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ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA 
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE 
Streptomyces clavuligerus 
 
 
 
 
 
 
 
 
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO 
Ingeniera Química, M.Sc. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA 
FACULTAD DE INGENIERÍA 
DOCTORADO EN INGENIERÍA 
MEDELLIN (ANT.) 
2013
 
 
ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA 
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE 
Streptomyces clavuligerus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO 
Ingeniera Química, M.Sc. 
Tesis para optar al título de Doctora en Ingeniería 
 
 
Director 
JUAN CARLOS QUINTERO DÍAZ 
Ingeniero Químico, M.Sc., Ph.D. 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA 
FACULTAD DE INGENIERÍA 
DOCTORADO EN INGENIERÍA 
MEDELLIN (ANT.) 
2013
iii 
 
 
 
Gracias Dios: 
 
Por los dones que me has dado y por iluminarme 
 para saber cuál es el mejor camino a seguir, 
por enseñarme a aceptar y aprender de las dificultades 
 y darme ánimos para seguir en la lucha de mis metas propuestas. 
 
Porque he aprendido no sólo de los buenos resultados, 
y de las excelentes personas que has puesto en mí camino, 
 sino también de aquellos que en ciertos momentos desearon hacerme daño. 
 
Por permitirme ser un ser integral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Debo este logro a la memoria de mi padre, por siempre creer en mí y brindarme su apoyo. 
Inyectó energía a mi vida, mi hija, quien me motivo a continuar con mi trabajo. 
Otra razón de inspiración, mi amor, quien me enseñó aprender a desaprender, 
 Sin duda, gracias a mis amigos y a toda mi familia por confiar en mí . 
 
iv 
 
AGRADECIMIENTOS 
La autora expresa sus agradecimientos a: 
 
La Universidad de Antioquia por su apoyo para iniciar mis estudios a través de la beca de 
Estudiante instructor y posteriormente facilitar la culminación a través de Comisión de Estudios. Al 
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación - COLCIENCIAS, por financiar 
mi estudios a través de la Convocatoria de Doctorados Nacionales – 2007. 
 
La Universidad de Antioquia y a Colciencias, por el apoyo económico al proyecto ―Modelado 
metabólico de la producción de ácido clavulanico‖ a través del contrato 227 de 2009 y por el apoyo 
para dotación a través del proyecto de Sostenibilidad. 
 
Los profesores evaluadores Claudio Avignone-Rosa, Pablo Iván Nikel y Rodrigo Torres por su 
colaboración y disponer parte de su tiempo para la revisión, mejoramiento y sustentación de este 
trabajo. 
 
El Profesor Juan Carlos Quintero Díaz, Director de la Investigación, por sus enseñanzas, por su 
compresión, por la confianza depositada en mí y la motivación durante el desarrollo del trabajo. 
 
Los profesores Paloma Liras y Juan Francisco Martín por permitirme realizar la pasantía en 
INBIOTEC y brindarme las orientaciones y acompañamiento para la realización de los cultivos de 
producción de ácido clavulánico en este trabajo. 
 
Los profesores Silvia Ochoa C. y Rigoberto Ríos E. por sus orientaciones para la realización del 
proyecto modelado metabólico de la producción de AC y por su apoyo en este trabajo. 
 
 
La estudiante de Maestría Nathalia Gómez Grimaldos por permitir profundizar más en los aspectos 
de modelado cinético y por toda su colaboración en la realización de las pruebas experimentales y 
en especial por su amistad. 
 
Al profesor Rodrigo Torres Sáez y sus estudiantes Cesar Vargas García y Carlos García Sánchez 
por su apoyo en el manejo del software CellNetAnalyzer y algunos tips para el trabajo en modelado 
metabólico en sistemas subdeterminado (FBA). 
 
La profesora María Esperanza López y el Ingeniero Cesar Augusto Botache por confiar en mí, y ser 
mis codeudores ante el ICETEX en el crédito condonable concedido por COLCIENCIAS. Al 
profesor Mauricio Sánchez por confiar en mí al servirme de codeudor ante la Universidad de 
Antioquia para acceder a la comisión de Estudios. 
 
Los integrantes del Grupo de Bioprocesos por su compañía, apoyo e interés en el buen desarrollo 
de este trabajo. 
 
