2079-3480-cjas-54-01-113

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Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020. 113
Increase in the development of Pueraria phaseoloides (tropical Kudzu) 
due to tolerant acid rhizobia under acidity and low fertility conditions
Incremento del desarrollo de Pueraria phaseoloides (Kudzú tropical) por 
rizobios ácido tolerantes en condiciones de acidez y baja ertilidad
I. Hernández1, P. R. Rosales1, P. J. González1, J. F. Ramírez2, María C. Nápoles1 and Reneé Pérez1
I. Hernández: https://orcid.org/0000-0002-5760-816X
1Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas. Gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, CP 32 700.
2Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, Avenida Independencia, km 81/2 Boyeros, La Habana, Cuba.
Email: ionel@inca.edu.cu 
The effect of acid-tolerant rhizobia isolates on growth, nodulation 
and yield of tropical kudzu, grown under acidity conditions, was 
determined. By measuring the diameter of the colony and the 
number of viable cells, the pH tolerance of three Bradyrhizobium 
strains: K2, 1_2 and 2_4 was established under acidity conditions. 
Two inoculation tests of tropical kudzu were carried out: one under 
controlled conditions, and another in the field. The effect of acidity 
on nodulation, growth and yield of crop was determined. A simple 
classification ANOVA and a two-factor arrangement were used in 
the statistical analysis. The three strains of rhizobia were tolerant at 
pH 4.5. This condition did not decrease its dispersion in the Petri 
dish, the diameter of the colonies or the number of viable cells. 
The acidity did not decrease the nodulation or the growth of kudzu 
plants, inoculated with K2 and 1_2 under controlled conditions. The 
inoculation of kudzu with rhizobia isolates produced effectiveness 
in the biological fixation of nitrogen, more than 90 % of the total 
nodules, more than 75 % of the aerial dry mass yield, and more than 
45 % of the nitrogen content of the aerial biomass of plants, under 
field conditions. The elaboration and application of inoculants based 
on K2 and 1_2 would contribute to reducing the use of mineral 
fertilizers in soils affected by acidity.
Key words: Bradyrhizobium, stress, forages, growth. 
Se determinó el efecto de aislados de rizobios tolerantes a la acidez en el 
crecimiento, la nodulación y el rendimiento de kudzú tropical, cultivado 
en condiciones de acidez. Mediante la medición del diámetro de la 
colonia y el número de células viables se estableció, en condiciones de 
acidez, la tolerancia a pH 4.5 de tres cepas de Bradyrhizobium: K2, 1_2 
y 2_4. Se realizaron dos ensayos de inoculación de kudzú tropical: uno 
en condiciones controladas, y otro en campo. Se determinó el efecto de 
la acidez en la nodulación, crecimiento y rendimiento del cultivo. Se 
empleó un ANOVA de clasificación simple y un arreglo bifactorial en 
el análisis estadístico. Las tres cepas de rizobios resultaron tolerantes 
a pH 4.5. Esta condición no disminuyó su diseminación por la placa 
Petri, el diámetro de las colonias ni el número de células viables. 
La acidez no disminuyó la nodulación ni el crecimiento de plantas 
de kudzú, inoculadas con K2 y 1_2 en condiciones controladas. La 
inoculación de kudzú con los aislados de rizobios produjo efectividad 
en la fijación biológica del nitrógeno, más de 90 % de los nódulos 
totales, más de 75 % del rendimiento en masa seca aérea, y más de 
45 % del contenido de nitrógeno de la biomasa aérea de las plantas, 
en condiciones de campo. La elaboración y aplicación de inoculantes 
basadas en K2 y 1_2 contribuiría a disminuir el uso de fertilizantes 
minerales en suelos afectados por la acidez.
Palabras clave: Bradyrhizobium, estrés, forrajes, crecimiento. 
Approximately 50 % of the world's tropical soils are 
affected by acidity, a phenomenon that causes a major 
problem in world agricultural production (Vitorello 
2005 and Toledo 2016). In Cuba, more than 30 % are 
affected by this limitation (Hernández et al. 2015). 
One of the main factors that promote soil acidity is 
the indiscriminate use of acidifying mineral fertilizers 
(Goulding 2016).
The knowledge about the symbiosis established 
by diazotrophic bacteria, such as rhizobia, with 
leguminous plants has allowed the elaboration and use 
of biofertilizers made from these microorganisms, a 
practice that helps to reduce the application of mineral 
fertilizers (Saldaña 2017).
However, the soils acidity constitutes a limiting factor 
for establishing the interaction between legumes and 
rhizobia (Reeve et al. 2006).The low pH levels decrease 
the survival of these bacteria and the establishment of the 
plant. In addition, the processes of infection, nodulation 
and biological nitrogen fixation (BNF) are affected 
Aproximadamente, 50 % de los suelos tropicales del 
mundo está afectado por la acidez, fenómeno que causa un 
importante problema en la producción agrícola mundial 
(Vitorello 2005 y Toledo 2016). En Cuba, más de 30 % 
se encuentra afectado por esta limitante (Hernández et 
al. 2015). Uno de los principales factores que propician 
la acidez de los suelos es el uso indiscriminado de los 
fertilizantes minerales acidificantes (Goulding 2016). 
Los conocimientos acerca de la simbiosis que 
establecen bacterias diazotróficas, como los rizobios, con 
las plantas leguminosas han permitido la elaboración y 
el empleo de biofertilizantes elaborados basados en estos 
microorganismos, práctica que contribuye a disminuir 
la aplicación de fertilizantes minerales (Saldaña 2017). 
No obstante, la acidez de los suelos constituye un 
factor limitante para el establecimiento de la interacción 
entre las leguminosas y los rizobios (Reeve et al. 2006). 
Los bajos niveles de pH disminuyen la sobrevivencia 
de estas bacterias y el establecimiento de la planta. Se 
afectan además, los procesos de infección, nodulación 
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(Graham and Vance 2003).
Pueraria phaseoloides (tropical kudzú) is a forage 
legume that, in association with grasses, allows raising 
the protein level in the animals diet, and increasing 
the forage quality and digestibility (Carvalho da 
Paz et al. 2016). The inoculation of this crop with 
rhizobia strains, competitive and specific, promotes 
their growth, provides nitrogen to the soil and favors 
the accompanying and successive crops (Sarr et al. 
2016).
The inoculation of tropical kudzú with rhizobia that 
have a certain acidity tolerance is an interesting practice 
that could improve the establishment of the crop in soils 
affected by acidity.
The objective of this study was to determine the 
effect of acid-tolerant rhizobia isolates on growth, 
nodulation and yield of tropical kudzú, grown under 
acidity conditions.
