4to teo CULTIVO CELULAR

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Para abordar el estudio de las células debo determinar QUE QUIERO ESTUDIAR; luego se 
debe determinar DÓNDE SE QUIERE ESTUDIAR; a su vez → lo que se desea estudiar → ¿se 
desea estudiar en la célula entera o en compartimentos aislados (esto se conoce como 
sistema libre de células)?. Una vez sabido todo esto → se debe elegir que metodología se 
va utilizar → TÉCNICAS QUE PERMITEN EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS → por ejemplo, si yo quisiese 
estudiar la ultra estructura de la célula → podría elegir la microscopía. 
SISTEMA BIOLÓGICO DE ESTUDIO → es el sistema del cual yo quiero estudiar alguna 
característica celular. El sistema biológico de estudio puede ser: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cultivo celular 
4° T E O R I C O 
SISTEMAS BIOLÓGICOS DE ESTUDIO 
IN VIVO IN VITRO 
La muestra se obtiene 
directamente del individuo. 
Todos los experimentos que se 
realizan fuera del organismo. 
Cuando la muestra se obtiene de un ser 
vivo se denomina BIOPSIA. 
Si el animal de experimentación fue 
sacrificado y se obtienen sus órganos o si 
se obtiene una muestra de una persona 
ya fallecida → se denomina NECROPSIA. 
En el caso de que la muestra sea un 
órgano entero → ÓRGANO O TEJIDO 
AISLADO. 
Si por ejemplo, de un riñón extraído de 
una rata, se extraen los túbulos colectores 
para su estudio → SON ESTRUCTURAS 
AISLADAS. 
A partir de una estructura aislada se 
podrían separar las células que la 
constituyen → se tendrían CÉLULAS 
AISLADAS. 
Si se requiere de una gran cantidad de 
células para el estudio, más que las que 
obtuve a partir del órgano → se puede 
realizar un CULTIVO CELULAR → para 
obtener CÉLULAS EN CULTIVO. 
Libre de células 
Aquel que está 
compuesto por los 
compartimentos aislados. 
Estos compartimentos 
aislados se pueden 
obtener a partir de un 
procedimiento 
denominado 
FRACCIONAMIENTO 
CELULAR. 
Las células que se 
mantienen por mucho 
tiempo y en gran 
cantidad se mantienen 
gracias a TÉCNICAS DE 
CULTIVO CELULAR. 
CULTIVO CELULAR → es un conjunto de técnicas que permiten el crecimiento y el 
mantenimiento de las células fuera de un organismo, es decir “in vitro”, preservando sus 
propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. 
Estos cultivos pueden realizarse obteniendo la muestra a partir de un animal de 
experimentación, de un humano o también se puede cultivar líneas celulares. 
Obtención de células para la realización de un 
cultivo celular 
Para realizar el aislamiento de células de un tejido → se debe tener en cuenta que tipo de 
tejido se tiene. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AISLAMIENTO DE CÉLULAS DEL TEJIDO 
Consistencia líquida Consistencia sólida 
Se puede tener un tejido cuya 
consistencia sea líquida → por 
ejemplo la sangre o la médula 
ósea. 
MANERAS DE SEPARAR CÉLULAS DE UN 
TEJIDO LÍQUIDO: 
Centrifugación en gradiente 
Afinidad e imanes (DYNABEDS) 
TUBOS TIPO FALCON → se agrega una sustancia llamada Ficoll-Paque → cuando se 
centrifuga a esta sustancia, es capaz de formar gradiente. En general se pone en el 
tubo, arriba de la muestra de Ficoll, la sangre completa y luego se la centrifuga → 
luego se observa que → la muestra se separó y los glóbulos rojos que están en mayor 
cantidad y son más pesados van hacia el fondo del tubo; en la mitad del tubo se 
encuentran los glóbulos blancos; y la parte superior, que no pudo penetrar el gradiente 
→ es el plasma. CON ESTE PROCEDIMIENTO SE PUEDEN SEPARAR DISTINTOS TIPOS DE CÉLULAS. 
Dentro de la franja de glóbulos blancos hay 5 tipos celulares → si 
solo quisiese cultivar monocitos → debería separarlos mediante la 
técnica de afinidad e imanes. ESTA TÉCNICA SE UTILIZA TANTO PARA 
SEPARAR CÉLULAS COMO PARA SEPARAR MOLÉCULAS O 
COMPARTIMIENTOS CELULARES. En el PRIMER TUBO → se tiene, por 
ejemplo, la mezcla de glóbulos blancos obtenida en la 
centrifugación. Cada célula presenta, en su superficie, proteínas o 
moléculas que son típicas y únicas de cada tipo celular → a esto se 
lo denomina ANTÍGENO DE SUPERFICIE. Se agrega al tubo bolitas 
magnéticas 
Una vez que se tiene a la célula aislada → se la 
recoge en un TUBO DE TIPO EPPENDORF → una vez 
que éste es centrifugado, las células que 
sedimentaron quedan al fondo (se denomina a 
esto PELLET); el líquido que queda por encima 
de las células es denominado SOBRENADANTE → 
se descarta el sobrenadante y se queda con el 
pellet → se lo traslada a un recipiente para 
poder realizar el cultivo celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ya sea que se utilice citometría de flujo, afinidad por imanes o centrifugación → todas son 
maneras de separar distintos tipos celulares de un tejido líquido. 
AISLAMIENTO DE CÉLULAS DE TEJIDO CON 
CONSISTENCIA SÓLIDA 
 