A los profesores del Departamento de Alimentos de la Facultad de Química Farmacéutica, por 
creer en mí y tener paciencia para la buena culminación de mis estudios doctorales. 
 
Y a todos aquellos que se me escapan sus nombres de la mente, pero están en mi corazón y que de 
alguna manera han estado colaborándome, como amigos o como personas silenciosas, pero 
importantes también para el cumplimiento de esta meta. 
v 
 
ABREVIACIONES 
AA 
AAs 
Ac. 
AC 
ACCOA 
ACM 
Aminoácido 
Aminoácidos 
Ácido 
Ácido clavulánico 
Acetil-coenzima A 
Ac. clavamínico 
 
dGTP 
DHAP 
DHC 
DMC 
proclavamínico 
Deoxiguanosina-5 trifosfato 
Dihidroxiacetona fosfato 
Ac. dihidroxiclavamínico 
Ac. dihidroxiclavamínico 
Dimétil citraconato 
AICAR 5-aminoimidazol-4- dTTP Deoxitimidina-5-fosfato 
 carboxamida E4P Eritrosa-4-fosfato 
aIPM Alfa-isopropilmalato ED Entner- Deudoroff 
aKG Alfa-cetoglutarato EMP Embden Meyerhoff Parnas 
aKI 
aKIC 
Alfa-cetoisovalerato 
Alfa-cetoisocaproato 
F 
F16P 
Grados de libertad 
Fructosa-1.6-bifosfato 
aKMETVAL 
ALA 
APC 
ARG 
ARG-SUC 
ASN 
Alfa-ceto-beta-metilvalerato 
Alanina 
Ac. proclavamínico 
Arginina, C-5 
Argino-succínico 
Asparagina 
F6P 
FADH2 
 
FBA 
 
FC 
Fructosa-6-fosfato 
Dinucleótido de flavina- 
adenina (forma reducida) 
Flux balance analysis, balance 
de flujo metabólico 
Fuente de carbono 
ASP 
ASPSEMALD 
ATP 
ß IPM 
ß-LS 
C55P 
Aspartato 
Semialdehido aspartato 
Adenosina-5-trifosfato 
β-isopropilmalato 
ß-lactama sintetasa 
Undecaprenil-fosfato 
FN 
FOBJ 
FUM 
G6P 
GAP 
GCL 
Fuente de nitrógeno 
Función objetivo 
Fumarato 
Glucosa-6-fosfato 
Gliceraldehido -3-fosfato 
Glicerol 
C55PP 
CAR 
CARBP 
CCHO 
Undecaprenil-pirofosfato 
Clavaldehído reductasa 
Carbamoilfosfato 
Clavaldehído 
GCL3P 
GLN 
GLU 
GLY 
Glicerol-3-fosfato 
Glutamina 
Ac. glutámico 
Glicerol 
CEA 
Ceas 
CDP 
CHOR 
Carboxietil arginina 
Carboxietil arginina sintasa 
Citidina-5-trifosfato 
Ac. corísmico 
GPC 
gN1P 
gN6P 
GTP 
Ac. guanidinoproclavamínico 
Glucosamina-1-fosfato 
Glucosamina-6-fosfato 
Guanosina-5-trifosfato 
CITRU 
CMP 
CO2 
CTP 
CYS 
Citrulina 
Citidina-5-monofosfato 
Dióxido de carbono 
Citidina-5-trifosfato 
Cisteína 
HIS 
HOMCYS 
HSER 
ILE 
IM 
Histidina 
Homocisteína 
Homoserina 
Isoleucina 
Ingeniería Metabólica 
dATP 
dCTP 
D 
DFM 
 
DGPC 
Deoxiadenosina-5-trifosfato 
Deoxicitidina-5-trifosfato 
Tasa de dilución 
Distribución de flujos 
metabólicos 
Ac. deoxiguanidino- 
ISOBUTCOA 
ISOPP 
LEU 
LLDIAPIM 
LYS 
MAL 
IsobutirilCoA 
Isopentenil-pirofosfato 
Leucina 
Ac. LL-diaminopimélico 
Lisina 
Malato 
vi 
 