Materials and Methods
Three Bradyrhizobium isolates (K2, 1_2 and 2_4) 
were used, from nodules of tropical kudzu (Hernández 
et al. 2013). To obtain pre-inoculums in 250 mL 
Erlenmeyers bottles, with 50 mL of the same liquid 
medium, a loop of the isolates, stored at 4 oC in test 
tubes with mannitol yeast agar (MY medium) (Vincent 
1970) and pH 6.8 was used . The cell concentration of 
cultures was fitted to 1x108 cells mL-1.
In the inoculation tests of the three bacterial 
isolates, under controlled culture conditions and in field 
conditions, tropical kudzu seeds were used, donated by 
the Estación Experimental de Pastos y Forrajes (EEPF) 
of Cascajal, Villa Clara. For the test under controlled 
conditions, the seeds were superficially disinfected 
with 70 % ethanol for 5 min. and scarified with 98 % 
sulfuric acid for 10 min. They were immersed in 25 % 
(v/v) sodium hypochlorite for 15 min. Then, they were 
washed ten times with sterile distilled water, under 
aseptic conditions. The seeds were placed on plates 
containing water agar (0.75 %) (m/v) and incubated at 
28 ºC in the darkness for 72 h.
Classification of bacterial isolates according to 
their tolerance to acidity. A loop of the bacterial 
cultures was grown in triplicateon plates containing 
solid MY medium, with pH 4.5 and 6.8. The culture 
technique described by de Oliveira and Magalhães 
(1999) was applied for this purpose (figure 1). Based 
on the acidity levels of the medium, this technique 
allows the bacteria to be classified as sensitive, 
moderately tolerant or tolerant, according to the 
areas of the plate that cover with their growth. In the 
experiment, the growth of the isolates at pH 6.8 was 
used as a control.
Plates were incubated at 28 ºC for 10 d and the 
areas covered by bacterial growth were monitored 
every two days. In addition, the colony diameter of 
the isolates was measured under both pH conditions, 
y fijación biológica de nitrógeno (FBN) (Graham y 
Vance 2003). 
Pueraria phaseoloides (kudzú tropical) es una 
leguminosa forrajera que, en asociación con gramíneas, 
permite elevar el nivel proteico en la dieta de animales, y 
aumentar la calidad y digestibilidad forrajera (Carvalho 
da Paz et al. 2016). La inoculación de este cultivo con 
cepas de rizobios, competitivas y específicas, promueve 
su crecimiento, aporta nitrógeno al suelo y favorece los 
cultivos acompañantes y sucesivos (Sarr et al. 2016). 
La inoculación de kudzú tropical con rizobios que 
poseen cierta tolerancia a la acidez constituye una 
práctica interesante que podría mejorar el establecimiento 
del cultivo en suelos afectados por la acidez. 
El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto 
de aislados de rizobios tolerantes a la acidez en el 
crecimiento, la nodulación y el rendimiento de kudzú 
tropical, cultivado en condiciones de acidez.
Materiales y Métodos
Se emplearon tres aislados de Bradyrhizobium (K2, 
1_2 y 2_4), provenientes de nódulos de kudzú tropical 
(Hernández et al. 2013). Para obtener pre inóculos en frascos 
Erlenmeyers de 250 mL, con 50 mL del mismo medio 
líquido, se utilizó una asada de los aislados, conservados a 
4 oC en tubos de ensayo con medio levadura manitol (LM) 
agar (Vincent 1970) y pH 6.8. La concentración celular de 
los cultivos se ajustó a 1x108 células mL-1. 
En los ensayos de inoculación de los tres aislados 
bacterianos, en condiciones controladas de cultivo y en 
condiciones de campo, se utilizaron semillas de kudzú 
tropical, donadas por la Estación Experimental de Pastos 
y Forrajes (EEPF) de Cascajal, Villa Clara. Para el ensayo 
en condiciones controladas, las semillas se desinfectaron 
superficialmente con etanol al 70 % durante 5 min. y 
se escarificaron con ácido sulfúrico al 98 % durante 
10 min. Se sumergieron en hipoclorito de sodio al 25 % 
(v/v) por 15 min. Luego, se lavaron diez veces con agua 
destilada estéril, en condiciones de asepsia. Las semillas 
se colocaron en placas que contenían agar agua (0.75 %) 
(m/v) y se incubaron a 28 ºC en la oscuridad durante 72 h. 
Clasificación de los aislados bacterianos según 
su tolerancia a la acidez. Una asada de los cultivos 
bacterianos se cultivó por triplicado en placas que 
contenían medio LM sólido, con pH 4.5 y 6.8. Se aplicó 
para ello la técnica de cultivo descrita por Oliveira y 
Magalhães (1999) (figura 1). Atendiendo a los niveles 
de acidez del medio, esta técnica permite clasificar 
las bacterias en sensibles, medianamente tolerantes o 
tolerantes, según las zonas de la placa que cubran con su 
crecimiento. En el experimento, se utilizó como control 
el crecimiento de los aislados a pH 6.8. 
Las placas se incubaron a 28 ºC durante 10 d y se 
monitorearon las zonas cubiertas por el crecimiento 
bacteriano cada dos días. Además, se midió el diámetro 
de colonia de los aislados en ambas condiciones de pH, 
a los seis y 10 d de incubación. Se tomaron los valores 
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Figure 1. Culture technique proposed by de Oliveira and Magalhães (1999) to classify rhizobia, according 
to the level of acidity they tolerate in the culture medium: growth area 1 (a loop rubbing several 
times in both directions), area 2 (four loops only in one direction), area 3 and 4 (same as area 2, 
but in other regions of the Petri dish). The scoring intervals for the rhizobia classification were: 
sensitive (1.00-2.00), moderately tolerant (2.01-3.00) and tolerant (3.01-4.00).
at 6 and 10 d of incubation. The diameter values of 
five colonies were taken in each of the replications 
per treatment.
Effect of pH on cell viability. Pre-inoculums of the 
three rhizobia isolates were used for inoculation in 
250 mL Erlenmeyers bottles, containing 50 mL of MY 
medium at pH 4.5 and 6.8, at a rate of 8 % (v/v). The 
cultures were maintained under agitation conditions at 
150 rpm for 56 hours and at a temperature of 28 °C. A 
completely randomized design with three repetitions was 
used for each isolate and pH condition.
The concentration of viable cells (CFU mL-1) in the 
logarithmic or exponential growth phase (56 h of culture) 
was determined by the serial dilution method (10-4-10-
6). The samples were cultured by dissemination in plates 
with solid MY medium at pH 6.8 and the plates were 
incubated at 28 °C for 10 d.
