Brucella-OIE

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Descripción de la enfermedad: Brucelosis es la denominación genérica de las infecciones, 
animales o humanas, causadas por cualquier especie del género Brucella, principalmente Brucella 
abortus, B. melitensis y B. suis. En el ganado bovino, la infección por Brucella suele deberse a 
B. abortus, menos frecuentemente a B. melitensis y en ocasiones a B. suis. Brucella melitensis es 
el principal agente causal de la infección por Brucella en ovejas y cabras. La infección por Brucella 
en cerdos se debe a las biovariedades 1-3 de B. suis, pero la enfermedad causada por la 
biovariedad 2 difiere en cuanto a gama de hospedadores, a la distribución geográfica, que es 
limitada, y a la patogenicidad. En algunas zonas, la infección por B. suis se ha establecido en 
jabalíes. Clínicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o más de los siguientes signos: 
aborto, retención de placenta, orquitis, epididimitis y, en ocasiones muy infrecuentes, artritis, con 
excreción de los microorganismos en las secreciones uterinas y en la leche. El diagnóstico 
definitivo solo puede realizarse a partir del aislamiento de Brucella procedente de los abortos, de 
las secreciones de la ubre y de los tejidos tomados en el examen postmórtem. Brucella abortus, 
B. melitensis y B. suis son muy patógenos en el ser humano, de tal forma que los tejidos, cultivos o 
materiales que puedan estar contaminados deben manipularse en las condiciones de contención 
correspondientes. 
Identificación del agente: La evidencia de Brucella la proporciona la observación de 
microorganismos de tipo Brucella en material abortado o en secreciones vaginales mediante la 
tinción con la técnica ácido alcohol resistente modificada, sobre todo si está respaldada por 
pruebas serológicas, y se considera provisional. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
constituye un medio de detección de ADN de Brucella en una muestra. Cuando sea posible, se 
debe aislar Brucella spp. cultivando muestras de secreciones uterinas, fetos abortados, 
secreciones de las ubres o tejidos específicos, como ganglios linfáticos u órganos reproductores 
masculinos o femeninos. Las especies y biovariedades deben identificarse mediante fagolisis y 
según criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos. La PCR puede constituir un método 
complementario tanto de identificación como de tipificación basado en secuencias específicas del 
genoma. 
Pruebas de inmunidad humoral y celular: Las pruebas con el antígeno tamponado de Brucella, 
es decir, la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinación en placa con antígeno 
tamponado, así como la fijación del complemento, el enzimoinmunoanálisis (ELISA) o el ensayo de 
polarización de la fluorescencia, son pruebas adecuadas tanto para analizar rebaños/manadas 
como animales específicos, ya sean pequeños rumiantes, camélidos o bovinos (ganado bovino o 
búfalos). Sin embargo, ninguna prueba serológica es adecuada por sí sola para todas las especies 
animales ni para todas las situaciones epidemiológicas, y algunas no son adecuadas para el 
diagnóstico de la brucelosis porcina. Por lo tanto, la reactividad de las muestras que dan positivo 
en las pruebas de cribado debe comprobarse utilizando un sistema confirmativo y/o 
complementario establecido. El ELISA indirecto o la prueba del anillo de leche, realizadas con 
muestras de leche de tanque, son eficaces para el cribado y el control de la brucelosis en las vacas 
lecheras. Y la prueba de la brucelina cutánea puede emplearse en rumiantes y cerdos no 
vacunados, ya sea a modo de cribado o de prueba confirmativa a nivel de rebaño cuando surgen 
positivos en las pruebas serológicas en ausencia de factores de riesgo evidentes. 
Requisitos para las vacunas y el material biológico de diagnóstico: La cepa 19 de Brucella 
abortus y la cepa Rev.1 de B. melitensis continúan siendo los microorganismos vacunales de 
referencia para el control de las infecciones por Brucella en ganado bovino y en ganado ovino y 
caprino, respectivamente, con las que deben compararse otras vacunas. Ambas deben prepararse 
a partir de cultivos de inóculo suficientemente derivados. En algunos países, la vacuna preparada 
con la cepa rugosa de B. abortus RB51 también se ha convertido en la vacuna oficial para la 
prevención de la infección por B. abortus en ganado bovino. Para el control de la infección por 
Brucella en cerdos no existe ninguna vacuna adecuada. Las preparaciones a base de brucelina 
deben estar libres de lipopolisacárido liso, y los antígenos para las pruebas serológicas deben 
prepararse a partir de la cepa lisa de B. abortus 1119-3 o 99 y, en el caso del ELISA indirecto, 
también a partir de la cepa lisa de B. melitensis 16M. Tanto las vacunas como las preparaciones a 
base de brucelina deben cumplir con la normativa correspondiente. 
Bruelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones, humanas o animales, causadas por distintas 
especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección de ganado 
ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis). 
Agentes patógenos causales: La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género 
Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes 
entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias 
moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de 
Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en 
lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis 
especies tipo de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionadas con las seis 
especies tipo de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las 
cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, 
B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis
1
. Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus 
características de cultivo y serológicas (véanse las Tablas 2 y 3). En la última década se han aislado cepas de 
Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay 
estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que 
podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva 
cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa 
Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones 
humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las 
mismas. Aunque solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima 
y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et 
al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas 
de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado 
como nuevas especies de Brucella. 
El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la 
clase Alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas 
y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales 
(Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). 
La infección por Brucella en ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella 
abortus.En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el 
ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede 
deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de 
la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se 
 
1 http://www.the-icsp.org/subcoms/Brucella.htm 
http://www.the-icsp.org/subcoms/Brucella.htm
transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, 
pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda 
se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. 
Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras 
la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que 
suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, 
en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales se produce una profusa excreción del 
microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar 
infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones 
suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de 
microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el 
microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. 
Los bovinos macho adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede ser una causa 
de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las 
extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser 
el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. 
La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causa 
principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado 
infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente 
infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, 
pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del 
agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva 
Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy 
similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales 
de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas 
por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella 
también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de 
distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la 
reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). 
La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de 
B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, 
pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se 
crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el 
sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina 
puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la 
bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland 
(Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones 
humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En 
general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o 
de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y 
las membranas fetales. La transmisión durante la copula también es frecuente, y la excreción de 
B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En 
los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto 
reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que 
en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, 
epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen 
ser unilaterales, empiezan con una hyperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se 
caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene 
lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier 
momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no 
suele ser evidente y, en los rebaños infectados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la 
infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y 
ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad 
sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin 
ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos 
sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en 
ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se 
recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedar infectados 
de por vida (Olsen et al., 2012). 
La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la 
gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica 
de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La 
prevalencia en jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de 
Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, 
y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis 
causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. 
Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. 
No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que 
hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de 
jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se 
han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. 
Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y 
en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la 
alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado 
con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. 
Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano 
y eleuropeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus 
elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos 
clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, 
ovino y caprino. 
La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se 
encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis 
en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias 
especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la 
cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje), se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así 
como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no 
pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por 
Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. 
Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras 
especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el 
hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por co-
habitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden 
contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer 
otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los 
caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las 
bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras 
naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microrganismos similares a B. 
suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de 
Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por 
la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se 
han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado 
que son distintas de B. suis en base al perfil genético. 
Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la 
bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado 
doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos, de 
tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a 
menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden tener lugar en casi cualquier lugar, a veces en 
el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos 
reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente 
intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o 
liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones 
bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. 
La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer 
tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. 
Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y 
distintos signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones 
sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por 
contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente 
procedentes del reno, especialmente la médula ósea. 
La infección por Brucella es fácilmente transmisible al ser humano, en el que causa un proceso febril 
(fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones 
graves que afecten a los sistemas musculoesquelético y cardiovascular y al sistema nervioso central. 
Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae 
básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos 
constituye el principal riesgo para el público general en los lugares en los que la enfermedad es 
endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que 
manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una 
de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio 
relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a 
un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo 
biológico (véase el Capítulo 1.1.4. Bioseguridad y bioprotección: norma para la gestión del riesgo 
biológico en el laboratorio veterinario y en las instalaciones de los animales). Se han realizado 
recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben 
aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; 
Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004; Capítulo 1.1.3 
Transporte de material biológico). 
