4-Ongay-Larios-oligos

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Comité Editorial: González Andrade, M.; Hernández Alcántara, G.; Martínez González, J.J.; 
Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M. 
© ISSN-0188-137X 
 
 
Versión electrónica en http://bq.facmed.unam.mx/tab 
MENSAJE BIOQUÍMICO 
Mens. Bioquím. 45 (2021) 1-10 
 
 
Memoria del XLVIII Taller de Actualización Bioquímica, Facultad de Medicina; UNAM 
 
Síntesis química de oligonucleótidos: Método de 
fosforamiditas. 
 
Chemical synthesis of Oligonucleotides: Phosphoramidite method. 
 
Ongay-Larios, Laura1* y Mora Cabrera, D. Minerva1. 
 
1. Unidad de Biología Molecular, Instituto de Fisiología Celular, UNAM. 
 
*Correspondencia. Instituto de Fisiología Celular, Circuito Exterior s/n, Ciudad Universitaria, Coyoacán, CDMX, México. 
CP. 04510 Tel. +52 (55) 56 22 56 56, longay@ifc.unam.mx 
 
 
Resumen 
Los oligonucleótidos son cadenas de ácido nucléico 
relativamente cortas; van de unos cuantos 
nucleótidos hasta unos 200 nucleótidos los más 
largos. El uso de estas moléculas es de gran 
importancia en la biología molecular ya que se 
emplean en una gran variedad de técnicas como son 
el ADN recombinante, la mutagénesis dirigida, los 
microarreglos, la PCR, y la secuenciación, entre 
otras. 
Los oligonucleótidos generalmente se producen por 
síntesis química. Actualmente el método más 
utilizado es el de fosforamiditas en fase sólida, 
utilizando como soporte perlas de vidrio con poros 
de tamaño controlado (CPG). Este proceso utiliza 
nucleósidos modificados que tienen sus grupos 
reactivos protegidos, los cuales se activan de 
manera específica en el momento adecuado, lo que 
promueve la síntesis lineal, y evita la ramificación 
del oligonucleótido. La síntesis involucra la adición 
secuencial de los nucleósidos en dirección 3’-5’: el 
nucleósido es incorporado a la cadena creciente 
mediante un ciclo de síntesis que consta de cuatro 
pasos: desprotección, acoplamiento, bloqueo y 
oxidación. El ciclo se repite hasta obtener el 
oligonucleótido de la longitud deseada. Una vez que 
se completa la síntesis el oligonucleótido es 
liberado del soporte sólido y se eliminan todas las 
protecciones para obtener una molécula de ADN de 
cadena sencilla activa. Esta molécula se purifica y 
Abstract 
Oligonucletides may be defined as short nucleic 
acid strands up to 200 nucleotides. These molecules 
have an important use in molecular biology 
techniques, such as recombinant DNA, side directed 
mutagenesis, microarrays, PCR, DNA sequencing 
methods, among others. 
Oligonucleotides can be synthesized chemically. At 
present, the phosphoramidite method in solid phase 
with controlled pore glass (CPG) support is the 
most commonly used. This method employs 
modified nucleosides that have their reactive groups 
protected with different molecules; the protected 
groups can be removed selectively at the 
appropriate moment which renders the precise 
group of the molecule active allowing the coupling 
of the nucleosides to perform the synthesis. These 
protective groups prevent unwanted side reactions. 
Nucleosides are sequentially incorporated to the 
growing chain in 3’-5’ direction through a four 
steps synthesis cycle: deprotection, coupling, 
capping, and oxidation. The cycle is repeated until 
the oligonucleotide is complete; then the 
oligonucleotide is cleaved from the solid support 
and all protections are removed. This renders a 
functional single-stranded DNA molecule, which is 
afterwards purified by alcoholic precipitation. 
Chemical synthesis is carried out on automatic 
synthesizers; the process is highly efficient, 
reproducible and with very high yield. 
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se concentra por precipitación alcohólica. El 
proceso de síntesis se lleva a cabo en sintetizadores 
automatizados con muy alta eficiencia, 
reproducibilidad y rendimiento. La calidad del 
oligonucleótido sintetizado se puede evaluar en 
geles desnaturalizantes de poliacrilamida. Los 
oligonucleótidos son estables por varios años si se 
almacenan a -20°C y libres de nucleasas. 
Oligonucleotides can be analyzed through 
polyacrylamide gel electrophoresis to determine 
their quality. Oligonucleotides are stable several 
years when stored at -20°C and free of nucleases. 
 