MCC 
 
MET 
Metabolismo central del 
carbono 
Metionina 
TRP 
TYR 
Triptófano 
Tirosina 
METHF n5-n10-metilen-
tetrahidrofolato 
UREA 
UTP 
Urea 
Uridina-5-trifosfato 
MP Medio de producción VAL Valina 
MK-9H 
NADH 
Menaquinona-9-(reducida) 
Nicotinamida-adenina-di 
nucleótido-(reducida) 
X5P Xilulosa-5-fosfato 
NADPH Nicotinamida-adenina-di 
nucleótido-fosfato-(reducida) 
DGPC Ac. deoxiguanidino 
proclavamínico 
NAG1P N-acetil-glusosamina-1-fosfato 2METBUTCOA 2-metilbutirilCoA 
NH4 Amonio 3METBUTCOA 3-metilbutirilCoA 
O2 Oxígeno 3PG 3-fosfoglicerato, 
OD Oxígeno disuelto 
OAA Oxaloacetato 
ORN 
OTR 
Ornitina 
Velocidad de transferencia de 
O2 (oxygen transfer rate). 
 
OUR Velocidad de consumo de O2 
por la célula (oxygen uptake 
rate). 
 
P Fósforo 
PAH Proclavaminato 
amidinohidrolasa 
 
PEP Fosfoenolpiruvato 
PHE Fenilalanina 
PP Pentosa fosfato 
ppGpp Nucleótido de guanosina 
tetrafosfato 
 
PRO 
PRPP 
Prolina 
5-fosforibosil-pirofosfato 
 
PYR Piruvato 
R5P Ribulosa-5-fosfatoRIB5P Ribosa-5-fosfato 
RNA Ácido ribonucleico (ARN) 
mRNA Mensajero RNA 
rRNA RNA ribosomal 
tRNA RNA de transferencia 
Sc Streptomyces clavuligerus 
SED7P Sedoheptulosa-7-fosfato 
SER Serina 
SUC Ac. succínico 
SUCCOA 
T 
Succinil-CoA 
Temperatura 
 
THR Treonina 
vii 
 
CONTENIDO 
 
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... iv 
ABREVIACIONES ................................................................................................. v 
LISTA DE TABLAS .............................................................................................. xii 
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xii 
LISTA DE APÉNDICES ....................................................................................... xii 
LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................ xii 
RESUMEN .......................................................................................................... xv 
SUMMARY ......................................................................................................... xvii 
INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 19 
CAPÍTULO 1. .......................................................................................................... 
SALUD PÚBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. ................................ 29 
1.1. LOS ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS..................................................... 31 
1.1.1. Generalidades. ............................................................................................ 31 
1.1.2. Clasificación de los antibióticos. ............................................................... 33 
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBIÓTICOS. ........................... 36 
1.3. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE β-LACTÁMICOS ................................. 38 
REFERENCIAS ................................................................................................... 41 
CAPÍTULO 2 ........................................................................................................... 
METABOLISMO DE S. Clavuligerus .................................................................. 43 
2.1. BIOLOGÍA DE Streptomyces sp. ................................................................. 44 
2.1.1. Ciclo de Vida: ................................................................................................. 44 
2.1.2. Clasificación del microrganismo en estudio: ................................................. 48 
viii 
 
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos: .................................................. 49 
2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos: .......................... 51 
2.2. CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS DE Streptomyces .......................... 51 
2.2.1. Requerimientos de energía. ....................................................................... 53 
2.2.2. Síntesis de biomasa ................................................................................... 54 
2.2.3. Ruta de Gluconeogénesis. .......................................................................... 54 
2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato. ..................................................................... 54 
2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos). .............................. 55 
2.2.6. Ciclo de la urea. ......................................................................................... 56 
2.2.7. Biosíntesis de aminoácidos: ....................................................................... 57 
2.2.8. Biosíntesis del ácido clavulánico y otras clavamas ................................... 63 
2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y FORMULACIÓN DEL 
MEDIO DE CULTIVO. ......................................................................................... 68 
2.3.1. Fuentes de nitrógeno.................................................................................. 69 
2.3.2. Fuentes de carbono: ................................................................................... 72 
2.3.3. Estudios del efecto de la fuente de fósforo. ............................................... 73 
2.3.4. Efecto de elementos trazas. ....................................................................... 74 
2.3.5. Efecto del oxígeno .................................................................................... 75 
2.4. TIPO DE OPERACIÓN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y CONTINUO. ........ 78 
2.5. MODELADO Y SIMULACIÓN EN BIOPROCESOS. ................................. 80 
2.5.1. Modelado cinético de Streptomyces sp. ....... ¡Error! Marcador no definido. 
2.5.2. Modelado metabólico .................................................................................. 85 
REFERENCIAS ................................................................................................. 107 
 
