucatán 16.5 San Luis Potosí 8.4 Veracruz 2.0 Puebla 1.6 Morelos 1.4 Zacatecas 0.1 Nacional 100 Clasificación Botánica La categoria taxonómica de Aloe vera (Castro, 2004) es: Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Liliopsida Orden: Liliales Familia: Liliaceaes Género: Aloe Especie: Aloe vera Nombre común: sábila 12 El género de Aloe tiene 581 especies aceptadas (The Plant List, 2018), A. vera fue descrita por primera vez por Carl von Linné en 1753 (Linnaei C., 1753), y la primera clasificación de los Aloes se realizó en la Isla de Barbados y fue realizada por el botánico Miller (Grindlay y Reynolds, 1986), reportando que el Aloe barbadensis es originario de esa zona y fue introducido al mundo como producto del comercio marítimo en el caribe. El nombre proviene del griego “aloệ” y árabe “alloeh”, que significa: “la sustancia amarga brillante”, la palabra vera proviene del latín y significa: “verdad” (Boudreau y Beland., 2006; Surjushe et al., 2008). Las características de A. vera son (Reynolds y Dweck, 1999; Choi y Chung, 2003; Ramachandra y Srinivasa, 2008).: Tiene hojas perennes en forma de roseta Alcanza hasta 50 cm dealtura Las especies más populares son Aloe barbadensis Miller (Aloe vera), Aloe aborescens y Aloe chinensis (Bozzi et al., 2007). Aloe barbadensis es considerada la de mayor actividad biológica ya que cuenta con más reportes de compuestos bioactivos (Joshi, 1997; WHO, 1999; Yagi et al., 1998). El nombre aceptado actualmente es Aloe vera (L.) Burm. F. o mayormente nombrada Aloe vera (Vinson et al., 2005). Pero la planta se ha conocido bajo distintos nombres coloquial y científicamente (Reynolds, 2004): Sábila Aloe vera Aloe curacao Aloe barbadensis Normalmente se separa en 2 productos: látex de Aloe (jugo de Aloe) y gel de Aloe (Bozzi et al., 2007). El Aloe vera es una especie xerofita y suculenta, originaria específicamente de la península de Arabia (Rahda y Laxmipriya, 2015; Vega et al., 2005); se le ha identificado 75 principios activos (tabla 2) (Rahda y Laxmipriya, 2015); presenta compuestos fenólicos, principalmente cromonas y antraquinonas, ubicados en la capa interna de las células epidermales (Lucini et al., 2014); el parénquima gelatinoso (gel) e incoloro está constituido principalmente por agua, mucilagos, ácidos y sales orgánicas, enzimas, saponinas, taninos, Figura 1.- Aloe vera (Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry) 13 trazas de alcaloides y vitaminas. En cuanto a los compuestos fenólicos presentes en Aloe vera le dan un carácter antioxidante (Franco-Quino et al., 2016). Figura 2.-Partes del A. vera (Modificado de Power of Aloe vera) Más específicamente, el látex de Aloe es conocido por su propiedad como laxante, los constituyentes principales y activos son los derivados del hidroxiantraceno como las antraquinonas, glucósidos de aloína A y B (Saccu et al., 2001). El gel de Aloe se encuentra en la parte interna de las hojas frescas (Reynolds y Dweck, 1999), constituido principalmente por agua (>98%) y polisacáridos (pectinas, celulosa, hemicelulosa, glucomanano, acemanano y derivados de manosa), el acemanano es considerado el componente bioactivo del gel de Aloe (Djeraba y Quere, 2000; Femenia et al., 1999). Normalmente el gel se comercializa en polvo concentrado (Bozz et al., 2006), tradicionalmente el gel es utilizado como tópico (heridas, irritaciones leves, quemaduras) o internamente para el tratamiento de úlceras, estreñimiento, tos, diabetes y artritis (Eshun y He, 2004; Vogler y Ernst, 1999). Tabla 2.-Principios bioactivos de Aloe vera Principios bioactivos de Aloe vera recopilado de Shelton 1991, Vogler y Ernst 1999, Vega et al. 2005, Surjushe et al. 2008, Ferraro 2009. Polisacáridos Aminoácidos Vitaminas Minerales Enzimas Fitohormonas Manosa Arginina Tiamina (B1) Calcio Catalasa Auxinas Glucomanano Lisina Riboflavina (B2) Fósforo Oxidasa Giberelinas Acemanano Valina Niacina (B3) Zinc Amilasa Ácido glucurónico Fenilalanina Ácido fólico (B9) Hierro Lipasa 14 Manosa-6- fosfato Isoleucina Ácido ascórbico (C ) Sodio Fosfatasa alcalina Algenógeno Leucina Alfa- tocoferol (E) Magnesio Peroxidasa C-glucosil cromona Treonina Retinol (A) Manganeso Carboxipeptidasa Celulosa Metionina Cromo a Aldopentosas Cobre Antraquinonas Aloemodina Resistannol Barbaloin Sin embargo, es bien sabido que las diferentes condiciones de cultivo, así como las diferentes partes, edad de la planta y el método de extracción pueden afectar considerablemente su composición química (Chithra et al., 1998). La recolección destinada a la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria es con plantas adultas de entre 3 y 5 años de edad, esto para obtener pulpa de Aloe de buena calidad (Reynolds y Dweck, 1999; Choi y Chung, 2003; He et al., 2005; Bozzi et al., 2007). Propiedades terapéuticas de A. vera El Aloe vera durante siglos fue utilizada por sus propiedades medicinales y terapéuticas sin ningún entendimiento claro o análisis científico de cada una de sus