Identificação química e perspectiva medicinal de Magnolia pugana

•

Outros

Los Mejores Apuntes

27/10/2022

¡Este material tiene más páginas!

Entonces, ¿te gustó este material?

Ayude a animar a otros estudiantes a mejorar el contenido

¿Te gustó este material? ¡Compartir! 🧡

Ingeniería Civil

106.495 Materiales compartidos

Descarga la aplicación para disfrutar aún más

Lea materiales sin conexión, sin usar Internet. Además de muchas otras características!

Vista previa del material en texto

Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México
bibliotecadigital@redudg.udg.mx - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA
Coordinación de Bibliotecas
Biblioteca Digital

La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor
ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la
Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara,
esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos
que posteriormente quiera darle a la misma.
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Identificación química y
perspectiva medicinal de los aceites
esenciales de hojas, semillas y
flores de Magnolia pugana
Tesis
que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias en Biosistemática
y Manejo de Recursos Naturales y
Agrícolas
Presenta
Edison Antonio Osorio Muñoz
Zapopan, Jalisco Septiembre de 2020
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Identificación química y perspectiva
medicinal de los aceites esenciales de hojas,
semillas y flores de Magnolia pugana
Tesis
que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias en Biosistemática y Manejo
de Recursos Naturales y Agrícolas
Presenta
Edison Antonio Osorio Muñoz
DIRECTOR
Dr. Mario Alberto Ruíz López
Zapopan, Jalisco Septiembre de 2020
DECLARATORIA DE ORIGINALIDAD
A Quien Corresponda:
Por este conducto el (la) abajo firmante, autor(a) del Trabajo Recepcional
(Tesis) titulada: “Identificación química y perspectiva medicinal de los aceites
esenciales de hojas, semillas y flores de Magnolia pugana”, declaro que el
contenido del mismo constituye un documento inédito y original por lo que cumple
con los términos de originalidad a los que se hace mención en el Artículo 73 del
Reglamento General de Posgrado y el Artículo 147 Fracción I del Reglamento General
de Titulación de la Universidad de Guadalajara.
A T E N T A M E N T E
Zapopan, Jalisco, a 07 de septiembre de 2020
_____________________________________
Ing. Edison Antonio Osorio Muñoz
Código: 218901587

DEDICATORIA

A Dios por brindarme la salud, y fortaleza mental en todo momento durante mi
trabajo.

A mis Padres María Elena Muñoz Proaño y Edison Osorio Guzmán, mis Abuelitas
Emma Judith, Mercedes Leonor y Wilma Josefina por su apoyo, guía, y los buenos
valores que me han inculcado desde niño.

A Alexandra, gracias por acompañarme todos los días, brindarme tu amor,
motivarme, creer en mí y demostrar tu compromiso por estar juntos y afrontar
nuevos retos.

A mis hermanos, tíos y primos, por sus valiosas palabras de ánimo.

A todos mis seres queridos que me acompañan desde el Cielo Enrique†, Mamía†,
César†, Segundo†, gracias por todas sus enseñanzas y los hermosos momentos
vividos.

A “Panchito”, por ser la compañía de mi familia y guardián en casa.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por haberme
seleccionado y otorgado una beca de Estudios y manutención en México dentro del
programa de Maestría en Ciencias en Biosistemática y Manejo de Recursos Naturales
(BIMARENA) en la Universidad de Guadalajara.

A la Organización de Estados Americanos (OEA) y Banco Santander, por haberme
seleccionado y otorgado una beca de movilidad y ayuda como extranjero para
establecimiento de mis estudios.

A la Universidad de Guadalajara por el apoyo económico, bibliográfico, logístico,
investigativo y académico dentro de la Maestría BIMARENA.

A la Universidad Politécnica Salesiana por permitirme continuar con mi formación
profesional y haberme otorgado una licencia sin remuneración durante el tiempo que
demoró el programa.

Al Dr. Marco F. Cerna C. y al Dr. Hugo Cerda por ponerme en conocimiento y
establecer el contacto que me brindó la oportunidad de postular y concursar a través
de la Embajada de México en Quito-Ecuador y la Universidad de Guadalajara para
una plaza en el programa BIMARENA.

Al Departamento de Salud Pública, al Departamento de Botánica y Zoología y al
Departamento de Biología Celular y Molecular encabezados por la Dra. Delia
González, Dra. Jaqueline Reynoso y la Dra. Anne Santerre respectivamente, por
permitirme trabajar la parte experimental en sus diferentes laboratorios.

A los Doctores Mario Ruíz, Antonio Vázquez, Ramón Reynoso, Mario Noa, Elisa
Cabrera, Lucía Barrientos, Rosario Huizar, Paco Noriega, Rosa Romo, Gregorio
Nieves, Martha Escoto y Patricia Zarazúa por sus valiosos aportes y ayuda brindada
en mi formación académica y del desarrollo de esta investigación.

Al Laboratorio de Ciencias de la Vida de la Universidad Politécnica Salesiana en
Ecuador, encabezado por la M.Sc. Carina Hidalgo por todo el apoyo en ensayos de
desarrollo experimental de este trabajo.

i
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... iv
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................. vi
ÍNDICE DE FÓRMULAS ........................................................................................ viii
ÍNDICE DE ANEXOS ................................................................................................ ix
UNIDADES Y ABREVIATURAS ............................................................................. x
RESUMEN ................................................................................................................ xii
ABSTRACT ............................................................................................................. xiii
I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
II. MARCO TEÓRICO .................................................................................... 3
2.1. Medicina tradicional con plantas. .................................................................. 3
2.2. Generalidades de la Familia Magnoliaceae. .................................................. 3
2.3. Género Magnolia spp. .................................................................................... 5
2.3.1. Generalidades de las especies de Magnolia en México. ................................ 5
2.3.2. Magnolia pugana (Iltis & A. Vázquez) A. Vázquez & Carvajal. .................. 6
2.3.2.1. Descripción Taxonómica y Botánica. ............................................................ 7
2.4. Metabolitos secundarios................................................................................. 9
2.5. Aceites esenciales. ......................................................................................... 9
2.5.1. Función y localización en plantas. ............................................................... 10
2.5.2. Métodos de extracción. ................................................................................ 11
2.5.3. Composición química. ................................................................................. 12
2.5.3.1. Fenilpropanoides .......................................................................................... 12
2.5.3.2. Terpenos ....................................................................................................... 13
2.5.4. Quimiotipos en aceites esenciales. ............................................................... 15
2.6. Métodos de análisis cuali-cuantitativos de los componentes de un aceite
esencial. ........................................................................................................ 15
2.6.1. Cromatografía de capa fina. .........................................................................16
2.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. ..................... 17
2.7. Aplicaciones de aceites esenciales. .............................................................. 18
2.8. Actividad biológica de un aceite esencial. ................................................... 18
2.8.1. Actividad antioxidante. ................................................................................ 19
2.8.1.1. Ensayo con 2,2‐Difenil‐1‐Picrilhidracilo. .................................................. 20

ii
2.8.1.2. Ensayo con 2,2′‐Azinobis‐3‐Etilbenzotiazolina‐6‐Ácido Sulfónico. ....... 21
2.8.2. Actividad antibacteriana. ............................................................................. 21
2.8.2.1. Concentración Mínima Inhibitoria. .............................................................. 22
2.8.2.2. Tinción con Cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio. ......................................... 22
2.8.3. Actividad citotóxica. .................................................................................... 23
2.8.3.1. Tinción con Bromuro de Metiltiazolildifenil-tetrazolio. ............................. 24
2.9. Estudios de composición química y actividad biológica en Magnolia spp. 24
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................ 26
IV. HIPÓTESIS ................................................................................................ 27
V. OBJETIVOS ............................................................................................... 27
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................. 28
6.1. Diseño experimental. ................................................................................... 28
6.2. Lugar de estudio y recolección del material vegetal. ................................... 28
6.3. Extracción de los aceites esenciales de M. pugana mediante
hidrodestilación. ........................................................................................... 29
6.4. Pruebas generales y organolépticas de los aceites esenciales de M.
pugana.......................................................................................................... 31
6.5. Caracterización química de los aceites esenciales mediante GC-MS. ......... 32
6.6. Determinación de la actividad antioxidante. ................................................ 34
6.6.1. Autografía de la actividad antioxidante mediante HPTLC. ......................... 39
6.7. Determinación de la actividad antibacteriana. ............................................. 41
6.7.1. Bioautografía de la actividad antibacteriana mediante TLC........................ 45
6.8. Determinación de la actividad citotóxica. .................................................... 46
6.8.1. Establecimiento de Cultivos celulares. ........................................................ 47
6.8.2. Ensayo de actividad citotóxica..................................................................... 49
6.8.3. Análisis estadístico....................................................................................... 52
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 53
7.1. Propiedades de los aceites esenciales de M. pugana. .................................. 53
7.1.1. Cuantificación y caracterización química de los aceites esenciales mediante
GC-MS. ........................................................................................................ 54
7.2. Determinación de la actividad antioxidante. ................................................ 66
7.2.1. Autografía de la actividad antioxidante mediante HPTLC-GC/MS. ........... 72
7.3. Determinación de la actividad antibacteriana. ............................................. 74