 
ix 
 
CAPÍTULO 3 ........................................................................................................... 
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO POR FERMENTACIÓN DE 
Streptomyces clavuligerus: EVALUACIÓN DE DIFERENTES MEDIOS DE 
CULTIVO Y MODELADO MATEMÁTICO. ....................................................... 115 
3.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 116 
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 118 
3.2. 1. Técnicas microbiológicas. ...................................................................... 118 
3.2.2. Métodos analíticos .................................................................................. 120 
3.2.3. Modelo matemático. ............................................................................... 121 
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 122 
3.3.1. Evaluación de los medios de cultivo. ....................................................... 122 
3.3.2. Evaluación de la concentración de glicerol. ............................................ 124 
3.3.3. Fermentación en biorreactor de laboratorio ............................................. 126 
3.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 129 
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 130 
CAPÍTULO 4 ..................................................................................................... 133 
UNA COMBINACIÓN DE ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD Y AFM MUESTRAN 
LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA DE ALIMENTACIÓN DE 
AMINOÁCIDOS PARA LA BIOSÍNTESIS DE AC EN Sc. ................................ 133 
4.1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 134 
4.2. MATERIALES Y MÉTODOS: .................................................................. 136 
4.2.1. Técnicas microbiológicas. ....................................................................... 136 
4.2.2. Métodos experimentales. ......................................................................... 138 
4.2.3. Métodos analíticos ................................................................................... 141 
4.2.4. Planteamiento de la red metabólica. ........................................................ 143 
4.2.5. Análisis de flujos metabólicos y de sensibilidad. .................................... 146 
x 
 
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 147 
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la producción de AC. . 147 
4.3.2. Análisis cuantitativo del comportamiento metabólico intracelular.......... 151 
4.3.3. Análisis de la distribución de flujos metabólicos en Sc. ........................... 160 
4.4. CONCLUSIONES ...................................................................................... 164 
REFERENCIAS: ................................................................................................ 166 
CAPÍTULO 5 ........................................................................................................... 
ANÁLISIS DE BALANCES DE FLUJOS (FBA) EN LA PRODUCCIÓN DE AC 
EN Streptomyces clavuligerus .......................................................................... 169 
5.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 170 
5.2. METODOLOGÍA: .................................................................................... 172 
5.2.1. Planteamiento de la red metabólica. ........................................................ 172 
5.2.2. Análisis de balances de flujos metabólicos (FBA). ............................... 175 
5.2.3. Evaluación de la función objetivo (FOBJ): ............................................ 176 
5.2.4. Evaluación del efecto del flujo de nutrientes sobre la producción de AC. ... 
 ................................................................................................................. 178 
5.3. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................. 180 
5.3.1. Ajuste del modelo metabólico evaluando tres funciones objetivo. ......... 180 
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la producción de 
biomasa y AC y sobre algunos flujos metabólicos intracelulares. .......... 182 
5.4. CONCLUSIONES ..................................................................................... 190 
REFERENCIAS: ................................................................................................ 192 
 
 
xi 
 
LISTA DE TABLAS 
CAPÍTULO 1. 
Tabla 1. 1. Formulaciones comerciales, prescripciones médicas y microorganismos 
susceptibles de provocar enfermedades infecciosas ................................................... 32 
 
CAPÍTULO 2. 
Tabla 2. 1. Relación simplificada entre los aminoácidos y su producto de biosíntesis en 
la vía principal del carbono y los aminoácidos productos de síntesis .......................... 72 
Tabla 2. 2. Importancia biológica de los elementos químicos en los microorganismos. 76 
 
CAPÍTULO 3. 
Tabla 3.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de 
confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. 
clavuligerus. ............................................................................................................... 127 
 
CAPÍTULO 4. 
Tabla 4.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de 
confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. 
clavuligerus 149 
Tabla 4. 2. Valores de flujos medidos obtenidos a dos tasas de dilución. ............... 151 
Tabla 4. 3. Análisis de sensibilidad para los flujos calculados con respecto a cambios 
en los flujos medidos ................................................................................................. 153 
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor incidencia en 
el sistema, de acuerdo con el análisis de sensibilidad. .............................................. 160 
 