 
 
 
 
 
Citrometría de flujo (FACS) 
magnéticas → ÉSTAS BOLITAS ESTÁN UNIDAS A UN ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA EL ANTÍGENO DE SUPERFICIE 
ESPECÍFICO DE LA CÉLULA QUE SE QUIERE SEPARAR, en este caso monocito. 
ENTONCES → se agrega la bolita con el anticuerpo específico → una vez que la bolita con su 
anticuerpo entra en contacto con las células → el anticuerpo reconocerá con alta especificidad 
por complementariedad molecular al antígeno de superficie. De esta manera, siguiendo con el 
ejemplo → todos los monocitos quedarán unidos al anticuerpo que a su vez tiene unida la bolita 
magnética. AL FINAL DEL PROCEDIMIENTO → se aplica un imán potente sobre la superficie del tubo y 
donde esté éste quedaran adheridas todas las células que hayan sido unidas por las partículas 
magnéticas con el anticuerpo. En la solución quedarán aquellas células que no contenían el 
antígeno. DYNABEDS ES UNA MARCA DE BOLITAS MAGNÉTICAS. 
Otra manera en que se podrían separar monocitos de la 
solución de glóbulos blancos → sería utilizando la 
citometría de flujo → ES LA SEPARACIÓN DE CÉLULAS 
ASISTIDAS POR FLUORESCENCIA. 
En ese caso → hay que marcar al linfocito con el 
anticuerpo, que en este caso será fluorescente. En la 
mezcla de linfocitos y monocitos se tendrá a los 
monocitos que no estén marcados (azules) y los que sí lo 
estén (verdes) → la mezcla de estos será introducida en 
un aparato llamado CITRÓMETRO DE FLUJO → atravesaran 
láseres que podrán detectar la emisión fluorescente y 
permitirán la separación a través de la marcación de la 
célula con fluorescencia → el pasaje a través de los 
láseres produce la separación de aquellas células que 
poseen fluorescencia de aquellas que no. LAS CÉLULAS 
QUE TIENEN EL FLUORESCENTE SON LAS DE INTERÉS. 
A PARTIR DE UNA BIOPSIA O UNA NECROPSIA → se pueden obtener tejidos, órganos o fluidos → 
a partir de estos se pueden obtener determinados tipos celulares → a los cuales se les dará 
condiciones de cultivo → y ese cultivo que se propagara dentro del material de cultivo en 
condiciones adecuadas → se denominará CULTIVO PRIMARIO ya que las células que se 
están cultivando fueron obtenidas en forma directa del organismo vivo (o un organismo 
recientemente fallecido) que se busca estudiar. 
VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DE CULTIVO → número de 
divisiones que llevan a cabo las células por unidad 
de tiempo. Representado en función de las 
generaciones celulares. 
CUANDO SE PONEN CÉLULAS OBTENIDAS A PARTIR DE UN 
ORGANISMO, O SEA, UN CULTIVO PRIMARIO → en las 
primeras generaciones, la velocidad de división es 
muy elevada → el número de divisiones de esas células por unidad de tiempo es muy alta 
→ FASE I. Llega un momento, a una determinada generación, donde la velocidad de 
división disminuye y se mantiene constante a lo largo de un gran número de generaciones 
celulares → a este momento se lo denomina FASE II. Luego, las células disminuyen 
rápidamente la capacidad de rapidez de división → FASE III → a este proceso por el cual 
la velocidad de división disminuye se lo denomina SENESCENCIA REPLICATIVA. 
Senescencia replicativa 
 es un proceso en el cual la velocidad dedivisión de la célula disminuye → ojo, NO 
SIGNIFICA QUE LA CÉLULA SE MUERA → SINO QUE TIENE BAJA CAPACIDAD DE DIVISIÓN; los 
órganos, en edad adulta, están casi todos en senescencia replicativa. 
 
 La senescencia replicativa es un FENÓMENO QUE SE OBSERVA TANTO IN VIVO COMO IN 
VITRO → se inicia cuando las células alcanzan el LÍMITE DE HAYFLICK → es el número de 
duplicaciones que puede sufrir la célula antes de alcanzar la senescencia → 50 
divisiones o generaciones. 
 
 En este proceso → LA CÉLULA QUEDA PERMANENTEMENTE DETENIDA EN LA FASE DEL CICLO 
CELULAR G0/G1 → no responderán a los mitógenos → son sustancias que estimulan la 
división celular. La célula no podrá ingresar a la fase S para la duplicación del ADN y 
por lo tanto no se puede dividir. 
 
 La senescencia se asocia al acortamiento de los telómeros. 
 