iii
7.3.1. Bioautografía de la actividad antibacteriana mediante TLC........................ 79
7.4. Determinación de la actividad citotóxica. .................................................... 81
VIII. CONCLUSIONES...................................................................................... 91
IX. LITERATURA CITADA .......................................................................... 93
X. ANEXOS ................................................................................................... 110

iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de la familia Magnoliaceae en el mundo. ............................. 4
Figura 2. Reconocimientos a la Dra. Luz María Villareal de Puga. ......................... 7
Figura 3. Morfología de fruto, hoja y flor de Magnolia pugana. ............................. 8
Figura 4. Metabolitos primarios y secundarios en plantas. ...................................... 9
Figura 5. Localización de los aceites esenciales en plantas. ................................... 10
Figura 6. Proceso de Hidrodestilación empleando una trampa de Clevenger. ....... 12
Figura 7. Síntesis de Fenilpropanoides a partir de Ácido cinámico y Ácido p-
cumárico. ................................................................................................. 13
Figura 8. Síntesis de Terpenos a partir de Ácido Mevalónico. ............................... 14
Figura 9. Consideraciones acerca de un quimiotipo. .............................................. 15
Figura 10. Cromatografía de Capa Fina (TLC) de un aceite esencial y resultados con
reveladores específicos. ........................................................................... 16
Figura 11. Equipo de cromatografía de gases acoplado a espectrómetro de masas
GC-MS. ................................................................................................... 17
Figura 12. Prospección de aplicaciones con aceites esenciales. ............................... 18
Figura 13. Estructura de radical DPPH· y reducción en presencia de antioxidante. 20
Figura 14. Estructura de radical ABTS•+ y reducción en presencia de antioxidante. ..
................................................................................................................. 21
Figura 15. Estructura del TTC y reducción a formazán. .......................................... 23
Figura 16. Estructura del MTT y reducción a formazán. ......................................... 24
Figura 17. Diseño experimental del estudio. ............................................................ 28
Figura 18. Lugar de Estudio y recolección de material vegetal. .............................. 29
Figura 19. Extracción de aceite esencial por el método de hidrodestilación. ........... 30
Figura 20. Determinación de Parámetros físico-químicos de aceites esenciales. ..... 31
Figura 21. Análisis de Aceite esencial por GC-MS. ................................................. 33
Figura 22. Ensayo de Actividad Antioxidante con el radical DPPH·....................... 37
Figura 23. Ensayo de Actividad Antioxidante con el radical ABTS·+. .................... 38
Figura 24. Preparación, elución y revelado de compuestos en aceites esenciales en
TLC. ........................................................................................................ 39
Figura 25. Autografía de actividad antioxidante empleando HPTLC/GC-MS. ....... 40

v
Figura 26. Activación y establecimiento de cultivos e inóculos para ensayo de
microdilución en microplaca. .................................................................. 43
Figura 27. Ensayo de Microdilución y titulación con TTC. ..................................... 44
Figura 28. Bioautografía directa de actividad antibacteriana por TLC-DB. ............ 46
Figura 29. Establecimiento de cultivo inicial de líneas celulares. ............................ 48
Figura 30. Ensayo de actividad citotóxica: Preparación de placas. .......................... 50
Figura 31.Ensayo de actividad citotóxica: Adición de MTT. .................................. 51
Figura 32. Perfiles cromatográficos de los aceites esenciales de M. pugana. .......... 55
Figura 33. Representación gráfica de los valores de CI50 de los aceites esenciales. 68
Figura 34. Ensayo autográfico de actividad antioxidante en HPTLC con los aceites
esenciales de M. pugana.......................................................................... 72
Figura 35. Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) de los Aceites esenciales de
M. pugana................................................................................................ 75
Figura 36. Bioautografía Directa-TLC de los AEs de M. pugana frente a E. coli. .. 79
Figura 37. Bioautografía Directa-TLC de los AEs de M. pugana frente a S. aureus. ..
................................................................................................................. 80
Figura 38. Citotoxicidad de los Aceites esenciales de M. pugana y Ciclofosfamida
sobre la línea celular MCF-7 (Adenocarcinoma de mama). ................... 82
Figura 39. Citotoxicidad de los Aceites esenciales de M. pugana sobre la línea
celular HT-29 (Adenocarcinoma de colon). ............................................ 83
Figura 40. Representación de la Concentración Inhibitoria (CI50) de los aceites
esenciales y control frente a las líneas celulares MCF-7 y HT-29. ......... 85

vi
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de M. pugana. ................................................ 7
Cuadro 2. Principales métodos de extracción de aceites esenciales: ventajas y
desventajas. ........................................................................................... 11
Cuadro 3. Clasificación de Terpenos según el número de carbonos. .................... 14
Cuadro 4. Lugares y fechas de colecta de las partes vegetales de M. pugana. ..... 29
Cuadro 5. Programa de Temperatura para Análisis en GC-MS. ........................... 32
Cuadro 6. Preparación de aceites esenciales y concentraciones para ensayo de
actividad antioxidante con DPPH. ........................................................ 35
Cuadro 7. Preparación de aceites esenciales y concentraciones para ensayo de
actividad antioxidante con ABTS·+. ..................................................... 36
Cuadro 8. Preparación de aceites esenciales y concentraciones para ensayo de
actividad antibacteriana. ....................................................................... 42
Cuadro 9. Requerimientos para el cultivo de líneas celulares. .............................. 47
Cuadro 10. Preparación de aceites esenciales y concentraciones para ensayo de
actividad citotóxica. .............................................................................. 49
Cuadro 11. Características de los aceites esenciales de M. pugana. ....................... 54
Cuadro 12. Composición química del aceite esencial de hojas de Magnolia pugana
analizado por GC/MS. .......................................................................... 57
Cuadro 13. Composición química del aceite esencial de semillas de Magnolia
pugana analizado por GC/MS. ............................................................. 59
Cuadro 14. Composición química del aceite esencial de flores de Magnolia pugana
analizado por GC/MS. .......................................................................... 62
Cuadro 15. Similaridades de los Aceites esenciales de M. pugana basada en la
presencia de compuestos identificados. ................................................ 65
Cuadro 16. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre los compuestos
químicos identificados en los aceites esenciales de M. pugana. .......... 66
Cuadro 17. Actividad antioxidante de los aceites esenciales de M. pugana frente a
radicales libres DPPH y ABTS. ............................................................ 67
Cuadro 18. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre tratamientos para
evaluación de la actividad antioxidante con el radical DPPH. ............. 69

vii
Cuadro 19. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre tratamientos para
evaluación de la actividad antioxidante con el radical ABTS. ............. 70
Cuadro 20. Fracciones antioxidantes activas de los aceites esenciales de M. pugana
aisladas del ensayo autográfico. ............................................................ 73
Cuadro 21. Concentraciones mínimas inhibitorias de los aceites esenciales frente a
bacterias patógenas. .............................................................................. 74
Cuadro 22. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre tratamientos para
evaluación de la actividad antibacteriana. ............................................ 76
Cuadro 23. Fracciones antibacterianas activas en los aceites esenciales de M.
pugana localizados en TLC. ................................................................. 80
Cuadro 24. Actividad citotóxica de los aceites esenciales de M. pugana frente a las
líneas celulares MCF-7 y HT-29. ......................................................... 84
Cuadro 25. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre tratamientos en la
evaluación de la actividad citotóxica con la línea celular MCF-7. ....... 86
Cuadro 26. Análisis de varianza y comparaciones múltiples entre tratamientos en la
evaluación de la actividad citotóxica con la línea celular HT-29. ........ 87

viii
ÍNDICE DE FÓRMULAS
Fórmula 1. Cálculo de Porcentaje de Rendimiento de Aceites esenciales. ............. 31
Fórmula 2. Cálculo del Índice de Retención Aritmético de los componentes de un
aceite esencial empleando una programación de temperatura en GC... 33
Fórmula 3. Cálculo del porcentaje de inhibición de los radicales DPPH o ABTS. 39
Fórmula 4. Cálculo de Rf en TLC. .......................................................................... 40
Fórmula 5. Porcentaje de viabilidad celular. ........................................................... 52

ix
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Distribución por país de especies de Magnoliaceae. ........................ 110
ANEXO 2. Ejemplos de estudios de composición química y actividad biológica
en Magnolia spp. .............................................................................. 112
ANEXO 3. Serie de referencia de alcanos para determinación de índices de
retención aritméticos. ....................................................................... 115
ANEXO 4. Ficha técnica de Butilhidroxi-Tolueno (BHT). ................................ 116
ANEXO 5. Perfil cromatográfico de muestra de Aceite esencial de Thymus
vulgaris. ............................................................................................ 117
ANEXO 6. Fichas técnicas de cepas bacterianas utilizadas. ............................... 118
ANEXO 7. Ficha técnica de Antibiótico Ampicilina. ......................................... 125
ANEXO 8. Fichas técnicas de líneas celulares utilizadas. .................................. 126
ANEXO 9. Perfiles cromatográficos de los Aceites Esenciales de hojas, semillas y
flores de M. pugana .......................................................................... 132
ANEXO 10. Compuestos mayoritarios en los aceites esenciales de M. pugana. . 135
ANEXO 11. Mapa de Calor de Presencia de compuestos químicos en los aceites
esenciales de M. pugana. .................................................................. 138
ANEXO 12. Mapa de Calor del porcentaje total de componentes químicos de los
aceites esenciales de M. pugana. ...................................................... 139
ANEXO 13. Plot de carga en componentesprincipales de los Aceites esenciales de
M. pugana. ........................................................................................ 140
ANEXO 14. Porcentaje de inhibición de radical DPPH. ...................................... 141
ANEXO 15. Porcentaje de inhibición de radical ABTS. ...................................... 142