Método 
Propósito 
Demostrar 
ausencia de 
infección en 
la población 
Demostrar 
ausencia de 
infección en 
animales 
concretosa 
Contribuir a 
las políticas 
de 
erradicaciónb 
Confirmar 
casos clínicos 
sospechososc 
Determinar la 
prevalencia de 
la infección – 
vigilancia en el 
rebaño/manada 
Determinar el 
estado 
inmunitario en 
animales 
concretos o en 
poblaciones 
tras la 
vacunación 
Identificación del agente 
Métodos de tinción – – – + – n/a 
Cultivo – – – +++ – n/a 
PCRd – – – +/++ – n/a 
Detección de la respuesta inmunitaria 
BBAT 
(RBT o BPAT) 
+++ ++ +++ + +++ n/a 
FPA ++ ++ + ++ ++ n/a 
CFT ++ ++ +++ ++ +++ n/a 
I-ELISA +++ ++ +++ ++ +++ n/a 
C-ELISA ++ + + + ++ n/a 
BST ++ – + +++ ++ n/a 
SAT ++ + + – + n/a 
Pruebas 
basadas en el 
NH y proteínas 
del citosole 
– – + ++ – n/a 
Método 
Propósito 
Demostrar 
ausencia de 
infección en 
la población 
Demostrar 
ausencia de 
infección en 
animales 
concretosa 
Contribuir a 
las políticas 
de 
erradicaciónb 
Confirmar 
casos clínicos 
sospechososc 
Determinar la 
prevalencia de 
la infección – 
vigilancia en el 
rebaño/manada 
Determinar el 
estado 
inmunitario en 
animales 
concretos o en 
poblaciones 
tras la 
vacunación 
Pruebas en 
leche de tanquef 
I-ELISA con 
leche o prueba 
del anillo de 
leche 
+++ – +++ + +++ n/a 
Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el coste, la 
fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; – = no adecuado para esta finalidad; n/a = no aplicable. 
PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de 
bengala] y BPAT [prueba de la aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación del complemento; I- o C-ELISA = 
enzimoinmunoanálisis indirecto/de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba cutánea de la 
brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo 
a
Solo aplicable a rebaños/manadas, países o zonas libres de infección por Brucella. 
b
Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/manadas, se recomienda combinar pruebas para 
aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menosdos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I-
ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serología y BST. 
c
En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser 
muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. 
En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse 
una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba serológica debe considerarse infectado, 
incluso en ausencia de signos clínicos. 
En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse 
mediante cultivo (o PCR) o BST. 
En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como 
en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. 
d
Es posible que se obtengan falsos positivos. 
e
En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev.1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre 
los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generados a partir de la infección. 
f
Solo ganado lechero. 
Todos casos de aborto u orquitis del ganado bovino, ovino y caprino, así como porcino, deben considerarse 
sospechosos de brucelosis y deben estudiarse teniendo en cuenta los antecedentes del rebaño/manada y 
enviando muestras al laboratorio. El cuadro clínico no es patognomónico, de tal forma que el diagnóstico 
definitivo de infección por Brucella solo puede realizarse a partir del aislamiento e identificación de Brucella, pero 
en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico debe basarse en los métodos 
serológicos. 
 
No existe ninguna prueba que por sí sola permita identificar de forma definitiva una bacteria como Brucella. Así, 
para una identificación definitiva, es necesario aplicar una combinación de métodos basados en las 
características de crecimiento, serológicas, bacteriológicas o moleculares (Alton et al., 1988; Comité Mixto 
FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986). 
Todas las muestras de casos sospechosos deben enfriarse de inmediato una vez obtenidas y transportarse al 
laboratorio por el medio más rápido. Si el transporte va a durar más de 12 horas, todas las muestras excepto los 
hisopos vaginales deberán congelarse. Al llegar al laboratorio, las muestras que no deban cultivarse de 
inmediato deberán congelarse (Alton et al., 1988). En todos los casos, cuanto menos dure el transporte y el 
periodo de conservación, mayor será la probabilidad de aislar Brucella, especialmente cuando la cantidad inicial 
de Brucella en la muestra sea baja. No se ha demostrado que ningún medio de transporte específico mejore la 
supervivencia de Brucella en las muestras obtenidas de animales. 
El género Brucella está formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0,6–1,5 µm de largo por 
0,5–0,7 µm de ancho. Normalmente aparecen aislados, y con menos frecuencia en pares o en grupos 
pequeños. La morfología de los microorganismos del género Brucella es bastante constante, aunque 
en cultivos viejos se pueden observar formas pleomórficas. Brucella no es una bacteria móvil. No 
forma esporas ni produce flagelos, fimbrias ni cápsulas verdaderas. Los microorganismos del género 
Brucella son gramnegativos y no suelen mostrar tinción bipolar. Resisten al cambio de color por ácidos 
débiles y, por lo tanto, se tiñen de rojo mediante el método de Ziehl–Neelsen modificado por Stamp 
(Alton et al., 1988). Con este método, en frotis de órganos o de líquidos biológicos fijados previamente 
con calor o con etanol, Brucella se tiñe de rojo sobre un fondo azul. También puede utilizarse una 
técnica basada en anticuerpos conjugados a un fluorocromo o marcados con peroxidasa. La presencia 
de microorganismos intracelulares con morfología de Brucella, débilmente resistentes a ácidos, o 
inmunoespecíficamente teñidos, constituye un indicio preliminar de brucelosis. Sin embargo, estos 
métodos no son factibles o presentan una baja sensibilidad en la leche y en productos lácteos, donde 
los microorganismos del género Brucella se presentan a menudo en escaso número, y donde la 
presencia de glóbulos de grasa a menudo impide una interpretación correcta. En la interpretación de 
los resultados positivos por el método de Stamp hay que proceder con prudencia, puesto que en estas 
preparaciones, otros microorganismos que también causan aborto, como Chlamydophila abortus o 
Coxiella burnetii pueden ser difíciles de diferenciar de Brucella. Los resultados, tanto positivos como 
negativos, deben confirmarse por cultivo. 
Para poner de manifiesto el agente en diversas muestras biológicas, también se pueden utilizar 
métodos directos basados en sondas de ADN o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
(Bricker, 2002; Whatmore y Gopaul, 2011), pero por el momento, la sensibilidad y la especificidad de 
estos sistemas siguen siendo menores que las de la bacteriología clásica. No obstante, algunas de 
estas pruebas moleculares facilitan la identificación definitiva y la tipificación de las cepas de Brucella 
aisladas (véase el apartado B.1.4). 
El aislamiento bacteriológico es lento, caro y engorroso, pero para confirmar la enfermedad y 
determinar qué especies/biovariedades de Brucella la están causando debe realizarse siempre que 
sea posible. Aunque a menudo se considera insensible, puede ser efectivo cuando se optimiza el tipo 
y número de muestras, la forma de conservación, la cantidad sembrada y los medios de cultivo 
utilizados. 
El aislamiento y cultivo directo de Brucella suelen realizarse en un medio sólido. En general, 
este representa el método más satisfactorio porque permite aislar y reconocer claramente las 
colonias. Los medios sólidos también limitan el establecimiento de mutantes no lisos y el 
desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, en el caso de muestras voluminosas o 
cuando se pretenda lograr un enriquecimiento, puede recomendarse el empleo de medios 
líquidos. Existe una gran variedad de medios basales deshidratados a nivel comercial, como la 
base de medio para Brucella, o el agar triptosa (o tripticasa)-soja (TSA). Es necesario añadir un 
2–5% de suero bovino o equino para el cultivo de algunas cepas, como la biovariedad 2 de B. 
abortus, y muchos laboratorios añaden sistemáticamente suero al medio basal con resultados 
excelentes, como en el caso del agar sangre o del agar Columbia. También pueden utilizarse 
otros medios satisfactorios, como el agar de suero-dextrosa (SDA) o el agar de glicerol 
dextrosa (Alton et al., 1988). El medio SDA suele ser el de elección para la observación de la 
morfología de las colonias. Para el aislamiento de Brucella de la sangre u otros líquidos 
corporales o de la leche, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un 
medio bifásico no selectivo, conocido como medio de Castañeda. Este medio se emplea 
porque en medio líquido las brucelas tienden a disociarse, lo cual interfiere con la biotipificación 
llevada a cabo mediante las técnicas bacteriológicas convencionales. 