 
REPRESENTACIÓN DE UN CROMOSOMA DUPLICADO → 
ya pasó la fase S del ciclo celular. Hay partes del 
cromosoma que están formadas por ADN 
altamente repetitivo → el CENTRÓMERO y los 
TELÓMEROS → éstos últimos son las secuencias d 
AND que se encuentran en los extremos del 
cromosoma. Una de las funciones de los 
telómeros es “cerrar” el cromosoma → tener en 
el extremo, donde termina la secuencia de 
genes, una secuencia de ADN altamente 
repetitivita no codificable → protege la 
estabilidad del cromosoma. 
EN CADA DIVISIÓN → la longitud de los telómeros se acorta → esto debido al mecanismo de 
acción de la ADN-POLIMERASA habrá una cadena que quede sin su hebra complementaria 
→ para solucionar y evitar que se acorten los telómeros existe la enzima TELOMERASA → 
ésta es una transcriptasa reversa que utiliza un molde de ARN y → luego de la duplicación 
del cromosoma, aquellos extremos que hayan quedado más cortos serán reparados por 
la telomerasa → de manera que si el ADN es reparado y su longitud no se acorta, la célula 
puede seguir dividiéndose ya que sus cromosomas pueden seguir duplicándose y 
manteniendo la información genética. 
SIN EMBARGO → la actividad de la telomerasa es muy alta en las personas jóvenes; pero a 
medida que avanza la edad → la actividad de la telomerasa disminuye → y por ello, 
disminuye la longitud del telómero → ya que no puede ser reparado → entonces, en cada 
división celular se acortan. Para poder proteger el ADN que se encuentra en cada 
cromosoma → AL DISMINUIR LA ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA, LA CÉLULA ENTRA EN UN ESTADO 
SENESCENTE → DEJA DE DIVIDIRSE. 
POR OTRO LADO → al dejar de 
dividirse, las células quedarán 
detenidas en la transición G0/G1 
del ciclo celular. 
CICLO CELULAR → la célula pasa la 
mayor parte de su vida en 
interfase (período del ciclo 
donde la célula no se divide, no 
entra en mitosis) → la célula 
cuando no se divide está en la 
transición G0/G1. 
CUANDO LA CÉLULA RECIBE EL ESTÍMULO ADECUADO → comienza la duplicación del ADN en la 
fase S; terminando la fase S se tiene al cromosoma duplicado → cromosoma con dos 
cromátides. L 
LA FASE DE LA MITOSIS ES LA FASE M → acá se dividen los núcleos celulares y cada núcleo 
celular recibe una cromátide hermana de los cromosomas que se duplicaron. 
CUANDO LA CÉLULA QUEDA EN FASE G0/G1 → los cromosomas quedan allí en la célula; y las 
células no se vuelven a dividir. Para que las células pudieran dividirse deberían ser 
responsivas a señales desde el extracelular, a los MITÓGENOS → que serán SUSTANCIAS 
CAPACES DE ACTIVAR EL CICLO CELULAR. 
Los mitógenos activarán el ciclo celular a través de vías de señalización que van a 
provenir desde el exterior celular y llegaran hasta el núcleo celular activando una serie de 
mecanismos que permitirán a la célula que pase de la fase G0 a la fase G1 → y entre 
nuevamente en el ciclo celular. 
 
QUE LAS CÉLULAS PIERDAN LA SENESCENCIA Y READQUIERAN LA CAPACIDAD DE DIVISIÓN → se las 
denomina líneas celulares. Las líneas celulares pueden ser consecuencia de una 
transformación espontánea; también puede ser que la transformación no sea 
espontánea. Las células que se obtienen espontáneamente o por manipulación → no son 
tumorales → son una línea → lo que se hace es favorecer la división y hacer que no entren 
en senescencia replicativa. 
Otras células que también son líneas y que también se puede trabajar en ellas son células 
de trasnformación oncogénica → tienen su ADN mutado pero se muto dentro del 
organismo del cual se obtuvo. 
La mayor parte de las líneas celulares son líneas celulares de tejido epitelial o mesenquimal 
o embrionario. En general → las líneas celulares se compran. 
 
Requerimientos para que las células puedan 
crecer en cultivo 
Para que las células puedan crecer en cultivo se tiene 3 tipos de requerimientos 
necesarios. 
REQUERIMIENTOS PROPIOS DE LA CÉLULA 
 MEDIO NUTRICIO → Se necesita un MEDIO DE CULTIVO → éste ofrece aminoácidos, 
glucosa, vitaminas y sales a la célula. El medio de cultivo va a estar a un pH fisiológico 
adecuado (entre 7.2 y 7.4) y estará preparado con un agua especial. 
El medio de cultivo, habitualmente tiene color rojo, debido al indicador de pH → éste 
vira cuando la célula proliferó mucho en el cultivo, este metabólicamente muy activa 
y haya liberado al medio de incubación → CO2 → el CO2 hará que el medio vire del 
rojo al amarillo → esto es un indicador de que debe cambiarse el medio ya que se le 
están acabando los nutrientes; además → puede indicar que el crecimiento del 
cultivo en cuanto a la proliferación de las células ha sido muy alto y se debe hacer un 
subcultivo. 
Para que la célula pueda construir estructura y pueda obtener ATP → se necesita 
aminoácidos y glucosa. Al medio de cultivo → debe agregarse, además, SUERO FETAL 
BOBINO → no confundirse, éste no es el medio de cultivo, sino que se agrega como un 
componente del medio de cultivo. SE NECESITA AGREGÁRSELO AL MEDIO DEBIDO A DOS 
FACTORES: 
o porque en el medio de cultivo tengo factores de crecimiento (mitógenos) que 
estimularan para permitir el pasaje de G0/G1 a la fase S. EL SUERO ES FETAL → lo estoy 
obteniendo de un organismo que tiene alta cantidad de factores de crecimiento 
para que las células puedan recibir el estímulo adecuado y proliferar. 
o Además, el suero fetal bobino → TIENE ÁCIDOS GRASOS → son fundamentales, sin ellos 
→ las células no pueden construir membranas → y sin membranas no pueden 
dividirse. Los ácidos grasos provienen de las lipoproteínas plasmáticas. 
ENTONCES → SI NO SE LE APORTA SUERO FETAL BOBINO AL MEDIO DE CULTIVO → NO SE TENDRÍA 
FACTORES DE CRECIMIENTO NI ÁCIDOS GRASOS → O SEA, NO TENDRÍA APORTES PARA LA 
CONSTRUCCIÓN DE MEMBRANAS, NI MITÓGENOS. 
Otro factor importante → es el AGREGADO DE ANTIBIÓTICO → debido al proceso de 
manipulación → pueden ingresar bacterias u hongos al cultivo que lo contaminen. 
 