x
UNIDADES Y ABREVIATURAS

% v/v: Porcentaje volumen/volumen
g/mL: Microgramos por mililitro
L/mL: Microgramo por mililitro
°C: Grados centígrados
ABTS: 2,2′‐azinobis‐3‐etilbenzotiazolina‐6‐ácido sulfónico
AE: Aceite esencial
AEs: Aceites esenciales
BHT: Butil hidroxi tolueno
CI50: Concentración inhibitoria media (=IC50)
CLSI: Clinical and Laboratory Standar Institute (Instituto de Estándares
Clínicos y de Laboratorio)
CMI: Concentración mínima inhibitoria (=MIC)
DAP: Diámetro normal a la altura del pecho
DMEM: Dubelco’s Modified Eagle Medium (Medio Eagle Modificado de
Dubelco)
DMSO: Dimetilsufóxido
DPPH: 2,2‐difenil‐1‐picrilhidracilo
EO: Essential oil
EOs: Essential oils
g: Gramos
GC-MS: Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (Cromatografía
de Gas acoplada a Espectrometría de Masas)
H: Hora
HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography (Cromatografía de
Capa Fina de Alta Eficiencia)
L: Litros
LSD: Diferencia mínima significativa
m/z Relación masa/carga
mg/mL: Miligramos por mililitro
MHB: Muller Hinton Broth (Caldo Muller Hinton)
MpugF: Aceite esencial de flores de M. pugana

xi
MpugH: Aceite esencial de hojas de M. pugana
MpugS: Aceite esencial de semillas de M. pugana
MTT: Bromuro de Metiltiazolildifenil-tetrazolio
PVDF: Fluoruro de polivinilideno
TLC: Thin Layer Chromatography (Cromatografía de capa fina)
TSA: Tripticase soy agar (Agar de tripticasa de soya)
TSB: Tripticase soy broth (Caldo de tripticasa de soya)
TTC: Cloruro de trifeniltetrazolio
Tvul: Aceite esencial de T. vulgaris
UFC: Unit Forming Colony (Unidad formadora de colonia)
USD: United States Dollar (Dólar de Estados Unidos)

xii
RESUMEN

El objetivo de este estudio fue describir por primera vez los aceites esenciales (AEs)
extraídos de hojas, flores y semillas de Magnolia pugana (Magnoliaceae), una especie
endémica mexicana, y probar sus propiedades antioxidantes, antibacterianas y
citotóxicas in vitro. Los AEs extraídos se caracterizaron por cromatografía de gases-
espectrometría de masas (GC-MS). La actividad antioxidante se evaluó mediante
ensayos de los radicales libres 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•) y 2,2'-azino-bis
(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS•). La actividad antibacteriana se
determinó mediante la concentración mínima inhibitoria empleando el método de
microdilución frente a bacterias patógenas humanas. La actividad antioxidante y
antibacteriana fueron complementadas con un patrón de detección autográfico
mediante cromatografía de capa fina. Adicionalmente, se evaluó la actividad citotóxica
contra las líneas celulares MCF-7 (adenocarcinoma de mama) y HT-29
(adenocarcinoma de colon). Los resultados mostraron la presencia de ciclocolorenona
(38-40%) como el componente más notable y en común entre las partes vegetales
estudiadas. En los ensayos antioxidantes se obtuvieron los valores CI50 más bajos para
DPPH• (21.5 mg/mL: AE semillas) y para ABTS• (9.04 mg/mL: AE flores). La
actividad antibacteriana más fuerte se evidenció frente a bacterias Gram-positivas, con
los valores más bajos sobre S. epidermidis CMI (355.11 µg/mL: AE semillas) y S.
aureus CMI (710.23 µg/mL: AEs semillas y flores). La actividad citotóxica evidenció
un comportamiento selectivo y de dosis-respuesta sobre la línea celular MCF-7, con
una CI50 (27.25 µg/mL: AE hojas), mientras que contra la línea celular HT-29 la CI50
fue (54.01 µg/mL: AE de semillas). El análisis químico y las investigaciones in vitro
permitieron concluir que los AEs de M. pugana tienen una composición rica en
sesquiterpenos y que pueden ser una fuente prometedora de agentes antibacterianos y
citotóxicos, pero también con potencial antioxidante destacando el extraído de semillas
considerando su alto rendimiento.

Palabras clave:
Aceites esenciales, Magnolia pugana, caracterización química, detección autográfica,
actividades biológicas.

xiii
ABSTRACT

This study was aimed to describe for the first time the essential oils (EOs) extracted
from the leaves, flowers and seeds of Magnolia pugana (Magnoliaceae), a Mexican
endemic specie, and to test its antioxidant, antibacterial and cytotoxic properties in
vitro. The extracted EOs were characterized by gas chromatography-mass
spectrometry (GC-MS). Antioxidant activity was evaluated by testing the free radicals
2,2-diphenyl-1-picrilhydrazyl (DPPH•) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonic acid) (ABTS•). Antibacterial activity was determined by the minimum
inhibitory concentration using the microdillution method against human pathogenic
bacteria. Antioxidant and antibacterial activity were complemented with an
autographic screening pattern by thin layer chromatography. Additionally, cytotoxic
activity against MCF-7 (breast adenocarcinoma) and HT-29 (colon adenocarcinoma)
cell lines was evaluated. Results showed the presence of cyclocolorenone (38-40%) as
the most notable component and in common among the studied plant parts. The lowest
IC50 values obtained in the antioxidant tests were DPPH• (21.5 mg/mL: seeds EO)
and ABTS• (9.04 mg/mL: flowers EO). The strongest antibacterial activity was
observed against Gram-positive bacteria, with the lowest values on S. epidermidis MIC
(355.11 µg/mL: seeds EO) and S. aureus MIC (710.23 µg/mL: seeds and flowers EOs).
Cytotoxic activity test evidenced a selective and dose-response behavior on the MCF-
7 cell line, with an IC50 (27.25 µg/mL: leaves EO), while against the HT-29 cell line
the IC50 was (54.01 µg/mL: seeds EO). The chemical analysis and in vitro
investigations allowed concluding that the EOs of M. pugana have a composition rich
in sesquiterpenes therefore they can be a promising source of antibacterial and
cytotoxic agents, but also with antioxidant potential, highlighting the one extracted
from seeds considering its yield.

Keywords:
Essential oils, Magnolia pugana, chemical characterization, autographic detection,
biological activities.

I. INTRODUCCIÓN

Magnoliaceae según Vázquez-García et al., (2015) es una familia representativa del
bosque mesófilo de montaña; con carácter caducifolio, siempreverde y de gran
importancia en la botánica por su rol clave en la formación de los conceptos básicos
acerca de las flores primitivas (Pérez, 2015; Rivers et al., 2016). En esta familia, el
género Magnolia sobresale por ser el más representativo en número de especies
reportadas, a las cuales, sumadas la belleza de sus flores, el uso de sus maderas y la
presencia de compuestos potencialmente medicinales, las han convertido en un recurso
apreciado por los países de origen (Carranza, 2014; Serna y Guzmán, 2010). Al
respecto, Sarker y Maruyama (2002), señalan por ejemplo que especies como M.
officinalis, M. obovata y M. biondii desempeñan un papel importante como materia
prima de la medicina tradicional China y Japonesa, debido a la versatilidad de
propiedades medicinales evidenciadas ahora también con estudios experimentales que
incluyen la extracción de sus aceites esenciales.

Desde un punto de vista químico los aceites esenciales son metabolitos secundarios de
las plantas, constituidos por una mezcla compleja de compuestos fenólicos y
terpénicos que forman una matriz lipofílica, volátil y aromática, almacenada en
glándulas o células especializadas en raíces, cortezas, hojas, flores, frutas y semillas(Aljaafari et al., 2019; Pergentino de Sousa, 2015; Ribeiro y Simões, 2019). Las clases
de compuestos químicos aquí presentes les confieren actividades biológicas
generalmente antioxidantes, antimicrobianas, antiinflamatorias, antivirales,
antimutagénicas y anticancerígenas (Morsy, 2017; Saidi, 2014). Por esta razón los
aceites esenciales según Zheng et al. (2016), son una fuente natural con importante
potencial para el uso en las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria.

En un contexto particular, el territorio mexicano es uno de los puntos calientes más
importantes de biodiversidad y de conocimiento cultural, en el cual según Dahua
(2018), se estima que vivan aproximadamente el 11% de las especies del género
Magnolia a nivel mundial, corroborando lo señalado por Vázquez-García et al. (2015),
acerca de que en México el número de especies reconocidas se ha incrementado de
tres a cinco veces en la última década. No obstante, aunque se han realizado varios

estudios morfológicos y taxonómicos de las especies encontradas es necesario
complementarlos desde una perspectiva fitoquímica que permita incidir en el hallazgo
de moléculas bioactivas. Entre este grupo de especies se encuentra Magnolia pugana,
una especie endémica ubicada en el Oeste de México y restringida a pequeñas
poblaciones presentes mayoritariamente entre la zona centro-norte de Jalisco y
Zacatecas, que ha sido diferenciada de M. pacifica como especie desde 2002 basándose
en las evidencias morfológicas encontradas (Carranza, 2014; Jacobo-Pereira et al.,
2016).