In vitro nodulation test. The disinfected, scarified 
and pre-germinated kudzu seeds with emerging roots 
(1-2 cm) were placed in glass bottles with 50 mL of 
semi-solid Norris and Date (1976) medium, at a rate of 
one seed per bottle and were inoculated with 1 mL of 
the isolates. Inoculants similar to those used in the test 
of the effect of pH on cell viability were used and ten 
plants per treatment were established in a completely 
random design.
The plants grew under controlled conditions, 
with photoperiod of 16 h daylight/8 h of darkness, 
at a day/night temperature of 26/22 oC and relative 
humidity of 7 %. Four weeks after inoculation it was 
determined: number of nodules in main root (NNmr), 
total nodulation (TN), number of effective nodules 
in the main root (NNemr), total (NteN) and dry 
mass of total nodules (DMtN) (g). The effectiveness 
of nodules was determined by observing a reddish 
coloration inside the nodules, characteristic of the 
leghemoglobin protein (Singh and Varma 2017). The 
dissection of nodules was made with stainless steel 
scalpel blades. The root length (cm), dry mass of the 
aerial part (DMA) (g) and dry mass of root (DMR) 
(g) were also determined.
Inoculation test in the field. The experiment was 
carried out in the Estación Experimental de Pastos 
y Forrajes (EEPF) of Cascajal, in Villa Clara, in a 
del diámetro de cinco colonias en cada una de las réplicas 
por tratamiento. 
Efecto del pH en la viabilidad celular. Se emplearon 
pre-inóculos de los tres aislados de rizobios para su 
inoculación en frascos Erlenmeyers de 250 mL, que 
contenían 50 mL de medio LM a pH 4.5 y 6.8, a razón 
de 8 % (v/v). Los cultivos se mantuvieron en condiciones 
de agitación a 150 rpm durante 56 h y a temperatura de 
28 ºC. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado 
con tres repeticiones para cada aislado y condición de pH.
Se determinó la concentración de células viables 
(UFC mL-1) en la fase logarítmica o de crecimiento 
exponencial (56 h de cultivo) mediante el método de las 
diluciones seriadas (10-4-10-6). Las muestras se cultivaron 
por diseminación en placas con medio LM sólido a pH 6.8 
y las placas se incubaron a 28 °C durante 10 d.
Ensayo de nodulación In vitro. Las semillas 
desinfectadas, escarificadas y pre germinadas de kudzú 
con raíces emergentes (1-2 cm) se colocaron en frascos 
de vidrio con 50 mL de medio Norris y Date (1976) 
semisólido, a razón de una semilla por frasco y se 
inocularon con 1 mL de los aislados. Se emplearon 
inoculantes similares a los que se utilizaron en el 
ensayo del efecto del pH en la viabilidad celular y se 
establecieron diez plantas por tratamiento en un diseño 
completamente aleatorizado.
Las plantas crecieron en condiciones controladas, 
con fotoperíodo de 16 h luz/8 h de oscuridad, a una 
temperatura día/noche de 26/22 oC y humedad relativa 
de 70 %. Cuatro semanas después de la inoculación se 
determinó:número de nódulos en raíz principal (NNrp), 
nodulación total (NNt), número de nódulos efectivos en 
la raíz principal (NNerp), total (NNet) y masa seca de los 
nódulos totales (MSNt) (g). La efectividad de los nódulos 
se determinó mediante la observación de una coloración 
rojiza en el interior de los nódulos, característica de la 
proteína leghemoglobina (Singh y Varma 2017). La 
disección de los nódulos se realizó con hojas de bisturí 
de acero inoxidable. Se determinó además, la longitud 
de la raíz (cm), masa seca de la parte aérea (MSA) (g) 
y masa seca de raíz (MSR) (g). 
Ensayo de inoculación en campo. El experimento se 
realizó en la Estación Experimental de Pastos y Forrajes 
(EEPF) de Cascajal, en Villa Clara, en un suelo gleysol 
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petroferric ferruginous nodular gleysol soil (Hernández 
et al. 2015). This soil has strongly acidic pH. The content 
of organic matter (OM), assimilable phosphorus (P2O5), 
calcium (Ca2+), magnesium (Mg2+), sodium (Na+), 
potassium (K+) and cationic exchange capacity (CEC) 
are low (Paneque et al. 2010 ) (table 1).
nodular ferruginoso petroférrico (Hernández et al. 2015). 
Este suelo presenta pH fuertemente ácido. El contenido 
de materia orgánica (MO), fósforo asimilable (P2O5), 
calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+), sodio (Na+), potasio 
(K+) y capacidad de cambio catiónico (CCB) son bajos 
(Paneque et al. 2010) (tabla 1).
Table 1. Chemical characteristics of the soil (0-20 cm deep) petroferric ferruginous nodular gleysol
pH H2O OM (%)
P2O5 
(mg 100 g-1)
Exchangeable cations (cmolc kg-1)
Ca2+ Mg2+ Na+ K+ CEC
4.7+0.2 2.50+0.09 1.3+0.3 3.51+0.12 1.10+0.03 0.08+0.01 0.11+0.02 4.80+0.16
The confidence intervals of each parameter are shown (Tukey, α =0. 05)
The soil preparation was carried out in a 
conventional way by means of ploughing, light 
harrow, crossing, harrowing and furrowing. No 
fertilizer or fertility enhancing products were applied. 
Plots with a total area of 21 m2 and a calculation 
area of 14 m2 were used (six rows 5 m long, 70 cm 
apart). Four treatments were established: one without 
inoculation and the remaining three with rhizobia 
isolates, all distributed in a random block design, with 
four replications.
The inoculation of kudzu seeds with the rhizobia 
isolates was carried out using the seed covering method 
at the time of sowing, at a rate of 200 mL of inoculum for 
every 50 kg of seeds. The kudzu was sown in rows, with 
doses of 8 kg of total seed ha-1 (2 kg of pure germinable 
seed per ha).
At 120 d after sowing, samples from 10 plants of 
each plot were taken and the total number of nodules 
and the percentage of total effective nodules were 
determined. The aerial part of the plants was placed in 
an oven at 70 ºC, for 72 h and the ADM was determined. 
The percentage of ADM (% ADM) was calculated by 
the relation between the ADM of the control treatment, 
without inoculation, and the inoculated.
The yield in aerial dry mass of the plants (YADM, 
t ha-1) was determined 180 d after sowing, from the 
equation: YinADM = (green mass x% ADM)/100. The 
percentage of nitrogen content of the aerial biomass 
in 200 g of green mass was evaluated by colorimetric 
methods (Paneque et al. 2010). The percentage of 
increase of this variable in the inoculated treatments 
with respect to the control without inoculation was also 
evaluated.