 SUPERFICIE DE CULTIVO → hay dos tipos de cultivos celulares 
o unos que crecen adheridos a un soporte, es decir → CRECEN EN MONOCAPA → en 
general son las células que provienen de los tejidos sólidos. 
o Otros CRECEN EN SUSPENSIÓN → nunca se adherirán al soporte porque en su fuente 
original tampoco estaban adheridas. Un ejemplo son las células de la sangre. 
AQUELLAS CÉLULAS QUE CRECEN EN MONOCAPA → necesitan, para poder crecer → 
tener mitógenos (que vienen en el suero que se agrega al medio de cultivo); necesitan 
estar en una densidad adecuada y necesitan generar lámina basal → para que las 
células generen matriz extracelular se han generado superficies sólidas que pueden ser de 
vidrio o de plástico, en las cuales → ese vidrio o ese plástico estará recubierto por una 
densidad de cargas o por alguna sustancia inductora de cargas → éstas sustancias con 
alta densidad de cargas, INDUCIRÁN QUE LA CÉLULA SINTETICE MATRIZ EXTRACELULAR Y 
FAVORECERÁN QUE LA CÉLULA SE ADHIERA AL SOPORTE → una vez que la célula se adhirió al 
soporte, la célula tratara de emitir prolongaciones (filopodios) para tratar de establecer 
contacto con células vecinas → en ese momentoSE ACTIVA LA DIVISIÓN DE LAS CÉLULAS EN 
CULTIVO → FAVORECIDA POR LOS MITÓGENOS QUE SE ENCUENTRAN EN EL MEDIO DE CULTIVO. 
 
ESTOS MATERIALES DEBEN ESTAR ESTÉRILES → para ello, el material viene esterilizado y separado 
en bolsas. Cuando las células crecen en suspensión → también se las cultiva en el mismo 
tipo de plástico o vidrio → con la diferencia de que debe ser plástico o vidrio que no haya 
sido tratado para células que crecen en monocapa → es un plástico sin tratar → no 
necesito una superficie que induzca la generación de matriz extracelular. También, en el 
caso de células que crecen en suspensión → se pueden usar tubos para cultivo, como los 
tubos de tipo falcon. 
 
 
 
Si se desea obtener 
GRANDES 
CANTIDADES DE 
CÉLULAS → lo hago 
en botellas → ya 
que tienen una 
gran superficie. 
CUANDO LAS CÉLULAS CRECEN EN MONOCAPA Y SE AGREGA LAS CÉLULAS AL RECIPIENTE DE 
CULTIVO → lo primero que hacen las células es adherirse a la superficie de cultivo gracias a 
que ellas comienzan a fabricar matriz extracelular inducida por el recubrimiento que tiene 
el soporte de cultivo. Al comienzo → se observaría como en el recuadro 10% → hay una 
muy baja densidad de células; CON EL PASO DEL TIEMPO → LAS CÉLULAS COMIENZAN A 
DIVIDIRSE Y LA DENSIDAD DE CÉLULAS AUMENTA → se va viendo en los cuadros. Las distintas 
densidades que alcanza el cultivo mientras crece → se los denomina distintos grados de 
confluencia. 
ENTONCES → las distintas densidades nos dan una idea del crecimiento de cultivo → y se 
habla de grado o PORCENTAJE DE CONFLUENCIA → el cual da una idea de la densidad de 
cultivo. 
CULTIVO CONFLUENTE → es aquel cultivo que alcanzo entre el 80% y el 100% de confluencia 
→ ocupó prácticamente toda la superficie de la placa de cultivo. Cuando el cultivo 
alcanzó entre el 80% y el 100% de confluencia → se dice que el cultivo llegó a confluencia 
total o que el cultivo esta confluente. EN GENERAL → cuando el cultivo está confluente, la 
velocidad del cultivo disminuye ya que se activa la inhibición de la división celular al 
establecerse múltiples contactos entre las células. 
CUANDO EL CULTIVO LLEGA A CONFLUENCIA TOTAL → SE DEBE HACER UN SUBCULTIVO. 
Los TRANSWELLS es una multicaja de petri; posee unos conos 
que tienen una superficie que es un filtro poroso en donde se 
siembra la célula. El Transwells permite cultivar células con 
condiciones determinadas → PERMITE GENERAR UN AMBIENTE 
MUY SIMILAR AL QUE LA CÉLULA TIENE EN SU ÓRGANO DE ORIGEN. 
Además → EL TRANSWELLS SIRVE PARA ESTUDIAR LA CAPACIDAD 
DE MIGRACIÓN CELULAR. 
 