Todos los medios basales indicados anteriormente se pueden utilizar para la preparación de 
medios selectivos, añadiendo los antibióticos apropiados para evitar el crecimiento de 
microorganismos distintos a Brucella. 
El medio selectivo más difundido es el de Farrell modificado (FM) (Stack et al., 2002), que se 
prepara añadiendo a 1 litro de agar: sulfato de polimixina B (5 000 unidades = 5 mg); 
bacitracina (25 000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); ácido nalidíxico (5 mg); nistatina 
(100 000 unidades) y vancomicina (20 mg). Se ha comercializado un suplemento de 
antibióticos liofilizado. Sin embargo, a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el 
ácido nalidíxico y la bacitracina tienen efectos inhibidoressobre algunas cepas de B. abortus, 
B. melitensis y B. suis. Por ello, el uso simultáneo del FM y del medio de cultivo modificado de 
Thayer-Martin (mTM), que es menos selectivo, se ha considerado el sistema de elección para 
el aislamiento primario de Brucella en muestras de campo obtenidas de animales. Aun así, el 
mTM no es translúcido debido a que contiene hemoglobina como componente basal, siendo 
así inadecuado para la observación directa de la morfología de las colonias, que 
probablemente sea el procedimiento más práctico para la identificación provisional de Brucella 
(Alton et al., 1988). Recientemente, se ha formulado un nuevo medio de cultivo selectivo y 
translúcido (denominado CITA) (De Miguel et al., 2011). Para prepararlo, se usa agar sangre 
como componente básico y se suplementa con un 5% de suero de ternero estéril y 
vancomicina (20 mg/ litro), metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), nitrofurantoína (10 mg/ 
litro), nistatina (100 000 Unidades Internacionales [UI)]/litro), y anfotericina B (4 mg/litro). Esta 
combinación de antibióticos puede prepararse del siguiente modo: se pesan la vancomicina, la 
colistina y la nistatina en el recipiente estéril de 50 ml, a continuación se rehidrata la mezcla 
con 10 ml de una solución 1:1 de metanol absoluto en agua purificada estéril. Se pesa la 
nitrofurantoína en un tubo estéril y se disuelve con 1 ml de una solución de NaOH 0,1 M 
(previamente esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,22 µm). Por último, se pesan 10 
mg de anfotericina B en un recipiente estéril de 20 ml y se disuelven con 1 ml de 
dimetilsulfóxido. Una vez disueltos por completo (se precisan 5-10 minutos), se añaden 9 ml de 
una solución salina estéril tamponada con fosfato 10 mM (PBS) (pH=7,2 ± 0,2). La 
concentración final de la anfotericina B sería de 1 mg/ml; para 1 litro de medio se precisa un 
total de 4 ml de esta solución. La suspensión de anfotericina B restante puede conservarse a 
5°C ± 3°C varios días para usos posteriores. Este nuevo medio CITA inhibe la mayoría de 
microorganismos contaminantes pero al mismo tiempo permite el crecimiento de todas las 
especies de Brucella y es más sensible que el mTM y que el medio de Farrell para el 
aislamiento de todas las especies lisas de Brucella de las muestras de campo, de tal forma que 
se convierte en el medio selectivo de elección para el aislamiento de Brucella en términos 
generales, aunque la máxima sensibilidad diagnóstica se logre empleando de forma simultánea 
FM y CITA (De Miguel et al., 2011). 
Contrariamente a lo que ocurre con algunas biovariedades de B. abortus, así como con B. ovis, 
para el crecimiento de B. melitensis y B. suis no es indispensable una atmósfera de incubación 
que contenga un 5–10% de CO2 (Tabla 2), pero una atmósfera de este tipo, enriquecida con 
CO2, sí es la óptima para el cultivo de todas las especies de Brucella. 
Como es probable que el número de microorganismos de Brucella en la leche, en el calostro y 
en algunas muestras tisulares sea menor que en material de abortos, se recomienda un 
enriquecimiento. En el caso de la leche, los resultados también mejoran mediante 
centrifugación y cultivo de la crema y el precipitado, pero deben aplicarse estrictas medidas de 
seguridad para evitar la formación de aerosoles. Una forma más práctica de aumentar la 
sensibilidad del cultivo de leche evitando los riesgos de la centrifugación es aumentar el 
número de placas de cultivo tanto FM como CITA por muestra de leche analizada (dos placas 
por cuarterón como mínimo), e inocular cada placa con unos 0,5 ml de leche. El 
enriquecimiento se puede realizar en medio líquido formado por caldo de suero-dextrosa, con 
caldo de triptosa o caldo de (tripticasa)-soja (TSA) o con caldo para Brucella suplementado con 
una mezcla de antibióticos que lleve al menos anfotericina B (1 µg/ml) y vancomicina (20 µg/ml) 
(concentraciones finales). El medio de enriquecimiento debe incubarse a 37°C ± 2°C en aire 
suplementado con un 5–10% (v/v) de CO2 hasta un máximo de 6 semanas, realizando 
subcultivos semanales a los medios sólidos selectivos FM y CITA. Si se prefiere, se puede 
utilizar un sistema bifásico de medio selectivo líquido y sólido en el mismo frasco (técnica de 
Castañeda) para reducir el subcultivo. Para el aislamiento de Brucella de la leche a veces se 
recomienda un medio selectivo bifásico formado por el medio base de Castañeda al que se 
añaden los siguientes antibióticos en la fase líquida (las cantidades que se indican son por litro 
de medio): sulfato de polimixina B (6 000 unidades = 6 mg); bacitracina (25 000 unidades = 25 
mg); natamicina (50 mg); ácido nalidíxico (5 mg); anfotericina B (1 mg); vancomicina (20 mg) y 
D-cicloserina (100 mg). 
Todos los medios de cultivo deben someterse a un control de calidad con las cepas de 
referencia para comprobar que funcionan adecuadamente. Lo ideal es usar un inóculo pequeño 
de cepas exigentes, como la bv 2 de B. abortus, B. ovis o la bv 2 de B. suis. 
En medios sólidos adecuados, pueden observarse colonias claramente visibles de Brucella 
después de 3-4 días de incubación. Tras 4 días de incubación, las colonias de Brucella son 
redondas, de 1-2 mm de diámetro, con los bordes lisos. Son translúcidas y de color miel pálido 
a la luz del día en medio transparente. Vistas desde arriba son convexas y de color blanco 
perla. Posteriormente, las colonias crecen y se oscurecen ligeramente. Los cultivos en fase lisa 
(S) de Brucella presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente 
en el caso de los subcultivos, y a disociarse a formas rugosas (R). En este caso, las colonias 
son mucho menos transparentes, presentan una superficie mate más granular y el color varía 
de blanco mate a marrón al usar luz reflejada o trasmitida. La comprobación de esta 
disociación se realiza fácilmente por tinción con cristal violeta: las colonias rugosas se tiñen de 
rojo/violeta y las lisas no captan colorante o bien se tiñen de color amarillo claro. Si las colonias 
son lisas deben comprobarse con un antisuero anti-Brucella en fase lisa, o preferiblemente con 
sueros monoespecíficos contra los antígenos de superficie A y M. En cuanto a las colonias 
rugosas, deben comprobarse con antisuero contra el antígeno R de Brucella. Por lo general, los 
cambios de morfología de las colonias se asocian a cambios en la virulencia, en las 
propiedades serológicas o en la sensibilidad a los fagos. La morfología típica de las colonias y 
un resultado positivo en la prueba de aglutinación con un antisuero específico anti Brucella, 
seguido de las pruebas de la oxidasa y la ureasa (véanse las Tablas 2 y 3) proporcionan una 
identificación provisional de la cepa como Brucella. De todas formas, se recomienda que la 
confirmación y tipificado posteriores se realicen en un laboratorio de referencia. 