Statistical analysis. The data from the acidity 
tolerance tests in the culture medium were subjected 
to the normality test (Bartlett test) and variance 
homogeneity (Kormogorov-Smirnov test). Simple 
classification variance analysis was applied. The 
Tukey (P <0.05) means comparison test was used to 
discriminate differences between the means (Sigarroa 
1985).
A bifactorial arrangement was used with the 
inoculation test data under controlled conditions and the 
La preparación del suelo se realizó de forma 
convencional mediante labores de roturación, grada 
ligera, cruce, grada y surcado. No se aplicó fertilizante 
ni productos mejoradores de la fertilidad. Se emplearon 
parcelas con área total de 21 m2 y área de cálculo de 
14 m2 (seis surcos de 5 m de largo, separados a 70 cm). Se 
establecieron cuatro tratamientos: uno sin inocular y los 
tres restantes con aislados de rizobios, todos distribuidos 
en un diseño de bloques al azar, con cuatro réplicas.
La inoculación de semillas de kudzú con los 
aislados de rizobios se realizó mediante el método de 
recubrimiento de la semilla en el momento de la siembra, 
a razón de 200 mL de inóculo por cada 50 kg de semillas. 
El kudzú se sembró en los surcos a chorrillo ligero, con 
dosis de 8 kg de semilla total ha-1 (2 kg de semilla pura 
germinable por ha). 
 A los 120 d después de la siembra, se tomaron 
muestras de 10 plantas de cada parcela y se determinó 
el número total de nódulos y el porcentaje de nódulos 
totales efectivos. La parte aérea de las plantas se colocó 
en estufa a 70 ºC, durante 72 h y se determinó la MSA. 
El porcentaje de MSA (% MSA) se calculó mediante 
la relación entre la MSA del tratamiento control, sin 
inocular, y los inoculados. 
El rendimiento en masa seca aérea de las plantas 
(RendMSA, t ha-1) se determinó 180 d después de la 
siembra, a partir de la ecuación: RenMSA = (masa verde 
x % MSA)/100. Se evaluó el porcentaje de contenido de 
nitrógeno de la biomasa aérea en 200 g de masa verde 
mediante métodos colorimétricos (Paneque et al. 2010). 
También se evaluó el porcentaje de incremento de esta 
variable en los tratamientos inoculados con respecto al 
control sin inocular. 
Análisis estadístico. Los datos provenientes de los 
ensayos de tolerancia a condiciones de acidez en el 
medio de cultivo se sometieron a la prueba de normalidad 
(test de Bartlett) y homogeneidad de varianza (test de 
Kormogorov-Smirnov). Se aplicó análisis de varianza de 
clasificación simple. Se utilizó el Test de comparación de 
medias de Tukey (P<0.05) para discriminar diferencias 
entre las medias (Sigarroa 1985).
Un arreglo bifactorial se utilizó con los datos del 
ensayo de inoculación en condiciones controladas y 
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strain factors with three levels (1_2, 2_4 and K2) and pH 
with two (6.8 and 4.5) were taken into account. The data 
were processed similar to that described above, regarding 
the test of normality and homogeneity of variance. The 
SPSS 21 program was used for statistical processing 
(Gray and Kinnear 2012)
The results of the experiment under field conditions 
were processed by analysis of variance. The Tukey’s 
multiple comparison test was used (Sigarroa 1985) 
in cases there were significant differences between 
treatments.
At average values of the petroferric ferruginous 
nodular gleysol soil of the EEPF Cascajal, Villa Clara, 
was estimated the confidence interval of means at α = 
0.05 (Payton et al. 2000). All results were showed in the 
SigmaPlot program (2001).
Results
Tolerance and multiplication of rhizobia isolates 
under acidity conditions. Rhizobia isolates takes up to 
the fourth growth area in the solid ML medium, with pH 
4.5, at six incubation days, so they are microorganisms 
tolerant to this acidity condition (dos Santos Hara and 
Oliveira 2005). This performance occurred at four days 
for the isolated 2_4, at six for 1_2, and at eight days for 
K2. It took place in the same culture medium with pH 
6.8 (figure 2).
se tuvieron en cuenta los factores cepa con tres niveles 
(1_2, 2_4 y K2) y pH con dos (6.8 y 4.5). Los datos se 
procesaron de manera similar a lo descrito anteriormente, 
en cuanto a la prueba de normalidad y homogeneidad 
de varianza. El programa SPSS 21 se empleó para el 
procesamiento estadístico (Gray y Kinnear 2012)
Los resultados del experimento en condiciones de 
campo se procesaron igualmente mediante un análisis de 
varianza. Se utilizó la dócima de comparación múltiple 
de Tukey (Sigarroa 1985) en los casos en que hubo 
diferencias significativasentre tratamientos. 
A los valores promedio de los análisis del suelo 
Gleysol nodular ferruginoso petroférrico de la EEPF de 
Cascajal, Villa Clara, se le estimó el intervalo de confianza 
de las medias a α=0,05 (Payton et al. 2000). Todos los 
resultados se graficaron en el programa SigmaPlot (2001). 
Resultados
Tolerancia y multiplicación de los aislados de rizobios 
en condiciones de acidez. Los aislados de rizobios ocuparon 
hasta la cuarta zona de crecimiento en el medio LM sólido, 
con pH 4,5, a los seis días de incubación, por lo que son 
microorganismos tolerantes a esta condición de acidez 
(dos Santos Hara y Oliveira 2005). Este comportamiento 
se produjo a los cuatro días para el aislado 2_4, a los seis 
para 1_2, y a los ocho días para K2. Tuvo lugar en el mismo 
medio de cultivo con pH 6.8 (figura 2). 
pH 6.8
Tiempo (Días)
0 2 4 6 8 10
K2 
1_2 
2_4 
pH 4.5
0 2 4 6 8 10
Zo
na
s 
de
 c
re
ci
m
ie
nt
o
0
1
2
3
4
G
ro
w
th
 a
re
a 
Time (Days) 
Figure 2. Scoring intervals, according to the growth areas of rhizobia isolates in the Petri dish 
(pH 4.5 and 6.8) during 10 d of incubation.
In the medium with pH 4.5, isolate 2_4 grew to the 
third growth area after four days of incubation. The 
remaining two isolates grew to the second area in the 
same interval. The K2 isolate took longer to occupy up 
to the fourth growth zone in the MY medium, with pH 
6.8 (8 d) than in the medium with pH 4.5 (6 d).
The three rhizobia isolates produced small colonies, 
smaller than 1 mm, in MY medium (pH 4.5 and 6.8) at 
10 d of incubation (figure 3).