Palabras claves: oligonucleótido, síntesis química, 
fosforamidita, grupo protector. 
 
Keywords: oligonucleotide, chemical synthesis, 
phosphoramidite, group protection. 
Introducción 
 
Los oligonucléotidos son cadenas de ácido 
nucléico relativamente cortas que tienen gran 
importancia en diferentes procesos biológicos y que 
se utilizan ampliamente en diferentes técnicas de 
laboratorio. El desarrollo y evolución de las técnicas 
de síntesis química de oligonucleótidos ha permitido 
avances significativos en distintas técnicas de 
biología molecular y en particular en la tecnología 
del ADN recombinante. Es interesante mencionar 
que mediante este proceso se han podido sintetizar 
varios genes [1]. 
 
La demostración de que el ADN contiene la 
información genética por Avery y colaboradores [2] 
y el descubrimiento de la estructura de la molécula 
como una doble hélice por Watson y Crick en 1953 
[3], permitieron inferir varias actividades esenciales 
en el proceso de expresión génica, lo que impulsó de 
manera muy importante el interés por entender los 
mecanismos moleculares involucrados en dicho 
proceso. El avance en el conocimiento de los 
sistemas biológicos impulsó el desarrollo de técnicas 
que pusieron en evidencia, entre otras cosas, la 
importancia del uso de oligonucleótidos sintéticos 
para entender y manipular distintos procesos 
biológicos. Por ejemplo, mediante el uso de 
oligoribonucleótidos sintéticos se pudo descifrar la 
mayoría de los codones del código genético [revisado 
en 4, 5]. Este tipo de estrategias planteó la necesidad 
de tener la capacidad de sintetizarlos de manera 
eficiente. 
 
Antecedentes 
 
Las primeras técnicas eran extremadamente 
complicadas y laboriosas que permitían acoplar tan 
sólo unos cuantos nucleótidos. Sin embargo, el 
enorme potencial de la aplicación de este tipo de 
moléculas sintéticas en diferentes experimentos 
biológicos, bioquímicos y biofísicos impulsó un 
mejoramiento dramático en las técnicas de síntesis 
química de oligonucleótidos [6]. 
 
La síntesis química de oligonucleótidos tiene sus 
inicios en los años 1950’s con los experimentos de 
Michelson y Todd en los que reportan la síntesis de 
dinucleótidos con un enlace fosfodiester entre dos 
nucleósidos de timidina [7]. Posteriormente Khorana 
y colaboradores desarrollan el método de fosfato 
diéster, en donde una de sus principales aportaciones 
fue el uso de grupos protectores en algunos de los 
grupos reactivos de los nucleótidos utilizados durante 
la síntesis y de esta forma controlar el acoplamiento 
de los nucleótidos [8,9]. En los siguientes cuarenta 
años se implementaron otros protocolos, como el 
método de fosfato triéster y el de fosfito triéster que 
introdujeron algunas modificaciones al método de 
Khorana; que hacen el proceso general más rápido y 
eficiente. 
 
En el método de fosfato triéster implementado 
por Letsinger y Rees se introdujo la protección del 
fosfato en el extremo 3’ del nucleósido con un grupo 
β-cianoetilo y evitar que se den ramificaciones del 
oligonucleótido durante el proceso de síntesis, que 
era uno de los problemas del método de fosfato 
diéster [4]. Otra aportación importante fue 
implementar el proceso de síntesis del 
oligonucleótido en fase sólida, en el cual la extensión 
de la cadena nucleotídica se da sobre un soporte 
sólido [10]. Estas modificaciones permitieron 
desarrollar los primeros sistemas de síntesis 
semiautomatizados y aparecenlos primeros 
sintetizadores de ADN [4]. Finalmente, este mismo 
grupo de investigadores proponen el método de 
fosfito triéster en el cual se sustituye el grupo fosfato 
del extremo 3’ del nucleósido por un grupo fosfito, lo 
que permite que la reacción de acoplamiento entre 
los nucleósidos durante la extensión de la cadena sea 
mucho más rápido y eficiente (aunque se requiere 
introducir un paso adicional de oxidación para dar 
estabilidad al enlace éster internucleotídico), 
reduciendo el tiempo de síntesis debido a la 
velocidad de acoplamiento [6]. 
 