Para el diagnóstico de la brucelosis animal mediante cultivo, la elección de las muestras en 
general depende de los signos clínicos observados. Las muestras más adecuadas son 
secreciones vaginales (hisopos), fetos abortados (contenido gástrico, bazo y pulmones), 
membranas fetales, leche, semen y líquidos de las artritis o de los higromas. Los tejidos 
preferidos para cultivo de las canales animales son los del sistema reticuloendotelial (es decir, 
ganglios linfáticos de la cabeza, mamarios y genitales, y el bazo), el útero inmediatamente 
antes o después del parto, y las ubres. Suele aparecer crecimiento pasados 3 a 4 días, pero los 
cultivos no deben considerarse negativos hasta que hayan pasado 7 a 10 días. 
Las muestras se toman asépticamente con instrumentos estériles. Las muestras de tejido 
se preparan retirando el material irrelevante (como la grasa), cortándolas en pequeños 
trozos y macerándolas con un digestor (“Stomacher”) o en un homogeneizador de tejidos 
con una pequeña cantidad de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) antes 
de inocularlas en medios sólidos. 
Una fuente excelente para recogerBrucella es un hisopo vaginal tomado después del 
aborto o del parto, y es mucho menos arriesgado para el personal que el material del 
aborto. A continuación, el hisopo se siembra directamente en medios sólidos. 
Las muestras de leche deben recogerse de forma limpia después de lavar y secar toda la 
ubre y desinfectar los pezones. Es esencial que las muestras contengan leche de todos 
los cuarterones, y se deben tomar 10–20 ml de cada pezón cambiando o desinfectando 
los guantes entre animales para evitar la contaminación cruzada de las muestras. Los 
primeros chorros se desechan y la muestra se recoge directamente en un recipiente 
estéril. Se ha de proceder con cuidado de evitar el contacto entre la leche y las manos del 
ordeñador. La leche se puede centrifugar y la crema y la parte depositada se siembran en 
medio selectivo sólido, por separado o mezclados, o bien se siembran directamente como 
se ha indicado previamente. Si en muestras de leche de tanque se detecta Brucella, su 
número suele ser muy bajo y el aislamiento a partir de tales muestras es improbable. 
Los productos lácteos, como los quesos, deben cultivarse en los medios descritos arriba. 
Como es probable que estos materiales contengan un bajo número de microorganismos, 
se recomiendan cultivos de enriquecimiento. Es necesario que las muestras estén 
homogenizadas cuidadosamente antes del cultivo, después de haberlas sometido a un 
triturador de tejidos, a un digestor (“Stomacher”) o a una batidora eléctrica con un 
volumen adecuado de PBS estéril (evitando un exceso de dilución). Deben cultivarse las 
capas superficiales (corteza y partes adyacentes) y el interior del producto. Como las 
brucelas crecen, sobreviven y desaparecen rápidamente, su distribución por las diferentes 
partes del producto varía en función de las condiciones físico-químicas locales derivadas 
de la tecnología específica del proceso. 
Este tipo de muestras debe obtenerse de forma aséptica y sembrarse directamente en 
medios selectivos sólidos. 
Después de la toma, todas las muestras deben enfriarse rápidamente (4–10°C) y transportarse 
al laboratorio lo antes posible. De lo contrario, deben congelarse para evitar pérdidas de 
viabilidad. A su llegada al laboratorio, deben congelarse todas las muestras de leche y de 
tejidos o de otros líquidos biológicos que no vayan a cultivarse de inmediato. 
El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sea absolutamente necesario, 
aunque a veces constituyen el único medio para detectar la presencia de Brucella, sobre todo 
cuando las muestras están muy contaminadas o es probable que contengan un número bajo de 
microorganismos del género Brucella. La inoculación en los animales puede realizarse por vía 
intravenosa o intraperitoneal en ratones o por vía intramuscular, subcutánea o intraperitoneal 
en cobayas. Este trabajo debe realizarse en condiciones adecuadas de bioseguridad, como se 
indica en el Capítulo 1.1.4. Los bazos de los animales inoculados se cultivan durante 7 días 
(ratones) o 3-6 semanas (cobayas) después de la inoculación. Pueden obtenerse muestras de 
suero de los cobayas mediante punción intracardiaca antes de la necropsia y someterse a 
pruebas de antígeno tamponado de Brucella (BBAT); un resultado serológico positivo es muy 
indicativo de brucelosis (Alton et al., 1988). 
Cualquier colonia con una morfología similar a la de Brucella debe examinarse tiñendo un frotis con la 
tinción de Gram. Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serológicas, tintoriales y de 
sensibilidad a los fagos, la morfología colonial resulta esencial para las pruebas de tipificación que se 
describen más abajo. Los métodos recomendados para observar la morfología de las colonias son el 
método de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun y 
Bonestell, o el método de White y Wilson de tinción de colonias con cristal violeta (Alton et al., 1988). 
La identificación de Brucella se puede realizar mediante una combinación de las siguientes pruebas: 
morfología celular mediante la tinción de Gram o de Stamp, observación directa de la morfología de 
las colonias, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa y oxidasa, y la prueba de la aglutinación 
en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La identificación de especies y de biovariedades 
requiere pruebas elaboradas (como la lisis por fagos y la aglutinación con sueros monoespecíficos 
anti-A, anti-M o anti-R), que deben realizarse en laboratorios de referencia con experiencia en estos 
métodos. La utilización simultánea de varios fagos, como Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1 
(Iz1) y R/C, representa un sistema de tipificación fágica que, con suficiente experiencia, permite 
identificar las especies lisas y rugosas de Brucella. No obstante, algunas propiedades, como el 
requerimiento de CO2 para crecer, la producción de H2S (detectada mediante papeles con acetato de 
plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina básica y tionina, se detectan mediante pruebas 
sistemáticas que pueden realizarse en laboratorios no especializados moderadamente equipados 
(véanse las Tablas 2 y 3). 
Para el mantenimiento de cepas de B. abortus, B. melitensis o B. suis, o cuando se envían a un 
laboratorio de referencia para su tipificación, es esencial seleccionar solo cepas lisas. Los cultivos se 
pueden conservar durante algún tiempo a 5°C ± 3°C, pero para periodos largos deben liofilizarse o 
conservarse en un tubo con tapón de rosca a temperaturas ≤ –16°C en caldo de triptosa con glicerol al 
15% (v/v). Para el envío, se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tapón de rosca o se 
subcultivan en un agar inclinado con los nutrientes adecuados en tubos con tapón de rosca. Las cepas 
también pueden enviarse suspendidas en medios de transporte (como el medio Amies), aunque este 
puede ocasionar disociación. 
Para el transporte de cultivos de Brucella, las tapas de los frascos o recipientes deben enroscarse bien 
ajustadas y sellarse con cinta de PVC (cloruro de polivinilo). Los frascos deben envolverse con papel 
absorbente o algodón, sellarse en bolsas de polietileno e introducirse en un recipiente rígido (triple 
envoltorio) de acuerdo con los requisitos de la Asociación Internacional del Transporte Aéreo (IATA) 
para el envío de bienes peligrosos (IATA, 2013). Estas normas se resumen en el Capítulo 1.1.2 
Recogida, presentación y almacenamiento de muestras para el diagnóstico y en el Capítulo 1.1.3 
Transporte de material biológico, y deben cumplirse. 
La PCR, incluido el formato en tiempo real, constituye otro medio de detección e identificación de 
Brucella sp. (Bricker, 2002; Lopez-Goñi et al., 2011; Ocampo-Sosa et al., 2005; Whatmore y Gopaul, 
2011). Pese al alto grado de homología del ADN dentro del género Brucella, se han desarrollado 
varios métodos moleculares que permiten, hasta cierto punto, la diferenciación entre especies de 
Brucella y algunas de sus biovariedades, como la PCR, el análisis del polimorfismo en la longitud de 
fragmentos de restricción ampliados mediante PCR (RFLP) y la transferencia Southern (se ofrece una 
revisión en las referencias Bricker, 2002; Moreno et al., 2002; Whatmore y Gopaul, 2011). También se 
ha desarrollado una electroforesis en gel de campo pulsante que permite la diferenciación entre varias 
especies de Brucella. Mediante el empleo de la PCR puede biotipificarse Brucella y pueden 
diferenciarse las cepas vacunales, pero la PCR se ha validado poco para el diagnóstico primario. 