Cultivo que se divide hasta ocupar toda la superficie → se tiene un CULTIVO BIDIMENSIONAL 
→ están a lo largo y a lo ancho del recipiente. Hoy ya hay tecnología que genera que los 
cultivos tengan, también, volumen → CULTIVOS TRIDIMENSIONALES → tienen un aspecto 
parecido a lo que se esperaría encontrar en el organismo. En general, para cultivos 
tridimensionales → se usa una TÉCNICA PARTICULAR → a las células se las crece EN GOTA. 
 
IMAGEN IZQUIERDA → caja de Petri llena de puntitos de medios de cultivo → éstos son gotas. 
Lo que se hace en este tipo de cultivos → es en cada gota sembrar una cantidad mínima 
(pero adecuada) de células → éstas gotas nunca se adherirán al soporte → ya que la 
caja con las gotas se apoyara de manera invertida. 
IMAGEN DERECHA → las células están en la gota → pero al no poder estar en contacto con 
la superficie de cultivo, las células no se pegan a la superficie de cultivo → comienzan a 
aglutinarse entre ellas y empiezan a establecer interacciones entre ellas → de manera tal 
que el CULTIVO CREZCA EN FORMA DE ESFERA. ESTE TIPO DE CULTIVOS TRIDIMENSIONALES SE LO 
DENOMINA CULTIVO DE ESFEROIDES. 
CULTIVO DE ORGANOIDES → son cultivos 3D → pero ya no son de un solo tipo celular, tendrán 
diversos tipos celulares. CUANDO SE GENERA EL CULTIVO 3D SE OBTIENE ALGO SIMILAR A UN 
ÓRGANO. 
Requerimientos de asepsia/EQUIPAMIENTO 
Asepsia es el conjunto de procedimientos que impiden la presencia de bacterias, hongos 
y virus en el ambiente u objetos. Se debe trabajar en condiciones de asepsia para estar en 
condiciones de esterilidad. 
EN GENERAL → las condiciones de asepsia y el equipamiento se 
encuentran relacionadas. SE DEBE TRABAJAR EN CABINAS DE 
SEGURIDAD BIOLÓGICA (comúnmente conocidas como flujos 
laminares) → las cabinas tienen una serie de filtros que filtran el 
aire que ingresa ellas→ de manera que el ambiente que se 
encuentra dentro de la cabina esté en condiciones de 
asepsia. Todos los elementos que ingresen a la cabina deben 
estar esterilizados para asegurar que se encuentren libres de 
microorganismos → todo lo que ingresa a la cabina se rocía 
con alcohol 70%. 
Existen distintos tipos de cabinas de seguridad biológica: 
 DE TIPO 1 → son las que se usan cuando se manipula material, el cual es poco probable 
que cause enfermedades. Se utilizan para extraer ARN o filtración de medios. 
 DE TIPO 2 → son aquellas que se utilizan cuando el material manipulado puede generar 
enfermedades. Se suelen utilizar para trabajar con células tumorales humanas. 
 DE TIPO 3 → son aquellas que se utilizan cuando se manipulan agentes biológicos que 
pueden llegar a propagarse tanto al operador como a la población. 
 
 
 