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Poco después, a principios de los 1980’s, 
Caruthers hace una modificación al método de fosfito 
triéster e introduce el uso de fosforamiditas en las 
cuales se cambia el grupo cloruro por un grupo 
amina en el nucleósido, con este cambio las 
fosforamiditas son activadas justo antes del 
acoplamiento añadiendo un ácido débil a la mezcla 
de reacción [11]. La ventaja de estos compuestos es 
que son más estables lo que permite un mejor manejo 
y almacenamiento [4]. Así mismo este grupo trabajó 
intensamente en el mejoramiento del soporte sólido y 
publican el uso de matrices inorgánicas como soporte 
sólido [6]. 
 
Estas modificaciones han mejorado la 
selectividad, la velocidad y la eficiencia de síntesis; 
así mismo han permitido que la longitud del 
polinucleótido pueda ser mucho mayor y actualmente 
se pueden hacer oligonucleótidos hasta de unos 200 
nucleótidos. 
 
Método de fosforamiditas 
 
Actualmente el método mas utilizado para la 
síntesis química de oligonucleótidos es el de 
fosforamiditas en fase sólida. Las fosforamiditas son 
nucleósidos modificados con grupos químicos de 
protección en los grupos reactivos de la molécula, 
cuya función es evitar reacciones no deseadas 
durante la síntesis. Un punto importante es que los 
grupos protectores son fácilmente removibles de 
manera selectiva en el momento necesario durante el 
proceso de síntesis, para permitir la reacción 
específica [5]. Existen diversas moléculas que 
pueden usarse para proteger los sitios reactivos, pero 
actualmente los más utilizados son: a) un grupo 
dimetoxitritilo (DMT) en el extremo 5’ del 
nucleósido, mientras que b) el grupo fosfito en el 3’ 
está protegido con un β-cianoetilo y un 
diisopropilamino [11]. 
 
También se tienen modificaciones en los grupos 
amino de los anillos heterocíclicos de las bases 
nitrogenadas, los mas utilizados son: i) un benzoilo 
para adenina, ii) para citosina se puede usar el 
benzoilo o acetilo y iii) para la guanina un 
isobutirilo; la timina no contiene grupo protector ya 
que no presenta un grupo amino. Estos grupos 
protectores evitan que se generen reacciones no 
deseadas o ramificaciones de la cadena durante la 
síntesis del oligonucleótido. La figura 1 muestra la 
estructura de las fosforamiditas. 
 
 
 
Figura 1. Esquema general de las fosforamiditas. Se muestran los grupos protectores: Dimetoxitritilo en el 5’-OH, β-cianoetilo y 
diisopropilamina en el grupo fosfito 3’, un grupo benzoilo en el grupo amino reactivo de la adenina, un acetilo en la citosina y un 
isobutirilo en la guanina. 
 
La síntesis involucra la adición secuencial de los 
monómeros (fosforamiditas) a la cadena creciente 
mediante ciclos de síntesis que involucran cuatro 
pasos fundamentales; 1) desprotección o eliminación 
del dimetoxitritilo, 2) activación y acoplamiento, 3) 
bloqueo y 4) oxidación. La síntesis se lleva a cabo en 
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fase sólida en donde el nucleósido del extremo 3’ de 
la cadena a sintetizar se encuentra covalentemente 
unido al soporte sólido mediante un espaciador 
(conector); el soporte sólido puede ser CPG (vidrio 
con poros y canales de tamaño controlado) o 
poliestireno. La síntesis se realiza en dirección 3’ – 
5’ (dirección opuesta a la síntesis enzimática) (Figura 
2). 
 
Ciclo de síntesis 
 
1. Desprotección 
 
El ciclo inicia con la eliminación del grupo 
dimetoxitritilo (DMT) mediante un tratamiento con 
un ácido, generalmente ácido tricloroacético (TCA) o 
ácido dicloroacético (DCA), lo cual expone el 
hidroxilo en el extremo 5’ del nucleósido, al cual será 
unido el siguiente nucleósido. 
 
2. Acoplamiento 
 
 El siguiente monómero es añadido junto con un 
activador, como el tetrazol que actúa como un ácido 
débil, el diisopropilamino del nucleósido entrante es 
eliminado y se forma un intermediario tetrazolil-
fosforamidito que reacciona con el hidroxilo 5’ libre 
de la cadena oligonucleotídica anclada en el soporte 
sólido y se forma el enlace fosfito-triéster 
internucleotídico. 
 