Con estos argumentos, se realizó por primera vez la caracterización química y ensayos
in vitro de actividad biológica antioxidante, antibacteriana y citotóxica con los aceites
esenciales de hojas, semillas y flores de Magnolia pugana obtenidas en una zona
delimitada dentro de Jalisco, México.

II. MARCO TEÓRICO
2.1. Medicina tradicional con plantas.
La medicina tradicional es el conocimiento, habilidades y prácticas basadas en las
teorías, creencias y experiencias utilizadas en el mantenimiento de la salud y en la
prevención, diagnóstico, mejora y tratamiento de enfermedades físicas y mentales
(Benzie y Wachtel-Galor, 2011). Sin embargo, según Moncayo y Noriega (2020),
actualmente el conocimiento tradicional sobre el uso de plantas medicinales es objeto
de observación por parte de la comunidad científica enfocada a los compuestos activos
y su estructura química ya que es una manera en la cual los investigadores validan
estos conocimientos mediante un fundamento o técnica exploratoria. El término de
planta medicinal hace referencia a plantas que son una fuente rica en compuestos que
pueden ser empleados para desarrollar síntesis de drogas (Jamshidi-Kia et al., 2018).
En este aspecto la familia Magnoliaceae ha sido utilizada en la medicina tradicional
oriental donde sobresalen las especies Magnolia officinalis y Magnolia obovata
(Sarker y Maruyama, 2002), y en América existen precedentes de usos vinculados a
las comunidades indígenas de Mesoamérica hacia el siglo XVI, como lo asevera
Waizel-Bucay (2002), donde el conocimiento tradicional de Magnolia mexicana
(Yoloxochitl) están orientadas a curar afecciones del corazón, dolor de estómago o
como tranquilizante en el alivio de condiciones psicológicas, para lo cual se emplean
cortezas, flores, semillas y hojas de esta especie.
2.2. Generalidades de la Familia Magnoliaceae.
La familia Magnoliaceae es uno de los grupos más antiguos de las angiospermas que
tuvo su origen durante el Cretácico Tardío hace aproximadamente 100–113 millones
de años (Dahua, 2018). Una información interesante es la mostrada por Hebda e Irving
(2013) en donde por análisis moleculares sugieren tuvo su origen en América del Norte
en el Cretácico Tardío y durante el Eoceno se extendió hacia el Este primero en Europa
y luego por Asia, terminando por extinguirse en Europa durante el Cenozoico medio
por el enfriamiento global dividiendo las poblaciones en dos grupos la norteamericana
y la asiática; posteriormente durante el Cenozoico tardío en ambos continentes se dio
una migración hacia el Sur llegando a América Central, América del Sur y el Sudeste
de Asia respectivamente, tal como se puede apreciar en la Figura 1, en estos hábitats
se han diversificado con las condiciones ambientales. Corroborando lo expuesto por

Sarker y Maruyama (2002), quienes mencionan que la mayoría de especies (80%), se
distribuyen en el sudeste asiático desde los Himalayas hacia el este hasta Japón y hacia
el sureste a través del Archipiélago Malayo, el 20% restante se encuentra en América,
desde el sudeste norteamericano a través de América tropical hasta Brasil. Según
Rivers et al., (2016) los países con mayor número de especies son China 20.2%,
Vietnam 8.7%, Colombia 6.3%, México 5.8% e Indonesia 5.4% como se observa en
el Anexo 1.

Figura 1. Distribución de la familia Magnoliaceae en el mundo.

Fuente: Stevens, 2017.

La familia como tal fue nombrada en honor a Pierre Magnol, profesor de botánica y
medicina en Montpelier (1638-1715), con especies correspondientes a árboles siempre
verdes y caducifolios que crecen en las zonas tropicales y en los que sobresalen las
vistosas flores terminales, bisexuales, actinomórficas, con numerosos tépalos,
estambres y carpelos, todos ellos dispuestos en forma espiral sobre un eje alargado
(Pérez, 2015; Rivers et al., 2016; Sarker y Maruyama, 2002). Esta familia según el
sitio “The Plant List: A working list of all plant species” (2013), abarca los géneros
Champaca, Dugandiodendron, Liriodendron, Magnolia, Manglietia, Michelia,
Sphaerostema, Talauma y Yulania; estimándose a nivel mundial aproximadamente
354 especies de Magnoliaceae. En el neotrópico la riqueza y el endemismo de
Magnoliaceae como indica Vázquez et al., (2019) ha resultado mucho mayor de lo
esperado; ahora se conocen cerca del doble de las especies neotropicales reportadas en
2007; con ello la proporción de Magnoliaceae entre Asia y el continente Americano se
ha incrementado de un 33% a un 49% . Como especies silvestres estas plantas también

son apreciadas y usadas para madera y medicinas por comunidades locales, así como
en el comercio internacional (Rivers et al., 2016).
2.3. Género Magnolia spp.
Se trata del género más diverso de Magnoliaceae con más de 240 especies, este se
subdivide en tres subgéneros: Magnolia, Yulania y Gynopodium (Carranza, 2014). Los
países que presentan mayor riqueza de especies son China, 100 spp., Vietnam, 60 spp.,
México, 40 spp., Colombia, 35 spp., Ecuador, 23 spp. y otros países con menor
diversidad son Costa Rica, Honduras, Venezuela, Brasil (Dahua, 2018). Según
Vázquez-García et al., (2015) las especies de Magnolia del Neotrópico en América
son en su mayoría alopátricas, endémicas y extremadamente raras, por lo que ante la
elevada tasa de deforestación y el enorme impacto de las explotaciones mineras un alto
porcentaje de especies se encuentran en riesgo de extinción.
2.3.1. Generalidades de las especies de Magnolia en México.
México, contiene una inmensa diversidad natural y también es hogar de un enorme
capital cultural, con aproximadamente 60 diferentes culturas vivas con sabiduría
etnobotánica ancestral de las propiedades de plantas (Calbo-Irabien, 2018). Según
indica Dahua (2018), en México, las Magnolias representan el 11 % de las especies a
nivel mundial y se encuentran distribuidas mayoritariamente en los estados de Oaxaca,
Veracruz, Chiapas y Jalisco. La primera descripción publicada de una especie de
Magnolia en el Neotrópico y en el continente americano es la de Magnolia dealbata
Zucc., bajo el nombre de “Eloxóchitl”, la cual fue descrita e ilustrada por Hernández,
(1951) en su obra Rerum Medicarum Novae Hispaniae Thesaurus, durantela Primera
Expedición a la “Nueva España” (México). Sin embargo, la importancia de las
Magnolias en el neotrópico está documentada antes, por ejemplo, según Vázquez-
García et al. (2015) y Waizel-Bucay (2002), Moctezuma, el emperador Azteca, con la
finalidad de construir un jardín medicinal y de recreación en Oaxtepec, Morelos,
México ordenó a su gobernador Pinotl, traer de la costa oriental al altiplano central el
“Yoloxochitl“, Magnolia mexicana DC., del Náhuatl yolo (corazón) y xochitl (flor),
siendo este uno de los árboles ornamentales más apreciados por su apariencia y las
propiedades aromáticas-mágicas que le atribuían. En la actualidad en México el género
abarca 36 especies de las cuales un 94 % son endémicas y con una restringida
distribución geográfica (Rodríguez-Ramírez et al., 2020), este número de especies

catalogadas ha aumentado con más investigaciones en campo; ejemplos recientes son
Magnolia yajlachhi, “la flor del corazón”, catalogada como una nueva especie de árbol
nodriza y de relevancia medicinal y ceremonial en la cultura Zapoteca en la Sierra
Norte del Estado de Oaxaca (Domínguez-Yescas y Vázquez, 2019); Magnolia
rzedowskiana (Vázquez-García et al., 2015), conocida como “flor de mayo”, endémica
del bosque de niebla de la porción central de la sierra Madre Oriental de México, sus
poblaciones naturales están restringidas a los Estados de Hidalgo, Querétaro, San Luis
Potosí y Veracruz (Gutiérrez-Lozano et al., 2020). En el Estado de Jalisco se han
reportado seis especies: M. pugana, M. pacifica, M. vallartensis, M. iltisiana, M.
jaliscana y M. ofeliae; además Dahua, (2018) menciona que estas especies prosperan
favorablemente en el bosque mesófilo de montaña y al considerarse especies
endémicas son indicadores de la conservación de este ecosistema.
2.3.2. Magnolia pugana (Iltis & A. Vázquez) A. Vázquez & Carvajal.
La disponibilidad de mayor cantidad de frutos maduros procedentes de poblaciones
representativas de la costa norte y del centro de Jalisco, aunado a exploraciones
adicionales en hábitats potenciales permitió reconocer y confirmar una discontinuidad
morfológica, ecológica y geográfica entre Magnolia pacifica subs. pacifica y
Magnolia pacifica subs. pugana, por lo que según Vázquez et al. (2002), esta última
se propuso como una especie independiente, siendo tan solo los caracteres del número
de carpelos por fruto y número de estambres por flor los que permiten separarla con
claridad. La especie lleva su nombre en honor a Luz María Villarreal de Puga, eximia
profesora y exploradora botánica del Instituto de Botánica de la Universidad de
Guadalajara (Figura 2). Esta especie es endémica del occidente de México y está
actualmente restringida a pequeñas poblaciones locales donde se distribuye en bosques
de galería en las barrancas del sur de Zacatecas y del centro-norte de Jalisco donde es
utilizada principalmente para la elaboración de muebles y como combustible
(Carranza, 2014; Jacobo-Pereira et al., 2016). Además, tiene un muy pequeño tamaño
de población, de cualquier manera, como no se conoce el número de individuos
maduros, es clasificada como: en peligro basándose en la extensión de ocurrencia de
2460 Km2, el área de ocupación de 114 Km2 y la ocurrencia en dos localizaciones en
Jalisco y Zacatecas (Rivers et al., 2016). Otro datos de importante interés son los
resultados mostrados por Dahua (2018), en donde se describió la estacionalidad de las

fenofases en las que se muestra la foliación continua sin estacionalidad; la floración
discontinua con estacionalidad alta y máxima en el mes de junio y la fructificación
pese a que fue continua se observó una estacionalidad alta y máxima en febrero.