Por ejemplo → todos los trabajos 
del COVID fueron realizados en 
cabinas de tipo 2 y 3. 
ADEMÁS DE TRABAJAR EN UNA CABINA DE SEGURIDAD SE NECESITAN: 
 MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES DE TRABAJO → se los puede esterilizar haciéndolos 
pasar por filtros que tengan un tamaño de poro de 0,22 micrones → este es el tamaño 
de poros que retienen a los microorganismos como bacterias y hongos. Esta operación 
debe hacerse dentro de la cabina de bioseguridad. 
 MATERIAL DE LABORATORIO Y DE CIRUGÍA → esterilizados por calor seco, en una estufa de 
esterilización; o en una autoclave que es una olla a presión; y otra forma de esterilizar 
material es a través de la radiación gamma → mediante esta generalmente se 
esteriliza los plásticos para cultivo. 
 OPERADOR Y AMBIENTE 
OTROS EQUIPAMIENTOS QUE SE REQUIEREN ADEMÁS DE LA CABINA DE BIOSEGURIDAD SON: 
 ESTUFA DE CULTIVO → una vez obtenidas las células y puestas en el recipiente con el 
medio adecuado → se les debe dar condiciones de cultivo para que proliferen → las 
estufas de cultivo mantienen una temperatura de 37°C, tienen una atmosfera que 
balancea el oxígeno y el CO2 en el aire que ingresa y mantiene una determinada 
humedad en el ambiente. 
 MICROSCOPIO INVERTIDO → el revolver está en la parte inferior del microscopio → de 
manera tal que el objetivo mirará desde abajo a las células pegadas en el recipiente 
sobre la platina. 
 TANQUES DE NITRÓGENO → se los necesita para almacenar las células de cultivo. El 
congelamiento de las células es secuencial → se las pone en un dispositivo y la 
temperatura va bajando un grado cada determinado período de tiempo → cuando 
se alcanzan los -130°C las células son llevadas al tanque de nitrógeno. 
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL CULTIVO CELULAR 
Ventajas 
 Obtención de grandes cantidades de células. 
 Obtención de poblaciones genéticamente homogéneas (clones). 
 Se puede realizar la manipulación genética. 
 Se puede estudiar la capacidad de diferenciación. 
 Se puede dar a los cultivos condiciones experimentales controladas. 
 Se puede criopreservar un cultivo. 
 Desventajas
 Por más que se pueden obtener poblaciones genéticamente homogéneas → en 
algún momento y a lo largo de los pasajes → puede haber una inestabilidad 
genética lo que puede llevar a una variación del genoma. 
 No están en las mismas condiciones que en el organismo → tienen perdida de la 
relación de la célula con la matriz extracelular y perdida de la relación de las 
células con sus células vecinas y con los factores humorales endócrinos provistos por 
el organismo. 
 Las células pueden sufrir desdiferenciaciones o transdiferenciaciones.El fraccionamiento celular es un CONJUNTO DE TÉCNICAS QUE PERMITE TENER FRACCIONES 
ENRIQUECIDAS O PURAS DE COMPARTIMIENTOS CELULARES. La separación se lleva a cabo a 
partir de ciertos protocolos que utilizan como método separativo, fundamentalmente → a 
la centrifugación. Hoy en día → a través de los dynabeds se separan vesículas celulares. 
EL FRACCIONAMIENTO CELULAR CONSTA DE DOS PASOS: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fraccionamiento celular 
Homogeneización Separación 
Es la disrupción o ruptura de las 
membranas celulares de manera tal 
que la célula libera todo su contenido a 
un medio de homogeneización. 
Si se trabaja con CÉLULAS AISLADAS → el 
proceso se denomina LISADO. 
Si se trabaja con TEJIDO U ÓRGANOS → el 
proceso se denomina HOMOGENADO. 
Existen varios métodos para obtener o 
un lisado o un homogenado: 
1. Shock hipotónico. 
2. Sonicación. 
3. Congelación-descongelación. 
4. Homogenizador mecánico. 
Una vez que se tienen todas las 
organelas en suspensión → la 
separación de las mismas se puede 
llevar a cabo por: 
 CENTRIFUGACIÓN 
a. Sacarosa isotónica 
b. Gradiente. 
 AFINIDAD → a través de los imanes 
(Dynabeds). 
La centrifugación, fundamentalmente, 
es una técnica de separación → 
permite SEPARAR O AISLAR PARTÍCULAS QUE 
ESTÁN SUSPENDIDAS EN UN LÍQUIDO de 
manera tal que → luego del proceso 
obtengo un sedimento o pellet y un 
sobrenadante. AL APLICAR LA FUERZA 
CENTRÍFUGA → AUMENTA UN DETERMINADO 
NÚMERO DE VECES LA FUERZA DE GRAVEDAD 
→ PARA AYUDAR A QUE LAS PARTÍCULAS 
SEDIMENTEN MÁS RÁPIDO. 
La “g” indica el aumento de la fuerza de 
la gravedad → si centrifugue algo 600 G 
→ quiere decir que aumento 600 veces 
la fuerza de la gravedad. 
Las revoluciones dependen del tipo 
de centrifuga del rotor. 
Una vez sometida la muestra a la centrifugación → quedan dos partes en el tubo: 
 El SEDIMENTO O PELLET → es la parte donde sedimentaron las partículas. 
 El líquido que queda por encima del pellet → SOBRENADANTE. 
 
CENTRIFUGA TÍPICA → el rotor es un recipiente donde se introducen los tubos cerrados 
(generalmente); rotor de ángulo fijo → el tubo solo se puede poner en una posición → 
inclinada con respecto del eje del rotor. Mediante esta técnica se puede centrifugar una 
muestra de sangre → la sangre, cuando se centrifuga en determinadas condiciones se 
separa en 3 fracciones: 
 FRACCIÓN INFERIOR → constituida por los glóbulos rojos → es el PELLET. 
 FRACCIÓN MEDIA → constituida por los glóbulos blancos. 
 FRACCIÓN SUPERIOR → constituida por el líquido en donde estaban suspendidas las 
células, o sea, el plasma → SOBRENADANTE. 
Para obtener un hematocrito → se necesita sangre anti coagulada. 
Dentro de los tubos → para obtener compartimientos aislados → no se puede partir de 
células enteras o de tejidos. Antes de someter a la muestra a una centrifugación se debe 
obtener los compartimentos separados → para esto se utilizan los PROCESOS DE 
HOMOGENEIZACIÓN. 
 