3. Bloqueo 
 
Un porcentaje muy bajo de moléculas, menor al 
1-2%, que no reaccionan en el paso de acoplamiento 
son bloqueadas de manera permanente mediante una 
reacción de acetilación del extremo 5’ hidroxilo libre 
con ácido acético anhidro y N-metilimidazol, esto se 
hace antes del paso de oxidación para impedir que 
participen en el siguiente ciclo de síntesis y evitar 
que se generen oligonucleótidos con deleciones 
internas. 
 
4. Oxidación 
 
El último paso del ciclo de síntesis es una 
reacción de oxidación para estabilizar el enlace 
internucleotídico recién formado. Esto se lleva a cabo 
añadiendo una solución de yodo, el fósforo trivalente 
del enlace fosfito es oxidado a un fósforo 
pentavalente formando así un enlace fosfato triéster 
estable. 
 
Este ciclo de síntesis se repite para cada 
nucleótido hasta obtener la cadena de ADN deseada.
 
 
Figura 2. Ciclo de síntesis del método de las fosforamiditas. El proceso se lleva a cabo en fase sólida, el soporte solido (CPG) está 
contenido en columnas entre filtros, el ciclo consta de cuatro pasos: desprotección, activación/acoplamiento, bloque y oxidación, este 
ciclo se repite hasta obtener el oligonucleótido completo, el cual es liberado del soporte y se eliminan todos los grupos protectores. 
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Procesamiento final del oligonucleótido 
 
Cuando la síntesis se completa, el oligonucleótido 
permanece anclado al soporte sólido y aun contiene 
varios grupos protectores tanto en las bases como en 
el eje azúcar-fosfato que deben ser removidos. El 
grupo tritilo en el extremo 5’ puede ser eliminado 
mediante un paso adicional de desbloqueo con TCA. 
El oligonucleótido es entonces liberado del soporte 
sólido con una solución ligeramente básica y con un 
tratamiento a alta temperatura en esta misma 
solución se eliminan el resto de los grupos 
protectores, posteriormente el oligonucleótido es 
purificado para remover sales y otros contaminantes. 
De esta manera se obtiene una molécula química- y 
biológicamente activa que puede ser utilizada en 
diferentes aplicaciones. 
 
Automatización 
 
La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo en 
sintetizadores de ácidos nucléicos automáticos 
controlados por computadoras. Existen varios 
sintetizadores comerciales, que varían básicamente 
en la capacidad de síntesis, en la escala de síntesis y 
la cantidad de oligonucleótidos que pueden sintetizar 
simultáneamente,así como en la capacidad de 
monitorear automáticamente la eficiencia de 
acoplamiento. 
 
Materiales y reactivos 
 
Fosforamiditas: dA-CE Phosphoramidite (Bz), 
dC-CE Phosphoramidite (Bz), dG-CE 
phosphoramidite (iBu) y dT-CE Phosphoramidite. 
Acetonitrile anhydrous (ultra seco) (diluyente para 
las fosforamiditas). 0.25M 5-Ethylthiol-1H-Tetrazol 
en acetonitrilo (activador). THF/2,6-Lutidina/Acetic 
anhydride (Capmix A). 16% 1-Metilimidazol/THF 
(Capmix B). 0.02M Iodine/THF/Piridina/H2O 
(Oxidante). 3% TCA/DCM (Desbloqueador). 
Acetonitrilo anhidro grado HPLC. Columnas de 
síntesis de 200nmol: dT CPG1000, dA(Bz) 
CPG1000, dG(Dmf) CPG1000 y dC(Ac) CPG1000. 
Trampas para humedad. Tanque de Argón de ultra 
alta pureza. Hidróxido de amonio concentrado. 
Etanol Absoluto. Etanol al 70%. Agua destilada 
estéril. Pipetas y puntas para microvolúmenes. Tubos 
de diferentes volúmenes. 
 
Equipos 
 
- Sintetizador automatizado de oligonucleótidos 
MerMade 4 de BioAutomation. El equipo está 
diseñado para sintetizar oligonucleótidos en formato 
de columnas, configurado para 4 columnas, puede 
sintetizar oligonucleótidos estándar, degenerados y 
modificados, en escalas de 50 nmol a 5 μmol, con 
una eficiencia de acoplamiento del 99%. El progreso 
de la síntesis puede ser monitoreado en todas las 
columnas con un monitor de la línea de tritilo. El 
tiempo de síntesis depende de la longitud del 
oligonucleótido, una corrida típica de 4 
oligonucleótidos de 20 nucleótidos (nt) es menor a 
tres horas. En las condiciones estándar que se utilizan 
en la UBM se pueden sintetizar oligonucleótidos de 2 
a 100 nt. Las columnas contienen el soporte sólido 
CPG entre dos filtros, que permite el flujo de 
reactivos sin que se pierda el soporte (Figura 3).
 