Figura 2. Reconocimientos a la Dra. Luz María Villareal de Puga.
(a. Monumento a la Dra. Luz María Villareal de Puga. b. Ilustración artística de Magnolia
pugana en las afueras del Herbario Luz María Villareal de Puga del Instituto de Botánica
de la Universidad de Guadalajara (IBUG)).

2.3.2.1. Descripción Taxonómica y Botánica.
La clasificación de la especie se detalla a continuación en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de M. pugana.
Reino Plantae
Phylum Tracheophyta
Clase Magnolipsida
Orden Magnoliales
Familia Magnoliaceae
Género Magnolia
Especie pugana

Fuente: GBIF Backbone Taxonomy, 2017.

La descripción morfológica de la especie tomada de Vázquez et al., (2002)
corresponde a las siguientes características:
“Tipo: Árboles hasta de 20 m de altura, hasta de 150 cm de DAP; con las
primeras ramas de 2-15 m del suelo; ramillas esencialmente glabras, corteza rugosa 1–
2 cm de grosor, gris oscuro a castaño. Hojas coriáceas, angostamente oblongas o
lanceoladas a angostamente elípticas, 12–22 × 2.5–8 cm; agudas a obtusas en el ápice,

cuneadas en la base; estipulas lineares de 4.5–7 × 3–6(8)cm de ancho, pálido seríceas
en el exterior, con nervaduras reticuladas; pecíolos canaliculados, de 1–1.5(3) cm de
largo, glabros o rara vez pubescentes, flores con botones, ovoides a oblongoides;
brácteas 2–3, la superior espatácea de 4–6.5 × 1.5–2 cm; la bráctea inferior (pérula)
dehiscente, 1.5–2 × 6–9 mm, densamente pálida-velutina. Flores abiertas 9–15 cm en
diámetro, blancas; pedúnculos glabros, 3.5 × 3.5–6 mm, consiste de dos entrenudos,
0.5–1.5 mm de largo, el menor de 33 mm de largo; sépalos, 3, obovadas-oblongos,
cóncavos, 3–7 × 2–3.5 cm, verdosos en el exterior, blancos o color crema en el interior,
glabros en ambas caras; pétalos 6 a 7, anchamente obovados, abruptamente atenuados
hacia su delgado pecíolo, los exteriores 5–7 × 2.5–5.5 cm, los interiores 3–5.5 × 1–4
cm, blancos, glabros en ambas caras; estambres 92–104, 8–12 × 1–2 mm, las anteras
acuminadas a cuspidadas en el ápice, color crema; gineceo oblongoide-elipsoide,
verde, glabro; estilos encorvados, 2–3 mm de largo, verdosos, con papilas estigmáticas
inconspicuas. Frutos de tipo polifolículos oblongoides, glabros, con 25–35 folículos,
estos, cuando están maduro y abiertos, con lóculos ovales casi redondos, un poco más
largos que anchos, algunos tenidos de color rojizo. Semillas primaticas triangulares,
subcilindricas o rotundo comprimidas de 9–12 × 7–8 mm, con sarcotesta de color rojo
escarlata”. En la Figura 3 se aprecian las estructuras de fruto, hojas y flores de esta
especie.

Figura 3. Morfología de fruto, hoja y flor de Magnolia pugana.
(a. Fruto abierto. b. Hoja madura, c. Flor).

2.4. Metabolitos secundarios.
Los metabolitos secundarios son productos sintetizados por plantas los cuales ayudan
en su crecimiento y desarrollo pero que no son esenciales, como se muestra en la
Figura 4. El metabolismo secundario juega un importante rol en el mantenimiento para
que todos los sistemas de plantas trabajen adecuadamente y vuelven a las plantas
tolerantes contra el estrés abiótico y biótico (Siddiqui y Prasad, 2017). Estos
metabolitos como menciona Waksmundzka-Hajnos et al., (2008), tienen una limitada
distribución en los reinos animal, vegetal y fúngico y aunque aún no está
completamente descifrados los beneficios que estos compuestos le aportan a la planta;
en la mayoría de casos lo hacen como agentes anti-alimentarios, inhibidores de
crecimiento o germinación de plantas vecinas, adaptación a los efectos de la radiación
UV y la inhibición de microorganismos. Los metabolitos secundarios se clasifican en
productos nitrogenados, productos fenólicos y terpenos (Sierra et al., 2018).

Figura 4. Metabolitos primarios y secundarios en plantas.
Fuente: Bagher Hashemi et al., 2017; Rai et al., 2017.
2.5. Aceites esenciales.
La designación de aceite esencial como tal se origina desde la era de Aristóteles debido
a la idea de los elementos esenciales para la vida: fuego, aire, tierra y agua. En este
caso el quinto elemento era considerado ser elalma o espíritu de la vida (Bagher

Hashemi et al., 2017). Se los conoce también como esencias, aceites volátiles, aceites
etéricos o aeteróleo; y son productos naturales complejos formados por compuestos
volátiles aislados por métodos físicos de una planta entera o una parte de la cual se
sabe su origen (Can Baser y Buchbauer, 2009; Pergentino de Sousa, 2015). De acuerdo
a la Organización Internacional de Estandarización en la Norma 9235 (ISO, 2013) y
la Farmacopea Europea en la Norma 2098 (European Council, 2013), ambas en
vigencia, coinciden en que un aceite esencial es definido como “el producto oloroso,
usualmente de composición compleja, obtenido de materia prima natural y de origen
vegetal por medio de destilación con vapor (hidrodestilación o vapor directo) o por un
adecuado proceso mecánico del epicarpio en cítricos o por destilación seca”.
2.5.1. Función y localización en plantas.
En la naturaleza los aceites esenciales son muy importantes y están involucrados en la
defensa contra microorganismos, insectos y herbívoros, atracción de insectos
polinizadores y animales dispersantes de frutos, regulación de agua e interacciones
alelopáticas (Pergentino de Sousa, 2015). Los aceites esenciales se producen mediante
dos tipos de glándulas secretoras: aquellas localizadas en la superficie de la planta
(secreción exógena) y aquellas localizadas en los tejidos internos (secreción endógena)
y representan menos del 5% de la materia vegetal seca (Asbahani et al., 2015). A
continuación, en la Figura 5, se resume la funcionalidad y estructuras de
almacenamiento de aceites esenciales.

Figura 5. Localización de los aceites esenciales en plantas.
Fuente: Pergentino de Sousa, 2015.

2.5.2. Métodos de extracción.
Los aceites esenciales pueden ser extraídos mediante varios métodos, particularmente
destilación, extracción con solvente de baja polaridad, extracción asistida con
microondas (Ribeiro y Simões, 2019). A continuación, en el Cuadro 2 se muestra un
resumen de los principales métodos sus ventajas y desventajas. Sin embargo, el método
más empleado es el de hidrodestilación (Figura 6), en este caso los vapores de agua
penetran en la masa vegetal sujeta a destilación, destruyendo el recubrimiento de
olefinas y volatilizando el aceite, esta mezcla pasa a un refrigerante que la cambia a
líquido y finalmente alcanza el recipiente de separación (Butnariu y Sarac, 2018).

Cuadro 2. Principales métodos de extracción de aceites esenciales: ventajas y
desventajas.
Nombre Inversión Tamaño de
muestra
Tiempo de
extracción
Principales
desventajas
Principales
ventajas
Hidrodestilación y
destilación por
arrastre de vapor
Bajo > 1000L Alto Limitado por
temperatura
Gran escala
Extracción por
solventes
Bajo > 1000L Alto Limitado por
solubilidad
Gran escala
Ultrasonido Bajo 600 L Bajo Problemas
para
separación
Alta disrupción
celular
Microondas Media 150 L Bajo Puntos
calientes
Disrupción
celular
Calentamiento
Óhmico
Media Continua Bajo Establecer
parámetros
adecuados
Alta disrupción
celular
Extracción por
fluidos supercríticos
(SFE)
Alta 300 L Medio Establecer
parámetros
adecuados
Transferencia de
masa mejorada
Campos eléctricos
de pulso (PEF)
Alta Continua Medio Difícil
operación
Electroporación
de las paredes
celulares
Nota: Inversión (Bajo (500-10 000 $USD), Media (>10 000-25 000 $USD), Alta (>25 000
$USD)); T. Extracción (Bajo (<0.5 horas), Medio (0.5-2 horas), Alto (>2-8 horas)).