propiedades (Eshun y He, 2004). Una gran variedad de actividades biológicas ha sido confirmada con estudios científicos, por ejemplo, su acción desinfectante, antiviral, antibacterial, laxante, protección contra la radiación, antiinflamatorio e inmunoestimulatorio (Ni et al., 2004). Se destaca su actividad contra enfermedades de la piel, como dermatitis, psoriasis y contra los daños de la irradiación, también ayuda a las afecciones en los ojos principalmente producida por inflamación. Por otro lado, ayuda en los desórdenes intestinales, tales como estreñimiento atribuyéndole acción antidisentérica, antihemorroidal y colerética (Martinez et al., 1996; Chanfrau et al., 2000; Serrano, 2005). El gel de Aloe vera también mejora la cicatrización de heridas en forma dosis-dependiente y reduce el edema y dolor (Davis et al., 1986; Davis et al., 1987). Además el gel de A. vera es usado como un producto dermatológico y como un agente beneficioso para la piel, al aportar suavidad y tersura, propiedades que son 15 aprovechadas en la industria cosmetológica y farmacéutica. Por otra parte, éste gel es utilizado en varias bebidas como suplemento dietético (Vega et al., 2005). Por otro lado en 2006 Davis et al., realizaron estudios en humanos que muestran los efectos benéficos del A. vera en el tratamiento de síndrome de intestino irritable (SII) y en la colitis ulcerativa. Los resultados de este estudio mostraron que la ingestión de A. vera es segura y que podría beneficiar a los pacientes con diarrea predominante o con estreñimiento por SII. También se ha trabajado con modelos murinos como lo hicieron Kosif et al. (2008); investigaron el efecto del gel de Aloe vera en el sistema nervioso central de ratas albino Wistar y los resultados indicaron que el gel de A. vera no tiene ningún efecto tóxico en las neuronas ni en las células gliales del sistema nervioso central. Sin embargo, la relación entre las células de Purkinje y el tejido circundante del cerebelo se redujo considerablemente en el grupo tratado, lo que podría causar un cambio entre la conexión de las células y afectando parámetros fisiológicos. Además Kim et al. en 2009 utilizaron ratones con 4 semanas de edad que fueron alimentados con una dieta alta en grasas y baja en carbohidratos y se les administró el gel de A. vera durante 8 semanas. La administración del gel de Aloe disminuyó los niveles de glucosa en sangre de los ratones y disminuyó el tamaño de los adipocitos. Con este estudio se demostró que la administración oral del gel de A. vera a un modelo in vivo puede ser usado en el tratamiento de diabetes Mellitus tipo II, que después podría escalarse a seres humanos. Estudios sobre actividad biológica de extractos crudos de A. vera Es importante que al utilizar extractos crudos se tome en cuenta principalmente al pretratamiento de la planta, el crecimiento, riego, edad al momento de la cosecha, los métodos de extracción, condiciones de almacenamiento, uso de componentes frescos o secos, todo lo cual incide en la variabilidad del contenido de sus componentes (Chandegara y Varshney, 2013; Yaron et al., 1993). En el gel de A. vera se concentran la mayoría de los principios activos, es por ello que existen muchos trabajos de extractos acuosos, etanólico y clorofórmico de Aloe vera, donde por ejemplo se demuestra que son capaces de disminuir el edema, la acumulación de neutrófilos e inhibir la producción de prostaglandinas ocasionadas por una lesión en la pata de rata (Vázquez et al., 1996). Estos extractos acuosos también han ayudado a la comparación de micronutrientres de frutas con esta planta para la evaluación de propiedades antioxidantes, como se demostró con la naranja la cual tiene 3000 veces menos concentración que A. vera, además que esta última contiene mayor cantidad de calcio y potasio que cuentan con la capacidad de reducir radicales librescombinada con otras sustancias como vitamina C y E (Dominguez-Fernandez et al., 2012; Loots et al., 2007). Aunque otros estudios con extractos crudos de A. vera, han evaluado la inhibición bacteriana y fungicida Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus (Reyes de Fuentes y Fernandez Da Silva, 2014); concluyendo que 16 estos tuvieron una inhibición total por lo que proponen este extracto como alternativa natural contra infecciones de estos microorganismos. De manera similar Alarcon et al. en 2016 evaluaron dos extractos de A. vera contra bacterias patógenas como Helicobacter pylori, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus y Streptococcus mutants, evaluando a distintas concentraciones los extractos crudos, siendo H. pylori la bacteria más sensible ya que fue la que presentó inhibición en el crecimiento. Pero también se han realizado estudios contra virus como lo hicieron en 2016 Rezazadeh et al.; ellos probaron extractos crudos de A. vera contra virus de herpes simple (HSV-1), demostrando que los extractos causaron un efecto inhibitorio contra el HSV-1 en concentraciones de 0.2-5% en