 
 
Figura 3. Sintetizador automático de oligonucleótidos, MerMade 4. 
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El equipo tiene cuatro componentes: cámara de 
síntesis con capacidad para acomodar 4 columnas, 
sistema de vacío, cabeza de inyección que dispensa 
los reactivos en las columnas y un sistema de 
movimiento para posicionar la cabeza de inyección. 
 
Todos los reactivos se ponen en puertos 
conectados con líneas que permiten llevarlos a la 
cámara de síntesis, cada línea cuenta con válvulas de 
precisión que controlan la cantidad específica de 
reactivo depositado en las columnas, una válvula de 
vacío asociada a la base de cada columna drena los 
reactivos al términos de cada reacción. El equipo 
tiene conectado un tanque de argón, este se utiliza 
para generar una atmósfera libre de humedad 
necesaria para que la síntesis se lleve de manera 
óptima y promover el flujo de los reactivos 
controlado por el sistema de vacío. El sintetizador 
está conectado a una computadora con el software 
MM4 que tiene los programas para el mantenimiento 
y los scripts para controlar la operación del equipo en 
los distintos pasos del ciclo de síntesis. Se incluyen 
protocolos estandarizados y comprobados, 
adicionalmente los scripts se pueden crear o 
modificar. 
 
- Otros equipos. Centrifugas Eppendorf 5430R y 
5415C. Espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo 
Scientific). Termobloque de temperatura controlada. 
 
Procedimiento 
 
La síntesis de oligonucleótidos en la Unidad de 
Biología Molecular (UBM) del Instituto se lleva a 
cabo con el método de fosforamiditas en fase sólida 
en sintetizadores automáticos. A continuación se 
describe el protocolo para la síntesis en el 
sintetizador MerMade 4 de BioAutomation (Figura 
4).
 
 
Figura 4. Esquema general del procedimiento para la síntesis química de oligonucleótidos. El primer paso es la verificación del 
sistema, se revisa tanto el funcionamiento del equipo como las condiciones de los reactivos (a). Se hace la programación del equipo con 
la secuencia a sintetizar y el script apropiado para esa síntesis, y se procede a hacer la síntesis, en este punto es conveniente inspeccionar 
visualmente los primeros ciclos de síntesis (b). Una vez terminada la síntesis se procesa el oligonucleótido para librarlo de la columna y 
eliminar todos los grupos protectores (c). Se verifica la calidad de la síntesis analizando los resultados del monitor de tritilo y se verifican 
los productos sintetizados en geles de poliacrilamida (d). Finalmente el oligonucleótido es cuantificado por espectrofotometría, se genera 
un reporte de síntesis y el tubo se etiqueta y se guarda a -20°C hasta su uso (e-f). 
 
 
 
 
 
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Verificación del sistema 
 
Previo a la síntesis se verifica el funcionamiento 
del sintetizador: 
 
1. Verificar que la cantidad de reactivos en el 
equipo es suficiente para llevar a cabo el proceso, 
así como el tiempo que han estado en el 
sintetizador ya que estos tienen una vida media 
una vez que han sido colocados en el equipo, en 
caso necesario remplazarlos. Las fosforamiditas 
liofilizadas se disuelven en acetonitrilo de muy 
alta pureza (ultra seco) de acuerdo a las 
recomendaciones del proveedor antes de 
colocarlas en el sintetizador. Colocar dentro de 
los reactivos trampas para humedad. 
 
2. Verificar que el contenedor de desechos tiene 
suficiente espacio para colectarlos. 
 
3. Verificar que la cabeza dispensadora de reactivos 
en la cámara de síntesis se mueve sin problemas y 
que las líneas que dispensan los reactivos no 
estén tapadas, ni presentan fugas. 
 