La primera prueba de PCR múltiple específica de especie para la diferenciación de Brucella fue 
descrita por Bricker y Halling. La prueba, denominada PCR AMOS, se basaba en el polimorfismo 
resultante de la localización, específica de especie, de la secuencia de inserción IS711 en el 
cromosoma de Brucella e incluía cinco cebadores oligonucleótidos que podían identificar, sin 
diferenciarlas, las biovariedades 1, 2 y 4 de B. abortus, pero no lasbiovariedades 3, 5, 6 y 9 de 
B. abortus. Con el tiempo, se han introducido modificaciones de la prueba para mejorar el rendimiento, 
y se han incorporado otros cebadores específicos de cepa para la identificación de las cepas 
vacunales de B. abortus y de otras biovariedades y especies (Ocampo-Sosa et al., 2005). Se ha 
propuesto una nueva prueba de PCR múltiple (Bruce-ladder) para la identificación rápida y en un solo 
paso de Brucella. La principal ventaja de esta prueba respecto a las PCR descritas previamente es 
que permite identificar y diferenciar en un solo paso la mayoría de especies de Brucella, así como las 
cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y B. melitensis Rev.1. Contrariamente a lo que 
ocurre con otras PCR, Bruce-ladder también permite detectar ADN de B. neotomae, B pinnipedialis y 
B ceti. Además, mediante esta nueva PCR múltiple se pueden detectar las biovariedades 3, 5, 6 y 9 de 
B. abortus y las biovariedades 2, 3, 4, 5 de B. suis. Se ha descrito una actualización del protocolo de 
PCR Bruce-ladder original. Esta nueva versión (Bruce-ladder v2.0), que se ha validado en varios 
laboratorios, también permite diferenciar entre B. suis y B. canis, así como diferenciar B. microti. 
Además, se ha creado una nueva PCR múltiple (Suis-ladder) con la cual pueden identificarse con 
rapidez y exactitud cepas de B. suis a nivel de biovariedad (Lopez-Goñi et al., 2011). 
Otra prueba avanzada PCR multiplex también puede distinguir entre B. suis y B. canis y entre B. suis y 
B. Microti en una sola etapa, y entre las cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y 
B. melitensis Rev.1 (Kang et al., 2011). Esta prueba podría permitir también la diferenciación de las 
dos especies de mamíferos marinos, aunque requiere mayor validación de las cepas de campo. 
Existen otras pruebas, como las PCR/RFLP omp25, 2a y 2b, que pueden utilizarse para identificar 
ciertas especies de Brucella. 
Recientemente se han descrito otros procedimientos que permiten la identificación de todas las 
especies de Brucella, biovariedades de B. suis y cepas vacunales basados en la discriminación por 
polimorfismo de nucleótido único (SNP) mediante la extensión de cebador, PCR en tiempo real o la 
reacción en cadena de la ligasa. Estas pruebas son rápidas, sencillas e inequívocas y, al basarse en 
un análisis filogenético robusto, ayudan a garantizar la especificidad de especie/biovariedad de los 
marcadores que se utilizan (Whatmore y Gopaul, 2011). 
Recientemente también se han descrito otros métodos que pueden añadir información epidemiológica 
útil. Se trata de un esquema de secuenciación multilocus (Whatmore y Gopaul, 2011) y de varios 
esquemas de tipificación basados en la utilización de análisis de repeticiones en tándem de un número 
variable de locus múltiples (MLVA) (Bricker et al., 2003; Le Flèche et al., 2006; Whatmore y Gopaul, 
2011). Dependiendo de los marcadores concretos escogidos, estos métodos permiten diferenciar las 
cepas a nivel de especie o incluso subclasificarlas pudiendo llegar a obtener información 
epidemiológica útil a nivel de subespecie. 
La identificación de las cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y B. melitensis Rev.1 puede 
realizarse a partir de pruebas PCR específicas (Kang et al., 2011; Lopez-Goñi et al., 2011) o bien en 
función de sus características de crecimiento en cultivo. 
La cepa S19 de Brucella abortus presenta las propiedades normales de una biovariedad 1 de 
B. abortus, pero no requiere CO2 para crecer, ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 µg/ml = 
5 UI/ml), azul tionina (2 µg/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (todas ellas concentraciones finales), y presenta 
una alta utilización de L-glutamato (Alton et al., 1988). 
La cepa Rev.1 de Brucella melitensis tiene las propiedades normales de una biovariedad 1 de 
B. melitensis, pero crece más lentamente en medios sólidos, no crece en presencia de fucsina básica, 
ni con tionina (ambas a 20 µg/ml) o bencilpenicilina (3 µg/ml), pero sí en presencia de estreptomicina a 
2,5 o 5 µg/ml (5 UI/ml) (Alton et al., 1988). 
La cepa RB51 de Brucella abortus se puede distinguir de su homóloga lisa, la biovariedad 1 de 
B. abortus, por su morfología rugosa y el hecho de que crezca en presencia de rifampicina (250 µg por 
ml de medio). 
Especie 
M
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Lisis por fagosa 
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Hospedador preferente 
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B. abortus S –d + + + + – (+)e (+)f 
Ganado bovino y otros 
Bovidae 
B. melitensis S – – (–)g + – + +h Ovejas y cabras 
B. suis S – – + (+)i (+)i – + +j 
Bv. 1: suidos 
Bv. 2: suidos, liebres 
Bv. 3: suidos 
Bv. 4: renos 
Bv. 5: roedores 
B. neotomae S – –k + + + – – +j Rata del desiertol 
B. ovis R + – – – – + – – Ovejas 
B. canis R – – – – – + + +j Perros 
B. ceti S ND (–) (+) (+) – (+) + Cetáceos 
B. pinnipedialis S ND (–) (+) (+) – (+) +h Pinnípedos 
B. microti S – – + + + ND + +h Topillo común 
B. inopinata S ND – PLm ND ND ND ND +j Desconocido 
B. papionis S PLm PLm + ND – – +j Desconocido 
De Alton et al. (1988), Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis (1986), Whatmore (2009), 
y Whatmore et al. (2014). 
(+)/(–) La mayoría de cepas son positivas/negativas 
a Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1 (Iz1) y R/C 
b Fase habitual: S: lisa, R: rugosa 
c RTD: dilución habitual para la prueba 
d La bv 2 de B. abortus por lo general requiere suero para crecer en aislamiento primario 
e Algunas cepas africanas de la bv 3 de B. abortus son negativas 
f Intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas naturales, que son negativas 
g WB lisa algunas cepas 
h Lenta, excepto en algunas cepas, que es rápida 
I Algunas cepas de la bv 2 de B. suis no resultan lisadas por los fagos Wb e Iz1, o solo parcialmente 
j Rápida 
k Placas minuto 
l Neotoma lepida 
m Lisis parcial 
ND Por determinar
Especie 
B
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Tincióna 
Aglutinación con 
sueros 
monoespecíficos 
Cepa de referencia2 
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b
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A M R Cepa ATCC NCTC 
B. abortus 
1 (+)b + – + + – – 544 23448 10093 
2 (+)b + – – + – – 86/8/59 23449 10501 
3 c (+)b + + + + – – Tulya 23450 10502 
4 (+)b + – (+) – + – 292 23451 10503 
5 – – + + – + – B3196 23452 10504 
6c – (–) + + + – – 870 23453 10505 
9 +/– + + + – + – C68 23455 10507 
B. melitensis 
1 – – + + – + – 16M 23456 10094 
2 – – + + + – – 63/9 23457 10508 
3 – – + + + + – Ether 23458 10509 
B. suis 
1 – + + (–) + – – 1330 23444 10316 
2 – – + – + – – Thomsen 23445 10510 
3 – – + + + – – 686 23446 10511 
4 – – + (–) + + – 40 23447 11364 
5 – – + – – + – 513 ND 11996 
B. neotomae – + –d – + – – 5K33 23459 10084 
B. ovis + – + (–) – – + 63/290 25840 10512 
B. canis – – + (–) – – + RM6/66 23365 10854 
B. ceti (–) – (+) (+) + (–) – 
B1/94 
BCCN 94-74 
ND 12891 
B. pinnipedialis (+) – + (+) (+) (–) – 
B2/94 
BCCN 94-73 
ND 12890 
B. microti – – + + – + – 
CCM4915 
BCCN 07-01 
CAPM 6434 
ND ND 
B. inopinata – + + + – +e 
BO1 
BCCN 09-01 
CAPM 6436 
ND ND 
B. papionis – – – – + – – 
F8/08-60 
CIRMBP 0958 
ND 13660 
De Alton et al. (1988), Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis (1986), 
Whatmore (2009), y Whatmore et al. (2014). 