línea celular Vero, concluyendo que podría ser la pauta para un tratamiento tópico contra las infecciones orales de HSV-1. Además se probaron extractos de Aloe vera para evaluar sus propiedades antivirales contra PPMV-1 en palomas domésticas infectadas, el efecto más inhibitorio se observó en las palomas que se les administró el extracto de A. vera a 300 mg/kg de peso corporal, concluyendo con la posibilidad de utilizar los extractos de Aloe vera como antivirales (Dziewulska et al., 2018). Estudios sobre actividad biológica de productos procesados de A. vera La industria farmacéutica resalta lo más importante en el uso A. vera en ungüentos, cápsulas y tabletas, cosmética en cremas, lociones, champús, jabones, entre otros (Domínguez-Fernández et al., 2012), aunque la industria alimentaria también ha adicionado A. vera a productos como leche, yogurt, confitería y jugos, siendo utilizados específicamente para alimentos funcionales que no contengan efectos laxantes (Ramachandra y Srinivasa, 2008). Además la industria alimentaria cuenta con estudios como el de Serrano Olmos en 2017 quien observó el efecto del extracto de gel liofilizado de A. vera en Listeria monocytogenes en la elaboración de queso campesino, y aunque concluye que, si hubo inhibición de esta bacteria a concentraciones mayores de 80%, resalta que no hubo cambio sensorial alguno entre muestras tratadas con y sin A. vera. Además Ahluwalia et al. en 2016 realizaron un estudio in vitro para determinar los efectos de dos productos con A. barbadensis bien definidos: Extractos AVH200® y AVE200, y los aplicaron en células T de sangre humana, observando que AVH200® es más efectivo en comparación con AVE200 para reducir la activación y proliferación de células T, concluyendo que AVH200® tiene el potencial de reducir la activación, proliferación y secreción de citosinas de células T en sangre humana sana, sugieren un efecto supresor para estas células. El producto AVH200® al parecer es solo gel de Aloe deshidratado a bajas temperatura no especificadas, hecho polvo en concentración de 200:1, libre de pesticidas y solventes, esta información fue obtenida de la página Thorne quien es la empresa responsable. Además con AVH200® se realizó un programa piloto para la evaluación de los efectos de este producto sobre el síndrome del intestino irritable (SII) en 68 adultos diagnosticados con este padecimiento, obteniendo resultados de 55% de mejoramiento en 17 cuanto a los síntomas sin observar efectos adversos graves, resaltando que se necesitan hacer más estudios para determinar la eficacia real de este producto (Storsrud et al., 2015). En el caso de la industria farmacéutica y cosmética posee diversidad de estudios, por ejemplo para el caso de quemaduras el A. vera tiene un efecto similar en la aceleración y mejoría de la cicatrización de heridas; en un estudio realizado con ratas quemadas con agua caliente, el Aloe vera incrementó la reepitelización y disminución del tamaño de la quemadura en poco tiempo (Hosseinimehr et al., 2010). También en la dermatitis atópica se ha visto que el A. vera puede modular la respuesta inmunológica al incrementar los niveles de la inmunoglobulina E y la regulación de citocinas antiinflamatorias como las interleucinas 5 y 10 (Kim et al., 2010). Es por ello que Najafian et al. en 2018 evaluaron Plantavera (gel de Aloe) para demostrar la eficacia de la cicatrización en el caso de úlcera de pie diabético; Plantavera redujo la úlcera significativamente y sin mostrar efectos secundarios, concluyendo que Plantavera parecía ser un tratamiento efectivo, barato y seguro, pero de igual manera resaltan la necesidad de realizar más estudios para comprobar propiedades de cicatrización. En otro estudio similar se comparó sulfadiazina de plata, contra gel y jugo de Aloe, para evaluar el proceso de cicatrización de heridas en perros y gatos, concluyendo que el Aloe vera fue más efectivo que la sulfadiazina de plata, al acelerar el encogimiento de la herida, reduciendo el tiempo de curación y disminuyendo la gravedad de las lesiones asociadas (Drudi et al., 2018). A. vera ha resultado tan importante en distintos productos, para certificaciones de calidad en México la única restricción es que los suplementos alimenticios contengan menos de 10 ppm/kg de la antraquinona aloína u otro ingrediente prohibido (COFEPRIS, 2017), sin mencionar la evaluación de los procedimientos utilizados y la repercusión en estos productos. Procesos industriales usados para la deshidratación de productos naturales La UNESCO en 2005 elaboró una guía para el uso de cocinas, hornos y secadores solares para deshidratar frutas, legumbres, hortalizas, plantas y carnes. Dando como beneficio la conservación de alimentos y aprovechar la energía principalmente. En cuanto a los secadores solares recomienda tener cuidado con la humedad presente en los alimentos y el tiempo de exposición es de los más duraderos, ya que puede ser perjudicial en cuanto a su calidad (pérdida