Homogeneización 
Es la disrupción o ruptura de las membranas celulares → esto permite que el contenido 
celular salga al medio de homogeneización. Hay diferentes maneras de lograr esto: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Shock o lisis 
hipotónica 
Si las células se 
someten a una 
solución cuya 
concentración en 
solutos es menor a 
la concentración de 
solutos intracelular 
→ se favorece que 
el líquido de la 
solución fluya desde 
el exterior hacia el 
interior → célula 
expandirá su 
volumen de manera 
tal que si la solución 
está 
adecuadamente 
preparada → SE 
PRODUCE LA LISIS 
CELULAR → se 
rompen sus 
membranas y libera 
su contenido al 
medio de 
homogeneización. 
sonicación 
Se utiliza un aparato 
llamado sonicador 
→ emite ondas de 
ultrasonido de alta 
frecuenta → estas 
producen una 
perturbación del 
líquido de 
homogeneización 
→ de manera tal 
que generan 
muchas burbujas → 
tanto fuera como 
dentro de la célula 
→ estas burbujas 
terminan 
generando 
disrupciones en la 
membrana celular. 
Si la frecuencia de 
ultrasonido es muy 
elevada, podría 
alterar también las 
proteínas que se 
desea estudiar. 
Este método de lisis 
suele usarse en células 
aisladas → y se 
somete a las células a 
soluciones que tienen 
una concentración de 
cloruro de sodio inferior 
a 130mM o una 
Osmolaridad < 280. 
Este método suele 
usarse en células 
aisladas. 
Congelación - 
descongelación 
Cuando el agua se 
congela se 
expande → 
produciendo 
alteraciones en la 
membrana 
plasmática. 
Cuando el tejido se 
descongela → la 
célula está dañada 
y libera su 
contenido. 
Homogeneizador 
mecánico 
Método usado por 
excelencia → torga un 
buen homogenado y 
una alta eficiencia de 
homogeneización. 
SE REQUIERE DE CIERTO EQUIPAMIENTO PARA HACER UN HOMOGENADO CELULAR. 
VASO DE TIPO POTER → en el cual debe entrar un VÁSTAGO cuya 
punta es de teflón → encastra perfectamente en el vaso 
dejando menos de un milímetro entre el teflón y el vidrio. 
La parte de metal del vástago se introduce en una cabeza de 
taladro → gira el vástago del homogeneizador → se debe 
subir y bajar el vaso que contiene la mezcla de 
homogeneización que contiene el tejido que se desea 
homogeneizar → luego de este proceso → el tejido se 
transformó en un homogenado. 
La homogenización se 
realiza en una solución de 
homogenización → ésta 
contiene sacarosa 0,25M → la cual es isotónica. Esta 
sacarosa se prepara en un buffer tris-clorhídrico, 25mM; 
debe prepararse a un pH de 7,4 a 4°C → ya que el pH 
del tris-clorhídrico varía con la temperatura. Además → la solución, generalmente, tiene un 
quelante de calcio y magnesio. 
Otra cosa que se debe tener además de la solución de homogeneización es hielo → ya 
que todo el procedimiento debe hacerse a baja temperatura. 
Células o tejido en suspensión 
→ se aplica el vástago con cabeza de 
teflón para disrumpir la membrana 
celular → obteniendo un homogenado 
que contiene todas las organelas 
celulares. Luego → a este homogenado 
se lo lleva a la centrífuga → la 
centrifugación es un proceso que 
permite separar cosas que están en 
suspensión → éstas, ante la fuerza de la 
gravedad, descienden formando el 
pellet. 
SE HACE UNA CENTRIFUGACIÓN → en donde 
SE AUMENTA SECUENCIALMENTE LAS 
VELOCIDADES DE CENTRIFUGACIÓN → HASTA 
QUE EN EL SOBRENADANTE YA NO QUEDEN 
COMPARTIMENTOS CELULARES EN SUSPENSIÓN → a esto se lo denomina → CENTRIFUGACIÓN 
DIFERENCIAL → ésta es secuencial y se la realiza en sacarosa isotónica → permite obtener 
fracciones enriquecidas en algún compartimiento → SON FRACCIONES IMPURAS. 
 
Centrifugación en sacarosa isotónica 
DIAGRAMA DE FLUJO → se lo aplica cuando se 
está obteniendo fracciones celulares. 
LO PRIMERO QUE SE HACE ES EL HOMOGENADO 
CELULAR → luego se centrifuga el tubo con el 
homogenado celular (a baja cantidad de 
g) → lo cual permite separar lo más pesado; 
en el sobrenadante quedarán cosas más 
livianas que no lograron sedimentar a esa 
velocidad; y en el pellet quedarán núcleos, 
células enteras que no se rompieron durante 
la homogeneización, citoesqueleto y 
grandes extensiones de membrana 
plasmática. 
LUEGO → al sobrenadante se lo expone 
nuevamente al proceso de centrifugación 
→ esta vez se aplican más velocidades de g 
→ se obtiene un pellet compuesto de 
mitocondrias, lisosomas y peroxisomas (y 
algún contaminante que puede haber 
quedado de la fracción nuclear). A ESTE 
PELLET SE LO SUELE DENOMINAR FRACCION MITOCONDRIAL. 
A ESTE PELLET SE LO VUELVE A CENTRIFUGAR → nuevamente a una mayor 
velocidad de g → se obtienen vesículas de membrana plasmática, 
vesículas de retículo endoplasmático y aparato de Golgi, vesículas de 
transporte → todo esto constituye la FRACCIÓN MICROSOMAL y a este 
pellet se lo denomina MICROSOMAS. LOS MICROSOMAS NO SON UN 
COMPARTIMIENTO, SINO UN SEDIMENTO FORMADOPOR VESICULAS DE 
DIFERENTES COMPARTIMIENTOS CELULARES QUE SE GENERARON COMO UN 
ARTEFACTO DE LA TÉCNICA. 
Las primeras centrifugaciones se realizan en una centrifuga de ángulo fijo común; la última 
centrifugación se realiza en una ultracentrífuga → la cual disminuye la temperatura y 
permite hacer vacío → ya que sin el vacío la fricción levantaría temperatura y arruinaría la 
muestra. 
 