(+)/(–) La mayoría de cepas son positivas/negativas 
a Concentración de tinción en el agar dextrosa con suero: 20 µg/ml 
b Normalmente positiva en el aislamiento primario 
c Para diferenciar entre la bv. 3 y la 6, también se usa tionina a 40 µg/ml: bv 3 = +, bv 6 = – 
d Crecimiento a una concentración de 10 µg/ml de tionina 
e Aglutinación débil 
ND Por determinar 
 
 
2 http://www.the-icsp.org/taxa/Brucellalist.htm 
http://www.the-icsp.org/taxa/Brucellalist.htm
No existe ninguna prueba serológicaque sea adecuada en todas las situaciones epidemiológicas ni en todas las 
especies animales; todas tienen limitaciones, sobre todo cuando se trata de detectar la enfermedad en animales 
aislados. Para una interpretación o aplicación diagnóstica concreta, se deben tener en cuenta todos los factores 
que influyen en la idoneidad del método analítico y en los resultados de la prueba. En unidades epidemiológicas 
en las que se practique la vacunación con Brucella lisa, y dependiendo del método de vacunación que se utilice, 
pueden esperarse reacciones serológicas positivas en animales vacunados porque los anticuerpos presentan 
reacción cruzada con la infección por la cepa natural. Además, varias bacterias, en concreto Yersinia 
enterocolitica O:9, pueden inducir respuestas humorales que causen reacciones serológicas positivas falsas 
(FPSR) en pruebas de detección de la brucelosis, lo cual impedirá un diagnóstico serológico exacto. Estas FPSR 
pueden tener lugar en todas las especies animales a niveles variables según el momento y la región. 
La prueba de la seroaglutinación (SAT) en general se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. 
La prueba de la fijación del complemento (CFT) es más específica que la SAT y además posee un sistema 
estandarizado de concepto unitario. Las características de rendimiento diagnóstico de algunos 
enzimoinmunoanálisis (ELISA) y de la prueba de polarización de la fluorescencia (FPA) son similares o 
superiores a las de la CFT y, como son técnicamente más fáciles de ejecutar y más robustas, pueden ser 
preferibles. Se ha realizado una comparación entre los rendimientos diagnósticos de varias de estas en ganado 
bovino, pequeños rumiantes y suidos. 
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de 
aglutinación en placa con antígeno tamponado (BPAT), así como el ELISA y la FPA se consideran pruebas de 
cribado adecuadas. En función del objetivo de la prueba, las reacciones positivas deben comprobarse de nuevo 
utilizando un método confirmativo o complementario adecuado. 
En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano o europeo (Bison bison, 
Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus bactrianus y 
C. dromedarius) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sp. sigue un curso similar al que se 
observa en el ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos pero 
cada uno debe ser validado para la especie animal estudiada. 
Los estándares de referencia de la OIE son aquellos con los que se comparan y calibran todos los 
demás estándares. Estos estándares de referencia están a disposición de los laboratorios nacionales 
de referencia y deben utilizarse para establecer estándares secundarios o nacionales frente a los que 
puedan prepararse otros de trabajo para ser utilizados en el diagnóstico diario sistemático de 
laboratorio. 
Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Internacionales Estándar
3
. El 
uso de estos reactivos favorece la armonización internacional de las pruebas de diagnóstico y la 
estandarización de antígenos: 
i) Para la RBT, la CFT y la prueba del anillo de leche (MRT), se utiliza el Suero Estándar 
Internacional (OIEISS, anteriormente denominado Segundo Suero anti Brucella abortus 
Internacional de la OMS; OMS, 1953). Este suero es de origen bovino y contiene 1 000 UI (SAT) 
y 1 000 ICFTU (unidades internacionales de la prueba de fijación del complemento). 
ii) Para el ELISA indirecto (I-ELISA), el ELISA de competición o bloqueo (C-ELISA) y la FPA en 
ganado bovino, se dispone de tres sueros estándar de la OIE para ELISA. También son de 
origen bovino y contienen un estándar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), uno débilmente 
positivo (OIEELISAWPSS) y uno negativo (OIEELISANSS). 
iii) Para el I-ELISA, el C-ELISA y la FPA en ovejas y cabras, se usa el Suero Estándar Internacional 
anti-Brucella (ISaBmS) (McGiven et al., 2011). 
iv) Para el I-ELISA, el C-ELISA y la FPA en cerdos, todavía no existe ningún suero estándar 
internacional. 
 
3 Se pueden obtener en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la brucelosis, en el Reino Unido. 
Para la producción de antígeno para BBAT, SAT, CFT y FPA, siempre debe utilizarse la cepa 99 de 
Brucella abortus (Weybridge) (S99)
3
 o la cepa 1119-3 (USDA) (S1119-3)
4
 de B. abortus. Estas cepas 
de B. abortus también pueden utilizarse como fuente de extractos de antígeno soluble (lipolisacárido 
liso [S-LPS] o bien O-lipopolisacárido [OPS]) para los ELISA o las pruebas con Hapteno Nativo, pero 
la cepa 16M de B. melitensis también es adecuada para tal fin. Es importante destacar que el antígeno 
preparado con cualquiera de las dos cepas de B. abortus o con la cepa 16M de B. melitensis se utiliza 
en las pruebas de detección de cualquier infección por especies lisas de Brucella. 
Las cepas deben ser completamente lisas y no autoaglutinables en solución salina y acriflavina al 
0,1% (p/v). Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de B. abortus bv 1 o 
B. melitensis bv 1 que no necesitan CO2. Los cultivos de inóculo original deben propagarse para 
producir un lote de inóculo que tendrá cumplir las propiedades de estas cepas, y deben conservarse 
por liofilización o por congelación en nitrógeno líquido. 
Para la producción de antígeno, el cultivo del inóculo se utiliza para sembrar varios tubos de agar 
inclinado con medio de infusión de patata que se incuban a 37°C ± 2°C durante 48 horas. Los medios 
sólidos SDA y TSA, a los cuales se puede añadir un 5% de suero equino o suero de ternero neonato o 
un 0,1% de extracto de levadura, son satisfactorios con tal de que se utilice un inóculo adecuado, 
como se ha recomendado anteriormente. Se comprueba la pureza del crecimiento, se resuspende la 
cepa en PBS estéril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar capas de frascos Roux con medio sólido de 
infusión de patata o con glicerol-dextrosa. Estos se incuban luego a 37°C ± 2°C durante 72 horas con 
la superficie inoculada hacia abajo. La pureza del crecimiento se comprueba en cada frasco mediante 
la tinción de Gram, y los microorganismos se recogen añadiendo a cada frasco 50 – 60 ml de solución 
salina estéril con fenol (con un 0,5% de fenol en una solución de cloruro sódico al 0,85%). Los frascos 
se agitan suavemente, se decanta la suspensión, y los microorganismos se inactivan por 
calentamiento a 80°C durante 90 minutos. Después de una prueba de viabilidad, el antígeno se 
conserva a 5°C ± 3°C. 
Como alternativa, las células se pueden producir mediante cultivo en lote o continuo en un 
fermentador, en un medio líquido que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona 
de grado elevado (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato dihidrogenado de sodio (9 g) y 
fosfato hidrogenado disódico (3,3 g). El pH inicial es 6,6 (± 0,2), pero tiende a subir a 7,2 (± 0,2) 
durante el ciclo de crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de peptona y de extracto 
de levadura para producir un buen crecimiento sin formación de células anormales o disociadas. 