There were no significant differences between the 
diameter of the colonies produced by the isolate 1_2 in 
the medium with pH 4.5 with respect to those formed 
with pH 6.8, at six and 10 d of incubation. At six 
days, the rest of the isolates formed colonies that were 
En el medio con pH 4,5, el aislado 2_4 creció hasta la 
tercera zona de crecimiento a los cuatro días de incubación. 
Los dos aislados restantes crecieron hasta la segunda zona 
en el mismo intervalo. El aislado K2 demoró más tiempo 
en ocupar hasta la cuarta zona de crecimiento en el medio 
LM, con pH 6.8 (8 d) que en el medio con pH 4.5 (6 d). 
Los tres aislados de rizobios produjeron colonias 
pequeñas, menores de 1 mm, en medio LM (pH 4,5 y 
6,8) a los 10 d de incubación (figura 3). 
No se evidenciaron diferencias significativas entre 
el diámetro de las colonias que produjo el aislado 1_2 
en el medio con pH 4.5 con respecto a las que formó 
con pH 6.8, a los seis y a los 10 d de incubación. A los 
seis días, el resto de los aislados formaron colonias que 
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020.118
b
Aislados de rizobio
K2 1_2 2_4
D
iá
m
et
ro
 c
ol
on
ia
 (m
m
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
pH 4.5, 6 días 
pH 6.8, 6 días
pH 4.5,10 días 
pH 6.8,10 días 
a a a ab
b
a aa aa
a
Common letters do not significantly differ (Tukey, P <0.05)
Figure 3. Colony diameter (mm) of rhizobia isolates at 6 and 10 d 
of incubation (pH 4.5 and 6.8).
D
ia
m
et
er
- c
ol
on
y 
Rhizobia isoletes 
significantly higher at pH 6.8 than at pH 4.5. However, 
at 10 d, there were no significant differences between 
the isolates, nor between the colonies of the same isolate 
under different pH conditions.
In the effect of the pH of the medium on the 
multiplication of the three rhizobia isolates (figure 4), 
isolate 2_4 had a CFU number mL-1 at pH 4.5, which 
was significantly higher compared to those quantified at 
pH 6.8 . The two remaining isolates showed a similar 
amount of viable cells under both pH conditions. There 
were no significant differences between the three isolates 
in each of the pH conditions studied.
fueron significativamente mayores en pH 6.8 que en 
pH 4,5. Sin embargo, a los 10 d, no hubo diferencias 
significativas entre los aislados, ni entre las colonias 
del mismo aislado en las diferentes condiciones de pH.
 En el efecto del pH del medio en la multiplicación 
de los tres aislados de rizobios (figura 4), el aislado 2_4 
tuvo un número de UFC mL-1 en pH 4.5, que resultó 
significativamente superior con respecto a las que se 
cuantificaron en pH 6.8. Los dos aislados de rizobios 
restantes presentaron similar cantidad de células 
viables en las dos condiciones de pH. No se observaron 
diferencias significativas entre los tres aislados en cada 
Aislados de rizobio
K2 1_2 2_4
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
 v
ia
bl
es
 (U
FC
 m
L-
1) )
0
2e+8
4e+8
6e+8
8e+8
1e+9
pH 4.5 
pH 6.8 
a
ab ab
ab
a
b
N
um
be
r o
f v
ia
bl
e 
ce
lls
(U
FC
 m
L-
1 )
Rhizobia isolates
Same letters do not significantly differ (Tukey P <0. 05, n = 3)
Figure 4. Number of viable cells of rhizobia isolates in MY medium 
(pH 4.5 and 6.8)
Positive effect of rhizobia isolates on the nodulation, 
growth and yield of tropical kudzu plants, grown under 
acidity conditions. The analysis of the data from the 
inoculation test under controlled conditions allowed to 
detect the influence of each factor separately (strain and 
pH) (table 2) and the interaction of both factors together, 
on the nodulation and growth of tropical kudzu plants 
(table 3).
The strain factor influenced all the variables that were 
evaluated for nodulation and growth of tropical kudzu 
una de las condiciones de pH estudiadas. 
Efectos positivos de los aislados de rizobios en la 
nodulación, crecimiento y rendimiento de plantas de 
kudzú tropical, cultivadas en condiciones de acidez. 
El análsis de los datos provenientes del ensayo de 
inoculación en condiciones controladas permitió detectar 
la influencia de cada factor por separado (cepa y pH) 
(tabla 2) y la intereacción de ambos factores de manera 
conjunta, en la nodulación y crecimiento de las plantas 
de kudzú tropical (tabla 3). 
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020. 119
Table 2. Independent effect of strain and pH factors on the nodulation and growth of 
tropical kudzu plants
Treatments Nten DMtN Root length (cm) ADM (g) RDM (g)
Strain 
K2 3.65a 0.0044a 8.02c 0.0411b 0.0061a
1_2 3.15b 0.0037b 9.09a 0.0383c 0.0058b
2_4 2.95c 0.0036c 8.86b 0.0424a 0.0054c
F-Test * *** * *** ***
SE+ 0.42 0.0005 0.38 0.0025 0.0003
pH
6.8 3.67a 0.0041a 8.98a 0.042a 0.0059a
4.5 2.84b 0.0038b 8.33b 0.040b 0.0056b
F-Test * *** * *** ***
SE+ 0.33 0.0004 0.31 0.0021 0.0003
NteN, number of total effective nodules; DMtN, dry mass of total nodules; ADM, aerial dry 
mass; RDM, root dry mass, Same letters do not significantly differ (Tukey P < 0. 05, n=10)
Table 3. Combined effect of strain and pH factors on 
the nodulation of tropical kudzu. 
(Strain*pH) NNmr NtN NeNmr
K2, pH 6,8 3.30a 3.80a 3.00ab
K2, pH 4,5 3.44a 4.11a 3.33ab
1_2, pH 6.8 3.50a 4.00a 3.40a
1_2, pH 4.5 2.10ab 2.60ab 1.90ab
2_4, pH 6.8 3.30a 4.10a 3.20ab
2_4, pH 4.5 0.90b 1.40b 1.50b
SE+ 0.61* 0.76* 0.64*
NNmr number of nodules in main root, NtN number 
of total nodules, NeNmr number of effective nodules 
in the main root. 
Same letters do not significantly differ (Tukey P < 
0.05 n=10),
plants (table 2). The strain K2 stands out, with significant 
differences with respect to the rest of the strains, except 
in the root length and the ADM, variables where 1_2 
and 2_4 highlight, respectively.