Fuente: Bagher Hashemi et al., 2017; Gavahian y Farahnaky, 2018; Preedy, 2016; Seidi
Damyeh y Niakousari, 2017; Vorobiev y Lebovka, 2017.

Figura 6. Proceso de Hidrodestilación empleando una trampa de Clevenger.
(a. Material vegetal en proceso de extracción de aceite, b. Aceite esencial recolectado)

2.5.3. Composición química.
Como lo menciona Paksoy et al., (2016), la composición química de los aceites
esenciales es muy compleja y puede estar formada por cerca de 20 a 60 componentes
volátiles individuales; estos usualmente incluyen varios compuestos con una cantidad
extensa, algunos compuestos moderados y muchos componentes minoritarios con
concentraciones muy bajas. Los aceites esenciales están compuestos principalmente
de terpenoides: monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos, además de varios
alcoholes, cetonas y aldehídos de terpenoides como también de compuestos
aromáticos de la ruta de fenilpropanoides (Adams, 2017).
2.5.3.1. Fenilpropanoides
Estos compuestos aromáticos son un importante grupo en la industria de sabor y
fragancia a pesar de que constituyen una pequeña parte de los aceites esenciales. Este
grupo comprende constituyes derivados del n-propil benceno (El-Shemy, 2017).
Desde un punto de vista estructural, Pergentino de Sousa (2015), indica que estos
compuestos cumplen con un esqueleto tipo C6 (benceno)-C3 (propilo), su síntesis tiene
lugar a través de la ruta del ácido shikímico siendo los precursores principales el ácido
cumárico y ácido para-cumárico como se observa en la Figura 7, los cuales son

obtenidos de los aminoácidos fenilalanina y tirosina respectivamente. Algunos
ejemplos son trans-anetol, metil-chavicol, eugenol, isoeugenol, vainillina, safrol,
miristicina y cinamaldehído (El-Shemy, 2017).

Figura 7. Síntesis de Fenilpropanoides a partir de Ácido cinámico y Ácido p-
cumárico.
Fuente: Marco, 2006.
2.5.3.2. Terpenos
Los terpenos se sintetizan a partir de dos precursores: isopentenil pirofosfato (IPP) y
dimetilalil pirofosfato (DMAPP) para lo cual existen dos rutas biosintéticas en la
formación de estos precursores, la ruta del mevalonato (MVA) como se puede apreciar
en la Figura 8, presente en eucariotas, arqueas y algunas eubacterias, la cual
compromete siete reacciones enzimáticas para convertir acetil-CoA en IPP y DMAPP.
La segunda ruta, conocida como la ruta 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) ocurre
en eubacterias, algas, cianobacterias y cloroplastos de plantas y convierte piruvato y
gliceraldehido-3-fosfato en IPP y DMAPP mediante ocho reacciones enzimáticas
(Abdallah y Quax, 2017). Una vez formados los precursores IPP y DMAPP, entran en
acción las terpenosintasas, estas actúan en la formación de farnesil-difosfato (FPP),
geranil-difosfato (GPP) y geranilgeranil-difosfato (GGPP), moléculas que son
indispensables en la síntesis de las estructuras principales de los terpenos (Bagher
Hashemi et al., 2017).

Figura 8. Síntesis de Terpenos a partir de Ácido Mevalónico.
Fuente: Marco, 2006.

Estas estructuras o esqueletos son las unidades de isopreno (C5). Los terpenos son
producidos a partir de una combinación de varias unidades de isopreno; estos
contienen un esqueleto hidrocarbonado que puede ser rearreglado en estructuras
cíclicas por ciclasas, de esta manera forman estructuras monocíclicas y bicíclicas
(Ribeiro y Simões, 2019). En conclusión, basados en el número de unidades de
isopreno se pueden formar los compuestos expuestos en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Clasificación de Terpenos según el número de carbonos.

# Átomos
Carbono
# Unidades
Isopreno
Nomenclatura Esqueleto básico
5 1 Hemiterpenos

10 2 Monoterpenos
15 3 Sesquiterpenos
20 4 Diterpenos
25 5 Sesteterpenos
30 6 Triterpenos
40 8 Tetraterpenos

Fuente: Marco, 2006.

2.5.4. Quimiotipos en aceites esenciales.
La variabilidad de un aceite esencial en un organismo según de Souza et al., (2018),
está relacionada a factores bióticos y abióticos que afectan cuali-cuantitativamente la
composición del aceite; estos factores incluyen clima, composición de suelo, órganos
de la planta, edad, estacionalidad, ciclo circadiano; de esta manera es importante la
relación que existe entre la presencia de un quimiotipo y el genotipo o grupo de
genotipos que caracterizanun perfil químico, por lo que es de importancia conocer
estos factores que contribuyen al conocimiento de posibles aplicaciones en química,
medicina, farmacéutica y estudios taxonómicos. En este contexto resumido en la
Figura 9, los análisis químicos mediante herramientas analíticas permiten conocer
cualitativamente y cuantitativamente componentes aún en cantidades mínimas, así
como potenciales marcadores químicos.

Figura 9. Consideraciones acerca de un quimiotipo.
Fuente: Tisserand y Young, 2014.

2.6. Métodos de análisis cuali-cuantitativos de los componentes de un aceite
esencial.
Adams (2017), indica que cuando se trata de aceites esenciales, el investigador está
enfrentado con el problema de la identificación de numerosos componentes en mezclas
muy complejas. Complementando esta idea Pergentino de Sousa (2015), menciona que

para un seguimiento de la calidad del aceite son necesarias pruebas sensoriales,
ensayos físico químicos y cromatoespectrales; de esta manera la separación mediante
cromatografía gaseosa (GC) unida con técnicas espectroscópicas son útiles para una
precisa identificación de compuestos; dentro de estas la técnica GC unida a
espectrometría de masas (GC-MS) es una de las técnicas más empleadas para la
caracterización e identificación de compuestos en una mezcla compleja mediante la
comparación de los datos cromatográficos expresados en índices de retención y los
espectros de masas de muestras auténticas o librerías de referencia. También se puede
emplear un detector de ionización de llama para un análisis cuantitativo.
2.6.1. Cromatografía de capa fina.
La cromatografía de capa fina (TLC) es tal vez el método más rápido, sencillo y
comúnmente empleado para evaluar la pureza tanto como la complejidad y a menudo
la naturaleza de compuestos orgánicos (Shriner, 2013). En una TLC la fase inmóvil es
una fina capa de adsorbente extendida sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio.
En su obra Shriner (2013), indica que el método más común de reportar resultados en
TLC es mediante el cálculo del valor Rf (factor de retención) ya sea en un solvente
específico o un tipo de placa cromatográfica especial. En la Figura 10 se puede apreciar
una elución en TLC y los resultados posteriores con reveladores químicos o luminosos.

Figura 10. Cromatografía de Capa Fina (TLC) de un aceite esencial y
resultados con reveladores específicos.

(a. Elución de aceite esencial en una placa TLC de vidrio dentro de una cámara
saturada con solvente. b. Revelado químico de placa con Ácido sulfúrico/Vainillina.
c. Revelado por luz UV a 365 nm. d. Revelado químico con radical DPPH para
detección de compuestos antioxidantes).

2.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
Se trata de una metodología instrumental analítica originada de la conjugación de dos
técnicas instrumentales (Günzler y Williams, 2002); en primer lugar la cromatografía
de gases (GC) es una técnica de separación de compuestos que han sido convertidos
en fase gaseosa en base a sus puntos de ebullición o a las diferencias de polaridad
(Shriner, 2013); donde un gas acarreador, generalmente helio, transporta los gases a
través de una columna calentada que está revestida internamente con una fase
estacionaria (Abeer et al., 2017). Por otra parte la espectrometría de masas (MS), como
señala Jurado y Muñoz (2009), es una técnica analítica instrumental de alta
sensibilidad, que permite determinar el peso molecular y la estructura de un compuesto
químico, en donde según Barceló, (2006) el espectrómetro de masas convierte
moléculas neutras en partículas cargadas como iones positivos o negativos y los ordena
de acuerdo a su respectivo radio masa-carga (m/z), dando como resultado una
representación gráfica de las abundancias relativas de las especies iónicas conocida
como espectro de masas. El acoplamiento de ambas técnicas analíticas (GC-MS) como
se observa en la Figura 11, permite el análisis de mezclas químicas orgánicas; la
cromatografía gaseosa separa los componentes de la mezcla y la espectrometría de
masas caracteriza cada componente individualmente obteniéndose evaluaciones
cualitativas y cuantitativas (Medeiros, 2018).

Figura 11. Equipo de cromatografía de gases acoplado a espectrómetro de masas
GC-MS.
(Tomada en el Laboratorio de Química Instrumental- Universidad Politécnica Salesiana,
Ecuador).