del color natural, destrucción de vitaminas y valor nutritivo). La obtención de los productos comerciales de A. vera con frecuencia, implica algún tipo de tratamiento, por ejemplo, molienda, calefacción o deshidratación, que provocan modificaciones irreversibles en el gel (Kim et al., 1998). Debido a los distintos procesamientos inadecuados en los productos comercializados de A. vera, los ingredientes activos pueden ser modificados incluso eliminados principalmente por el proceso de secado (Izaguirre et al., 2013). Es por eso que distintas organizaciones comparten las condiciones y pasos limitantes en estos procesos por ejemplo la GEA (Gesellschaft für Entstaubungsanlagen, industria líder proveedora para industrias de alimentos y tecnología) sugiere la liofilización como el más adecuado para productos farmacéuticos y cosméticos, mientras que para 18 productos alimenticios el secado por atomización. Igualmente la GEA en 2015 sugiere el fileteado como pretratamiento para el secado, para proseguir con un proceso de corte y trituración, así la pulpa es deshidratada a 50 °C con una adición de enzimas para romper la viscosidad. No solo organizaciones se preocupan por estos procesos también existe distintas investigaciones científicas y estudios que respaldan los procesos inadecuados de A. vera, los cuales causan alteraciones en su constitución química. Domínguez-Fernández et al. en 2012 realizaron la técnica de extracción de Aloe vera mediante el lavado inmediato de las hojas con agua y jabón, para posteriormente separar de manera mecánica las hojas y obtener el filete de gel, realizaron una decoloración con carbón activado y de esta manera lograron retirar la aloínay antraquinonas; el líquido obtenido fue concentrado para reducir la cantidad de agua y junto con otros procesos obtener un polvo (Ramachandra y Srinivasa, 2008; He et al., 2005), mientras que Domínguez-Fernández et al. (2012) comentaron que el uso de enzimas como glucosa oxidasa y catalasa inhiben el crecimiento de organismos aerobios del gel, además de que existen otras medidas de esterilización en frío como la exposición de este a la luz ultravioleta seguido de una microfiltración. También sugieren técnicas como la pasteurización con temperaturas de 85 a 95 °C por 1 o 2 minutos, para posteriormente bajar la temperatura a 5 °C y mantenerla durante 10 a 15 segundos. Además Minjares-Fuentes et al. (2017) evaluaron los efectos sobre el acemanano de Aloe vera, frente distintos procesos industriales como secado por pulverización, congelación industrial, ventana de refractancia y sequedad de zona radiante; los procesos de secado provocaron que el rendimiento en seco de A. vera se viera reducido. No solo en las industrias farmacéuticas y alimenticias se utiliza el secado de A. vera técnicas por medio de secadores de tambor, horno y secado convectivo forzado han sido usadas sobre todo en productos textiles recubiertos con Aloe, como en guantes de uso doméstico o industriales (Bae y Kim, 1998; Cheng y Chen, 2009; Chou, 2002; Xu y Zhao, 2003). El secado por aspersión es un método ampliamente utilizado para concentrar y preservar los extractos de Aloe proporcionando un menor daño en la actividad biológica de los productos obtenidos, en comparación con el secado convectivo con aire forzado (Dominguez-Fernandez et al., 2012). Para productos semiterminados de A. vera destacan procesos como calentamiento, deshidratación y molienda (fricción entre las partículas) (Dominguez-Fernandez et al., 2012), mientras que para la conservación del gel de A. vera el secado convectivo bajo condiciones controladas, el secado por aspersión y la liofilización son los principales métodos (Dominguez-Fernandez et al., 2012). Además, la liofilización es un proceso donde se aplican bajas temperaturas para la remoción del agua del gel lo que permite conservar adecuadamente la actividad biológica del Aloe y en consecuencia obtener productos finales de alta calidad (Dominguez-Fernandez et al., 2012). Algo importante que se ha reportado es que la actividad biológica del gel de Aloe permanece esencialmente intacta cuando el gel es calentado a 65 °C por periodos menores a 15 minutos. Periodos extendidos o elevadas temperaturas han resultado en alta reducción de 19 los niveles de actividad biológica (Dominguez-Fernandez et al., 2012). Por lo tanto, para mejorar la calidad de los productos se han enfocado en desarrollar técnicas de extracción para preservar los compuestos activos del Aloe vera (Moore y McAnalley, 1995; Cerqueira et al., 1999; He et al., 2005; Bozzi et al., 2007; Ramachandra et al., 2008). Dado que el gel al ser expuesto a la presencia de oxígeno se oxida, se ha optado por el uso de procesos de combinación con frío y calor (Dominguez-Fernandez et al., 2012), debido a que se descompone por reacciones enzimáticas y crecimiento de bacterias, exceso de agua y presencia en un grado elevado de azúcares, siendo lo mejor el procesar de inmediato el gel después de su extracción (Dominguez-Fernandez et al., 2012). La aplicación de nuevas tecnologías ha sido investigada para sustituir, mejorar, modificar o complementar las alternativas convencionales empleadas en el procesamiento de materiales biológicos incluido el gel de Aloe. Estas tecnologías incluyen las Altas Presiones Hidrostáticas (APH), calentamiento óhmico, pulsos eléctricos, microondas, radiación gamma y ultrasonido; con el uso de estas nuevas tecnologías se ha logrado garantizar la inocuidad alimentaria, así como la preservación de características sensoriales y nutricionales, con la finalidad de obtener productos similares a los alimentos frescos (Hoover et al., 1989; Mackey et al., 1994; Fernandez et al., 2001; Deliza et al., 2005; McInerney et al., 2007). Influencia del calor en compuestos bioactivos El efecto del calor sobre distintos compuestos es diferente y debemos entender que para algunos es un efecto benéfico y para otros no (tabla 3). Tabla 3.- Influencia del calor sobre compuestos bioactivos. Compuesto Resumen del efecto Carotenoides (licopenos) Aumenta su biodisponibilidad con la cocción, ya que el licopeno se absorbe mejor a través de las grasas y aceites, por su liposolubilidad, y el calor al permitir que se rompan las paredes celulares del fruto, aumenta la liberación del compuesto y se facilita su absorción (Solorzano, 2006). Compuestos fenólicos A los compuestos fenólicos en maíz dulce como lo demostró Dewanto et al., 2002, luego de aplicar temperaturas a 115 ºC por 25 minutos se incrementó el contenido de ácido ferúlico a 55% y fenoles totales en 20 54%; indicando que durante el tratamiento térmico se produce una liberación de los fenoles conjugados de la matriz del alimento. Mientras Randhier et al., (2008) quienes indicaron que los compuestos fenólicos aumentan de manera efectiva cuando la temperatura se encuentra entre 60 y 80 ºC, y cuando excede los 100 ºC se produce una pérdida debido a su descomposición por efecto del calor, con lo que se contradice en lo que determinaron Dewanto et al 2002 en la primera parte de esta descripción. Compuesto polifenólicos Al respecto Katsube et al. (2009) estudiaron la estabilidad de los compuestos polifenólicos en las hojas de mora (Morus alba L.) secadas a 60 ºC y 70 ºC, encontrando que el secado a 60 ºC no influye en el contenido de compuestos polifenólicos, mientras que en hojas que fueron secadas a 70 ºC disminuyó significativamente. Folatos Estos compuestos son sensibles a la luz, al calor y son fácilmente oxidables, de manera que la cocción supone una destrucción de hasta un 80% de los mismos (Luckock, 2000; Mebart, 2006). Ácido linoleico La oxidación del ácido linoleico es inespecífica y catalizada por el calor (50 ºC), por lo que la adición de extractos que contengan antioxidantes, favorece el retraso de la decoloración del β-caroteno por inhibición de la oxidación del ácido linoleico (Laguerre et al., 2007). 21 Influencia del calor en polisacáridos Como se explicó anteriormente el calor causa distintos efectos sobre los compuestos químicos. Dado que en A. vera los polisacáridos, entre los más abundantes el acemanano, son los principales constituyentes, así como principales compuestos bioactivos, además por la estructura molecular no serían exentos de algunas modificaciones similares a las explicadas anteriormente. El acemanano es considerado el polisacárido con más propiedades atribuidas resaltando la propiedad inmunitaria que al parecer resulta ser únicamente de este compuesto (Femenia et al., 1999; Mandal y Das, 1980; McConaughy et al., 2008ab). Temperaturas entre 60-65°C son frecuentemente utilizadas en la industria alimentaria para llevar a cabo una pasteurización y con ello resolver el problema de la vida de anaquel que provoca grandes pérdidas económicas, sin embargo rangos de temperaturas superiores a 60 °C pueden alterar o modificar las estructuras químicas (tabla 4) provocando con ello una serie de consecuencias desde el cambio de las características organolépticas, cambio de textura e incluso pueden ser tóxicas. Tabla 4.-Influencia del calor sobre A. vera y sus compuestos bioactivos. Temperaturas usadas Proceso Efectos APH a temperatura ambientes Utilizado como pretratamiento para evaluar la capacidad antioxidantes de A. vera en relación con el uso de APH. APH incrementa los coeficientes de difusión de agua, las velocidades de secado, cambios importantes en la microestructura, y proporciona productos mássuaves y con una mayor capacidad antioxidante con respecto a las muestras sin tratamiento (Vega et al., 2011a) Evaluación sobre la presencia de microorganismos. Los resultados mostraron que muestras tratadas a 400 y 500 MPa por 1, 3 y 5 min presentaron niveles indetectables de los microorganismos monitoreados (Vega et al., 2011b). 4, 15 y 40 °C En una mezcla de polisacáridos se evaluó el efecto de la temperatura sobre la velocidad de precipitación y porcentajes El incremento de la temperatura disminuye el rendimiento del almidón a un pH ácido, pero ayuda a una precipitación más 22 de almidón. rápida. Por lo que se concluye que a 4 y 15 ºC el rendimiento del almidón es mayor (Parra-Huertas et al., 2012). 