The pH factor, when was independently analyzed 
(table 2), allowed to identify the negative effect of the 
acidity of the medium on the nodulation and growth of 
kudzu plants. However, in the analysis of the influence 
of both factors (pH and strain) (table 3) on the NNmr, 
TN and NENmr there were no significant differences 
between the plants inoculated with K2 and with 1_2 
in pH 4.5 and 6.8. In the rest of variables there was no 
interaction between both factors.
The field condition test showed that rhizobia isolates 
produced a significant increase in the number of total 
nodules, ADM and nitrogen content in the aerial 
biomass of kudzu plants, grown in an acid petroferric 
ferruginous nodularGleysol soil, in Cascajal, Villa 
Clara (table 4).
More than 60 % of total nodules were effective in 
BNF in plants inoculated with rhizobia isolates. K2 and 
El factor cepa influyó en todas las variables que se 
evaluaron de nodulación y crecimiento de las plantas 
de kudzú tropical (tabla 2). Se destaca la cepa K2, con 
diferencias significativas con respecto al resto de las 
cepas, excepto en el largo de raíz y la MSA, variables 
donde sobresalen 1_2 y 2_4, respectivamente. 
El factor pH, cuando se analizó de manera 
independiente (tabla 2), permitió identificar el efecto 
negativo de la acidez del medio en la nodulación y 
crecimiento de las plantas de kudzú. Sin embargo, en el 
análisis de la influencia de ambos factores (pH y cepa) 
(tabla 3) en el NNrp, NNt y NNerp no se identificaron 
diferencias significativas entre las plantas inoculadas con 
K2 y con 1_2 en pH 4.5 y 6.8. En el resto de las variables 
no hubo interacción entre ambos factores. 
En el ensayo en condiciones de campo se constató que 
los aislados de rizobios produjeron incremento significativo 
en el número de nódulos totales, MSA y contenido de 
nitrógeno en la biomasa aérea de las plantas de kudzú, 
cultivadas en un suelo Gleysol nodular ferruginoso 
petroférrico ácido, en Cascajal, Villa Clara (tabla 4).
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020.120
Table 4. Effect of rhizobia isolates on the nodulation and growth of tropical kudzu plants, grown in acid petroferric 
ferruginous nodular Gleysol soil, in Cascajal, Villa Clara.
Treatments
Nodulation ADM 
(t ha-1)
% increase in 
ADM (t ha-1)
Nitrogen content 
in aerial biomass (%)
% increase in nitrogen 
content in aerial biomassTN NteN (%)
Control without 
inoculation 
21c 31 4.03c - 2.19b -
K2 53a 93 7.27a 80.4 3.28a 49.77
1_2 50a 95 7.11a 76.43 3.33a 52.05
2_4 32b 68 5.19b 28.78 2.52b 15.07
SE± 2** - 0.23** - 0.04** -
NtN number of total nodules, NteN number of total effective nodules, ADM aerial dry mass. 
Same letters do not significantly differ (Tukey P < 0.05, n=10). 
1_2 highlighted with more than 90 %. Both isolates also 
produced an increase of more than 75 % of the yield of 
the aerial dry mass, and more than 45 % of the nitrogen 
content of the aerial biomass of the kudzu plants.
Discussion
The use of biofertilizers based on rhizobia strains, 
adapted to stressful conditions in the soil, such as acidity, 
is a biotechnological practice that offers a solution 
to improve agricultural production. The isolation, 
characterization and use of these bacteria in cultures 
of economic importance, especially those affected 
by abiotic factors as aggressive as the acidity of the 
soil, is increasingly important. This research allowed 
identifying potentialities in rhizobia strains, such as 
promising microorganisms for the inoculation of tropical 
kudzu in Cuban acid soils.
The three isolates, Bradyrhizobium K2, 1_2 and 
2_4, showed slow growth in the culture medium 
(figure 2) and formed colonies smaller than 1 mm in 
diameter (figure 3). These characteristics have been 
previously reported for the Bradyrhizobium genus 
(Wang and Martínez-Romero 2001 and da Costa et 
al. 2017).
The soils acidity constitutes a factor that limits 
bacterial growth (Turan et al. 2017). However, the 
three isolates studied in this research showed tolerance 
to acidic pH. The isolates grew in all areas of the Petri 
dishes where they were inoculated (figure 2). The 
acidity condition did not affect the diameter of their 
colonies (figure 3) and the number of viable cells 
during the exponential growth phase either (figure 4). 
Bradyrhizobium strains, equally tolerant to acid pH, 
have been recently identified (Helene et al. 2017 and 
Jang et al. 2018).
The three bacterial isolates excrete base to the culture 
medium (Hernández et al.2013). This characteristic 
is also representative of the Bradyrhizobium genus 
(Wang and Martínez-Romero 2001) and has been 
interpreted as one of the acidity tolerance strategies 
(Graham et al. 1994), which allows neutralizing 
the acidic pH and consuming nutrients from the 
medium. The production of bases could explain the 
Más del 60 % de los nódulos totales fueron efectivos 
en la FBN en las plantas inoculadas con los aislados de 
rizobios. Se destacaron K2 y 1_2 con más del 90 %. 
Ambos aislados además, produjeron incremento de más 
del 75 % del rendimiento de la masa seca aérea, y más 
del 45 % del contenido de nitrógeno de la biomasa aérea 
de las plantas de kudzú.
Discusión
El empleo de biofertilizantes basados en cepas de 
rizobios, adaptadas a condiciones estresantes en el 
suelo, como la acidez, es una práctica biotecnológica 
que ofrece una solución para mejorar la producción 
agrícola. El aislamiento, caracterización y empleo de 
estas bacterias en cultivos de importancia económica, 
sobre todo de aquellos afectados por factores abióticos 
tan agresivos, como la acidez de los suelos, es cada 
vez de mayor importancia. Esta investigación permitió 
identificar potencialidades en cepas de rizobios, como 
microorganismos promisorios para la inoculación del 
kudzú tropical en suelos ácidos cubanos.
 Los tres aislados, Bradyrhizobium K2, 1_2 y 2_4, 
presentaron lento crecimiento en el medio de cultivo 
(figura 2) y formaron colonias menores de 1 mm 
de diámetro (figura 3). Estas características se han 
informado anteriormente para el género Bradyrhizobium 
(Wang y Martínez-Romero 2001 y da Costa et al. 2017).
 La acidez de los suelos constituye un factor que 
limita el crecimiento bacteriano (Turan et al. 2017). Sin 
embargo, los tres aislados que se estudiaron en este trabajo 
mostraron tolerancia a pH ácido. Los aislados crecieron 
en todas las zonas de las placas Petri donde se inocularon 
(figura 2). La condición de acidez no afectó el diámetro 
de sus colonias (figura 3) y el número de células viables 
durante la fase de crecimiento exponencial tampoco (figura 
4). Cepas de Bradyrhizobium, igualmente tolerantes a pH 
ácidos, han sido identificadas recientemente (Helene et 
al. 2017 y Jang et al. 2018). 