4. Verificar que el equipo tiene la presión y nivel de 
vacío adecuados. 
 
5. Hacer un prueba de para verificar que el flujo de 
los reactivos tanto en volumen como en tiempo es 
adecuado. 
 
Síntesis del ADN 
 
1. Una vez comprobado el funcionamiento correcto 
del equipo se edita la secuencia de ADN que se 
quiere sintetizar y el programa de síntesis 
específico que se usará en el proceso utilizando 
los programas del equipo, siguiendo las 
indicaciones que se van desplegando en el 
programa [12]. Este sintetizador tiene capacidad 
para sintetizar 4 oligonucleótidos 
simultáneamente. Se puede programar diferentes 
escalas de síntesis que van de 50 nmol a 5 μmol. 
En la UBM usamos generalmente una escala 200 
nmol. 
 
2. Colocar en la cámara de síntesis las columnas 
adecuadas, dependiendo del nucleótido del 
extremo 3’ de los oligonucleótidos a sintetizar y 
se procede a iniciar la síntesis de los 
oligonucleótidos. 
 
3. Es conveniente que se monitoree el 
funcionamiento del equipo un par de ciclos para 
asegurarse de que el proceso se lleva de manera 
adecuada. 
 
Procesamiento del oligonucleótido 
 
1. Una vez terminada la síntesis retirar las columnas 
del sintetizador, sacar el soporte sólido con los 
oligonucleótidos anclados y ponerlo en un vial de 
2 ml con tapón de rosca. Añadir 2 ml de 
hidróxido de amonio concentrado (30%) frio, 
cerrar perfectamente el tubo y sellar el tapón con 
parafilm para evitar que pueda ser expulsado por 
la presión que se genera en el vial. 
 
2. Incubar a 55°C toda la noche (12-16 h) en un 
baño con temperatura controlada (termobloque) 
para liberar los oligonucleótidos del soporte 
sólido y remover todas las modificaciones 
protectoras. 
 
3. Retirar los viales del termobloque y enfriarlos 
durante un par de horas a -20°C para poder 
abrirlos sin que se derrame el líquido. Transferir 
la solución de hidróxido de amonio que contiene 
el oligonucleótido ya liberado a un tubo de 10ml, 
evitar transferir las perlas de CPG quese 
encuentra en el fondo del vial. 
 
4. Añadir tres volúmenes de EtOH al 100% frío y 
0.1 volúmenes de acetato de sodio 3M a pH 5.2 
para precipitar el ADN incubando a -20°C 
durante 2 h. Centrifugar a 10,000 rpm en frio 
durante 20 min, eliminar el sobrenadante y hacer 
un lavado con EtOH al 70% frio, repetir la 
centrifugación. 
 
5. Eliminar completamente el sobrenadante y dejar 
secar el botón de ADN a temperatura ambiente. 
Resuspender el botón en 250 μl de agua destilada. 
 
6. Cuantificar por espectrofotometría a 260 nm y 
con este valor determinar la concentración del 
oligonucleótido. 
 
7. Etiquetar el tubo y guardar a -20°C hasta que sea 
entregado para su uso. 
 
8. Generar un reporte de síntesis que se entregará 
junto con el oligonucleótido. 
 
Nota: Este proceso de purificación (desalar) es 
suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Para 
oligonucleótidos muy largo, mayores a 75-80 nt o 
algunas aplicaciones se recomiendan hacer una 
purificación que elimine productos truncados que se 
pueden generar debido a que la eficiencia de 
8 
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acoplamiento no es del 100%. Los métodos de 
purificación más ampliamente utilizados para este 
propósito son electroforesis en geles de 
poliacrilamida (PAGE) y cromatografía líquida de 
alta resolución (HPLC). 
 
Puntos clave 
 
- La síntesis química de ácidos nucléicos es 
altamente sensible a la presencia de agua, la cual 
inhibe de manera muy importante las reacciones que 
se llevan a cabo en el proceso. 
 
- El uso de equipos y reactivos de buena calidad es 
crítico para garantizar una buena eficiencia de 
acoplamiento y rendimiento. 
 
- Las fosforamiditas se deben mantener liofilizadas y 
se resuspenden en acetonitrilo anhidro de muy alta 
pureza (ultra seco) justo antes de colocar en el 
sintetizador, la vida media de estos reactivo en el 
equipo es de dos semanas. Evitar abrir repetidas 
veces las botellas de acetonitrilo, ya que esto puede 
introducir humedad que afectará negativamente la 
síntesis. 
 
- Se recomienda colocar trampas para humedad 
dentro de los frascos de reactivos al momento de 
colocarlos en el equipo. 
 