Durante el crecimiento puede ser necesario airear y remover vigorosamente, y ajustar el pH a 7,2 (± 
0,2) mediante la adición de HCl 0,1 M. El inóculo de siembra se prepara como se ha descrito 
anteriormente. El cultivo se incuba a 37 °C ± 0,2 °C durante 48 horas. El cultivo continuo puede 
mantenerse más tiempo, pero en este caso se precisa más experiencia. Para garantizar la pureza, 
deben realizarse controles durante el proceso del crecimiento tanto en medios sólidos como líquidos, 
un recuento de los microorganismos viables y comprobar que no hay disociación a formas rugosas. 
Debe comprobarse que las células que vayan a ser utilizadas en la preparación de todos los antígenos 
sean puras y lisas enla fase de recogida. 
El cultivo se recoge mediante centrifugación para precipitar los microorganismos, que se resuspenden 
en solución salina estéril con fenol. Los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80°C 
durante 90 minutos y se conservan a 5°C ± 3°C. Deben formar suspensiones estables en solución 
salina fisiológica sin evidencia alguna de autoaglutinación. Con las suspensiones se debe realizar una 
prueba de viabilidad sin que se evidencie crecimiento alguno después de una incubación de 10 días a 
37°C ± 2°C. El volumen de células concentradas (PCV) en las suspensiones inactivadas puede 
determinarse centrifugando volúmenes de 1 ml en tubos Wintrobe a 3 000 g durante 75 minutos. 
Esta es una prueba sencilla de aglutinación puntual que utiliza antígeno coloreado con rosa de 
bengala y tamponado a pH bajo, normalmente a 3,65 + 0,05 (Morgan et al., 1969). 
 
4 Puede obtenerse en los National Veterinary Services Laboratories (NVSL) del Departamento de Agricultura de EE.UU 
(USDA), 1800 Dayton Road, Ames, Iowa, EE.UU. 
El antígeno para la RBT se prepara depositando células muertas de las cepas de 
B. abortus S99 o S1119-3, recogidas por centrifugación a 23 000 g durante 10 minutos a 
5°C ± 3°C, y resuspendiéndolas uniformemente en una solución salina con fenol (0,5%) a 
razón de 1 g por cada 22,5 ml. (Nota: si se utiliza carboximetilcelulosa sódica como 
agente sedimentador durante la preparación del concentrado celular, los residuos 
insolubles deben eliminarse antes de la tinción filtrando la suspensión por un prefiltro 
AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensión se añade 1 ml 
de rosa de bengala al 1% (p/v) (CI Nº 45440) en agua destilada estéril, y la mezcla se 
remueve durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra a través de una 
gasa estéril y se centrifuga a 10 000 g para depositar las células teñidas, que a 
continuación se resuspenden uniformemente a razón de 1 g de células por 7 ml de 
diluyente (21,1 g de hidróxido de sodio disueltos en 353 ml de solución salina estéril con 
fenol, seguidos de 95 ml de ácido láctico, que se ajusta a 1 056 ml con solución salina 
estéril con fenol). El color de esta suspensión debe ser un rosa intenso y el sobrenadante 
de una muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser de 3,65 + 0,05. 
Después de la filtración a través de una gasa, la suspensión se filtra dos veces a través 
de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius Nº 13430, se ajusta a un PCV de 
aproximadamente el 8%, dependiendo de la estandarización final frente a un suero 
calibrado contra el OIEISS, y se conserva a 5°C ± 3°C en la oscuridad. El antígeno debe 
conservarse siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. No debe congelarse. 
Cuando se utiliza en la prueba estándar, el antígeno para la RBT debe dar una reacción 
positiva clara con una dilución 1/45 del OIEISS diluido en solución salina normal o con 
fenol al 0,5%, pero no a una dilución de 1/55. 
Pueden realizarse otras comprobaciones con el ISaBmS. Se ha determinado que la 
dilución más alta (en suero de cabra negativo) de este estándar que debe dar un 
resultado positivo y la dilución más baja (en suero de cabra negativo) que debe dar al 
mismo tiempo un resultado negativo son 1/16 y 1/200, respectivamente (McGiven et al., 
2011). 
También es aconsejable comparar la reactividad de lotes de antígeno nuevos y 
previamente estandarizados empleando un conjunto de sueros de referencia bien 
definidos. 
No obstante, la estandarización anterior respecto al OIEISS probablemente sea una 
causa de baja sensibilidad de algunos lotes de antígeno RB para el diagnóstico de 
infección por B. melitensis en pequeños rumiantes y de discrepancias respecto a la CFT 
(Blasco et al., 1994a). Al analizar pequeños rumiantes, las discrepancias respecto a la 
CFT pueden minimizarse usando tres volúmenes de suero y uno de antígeno (por 
ejemplo, 75 μl y 25 μl, respectivamente) en lugar de un volumen igual de cada uno como 
se indica en el procedimiento analítico estándar. No obstante, esta modificación de la RBT 
no debe recomendarse para analizar sueros de ganado bovino o porcino. 
i) Se llevan las muestras de suero y el antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4°C). Debe 
sacarse de la nevera solo el antígeno necesario para las pruebas del día. 
ii) Se depositan 25–30 µl de cada muestra de suero sobre una baldosa blanca, placa 
esmaltada o de plástico, o en una placa para hemaglutinación de la OMS. 
iii) Se agita bien el frasco de antígeno, pero suavemente, y se deposita el mismo volumen de 
antígeno cerca de cada gota de suero. 
iv) Inmediatamente después de añadir la última gota de antígeno a la placa, se mezclan 
cuidadosamente el suero y el antígeno (usando un porta limpio o una varilla de plástico 
para cada prueba) hasta producir una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de 
diámetro. 
v) La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente (22°C ± 4°C) 
en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reacción es oval o circular, 
respectivamente). 
vi Se comprueba la aglutinación justo a los 4 minutos. Cualquier reacción visible se 
considera positiva. Debe analizarse un suero control que dé una reacción positiva mínima 
antes de comenzar las pruebas de cada día para comprobar la sensibilidad de las 
condiciones de la prueba. 
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serológica, a veces puede 
originar una reacción positiva debido a vacunación con la cepa S19 de B. abortus o a 
reacciones serológicas positivas falsas (FPSR). Y este mismo fenómeno tiene lugar en los 
pequeños rumiantes o los cerdos afectados por FPSR y en los pequeños rumiantes 
vacunados con la cepa Rev.1 de B. melitensis. Por lo tanto, las reacciones positivas 
deben confirmarse con sistemas confirmativos y/o complementarios (que incluyan la 
investigación epidemiológica). En ocasiones muy infrecuentes se producen falsos 
negativos serológicos. Sin embargo, la RBT parece adecuada como prueba para detectar 
rebaños infectados o para garantizar la ausencia de infección en rebaños o manadas 
libres de brucelosis. 
El antígeno para la BPAT se prepara a partir de la cepa S1119-3 de B. abortus siguiendo 
el procedimiento descrito por Angus y Barton (1984). 
Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta 
(1 g/100 ml) de calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las 
dos soluciones se conservan por separado durante 24 horas, y luego se mezclan en 
volúmenes iguales en una botella opaca y se conservan en una nevera durante no menos 
de 6 meses antes de su uso. La mezcla de colorantes solo puede utilizarse entre 6 y 
12 meses después de su preparación inicial. 
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidróxido de sodio (150 g) en 3 
– 4 litros de solución salina estéril con fenol. A esta solución se añade ácido láctico (675 
ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros añadiendo solución salina estéril con fenol. El pH 
de la solución debe ser de 3,65 ± 0,05. 
Las células concentradas de B. abortus S1119-3 se diluyen a una concentración de 
250 g/litro en solución salina estéril con fenol; se añaden 6 ml de colorante por litro de 
suspensión celular, y la mezcla se agita antes de ser filtrada por algodón absorbente 
estéril. Las células se centrifugan a 10000 g a 5°C ± 3°C y las células concentradas se 
resuspenden a continuación a una concentración de 50 g/100 ml en diluyente tamponado 
(como se ha descrito anteriormente). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y 
después se diluye añadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de células 
resuspendidas (es decir, a una concentración final de 50 g de células 
concentradas/400 ml de diluyente tamponado). La mezcla se remueve a temperatura 
ambiente durante 20–24 horas antes de que la concentración celular se ajuste al 11%(p/v) con diluyente tamponado. Esta suspensión se remueve durante toda la noche antes 
de ser analizada. Pendiente de las pruebas de control final de calidad, el antígeno se 
conserva a 5°C± 3°C hasta su utilización. El antígeno no se debe congelar. 