2.7. Aplicaciones de aceites esenciales.
Al respecto Sarikurkcu et al., (2018), señalan que los fitocompuestos en general
poseen una amplia variedad de actividades farmacológicas, por lo que las plantas están
en el centro de atención por parte de la comunidad científica internacional con el
objetivo de extraer los componentes bioactivos. Entre estos compuestos los aceites
esenciales son un recurso natural potencial para la utilización en diferentes industrias,
como la farmacéutica, cosmética y alimentaria (Zheng et al., 2016; Joshi, 2012) debido
a que les preceden poderosas y singulares propiedades medicinales aún sub-exploradas
(Rai et al., 2017); además en estos ámbitos industriales los olores específicos que
poseen les brinda un valor económico (Butnariu y Sarac, 2018). A continuación, en la
Figura 12 se presentan algunos criterios de aplicaciones mencionados por Tisserand y
Young (2014), en campos incluyendo la ingeniería genética.

Figura 12. Prospección de aplicaciones con aceites esenciales.
Fuente: Tisserand y Young, 2014
2.8. Actividad biológica de un aceite esencial.
Los aceites esenciales son una compleja mezcla extraída de plantas las cuales pueden
poseer actividad antioxidante y antiinflamatoria de interés en la industria de alimentos
y cosméticos así como también en el campo de la salud humana (Saidi, 2014), otras
actividades incluyen antimicrobiana, antiviral, antimutagénica y anticancerígena
(Morsy, 2017). Según Calvo-Irabien (2018), la actividad biológica de un aceite

esencial dependerá de sus propiedades fisicoquímicas; siendo asumida en su mayoría
por los componentes mayoritarios, los cuales constituyen generalmente entre 20-95%
del aceite. No obstante, Morsy (2017), señala que la totalidad de la actividad no debe
atribuirse solo a los compuestos mayoritarios ya que los demás componentes del aceite
esencial juegan un interesante papel en la resorción, tasa de reacciones; es decir esta
combinación puede modificar la actividad y exhibir un efecto de sinergia o
antagonismo. Los métodos de detección de la actividad farmacológica se han vuelto
más fiables y específicos, frecuentemente empleando enzimas y células en bioensayos
evitando el uso de animales de laboratorio (Akhila, 2010).
2.8.1. Actividad antioxidante.
Las especies reactivas de oxígeno están involucradas en problemas de salud como
asma, inflamación, artritis, neurodegeneración, enfermedad de Parkinson,
mongolismo y talvez demencia (Yeung et al., 2020). Estas también exhiben acciones
críticas como transducción de señales, transcripción de genes y regulación de la
actividad de guanilil cliclasa en las células (Ferreira et al., 2018). Sin embargo los
radicales libres y otras especies relativas causan la oxidación de biomoléculas como
proteínas, aminoácidos, lípidos y ADN lo cual conduce al daño celular y muerte
(Sharififar et al., 2007). Por ejemplo de acuerdo a Halliwell y Gutteridge (2015), a
pesar de que los organismos requieren de oxígeno (O2) para la producción de energía
mediante la cadena de transporte de electrones, no quita el hecho de que se trate de un
gas tóxico y mutagénico, razón por la cual los aerobios han sobrevivido evolucionado
defensas antioxidantes. En este contexto Bajpai et al., (2009) mencionan que a nivel
industrial se han empleado muchos antioxidantes sintéticos como el butilhidroxianisol
(BHA) o butilhidroxitolueno (BHT), pero estos evidenciaron unpotencial riesgo de
toxicidad. Ante esta problemática las plantas pueden ser una importante fuente de
compuestos antioxidantes como lo detalla Giardi et al., (2010), los fitoquímicos como
polifenoles, flavonoides, isoflavonas y antocianinas han sido el objetivo de muchos
estudios recientes, siendo los fitoantioxidantes más empleados los derivados del fenol
o hidroxibenceno, debido a su estructura química y la capacidad de deslocalizar
electrones en el anillo aromático de esta manera se efectúa la actividad de barrido o
captura de electrones, donde el electrón del radical libre se estabiliza por efecto de la
resonancia del núcleo previniendo la reacción en cadena del radical. En cuanto a la

metodología, citando a Apak et al. (2018), los ensayos antioxidantes in vitro pueden
usar mecanismos basados en la transferencia de un átomo de hidrógeno en donde se
mide la capacidad de un antioxidante de neutralizar un radical al donar un átomo de
hidrógeno o mediante la transferencia de un electrón en singular, en el cual se detecta
la capacidad de un antioxidante de transferir un electrón para reducir iones metálicos
y radicales. Pero hay métodos que combinan estos mecanismos, estos ensayos mixtos
emplean radicales cromóforos estables como el 2,2‐difenil‐1‐picrilhidracilo (DPPH•)
y el 2,2′‐azinobis‐3‐etilbenzotiazolina‐6‐ácido sulfónico (ABTS•+).
2.8.1.1. Ensayo con 2,2‐Difenil‐1‐Picrilhidracilo.
La molécula de DPPH es caracterizada por ser un radical libre estable en virtud de la
deslocalización de su electrón libre a través de la molécula en su conjunto, por lo que
esta no se dimeriza, como podría ser el caso con la mayoría de radicales libres. La
deslocalización también da lugar al color violeta intenso, caracterizado por una banda
de absorción en solución etanólica centrada cerca de 520 nm. Cuando una solución de
DPPH es mezclada con una sustancia que puede donar un átomo de hidrógeno, esto da
lugar a la forma reducida con la pérdida de su coloración violeta, aunque se esperaría
que hubiera un color amarillo pálido residual del grupo picril todavía presente como
se observa en la Figura 13 (ChimActiv, 2019).

Figura 13. Estructura de radical DPPH· y reducción en presencia de antioxidante.

2.8.1.2. Ensayo con 2,2′‐Azinobis‐3‐Etilbenzotiazolina‐6‐Ácido Sulfónico.
El ABTS es una sustancia utilizada en varios ensayos enzimáticos como marcador de
reacción, pero también es usado en ensayos colorimétricos para estimar el potencial
antioxidante de sustancias o mezclas. Según detalla Torres et al., (2017) el ABTS, de
una coloración verde clara, reacciona con el persulfato de potasio y forma el radical
catiónico ABTS•+ de coloración verde azulada, la absorción del radical catiónico es
comparada con la absorción después de la estabilización del ABTS•+ por antioxidantes,
indicada por el cambio de coloración al verde claro, esta disminución de la absorbancia
es detectada espectrofotométricamente a una longitud de onda de 734 nm, de esta
manera mientras menor es la absorbancia después de la reacción es más clara la
coloración del reactivo y mayor el potencial antioxidante como se puede observar en
la Figura 14.

Figura 14. Estructura de radical ABTS•+ y reducción en presencia de antioxidante.

2.8.2. Actividad antibacteriana.
Como señala Joshi (2012), las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales
han sido reconocidas y científicamente establecidas, en su idea indica que su uso está
más relacionado a la medicina tradicional de países en desarrollo para cubrir con las
demandas de salud; en este contexto como agentes microbianos han adoptado variedad
de propósitos incluyendo preservación de alimentos, medicina complementaria y
terapéutica natural. En un ámbito global, Nazzaro et al., (2019), mencionan que la

Organización Mundial de la Salud (OMS) resaltó el incremento en la resistencia a los
antibióticos convencionales para la mayoría de patógenos, debido a la formación de
biofilms que incrementan la patogenicidad. La OMS además reporta que solo un 25%
de los medicamentos vendidos son derivados de plantas medicinales (Rai et al., 2017).
Por estas razones los aceites esenciales han sido objeto de más investigaciones y
pueden jugar un papel importante en la salud humana como productos naturales
alternativos y que además, representan una opción como agentes antibióticos
inhibiendo el crecimiento de las bacterias y actuando incluso en sus secuencias de
resistencia (Zakaria Nabti et al., 2020; Zhang et al., 2020).
2.8.2.1. Concentración Mínima Inhibitoria.
La concentración mínima inhibitoria es definida como la concentración más baja de
una droga que inhibirá el crecimiento visible de un organismo después de incubación
durante la noche (Andrews, 2001). Complementando este concepto Ramirez y Marin
(2009), indican que la concentración generalmente es expresada en (µg/mL) y el
tiempo de incubación es de 24 horas en el caso de bacterias; además la cuantificación
de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante
algunas de las variantes de los métodos de dilución.
2.8.2.2. Tinción con Cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio.
Según Sabaeifard et al., (2014), las sales de tetrazolio son de gran utilidad sobre todo
en biología para medir la actividad metabólica de células, en este caso el TTC es la
base sintética para otras sales como difenilbromuro de tetrazolio (MTT), cloruro de 5-
ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC) e hidróxido de 2,3-bis ((2-metoxy-4-nitro-5-
sulfofenil)-5-[(fenilamino-carbonil]-2H)- tetrazolio (XTT); Estas sales se usan
ampliamente en la cuantificación de células viables de cultivos planctónicos y para la
cuantificación de biofilms bacterianos. En presencia de un microorganismo, el TTC es
reducido a un formazán rojo el cual es directamente proporcional a las células viables
como se puede apreciar en la Figura 15; este método es considerado como un método
comparativo rápido para la evaluación de la actividad antibiótica de agentes
antimicrobianos (Moussa et al., 2013). De esta manera, como menciona Kim et al.,
2010, debido a la reducción del TTC por el microorganismo viable se produce el
formazán rojo y la inhibición del crecimiento puede ser medida cuantitativamente a
una absorbancia de 540 nm.