10, 20, 30, 40 y 50 ºC Evaluación de propiedades fisicoquímicas de extractos de gel de A. vera sometidos a procesos de secado por aspersión, congelación industrial, ventanas de refractancia y secado de zonas radiantes. Ocurrieron modificaciones fisicoquímicas que se vieron ligadas al incremento de la temperatura, modificaciones estructurales en el acemanano, principalmente en el grado de desacetilación (Minjares-Fuentes et al., 2016). 60 °C En polisacáridos deshidratados de A. vera se evaluaron las modificaciones físico- químicas causadas por las temperaturas. Concluyendo que a temperaturas mayores a 60 ºC causan desacetilaciones y muestran un aumento en el peso molecular por lo que estas modificaciones podrían tener efecto en la bioactividad (Femenia et al. 2003). 70 °C Evaluación de la actividad inmunomoduladora del jugo de A. vera, observando que cuando este se somete a temperaturas superiores a 70 ºC la capacidad inmunomoduladora se ve disminuida. Concluyendo que el tratamiento de calor es necesario para preservar el jugo de A. vera por mayor tiempo, la temperatura a usar debe ser menor a 70 ºC para evitar afectación a sus propiedades bioactivas (Shaik et al., 2018). 59-90 °C Evaluación de la temperatura respecto a los parámetros cinéticos del secado convectivo del gel de A. vera. Observando que reduce la capacidad antioxidante del gel con el incremento de la temperatura del aire de secado (Miranda et al., 2009). 23 Los tratamientos con calor utilizados para el procedimiento de los extractos de A. vera (tabla 4) (Minjares-Funtes et al., 2017) como son secado, secado por aspersión, liofilización industrial, secado por ventana de refractancia y secado por zona radiante causaron una disminución en el contenido de acemanano, además de causar desacetilación en las unidades de manosa, viéndose reflejada la disminución de propiedades funcionales como retención y absorción de agua y absorción de grasa; con lo que Mijares-Fuentes et al. concluyen que todas estas alteraciones pueden tener un efecto negativo en las propiedades benéficas atribuidas; y con base a lo anterior se puede pensar que someter el gel de A. vera a temperaturas mayores a 60 °C puede causar modificaciones ligadas no solo a la reducción de la actividad biológica sino también a la aparición de propiedades citotóxicas. Además debido a la abundancia de polisacáridos que se presentan en A. vera es necesario evaluar las modificaciones químicas que suceden para la obtención de productos deshidratados utilizados como suplementos alimenticios, en la etapa de tratamiento térmico. Esto con el fin de identificar si los polisacáridos presentes después del proceso térmico muestran un potencial citotoxicológico. Caracterización biológica de los polisacáridos de A. vera A los polisacáridos se les considera que juegan un papel inhibidor de la inflamación debido a que en algunos estudios se ha demostrado que el acemanano cuenta con reacciones específicas que incluyen la estimulación de la respuesta antigénica de los linfocitos, así como la estimulación para la formación de leucocitos, tanto en el bazo y la médula ósea de ratones que fueron sometidos a irradiaciones. Se pensaba que los efectos de inmunomodulación están vinculados a las glicoproteínas, es decir, las lecitinas, que se encuentran en el gel de Aloe vera (Reynolds y Dweck, 1999). Otro punto a tomar en cuenta es lo estudiado por Zacatecas-Ibáñez et al. (2016) quienes evaluaron la composición de acemanano presente en Aloe vera cultivado en la región de la Comarca Lagunera de Durango bajo diferentes niveles de estrés hídrico; con el fin de incrementar la producción de polisacáridos, logrando que el tratamiento que utilizaron con 40% en la reducción de riego para lograr el estrés hídrico, la planta presentó más de 10% de rendimiento de polisacáridos frente al tratamiento de control sin estrés. Resumiendo, así que el estrés hídrico podría ser un factor determinante en el rendimiento de los polisacáridos presentes en los extractos crudos, pero no así en los productos procesados. Aunado a este último estudio Chang et al. en 2010 evaluaron las concentraciones de los polisacáridos en Aloe arborescens de diferentes partes de la planta, con el fin de reconocer la parte con mayor concentración de polisacáridos. Las partes evaluadas fueron el jugo de gel, jugo de la piel o corteza y la flor; arrojando como resultado que la corteza contiene 2.4 más veces polisacárido que el gel, además 59.1% (gel) y el 79.8% (corteza) representan polisacáridos neutros, en las flores el 85.2% eran polisacáridos ligeramente ácidos; del gel y corteza los principales monómeros fueron ácido glucurónico, galactosa (63.7% en la corteza), glucosa (81% en el gel), manosa y xilosa con proporciones variables. Mientras que en la flor el 16.4% fue ácido glucorónico, además de galactosa, glucosa (40%) y manosa. 