 Los tres aislados bacterianos excretan base al medio 
de cultivo (Hernández et al. 2013). Esta característica 
también es representativa del género Bradyrhizobium 
(Wang y Martínez-Romero 2001) y se ha interpretado 
como una de las estrategias de tolerancia a la acidez 
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020. 121
performance of the three rhizobia isolates in the MY 
medium with pH 4.5.
The isolates 2_4 and K2 showed performances that 
suggest greater adaptation to acidity conditions (pH 
4.5) than in mediums close to neutrality (pH 6.8). In 
general, they occupied more areas in the Petri dishes 
under acidic conditions than at pH 6.8. In addition, 
2_4 had a higher concentration of viable cells at pH 
4.5. Similar results with the K2 isolate were previously 
obtained (Pérez 2010). Both isolates, in addition to 
the basic excretion, could have other mechanisms that 
allow them to remain viable and multiply in acidity 
conditions in the medium. These mechanisms could 
be the accumulation of internal buffers, the synthesis 
of proteins of acid shock, the exclusion of protons, 
the synthesis of surface lipopolysaccharides and 
the decrease in the permeability of the cytoplasmic 
membrane (Geddes et al. 2014).
The physicochemical characteristics of the soils of 
Cascajal in Villa Clara, mainly its acidity, constitute a 
decisive factor in the selection of rhizobia populations 
that reside there (Morón et al. 2005). The mechanisms 
of tolerance to this condition allow them to maintain 
intracellular pH between 7.2 and 7.5 to survive in 
free life way (Madigan et al. 2011) and establish 
symbiosis with the legumes resident in these soils. 
The adaptation of rhizobia to acidity requires the 
joint collaboration of various central functions of 
metabolism, such as the expression of membrane 
proteins, related to respiration and changes in the 
central metabolism of carbonand lipids (Draghi et 
al. 2016).
As part of this research, inoculation tests of 
rhizobia isolates were carried out in tropical kudzu 
seeds under acidity conditions. In the experiment, 
under controlled conditions, the analysis of the pH 
factor separately allowed to conclude that acidity 
decreased nodulation and plant growth. Plá and 
Cobos-Porras (2015) reported the negative effect of 
acidity on the formation of nodules. However, the 
joint analysis of the strain and pH factors allowed 
concluding that K2 and 1_2, when inoculated under 
acidity conditions, managed to counteract the negative 
effect of acidity on the nodulation of plants (table 3). 
The acid tolerance of both isolates (figures 2, 3 and 
4), perhaps due to their ability to produce base to the 
medium (Hernández et al. 2013), would neutralize 
the acidity in the rhizosphere environment of kudzu 
plants.
This mechanism would allow adequate colonization, 
nodule formation and subsequent BNF, and would favor 
N to the kudzu plant for their growth. Therefore, the 
plant would be better prepared to be establishing under 
acidity conditions. There were no significant differences 
in any of the plant growth variables, when the pH and 
strain factors were analyzed together. These results could 
support the proposed hypothesis.
(Graham et al. 1994), la cual permite neutralizar el pH 
ácido y consumir los nutrientes del medio. La producción 
de bases pudiera explicar el comportamiento de los tres 
aislados de rizobios en el medio LM con pH 4.5. 
 Los aislados 2_4 y K2 presentaron comportamientos 
que sugieren mayor adaptación a las condiciones de 
acidez (pH 4.5) que en medios cercanos a la neutralidad 
(pH 6.8). De manera general, ocuparon mayor cantidad 
de zonas en las placas Petri en condiciones ácidas que 
en pH 6,8. Además, 2_4 presentó mayor concentración 
de células viables en pH 4.5. Resultados similares con 
el aislado K2 se obtuvieron anteriormente (Pérez 2010). 
Ambos aislados, además de la excreción de base, pudieran 
contar con otros mecanismos que les permiten mantenerse 
viables y multiplicarse en condiciones de acidez en el 
medio. Estos mecanismos pudieran ser la acumulación 
de buffer internos, la síntesis de proteínas de shock ácido, 
la exclusión de protones, la síntesis de lipopolisacáridos 
de superficie y la disminución de la permeabilidad de la 
membrana citoplasmática (Geddes et al. 2014). 
Las características físico-químicas de los suelos de 
Cascajal en Villa Clara, fundamentalmente su acidez, 
constituyen un factor decisivo en la selección de las 
poblaciones de rizobios que residen en él (Morón et al. 
2005). Los mecanismos de tolerancia a esta condición les 
permiten mantener pH intracelular entre 7.2 y 7.5 para 
sobrevivir en forma de vida libre (Madigan et al. 2011) 
y establecer la simbiosis con las leguminosas residentes 
en estos suelos. La adaptación de los rizobios a la acidez 
requiere la colaboración conjunta de diversas funciones 
centrales del metabolismo, como la expresión de 
proteínas de membrana, relacionadas con la respiración 
y cambios en el metabolismo central del carbono y los 
lípidos (Draghi et al. 2016).
Como parte de esta investigación, se realizaron 
ensayos de inoculación de los aislados de rizobios en 
semillas de kudzú tropical en condiciones de acidez. En 
el experimento, en condiciones controladas, el análisis 
del factor pH por separado permitió concluir que la 
acidez disminuyó la nodulación y el crecimiento de las 
plantas. Plá y Cobos-Porras (2015) refirieron el efecto 
negativo de la acidez en la formación de los nódulos. Sin 
embargo, el análisis conjunto de los factores cepa y pH 
permitió concluir que K2 y 1_2, cuando se inoculan en 
condiciones de acidez, lograron contrarrestar el efecto 
negativo de la acidez en la nodulación de las plantas (tabla 
3). La ácido tolerancia de ambos aislados (figuras 2, 3 y 
4), quizás producto de su capacidad de producir base al 
medio (Hernández et al. 2013), neutralizaría la acidez en 
el entorno de la rizosfera de las plantas de kudzú.
Este mecanismo permitiría la adecuada colonización, 
formación del nódulo y posterior FBN, y propiciaría el N 
a la planta de kudzú para su crecimiento adecuado. Por 
lo tanto, la planta se encontraría mejor preparada para 
establecerse en condiciones de acidez. No se encontraron 
diferencias significativas en ninguna de las variables 
de crecimiento de las plantas, cuando se analizaron 
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020.122
The field inoculation test showed the positive effect 
of rhizobia isolates on effective nodulation, BNF and 
ADM, as well as on the nitrogen content of the aerial 
biomass of kudzu plants. Similar results were obtained 
in this same crop (González et al. 2016) and in canavalia 
(Martín et al. 2015).