- Es importante que el equipo esté perfectamente 
calibrado y se revisen regularmente los flujos de los 
reactivos. 
 
- El argón utilizado para generar la presión interna en 
el equipo debe ser de muy alta pureza para garantizar 
una atmósfera libre de humedad dentro del sistema. 
 
- Los oligonucleótidos se deben resuspender en agua 
o amortiguadores libres de nucleasas y serán estables 
meses o años si se almacenan a -20°C. 
 
Monitoreo de la eficiencia de síntesis 
 
La eficiencia de acoplamiento se puede 
monitorear mediante la visualización del catión DMT 
liberado en el primer paso del ciclo de síntesis 
(desbloqueo), el DMT liberado presenta un color 
naranja brillante el cual sirve como indicador de la 
efectividad del proceso de acoplamiento [13]. El 
MerMade 4 de la UBM cuenta con un sistema 
incorporado de monitoreo del tritilo liberado que 
mide la cantidad de catión liberado en cada ciclo y 
presenta gráficas que permiten visualizar el nivel de 
tritilo liberado ciclo a ciclo. 
 
Otro método utilizado para verificar la calidad de 
síntesis es el uso de geles de poliacrilamida, en los 
cuales se puede detectar la presencia del producto 
completo y si hay productos de síntesis truncados. 
Una alícuota del producto sintetizado se corre en 
geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12% y se 
visualiza por absorción de luz UV (UV shadowing) 
en placas de cromatografía. 
 
Servicio 
 
Para solicitar la síntesis de oligonucleótidos en la 
UBM llenar una solicitud con la información 
requerida, asignar un nombre a cada oligonucleótido 
con un máximo de 10 caracteres, no utilizar 
símbolos, escribir la secuencia de ADN con letras 
minúsculas en dirección 5’- 3’. 
 
Los oligonucleótidos se entregan desalados y 
resuspendidos en 250 μl de agua destilada estéril, 
junto con un reporte de síntesis que contiene los 
siguientes datos: Folio asignado por la UBM, nombre 
del oligonucleótido, tamaño (número de nucleótidos), 
volumen (μl), Tm, MW, concentración en μg/μl y 
μM, OD totales. 
 
Resultados 
 
Resultados representativos del rendimiento de la 
síntesis química en la UBM se presentan en la Tabla 
1. 
 
Tabla 1. Rendimiento obtenido de la síntesis de 
oligonucleótidos de diferente longitud, escala de síntesis 
200nmol. (Valores representativos de la UBM) 
 
Longitud del 
oligonucleótido (nt) 
μg/μl μg totales 
20 3.7 925 
30 5.2 1300 
40 6.9 1725 
63 9.1 2275 
 
El rendimiento es bueno y dentro de los límites 
esperados de acuerdo a la escala de síntesis utilizada 
y es semejante a la reportada en la literatura. Es 
importante hacer notar que el rendimiento varía de 
acuerdo a la longitud del oligonucleótido. 
 
El análisis en geles de poliacrilamida por la 
técnica de UV shadowing en placas de cromatografía 
permite observar las bandas correspondientes al 
producto de síntesis. Con este método podemos 
estimar la eficiencia de síntesis, la calidad del 
producto sintetizado y determinar la presencia de 
productos truncados que se generan como 
consecuencia de la eficiencia de acoplamiento 
durante cada ciclo de síntesis. 
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Ongay-Larios y Mora Cabrera Mens. Bioquim. 45 (2021): 1-10 
© 2021 Mensaje Bioquímico. Todos los derechos reservados. ISSN-0188-137X 
Comité Editorial: González Andrade, M.; Hernández Alcántara, G.; Martínez González, J.J.; 
Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M. Publicado por el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina; UNAM. 
 En la figura 5 se muestra el resultado obtenido de 
la síntesis de oligonucleótidos de diferente tamaño en 
el MerMade 4, las bandas oscuras corresponden a las 
moléculas de ADN. Como se puede observar en 
moléculas de ADN pequeñas, hasta de unos 40 
nucleótidos (nt), no se alcanza a detectar la presencia 
de subproductos (productos truncados), aún en los 
oligonucleótidos mayores (65nt y 73nt) sólo se 
detectan algunas bandas sumamente tenues de 
subproductos, esto debido a que el porcentaje de 
productos truncados cuando se tiene una eficiencia 
de acoplamiento del 99% es muy bajo y no 
representa ningún problema para la mayoría de las 
aplicaciones, lo que hace que en términos generales 
no se requiera una purificación para eliminarlos en la 
mayoría de los casos. 
 