Centrifugación en gradiente 
Existe otro tipo de rotor → denominado rotor VASCULANTE → con él se 
pueden hacer centrifugaciones en gradientes de densidad. Se 
coloca, por ejemplo, sacarosa en un tubo → y esta tendrá diferentes 
concentraciones a lo largo del tubo. El gradiente puede ser CONTINUO 
a lo largo de todo el tubo → e ir variando en cantidades pequeñas; o 
puede ser un GRADIENTE DISCONTINUO PREFORMADO. 
El homogenado se coloca en una CENTRÍFUGA DE 
ROTOR VASCULANTE → se centrifuga durante un 
determinado tiempo, en el cual las partículas más pesadas bajarán 
una distancia mayor que las partículas más livianas → se dice que se 
llega a un EQUILIBRIO EN LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN. ESTE TIPO DE 
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE SE DENOMINA “CENTRIFUGACIÓN EN 
GRADIENTE POR VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN”. 
DE ESTA MANERA → SE PUEDEN SEPARAR BANDAS → Y SE PUEDE OBTENER, POR 
EJEMPLO, UNA BANDA DE MITOCONDRIAS PURAS. 
CON ESTE TIPO DE CENTRIFUGACIÓN PUEDEN OBTENERSE FRACCIONES PURAS → 
podría partir de un homogenado o de la fracción mitocondrial cruda 
→ se la coloca en este tipo de gradiente → se lo somete a 
centrifugación → y separo mitocondrias, lisosomas y peroxisomas → y obtengo 3 
fracciones puras. 
Centrifugación de equilibrio de sedimentación 
ESTE TIPO DE CENTRIFUGACIÓN NO SE SUELE UTILIZAR 
PARA COMPARTIMIENTOS → SINO PARA MOLÉCULAS 
→ las moléculas se separan en base a su 
densidad → se van a equilibrar con la densidad 
que encuentren en el tubo. 
Este tipo de gradientes se autoforman en la 
centrífuga. Por ejemplo → cloruro de cesio → es 
un gradiente que suele usarse para la 
separación de moléculas de ADN → en la 
medida que se lo centrifuga → éste forma un 
gradiente que tendrá distintas densidades a lo 
largo del tubo → y las moléculas de ADN se van 
a ubicar, de acuerdo a su tamaño y a su 
densidad → en una u otra parte del tubo. 
Separación por afinidad (Dynabeds) 
Se pueden separar VESÍCULAS Y OTROS COMPARTIMIENTOS 
LIVIANOS de los homogenados celulares mediante el uso 
de Dynabeds. 
En el tubo → hay exosomas → son vesículas formadas 
dentro de la célula y luego liberados al extracelular. Las 
vesículas van a tener proteínas transmembranas 
caracterísricas. Se debe conjugar o unirle a la bolita 
magnética, un anticuerpo que reconozca esas proteínas → luego se pone la bolita 
magnética con el anticuerpo en el líquido que contiene a los exosomas → las bolitas, a 
través del anticuerpo, van a retener al exosoma → y con un imán podré separar todas las 
bolitas magnéticas que estarán reteniendo en su superficie a los exosomas → se descarta 
el líquido y se queda con las vesículas separadas del resto del homogenado. 
Entonces → para el fraccionamiento celular se debe formar un homogenado, y se debe 
separar a los distintos componentes del mismo mediante ciertas técnicas que pueden ser 
la centrifugación (por sacarosa isotónica o gradiente) o mediante afinidad por imanes. 
Caracterización de la fracción 
La caracterización de la fracción sirve para saber si obtuvimos lo que estábamos 
buscando obtener. PARA PODER CARACTERIZAR LA FRACCIÓN SE DEBE ESTUDIAR, EN LA FRACCIÓN 
OBTENIDA, ALGUNA MOLÉCULA QUE SEA CARACTERÍSTICA DE ELLA. 
POR EJEMPLO → si yo deseaba obtener una fracción mitocondrial cruda → para saber que 
realmente esta es la que obtuve → BUSCO ALGUNA MOLÉCULA QUE SEA CARACTERÍSTICA DE LAS 
MITOCONDRIAS → si esa molécula está presente quiere decir que tengo mitocondrias. 
TAMBIÉN SE PUEDE BUSCAR LA ACTIVIDAD DE ALGUNA ENZIMA QUE SEA EXCLUSIVA DE LA 
MITOCONDRIA → por ejemplo, una enzima del ciclo de Krebs.