El pH del antígeno tamponado en placa debe ser de 3,70 ± 0,03, y el pH de una mezcla 
de suero/antígeno a una proporción de 8:3 debe ser de 4,02 ± 0,04. La suspensión al 11% 
de células teñidas debe ser azul-verdosa. Cada lote de antígeno tamponado en placa 
debe comprobarse con al menos 10 sueros de reactividad débil, y los resultados deben 
compararse con uno o más lotes previos de antígeno. Si es posible, los lotes de antígeno 
deben compararse con el antígeno estándar preparado por el NVSL, USDA (la dirección 
se indica en la nota 4 a pie de página). Sin embargo, no se dispone de ningún 
procedimiento establecido de estandarización internacional ni para el OIEISS ni para el 
ISaBmS. 
i) Se llevan las muestras de suero y el antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4°C). Debe 
sacarse de la nevera solo el antígeno necesario para las pruebas del día. 
ii) Se agita bien la muestra. Se depositan 80 µl de cada muestra de suero en una placa de 
vidrio marcada con cuadros de 4 × 4 cm. 
iii) Se agita bien la botella de antígeno, pero con suavidad, y se depositan 30 µl de antígeno 
cerca de cada gota de suero. 
iv) Inmediatamente después de añadir la última gota de antígeno a la placa, se mezclan 
completamente el suero y el antígeno (utilizando un vaso limpio o una varilla de plástico 
para cada prueba) hasta producir una zona circular de unos 3 cm de diámetro. 
v) Después de la mezcla inicial, la placa se rota tres veces con inclinación para asegurar la 
dispersión homogénea de los reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en 
una cámara húmeda. 
vi) Se extrae la placa y se rota como antes, y se vuelve a incubar otros 4 minutos. 
vii) Se lee de inmediato la aglutinación una vez transcurridos 8 minutos. Toda reacción visible 
se considera positiva. Debe analizarse un suero control que dé una reacción positiva 
mínima antes de comenzar las pruebas de cada día para comprobar la sensibilidad de las 
condiciones de la prueba. 
Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la detección de 
anticuerpos inducidos por la vacuna, y las muestras positivas deben volver a analizarse 
con pruebas confirmativas y/o complementarias. Pueden producirse falsos negativos, 
debidos por lo general a fenómenos de prozona, que pueden eliminarse diluyendo el 
suero o volviendo a analizarlo después de cierto tiempo. Aunque en algunos países la 
BPAT se ha usado mucho para pequeños rumiantes y cerdos, aparentemente con buenos 
resultados, su valor diagnóstico en estas especies no se ha comprobado a nivel 
internacional. 
La CFT se utiliza mucho pero es difícil de ejecutar y requiere unas buenas instalaciones y una 
formación específica del personal para titular y conservar los reactivos adecuadamente. Existen 
muchas variaciones de la CFT, pero esta prueba se suele realizar de forma más cómoda en formato 
de microtitulación. Para la incubación de suero, antígeno y complemento, se puede utilizar la fijación 
en caliente o en frío: 37 ± 2°C durante 30 minutos o 5°C ± 3°C durante 14–18 horas. Varios factores 
influyen en la elección del método: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja 
calidad es más evidente con la fijación en frío, mientras que a 37 ± 2°C aumenta la frecuencia e 
intensidad de las prozonas, y se deben probar varias diluciones para cada muestra. 
Se han propuesto varios métodos para la CFT en los que se utilizan diferentes concentraciones de 
eritrocitos de oveja (SRBC) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2, 
2,5 o 3%). Los SRBC están sensibilizados con un volumen igual de suero de conejo anti-SRBC diluido 
hasta contener varias veces (en general de dos a cinco) la concentración mínima necesaria para 
producir un 100% de lisis de SRBC en presencia de una solución titulada de complemento de cobaya. 
El último se titula independientemente (en presencia o ausencia de antígeno, según el método) para 
determinar la cantidad de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de los 
SRBC sensibilizados por unidad de volumen de una suspensión estandarizada; estas se definen como 
la unidad hemolítica de complemento al 50% o al 100%/ dosis hemolítica mínima (C‟H o MHD50 o C‟H 
o MHD100), respectivamente. Se suele recomendar titular el complemento antes de cada serie de 
pruebas, siendo preferible un macrométodo para la determinación óptima de C‟H50. Normalmente se 
utilizan en la prueba 1,25 – 2 C‟H100 o 5–6 C‟H50. 
El diluyente estándar para la CFT es una solución salina tamponada con barbital (veronal). Se prepara 
con comprimidos comerciales; como alternativa, se puede preparar a partir de una solución madre de 
cloruro sódico (42,5 g), ácido barbitúrico (2,875 g), dietil barbiturato sódico (1,875 g), sulfato 
magnésico (1,018 g) y cloruro cálcico (0,147 g) en 1 litro de agua destilada, y se diluye antes de 
utilizarla añadiendo cuatro volúmenes de una solución de gelatina al 0,04%. No obstante, este tampón 
contiene derivados barbitúricos que en muchos países ya no se consiguen. También pueden 
obtenerse resultados satisfactorios con una solución de cloruro sódico sin barbitúrico al 0,85% que 
contenga calcio y magnesio, preparada a partir de 1 ml de una solución madre con cloruro de 
magnesio 1M y cloruro de calcio 0,3 M (MgCl2 anhidro: 9,5 g; CaCl2: 3,7 g; agua purificada: hasta 
100 ml) (se conserva en pequeñas cantidades a 5°C ± 3°C) hasta 1 litro de solución salina (Alton et 
al., 1988). El pH es crítico y debe ajustarse estrictamente a 7,35 (± 0,05). La sustitución del tampón 
veronal por este tampón sin barbitúrico ha sido validada por el Laboratorio de Referencia de la OIE 
para la Brucelosis, en Francia
5
. 
Existen numerosas variaciones de la prueba, pero sea cual sea el procedimiento, debe 
emplearse un antígeno preparado a partir de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la 
 
5 Puede obtenerse en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, en Francia. 
S99 o la S1119-3, y que esté estandarizado frente al OIEISS. El antígeno para la CFT puede 
prepararse mediante procedimientos especializados (Alton et al., 1988), o bien deben utilizarse 
células enteras diluyendo la suspensión madre de modo que el PCV de la suspensión de 
antígeno concentrado para la CFT sea aproximadamente del 2% antes de la estandarización 
frente al OIEISS. 
El antígeno debe estandarizarse para dar una fijación del 50% a una dilución 1/200 del OIEISS 
y debe mostrar también una fijación completa a diluciones más bajas de suero, porque una 
concentración demasiado débil (o demasiado fuerte) de antígeno puede no producir un 100% 
de fijación a diluciones de suero más bajas. Cuando son adecuadas dos diluciones de 
antígeno, debe escogerse la suspensión de antígeno más concentrada para evitar el fenómeno 
de prozona. El aspecto del antígeno a una dilución de 1/10 debe ser el de una suspensión 
blanca, uniforme y densa, sin agregación visible ni formación de depósito después de incubarla 
a 37°C ± 2°C durante 18 horas. No debe producir efectos anticomplementarios a la 
concentración de trabajo utilizada para la prueba. El antígeno se conserva a 5°C ± 3°C y no 
debe congelarse. 
Los sueros problema sin diluir y los estándares de trabajo adecuados se inactivan durante 
30 minutos en un baño de agua a 60°C ± 2°C. Si previamente se han diluido a la mitad con una 
solución salina tamponada con veronal, se pueden inactivar a 58°C ± 2°C durante 50 minutos. 
En general, solo se analiza sistemáticamente una dilución del suero (generalmente a 1/4 o 1/5, 
dependiendo del procedimiento de CFT escogido), pero para el comercio o cuando se hayan 
comprobado signos clínicos, se recomiendan diluciones seriadas a efectos