 
 
Figura 5. Oligonucleótidos de diferentes tamaños analizados 
en gel de poliacrilamida al 12% con la técnica de UV 
shadowing. 20nt (1), 25nt (2), 21nt (3, 6, 7, 9, 11, 12), 30nt (4, 
15), 40nt (5, 8), 19nt (10, 13), 28nt (14), 73nt (16, 17) y 65nt (18). 
 
Otra manera de evaluar la eficiencia de síntesis es 
mediante el análisis de la liberación del catión tritilo 
(DMT), como se mencionó anteriormente el 
sintetizador MerMade 4 cuenta con un monitor de la 
línea de tritilo para todas las columnas, esto permite 
monitorear el progreso de la síntesis y obtener 
gráficas de barras como las que se muestran en la 
figura 6, cada barra representa el nivel de tritilo 
liberado que es un indicador de la eficiencia de 
acoplamiento para cada ciclo de síntesis, como se 
puede observar el nivel de tritilo presenta ligeras 
variaciones en cada acoplamiento debido a la 
sensibilidad del sistema y a que el acoplamiento 
también es afectado por la composición de la cadena, 
sin embargo se mantiene bastante constante aun en 
oligonucleótidos muy largos (73nt, gráfica d) 
indicando que la eficiencia de acoplamiento es buena 
en los distintos ciclos de síntesis. Este tipo de 
monitoreo es bastante útil, ya que si se llega a 
observar una caída drástica en el nivel de tritilo en 
alguna de las columnasse puede abortar la síntesis 
para esa columna particular y evitar así un gasto 
innecesario de reactivos. 
 
Conclusiones 
 
Este protocolo permite sintetizar oligonucleótidos 
de muy alta calidad con un buen rendimiento. El 
proceso es altamente reproducible y eficiente con el 
sintetizador automático. El tiempo de síntesis es 
relativamente corto. La eficiencia de acoplamiento es 
elevada y constante a lo largo de la síntesis aun en 
oligonucleótidos muy largos, la presencia de 
productos truncos es mínima y solo se hace evidente 
en oligonucleótidos de longitudes mayores a los 70nt. 
Esto establece un límite a la longitud del 
oligonucleótido que se puede sintetizar.
 
 
Figura 6. Histogramas obtenidos por el monitor de tritilo integrado en el sintetizador. Se muestra el nivel de tritilo, indicador de la 
eficiencia de acoplamiento, ciclo a ciclo en la síntesis de oligonucleótidos de diferentes tamaños, a) 20nt, b) 30nt, c) 40nt y d) 73nt. 
 
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Ongay-Larios y Mora Cabrera Mens. Bioquim. 45 (2021): 1-10 
© 2021 Mensaje Bioquímico. Todos los derechos reservados. ISSN-0188-137X 
Comité Editorial: González Andrade, M.; Hernández Alcántara, G.; Martínez González, J.J.; 
Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M. Publicado por el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina; UNAM. 
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DRA. LAURA ONGAY LARIOS 
 
Bióloga egresada de la Facultad de Ciencias de la 
UNAM, realizó estudios de posgrado, Maestría y 
Doctorado, en la Universidad de Southampton en 
Inglaterra. 
 
Fue Profesor-Investigador durante 5 años en la 
Universidad de Guanajuato, México. Posteriormente 
se incorporó al Instituto de Fisiología Celular (IFC) 
de la UNAM, actualmente es Técnico Académico 
Titular C, Jefe de la Unidad de Biología Molecular 
(UBM) del IFC y pertenece al Sistema Nacional de 
Investigadores. 
 
Desde su incorporación a la UBM se ha 
especializado en técnicas de Biología Molecular. Ha 
contribuido a la formación de recursos humanos 
como asesor de seis tesis de licenciatura y una de 
maestría, ha participado como profesor en diferentes 
cursos teóricos y teórico-prácticos en Biología 
Celular y Molecular, tanto de licenciatura, como de 
posgrado. 
 
Proporciona asesoría especializada en técnicas de 
Biología Molecular y también ha dado varios 
entrenamientos en el uso y aplicaciones de equipos 
para la síntesis y secuenciación de ADN. 
 
Ha publicado 29 artículos en revistas 
internacionales indizadas, 2 artículos en revistas 
nacionales y un capítulo de libro.