Figura 15. Estructura del TTC y reducción a formazán.

2.8.3. Actividad citotóxica.
El cáncer es una enfermedad compleja, capaz de destruir el cuerpo de forma rápida,
debido al excesivo y descontrolado crecimiento celular, lo cual ha hecho que este
padecimiento sea considerado una de las enfermedades con mayor tasa de mortalidad
a nivel global. La eficacia de las quimioterapias convencionales se ve reducida gracias
a efectos colaterales, la comunidad científica busca terapias alternativas para el
tratamiento de esta enfermedad, por ende, los aceites esenciales son objeto de
investigación constante ya que se consideran agentes anticancerígenos promisorios ya
que, sus actividades biológicas permiten potenciar la actividad de algunos fármacos y
también actuar directamente a nivel celular (Contini et al., 2020; Pérez-González et
al., 2019). La actividad citotóxica de los aceites esenciales se ve dada por la naturaleza
lipofílica de su composición química, ya que pueden penetrar fácilmente las
membranas citoplasmáticas por dilución libre, así los compuestos químicos se unen a
proteínas intracelulares y generan reacciones internas que terminan en muerte celular
y por ende en una menor proliferación de las células cancerígenas (Ghasemian et al.,
2020). Existen varias metodologías para evaluar la actividad citotóxica de los aceites
esenciales, entre ellas se encuentra el ensayo colorimétrico MTT (bromuro de (3-(4,

5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio) mismo que cuantifica la conversión de una
sal amarillade tetrazolio en cristales morados de formazán (Mangis et al., 2019).
2.8.3.1. Tinción con Bromuro de Metiltiazolildifenil-tetrazolio.
La tinción con MTT (bromuro de (3-(4, 5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio)
equivale a un ensayo colorimétrico relacionado a la actividad metabólica de la célula.
El fundamento de esta prueba, como lo señala Bahuguna et al., (2017) involucra a la
enzima oxidoreductasa dependiente de NAD(P)H la cual convierte el MTT de color
amarillo intenso en un formazán insoluble ((E,Z)-5-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-1,3-
difenilformazan. Este último producto puede ser disuelto en DMSO y la coloración
obtenida es púrpura dependiendo de la actividad celular la cual será directamente
proporcional al número celular o viabilidad celular; esta reacción puede ser
cuantificada a una absorbancia de 540 nm.

Figura 16. Estructura del MTT y reducción a formazán.

2.9. Estudios de composición química y actividad biológica en Magnolia spp.
El género Magnolia juega un importante rol en la medicina tradicional china y
japonesa debido a la versatilidad de propiedades medicinales varias especies de este
género han sido incorporadas y usadas en diferentes preparaciones medicinales
exitosas comercialmente (Sarker y Maruyama, 2002). En la actualidad se han realizado

numerosos estudios en cuanto a los extractos y aceites esenciales de Magnolia spp.
como se pueden apreciar en el Anexo 2, siendo empleadas diferentes partes vegetales
como hojas, flores, frutos, semillas y corteza; en esta recopilación se evidencian
actividades desde antimicrobianas, antifúngicas, citotóxicas a antioxidantes. Según
Sarker (2002), hay un creciente interés en la industria y academia en lo referente a
plantas medicinales y aromáticas, ya que su aplicación en campos como la agricultura,
química, alimentos, sabores, bebidas, farmacéutica, cosmética y fragancia ofrecen un
valor agregado debido a los principios activos obtenidos de la materia prima
proveniente de raíces, rizomas, bulbos, hojas, tallos, cortezas, flores, frutos y semillas.
Pero el autor menciona una acotación importante, los productos naturales no significan
productos seguros y esto debe ser tomado en cuenta por las industrias; lo que implica
un adecuado manejo desde la cosecha y la selección del material vegetal en términos
morfológicos, metabólicos, químicos y genéticos.

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

México alberga una inmensa diversidad biológica-cultural en su territorio, por lo tanto,
es una nación poseedora de una amplia gama de vegetación originada de la variedad
climática, altitudinal y geográfica de sus regiones. En este ámbito se han realizado
investigaciones destinadas a divulgar el descubrimiento de nuevas especies, así como
también, los usos etnomedicinales con las plantas transitan al estudio científico
orientado hacia la caracterización y aplicación de los metabolitos importantes.

No obstante, se han publicado limitados estudios con aceites esenciales de muchas de
las especies endémicas aquí encontradas. Este es el caso de Magnolia pugana una
especie de Magnoliaceae distribuida entre los estados de Jalisco y Zacatecas, planta de
la cual, se desconocen tanto los perfiles en la composición química, así como de sus
potenciales biológicos.

Por esta razón se propuso generar nuevo conocimiento en torno a inquietudes como:
¿Cuáles son los componentes químicos encontrados en estos aceites esenciales? ¿Qué
clase de compuestos son? y ¿Poseen propiedades biológicas de interés?

IV. HIPÓTESIS

• Los aceites esenciales de hojas, semillas y flores de Magnolia pugana tienen
composición química y actividades antioxidante, antibacteriana y
citotóxicas diferenciadas.

V. OBJETIVOS

5.1.1. Objetivo general
• Extraer y evaluar la composición química y activad biológica de los aceites
esenciales de hojas, semillas y flores de Magnolia pugana.

5.1.2. Objetivos específicos
• Extraer los aceites esenciales de M. pugana por medio de hidrodestilación.
• Determinar la composición química de los aceites esenciales de flores, hojas
y semillas, mediante GC/MS.
• Determinar las propiedades biológicas antioxidante, antibacteriana y
citotóxica empleando ensayos in vitro.

VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Diseño experimental.
El alcance del estudio, según Hernández-Sampieri (2018), inicialmente fue
exploratorio, llegando a tener carácter correlacional entre la composición química y
las partes vegetales estudiadas, así como también con las actividades biológicas
antioxidante, antibacteriana y citotóxica. El esquema general de la etapa experimental
se presenta en la Figura 17.

Figura 17. Diseño experimental del estudio.

6.2. Lugar de estudio y recolección del material vegetal.
El área delimitada de estudio se presenta en la Figura 18. Se trataron de dos zonas
rurales de acceso privado (Cuadro 4), ubicadas a 10.8 Km y 8.62 Km al Oeste de
Tesistán, municipio de Zapopan, estado de Jalisco. Las muestras del material vegetal
de Magnolia pugana fueron aleatorias y compuestas de 12 individuos hasta alcanzar
un peso aproximado de 1 Kg de las partes vegetales (hojas, flores y semillas). Para la
colecta se empleó una garrocha para facilitar la toma de muestras de difícil acceso en
las zonas aéreas de los árboles. El material vegetal fue almacenado en contenedores
plásticos que lo protejan de la luz y calor hasta su traslado al laboratorio. En el

Laboratorio de Biotecnología del Departamento de Botánica y Zoología, las muestras
fueron limpiadas y almacenadas en congelación a -20°C hasta su destilación.

Figura 18. Lugar de Estudio y recolección de material vegetal.

Fuente: Google Earth, 2020.

Cuadro 4. Lugares y fechas de colecta de las partes vegetales de M. pugana.
Parte Vegetal de M.
pugana
Fecha de Colecta Localidad
Hojas Noviembre 2018
20°49'11.71"N
103°34'42.37"O
Semillas Febrero 2019
Flores Mayo-Junio 2019
20°44’49,77”N
103°30’44,53”O
Nota: Las localidades de muestreo correspondieron a sitios privados ubicados al Oeste
de Tesistán, Zapopan.

6.3. Extracción de los aceites esenciales de M. pugana mediante
hidrodestilación.
Los aceites esenciales de M. pugana fueron extraídos mediante hidrodestilación
basándose en el método empleado por Guerra-Boone et al., (2013), utilizando una
trampa de vidrio tipo Clevenger. El procedimiento se lo llevó acabo en el Laboratorio

de Extraíbles del Departamento de Celulosa y Papel. El equipo de destilación constó
de un balón de destilación de 1 L (hojas y flores) y 500 mL (semillas), un refrigerante
conectado a un recirculador de agua fría, una trampa de Clevenger continua con
recolector de 10 mL y como fuente de calor una manta de calefacción convencional.
El material vegetal fresco fue lavado y se pesaron aproximadamente 150 g en una
balanza semi-analítica Ohaus Scout Pro, el material fue a continuación colocado en el
balón de destilación junto con pequeños núcleos de ebullición para mejorar el contacto
con la parte vegetal. Se añadieron 300 mL de agua destilada y se acoplaron los
accesorios de vidrio como se muestra en la Figura 19. Se encendió la fuente de calor a
100 °C y el recirculador de agua a 10 °C. El tiempo empleado para la extracción fue
de 4 horas en hojas y en flores mientras que 8 horas en semillas. Una vez concluido el
proceso el aceite aislado en la trampa de Clevenger fue decantado en un vaso de
precipitación de 10 mL, se retiró la humedad remanente empleando sulfato de sodio
anhidro, posteriormente se filtró el aceite y se depositó en un frasco ámbar de 10 mL
para almacenamiento sin incidencia directa de la luz y en refrigeración a 4°C.

Figura 19. Extracción