24 Los productos de A. vera comercializados como suplementos alimenticios son obtenidos por diferentes procesos de secado (aerosol, liofilización, deshidratación por horno etc.) cuyo rango de temperatura puede ser entre 60 y 80 °C, donde los monosácaridos sufren modificaciones como reducción en su peso molecular en el caso de manosa y galactosa, así como la reducción en el grado de acetilación de este mismo componente de 40 a 70 % (Minjares-Fuentes et al. 2017); cuando estas modificaciones ocurren, surge un cuestionamiento sobre la pérdida de las actividades biológicas atribuidas a estos componentes, de las pocas evidencias científicas que respaldan este cuestionamiento fue lo demostrado por López et al. (2019 ), quienes evaluaron la capacidad inmunomoduladora de tres productos comerciales ILG, WLP e ILF siendo esta última la más interesante, todos se probaron en células CaCo-2 y THP-1; ILF consiste en gel de A. vera deshidratado a aproximadamente 80 °C, pulverizado y rico en fibra; como resultados obtuvieron que CaCo-2 mostró una CL50 a concentraciones de 1 g/L y menores de la recomendadas para su consumo, mientras que THP-1 a concentraciones de 250 mg/L mostró una disminución del 40% de liberación de IL-10, además realizaron tratamiento con carbón activado a ILF lo que causó un aumento en la actividad inmunomoduladora de 3.1 veces y la disminución de la citotoxicidad. Pero aun con todos estos estudios falta evidencia científica que relacione la citotoxicidad con los polisacáridos. Planteamiento del problema El gel de Aloe vera es sometido a tratamientos térmicos durante los procesos de deshidratación para su obtención como suplementos alimenticios, esto provoca modificaciones en sus constituyentes principalmente en los polisacáridos promoviendo una actividad citotóxica. Justificación Dado los cambios estructurales que puede sufrir el Aloe vera por los tratamientos térmicos, los antecedentes que demuestra la actividad citotóxica de los suplementos alimenticios de A. vera y a que no existen normas que regulen la acción térmica sobre los productos, es necesario evaluar la actividad toxicológicade estos deshidratados y centrarse en los metabolitos de mayor abundancia que son los polisacáridos. Hipótesis Los polisacáridos de cadena larga en suplementos alimenticios procesados por belt-dry son causantes del efecto citotoxicológico. 25 Objetivo general Determinar el efecto citotoxicológico in vitro de los polisacáridos de cadena larga (tratados térmicamente) en suplementos alimenticios de Aloe vera. Objetivos específicos 1. Obtener los filetes de A. vera y deshidratarlos a 3 diferentes temperaturas por el proceso de belt-dry 60, 80 y 100 ºC para así obtener las muestras pulverizadas. 2. Determinar la viabilidad o efecto necrótico en las células HT-29 expuestas a las 3 muestras sometidas y obtenidas a diferentes temperaturas. 3. Obtener los polisacáridos de la muestra potencialmente citotóxica. 4. Determinar la viabilidad o efecto necrótico en las células HT-29 expuestas a cada una de las muestras obtenidas de polisacáridos Metodología Metodología general: Figura 3.-Diagrama de flujo general de la metodología. 26 1.1 Obtención y preparación de muestras Las muestras utilizadas fueron hojas de A. vera que primeramente fueron cortadas y lavadas con jabón y agua, después se retiró el exceso de agua de las hojas con papel absorbente. Posteriormente se procedió a retirar la corteza de las hojas evitando tocar los tricomas donde se encuentra la aloína. Se obtuvo el gel (parte cristalina y gelatinosa) en porciones de 100 g, que fueron pasteurizadas a 60 °C durante 30 min (Dominguez-Fernandez et al., 2012). 1.1.1 Obtención de muestras crudas En cuanto a la obtención de estas muestras adicionales, después de la pasteurización de bandejas de aluminio con las muestras de A. vera, fueron sometidas en un autoclave a 60, 80 y 100 °C por 30 min. Obteniendo las muestras A. vera húmedo 60, 80 y 100 °C, que después fueron procesadas en un triturador previamente desinfectado, para llegar a una concentración de 3x se tomó en cuenta el porcentaje de masa seca obtenido de las muestras A60, A80 y A100. Las muestras fueron guardadas en tubos tipo Falcon de 50 mL en refrigeración para su posterior uso (Dominguez-Fernandez et al., 2012). 1.1.2 Deshidratación de muestras Para llevar a cabo la deshidratación de las muestras, bandejas de aluminio con 100 g fueron colocadas en hornos eléctricos a 60, 80 y 100 ºC (A60, A80 y A100 respectivamente) para lograr su deshidratación total, hasta obtener un peso constante de cada una. Una vez deshidratadas fueron almacenadas en un lugar seco y oscuro hasta su uso para ensayos posteriores (Dominguez-Fernandez et al., 2012). A B 27 Figura 4.-Proceso previo a la deshidratación, donde A muestra el plantío de A. vera, en B se pueden observar las hojas cortadas y lavadas, mientras que el proceso de fileteo se observa en C y finalmente las bandejas con A. vera cortado en cubos (D). 