CAPÍTULO 5. 
Tabla 5. 1. Flujos medidos a una tasa de dilución de 0.03 h-1. 177 
Tabla 5. 2. Condiciones de evaluación de los flujos de algunos sustratos a 
condiciones de limitación de nutrientes. 179 
Tabla 5. 3. Comparación entre flujos experimentales y simulados para diferentes 
funciones objetivos (tasa de dilución 0.03 h-1). 180 
xii 
 
LISTA DE FIGURAS 
CAPÍTULO 1. 
Figura 1. 1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos 34 
Figura 1. 2. Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis catalizada por 
β-lactamasa 38 
CAPÍTULO 2. 
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. 46 
Figura 2. 2. Presentación jerarquica de la taxonomia de Streptomyces 48 
Figura 2. 3. Morfología macroscópica de colonias de Streptomyces coelicolor. 50 
Figura 2. 4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosíntesis 
de antibióticos 53 
Figura 2. 5. Ruta de biosíntesis de ácido clavulánico y bifurcación hacia-ruta de las 
clavamas. 66 
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el 
modelado en bioprocesos 82 
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solución al modelado 
metabólico. 88 
Figura 2. 8. Presentación esquemática de la metodología empleada para realizar AFM.
 90 
Figura 2. 9 Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus 94 
Figura 2. 10. Matriz estequiométrica correspondiente al ejemplo de estudio 94 
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM 95 
Figura 2. 12. Representación esquemática de la metodología empleada para realizar 
FBA 101 
CAPÍTULO 3 
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la producción de ácido 
clavulánico (AC) 123 
xiii 
 
Figura 3. 2. Efecto de la concentración de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente 
de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la producción de ácido clavulánico 125 
Figura 3. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L, 
empleando el medio 5 a una concentración de glicerol de 5%. 127 
CAPÍTULO 4 
Figura 4. 1. Representación esquemática del proceso de producción de AC en lote y en 
continuo. 135 
Figura 4. 2. Representación esquemática de la red bioquímica empleada para AFM en 
Sc. 143 
Figura 4. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L, 
empleando el medio químicamente definido. 148 
Figura 4. 4. Distribución de flujos metabólicos de la producción de AC a partir de 
Streptomyces clavuligerus (Sc). 163 
CAPÍTULO 5. 
Figura 5.1. Representación sintética de la red bioquímica empleada para modelado 
metabólico en Sc. 173 
Figura 5.2. Representación simplificada de la red metabólica de Sc, incluyendo los flujos 
intracelulares más representativos. 182 
Figura 5.3. Efecto de la disminución del flujo de glicerol, sobre el flujo de AC y de 
biomasa y sobre los flujos internos, "In Silico" para S. clavuligerus. 184 
Figura 5.4. Efecto de la disminución del flujo de amonio, sobre el flujo de AC y de 
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 185 
Figura 5.5. Efecto de la disminución del flujo de oxígeno, sobre el flujo de AC y de 
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 187 
Figura 5.6. Efecto de la disminución del flujo de fosfato, sobre el flujo de AC y de 
biomasa y sobre los flujos internos," In Silico" para S. clavuligerus. 189 
 
xiv 
 
LISTA DE APÉNDICES 
CAPÍTULO 4 
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a 
partir de Sc. 194 
APÉNDICE B. Análisis de sensibilidad y de flujos metabólicos 
Tabla B1. Análisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos. 196 
Tabla B2. Análisis de flujos metabólicos, a dos tasas de dilución, en la producción de AC 
a partir de S. clavuligerus. 197 
 
CAPÍTULO 5 
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a partir 
de Sc¡Error! Marcador no definido. 
 198 
 
LISTA DE ANEXOS 
ANEXO 1. IMPACTOS DELTRABAJO DE INVESTIGACIÓN 201 
ANEXO 2. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE LA TESIS 205 
 
 
 