Many legumes require neutral or slightly acidic pH 
for growth and nodulation. pH values, less than 5.5, 
generally causes problems in the plant establishment 
and, consequently, in the BNF (Bordeleau and 
Prévost 1994). However, the inoculation of kudzu 
plants with the three rhizobia isolates considerably 
increased the number of total effective nodules in 
the acidic petroferric ferruginous nodular Gleysol 
soil, in Cascajal area (table 4). The acidity tolerance 
of rhizobia isolates that were used in this test could 
have been a determining factor for the establishment 
of an effective symbiosis between the kudzu plants 
and the bacteria.
A greater number of effective nodules for BNF in 
leguminous plants allow the increase of nitrogen content. 
This element is used for the formation of new structures 
that, in turn, it is an increase in plant growth (Gardner et 
al. 2017). The increase in the percentages of the nitrogen 
content in the aerial biomass and of the aerial dry mass of 
the plants inoculated with the isolates, is clear evidence 
of this phenomenon
There were nodes in the roots of the plants that 
were used as a negative control of the experiment. This 
suggests the presence of compatible rhizobia on the 
soil in the Cascajal area. However, this nodulation, and 
the effects that were found in the growth of the plants, 
were lower to that found in the inoculated plants. The 
use of more efficient strains and the application of 
higher concentration of bacteria offer advantages in 
colonization during root emission.
The rhizobia isolates used in this research were 
selected in previous researches, as promising for the 
inoculation of tropical kudzu. This selection was 
based on some physiological characteristics, such as 
the use of various carbon sources, the production of 
polyhydroxybutyrates (PHB) and the nodulation of this 
forage legume (Hernández et al. 2013).
These strains, in addition to the advantages they have 
for the form of application on the seed and its tolerance 
to acidity, have several characteristics that allow them 
to compete with other soil bacteria during the process 
of colonization and formation of nodules in kudzu 
plants. The inoculation of legumes with competitive 
and specific strains considerably increases the efficiency 
of rhizobia-legume symbiosis and BNF (Andrews and 
Andrews 2017).
It is concluded that the use of tolerant acid rhizobia 
for the inoculation of tropical kudzu, grown under acidity 
conditions, guarantees the successful establishment of 
symbiosis. The isolates of Bradyrhizobium K2, 1_2 and 
2_4, not only allow an effective nodulation in the BNF, 
conjuntamente los factores pH y cepa. Estos resultados 
pudieran avalar, en alguna medida, la hipótesis propuesta. 
El ensayo de inoculación en campo demostró el efecto 
positivo de los aislados de rizobios en la nodulación 
efectiva, FBN y MSA, así como en el contenido de 
nitrógeno de la biomasa aérea de plantas de kudzú. 
Resultados similares se obtuvieron en este mismo cultivo 
(González et al. 2016) y en canavalia (Martín et al. 2015).
Muchas leguminosas requieren pH neutro o ligeramente 
ácido para su crecimiento y nodulación.Valores de pH, 
inferiores a 5.5, desencadenan generalmente problemas 
en el establecimiento de la planta y, por consiguiente, 
en la FBN (Bordeleau y Prévost 1994). Sin embargo, la 
inoculación de las pantas de kudzú con los tres aislados 
de rizobios incrementó considerablemente el número 
de nódulos efectivos totales en el suelo Gleysol nodular 
ferruginoso petroférrico ácido, de la zona de Cascajal 
(tabla 4). La tolerancia a la acidez de los aislados de 
rizobios que se emplearon en este ensayo pudiera haber 
sido el factor determinante para el establecimiento de una 
simbiosis efectiva entre las plantas de kudzú y la bacteria.
La mayor cantidad de nódulos efectivos para la FBN en 
las plantas leguminosas permite el incremento del contenido 
de nitrógeno. Este elemento se emplea para la formación de 
nuevas estructuras que, a su vez, se traduce en aumento del 
crecimiento vegetal (Gardner et al. 2017). El incremento en 
los porcentajes del contenido de nitrógeno de la biomasa 
aérea y de la masa seca aérea de las plantas inoculadas con 
los aislados, es clara evidencia de este fenómeno. 
Se observaron nódulos en las raíces de las plantas que 
se emplearon como control negativo del experimento. Esto 
sugiere la presencia de rizobios compatibles en el suelo de 
la zona de Cascajal. Sin embargo, esta nodulación, y los 
efectos que se constataron en el crecimiento de las plantas, 
fueron inferiores al encontrado en las plantas inoculadas. 
La utilización de cepas más eficientes y la aplicación de 
mayor concentración de bacterias ofrecen ventajas en la 
colonización durante la emisión de la raíz.
Los aislados de rizobios empleados en esta investigación 
fueron seleccionados en investigaciones previas, como 
promisorias para la inoculación de kudzú tropical. Esta 
selección se basó en algunas características fisiológicas, 
como la utilización de diversas fuentes de carbono, la 
producción de polihidroxibutiratos (PHB) y la nodulación 
de esta leguminosa forrajera (Hernández et al. 2013).
Estas cepas, además de las ventajas que poseen por 
la forma de aplicación sobre la semilla y su tolerancia 
a la acidez, cuentan con diversas características que les 
permiten competir con otras bacterias del suelo durante 
el proceso de colonización y formación de los nódulos en 
las plantas de kudzú. La inoculación de las leguminosas 
con cepas competitivas y específicas incrementa 
considerablemente la eficiencia de la simbiosis rizobios-
leguminosa y la FBN (Andrews y Andrews 2017).
 Se concluye que la utilización de rizobios ácido 
tolerantes para la inoculación del kudzú tropical, cultivado 
en condiciones de acidez, garantiza el establecimiento 
Cuban Journal of Agricultural Science, Volume 54, Number 1, 2020. 123
but also increase these variables and the performance of 
kudzu under acidity conditions in the field. These results 
constitute an attractive proposal to validate inoculants 
based on these bacterial isolates in other acidic soils of 
the country.
exitoso de la simbiosis. Los aislados de Bradyrhizobium 
K2, 1_2 y 2_4, no solo permiten lna nodulación efectiva 
en la FBN, sino que incrementan estas variables y el 
rendimiento del kudzú en las condiciones de acidez en 
el campo. Estos resultados constituyen una propuesta 
atractiva para validar inoculantes basados en estos aislados 
bacterianos en otros suelos ácidos del país.
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Received: April 22, 2019
Accepted: October 24, 2019