1.1.3 Muestras deshidratadas e industriales Las muestras con las que se realizaron los posteriores ensayos fueron obtenidas a partir de A. vera como anteriormente se describió y muestras industriales descritas a continuación. Muestras obtenidas por deshidratación de A. vera: 60 °C (A60) 80 °C (A80) 100 °C (A100) Además de agregar 2 muestras de origen industrial, la primera de ellas tiene un alto contenido en fibra como lo describe López et al. (2017) y la segunda fue una muestra de A. vera liofilizada de origen comercial que a diferencia de ILF (100x) ésta se encuentra a una concentración de 200x y solo se sometió a un proceso de liofilización sin dar más detalles. ILF (alto nivel de fibra, deshidratada por belt-dry) ILL (bajo nivel de fibra, muestra comercial liofilizada) Figura 5.-Deshidratación de A. vera en horno eléctrico (A), mientras que en B se observa el homogeneizado del deshidratado obtenido utilizando un mortero. A C D B 28 1.2 Caracterización química de muestras deshidratadas e industriales La caracterización química fue realizada durante una estancia de 6 meses en la Universitat de les Illes Balears en España, en el departamento de Ingeniería Química con el Dr. Antoni Femenia Marroig responsable del Laboratorio de Ingeniería Agroalimentaria. Los objetivos incluidos en el plan de trabajo fueron los siguientes: Extraer los polisacáridos de cada muestra sometida a las diferentes temperaturas (A60, A80 y a100), así como las muestras industriales (ILF e ILL) y cuantificar los azúcares detectados por cromatografía de gases Análizar el grado de acetilación de los acemananos por resonancia magnética nuclear (RMN) de las muestras deshidratadas e industriales Para lograr y superar los objetivos fue necesario realizar las siguientes actividades: o Observar las muestras deshidratadas e industriales por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM por sus siglas en inglés) o Obtención del residuo insoluble en alcohol (AIR por sus siglas en inglés): Extracción de polisacáridos y fibra o Análisis de azúcares neutros (Cromatografía de gases) o Análisis de ácidos urónicos (Método espectrofotométrico) o Propiedades funcionales: Swelling, Water Retention Capacity, Fat Adsorption Capacity (Hinchamiento, Capacidad de retención de agua y adsorción de aceite) o FTIR (DME - grado de metil esterificación de los polisacáridos pécticos) o MNR (Determinación del grado de acetilación del acemanano) 1.3 Microscopía (SEM) La microscopía electrónica de barrido es una técnica de preparación y descripción de objetos vistos con un microscopio, con el fin de aportar información por medio de micrografías (González et al., 2014). Las muestras de A. vera fueron trituradas y colocadas en el disco de observación (2 mg aproximadamente), utilizando pegatinas especiales para fijarlas y la observación se llevó a cabo a 100 y 300X de aumento. Las muestras sometidas a observación por SEM fueron las muestras deshidratadas e industriales descritas en el apartado 1.1.3. Figura 6.-Disco con muestras para observación de SEM. 29 1.4 Obtención de residuo insoluble en alcohol (AIR) El objetivo de esta técnica es la extracción de azúcares y fibra de las muestras descritas en el apartado 1.1 utilizando la metodología (Owino et al., 2004; Viuda-Martos et al., 2015) que fue modificada en relación a la cantidad de fibra presente en las diferentes muestras. A continuación se describe la metodología que se llevó a cabo para obtener los AIRs: 1) Se pesaron 5 g de muestra (homogeneizada) y se transvasaron a un matraz Erlenmeyer, añadiendo 100 mL de etanol 85% (v/v). Se homogeneizó con un ultraturrax y se llevó a ebullición (para inactivar las enzimas). De nuevo se homogeneizó con ultraturrax y llevó a ebullición, se dejó enfriar y se filtró con papel Whatman GF-C (de fibra de vidrio). 2) La mezcla anterior (pasta que es el resultado de la fibra) se transvasó a otro matraz Erlenmeyer y de nuevo se añadió 100 mL de etanol al 85% (v/v). Volviendo a homogeneizar con ultraturrax y se llevó a ebullición, se dejó enfriar y se filtró con papel Whatman GF-C (de fibra de vidrio). 3) La pasta se transvasó a un matraz Erlenmeyer y se añadió 100 mL de etanol absoluto. Se repitió el proceso de homogeneizar con ultraturrax y se llevó a ebullición, para después dejar enfriar y filtrar nuevamente con papel Whatman GF- C (de fibra de vidrio). 4) Se lavó la pasta con acetona 2 ó 3 veces, utilizando un volumen aproximado al embudo Büchner para blanquearla (aproximadamente 10 mL). 5) La pasta se dejó secar en una campana de extracción durante 24 h. Para calcular el rendimiento se pesó y se redujo el tamaño de partícula con un molinillo, después se almacenó en frascos herméticos dentro de un desecador a temperatura ambiente. Figura 7.-Proceso para la obtención de AIR Después de someter las muestras originales al tratamiento para extraer el residuo insoluble de alcohol (AIR)
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