_Toc359835664
xv 
 
RESUMEN 
 
El ácido clavulánico (AC) es un inhibidor β-lactámico que se usa combinado con otros β-
lactámicos con propiedades antibióticas para combatir algunas enfermedades infecciosas. 
Actualmente se produce por fermentación a un costo elevado debido a que se obtiene en 
muy bajas concentraciones (menores a 1 g L
-1
). Hasta la fecha se han realizado importantes 
avances para mejorar la producción de ácido clavulánico (AC) tanto por el estudio de las 
variables ambientales que afectan su síntesis como por el establecimiento de las vías 
metabólicas y los genes involucrados en éstas, encontrándose muy pocos trabajos que 
involucran análisis de flujo. Para el mejoramiento genético de la producción de AC se han 
empleado las técnicas mutaciones, lográndose algunos avances al respecto. 
Con el presente trabajo se quiere resaltar la importancia de la aplicación del análisis de 
flujo metabólico, una herramienta de la Ingeniería Metabólica, para incrementar la 
producción de metabolitos de interés industrial, especialmente del ácido clavulánico 
obtenido a partir de Streptomyces clavuligerus. La importancia de esta estrategia radica en 
el análisis racional de las vías metabólicas para lograr identificar las enzimas responsables 
de una óptima biocatálisis en donde se maximice el rendimiento y la productividad del AC. 
Dentro de las metodologías usadas en ingeniería metabólica están: análisis de la capacidad 
celular, análisis de flujo metabólico, análisis de control metabólico, síntesis de sistemas e 
integración de datos bioinformáticos. En este trabajo se abordará el análisis de flujo 
metabólico a partir de las rutas bioquímicas ya establecidas y del conocimiento fisiológico 
y de fermentación existente. Para esto se validó alguna información de la literatura sobre el 
medio de cultivo a emplear y las condiciones operacionales de producción en lote y en 
xvi 
 
continuo. Una vez obtenidas las cinéticas de fermentación en lote, las cuales fueron 
referente de la investigación, se abordaron estudios en sistemas de operación continuos, 
para evaluar, en estado estacionario, los flujos metabólicos de los diferentes compuestos 
presentes en la ruta bioquímica ya definida, como glicerol, nitrógeno (asparagina), AC, 
oxígeno y aminoácidos de forma directa y los otros de manera indirecta empleando el 
balance de flujo metabólico tanto en sistema determinado (AFM) como subdeterminado 
(FBA). Estos se calcularon a través de un modelo matemático del sístema en estado 
estacionario haciendo uso del paquete computacional CellNetAnalyzer®. 
El resultado obtenido sobre la cuantificación de los flujos metabólicos, sirvió para conocer 
cuantitativamente el mapa metabólico de biosíntesis de AC y permitió realizar análisis de 
distribución de flujos bajo diferentes condiciones y estrategias para proponer posibles 
cuellos de botella, los cuales pueden servir para orientar posteriores trabajos de análisis de 
control metabólico o mejoramiento genético para la biosíntesis de antibióticos en 
Streptomyces clavuligerus. Se espera que conociendo las etapas controlantes de biosíntesis 
de AC de Sc, se incremente el título de AC en la fermentación a través de modificaciones 
genéticas u otras estrategias de alimentación de nutrientes y por ende se puedan disminuir 
los costos de producción. 
xvii 
 
SUMMARY 
 
Clavulanic acid (CA) is a potent β -lactamase inhibitor that is commonly used in 
combination with other β -lactam antibiotics for the treatment of certain infection diseases. 
Currently, CA is produced by fermentation at a relatively high cost, mainly because of the 
low concentration levels that are achieved (typically below 1g L
-1
). To date, there have 
been accomplished important advances for improving CA production, both by means of 
studying environmental parameters and culture medium, and by identifying metabolic 
pathways and their related genes; however it has been found relatively few studies related 
to flux analysis. Genetic improvements have also been performed for larger CA production. 
This work is aim at highlighting the importance of performing metabolic flux analysis (a 
Metabolic Engineering tool) for increasing the production of commercially important 
metabolites, e.g. CA produced by Streptomyces clavuligerus. The importance of this 
strategy relies on a metabolic-pathway rational analysis for the purpose of ascertaining the 
enzymes responsible of optimal bio-catalysis, thus maximizing CA yield and productivity. 
The following are the most frequently used methodologies in Metabolic Engineering: 
analysis of cellular capacity, metabolic flux analysis, metabolic control analysis, systems 
biology and data mining and bioinformatics. 
In this work, metabolic flux analysis has been applied to the production of clavulanic acid, 
based on the already established biosynthetic pathways, and the knowledge gained from of 
Streptomcyes physiology and from fermentation studies. 
. 
xviii 
 
Taking this into consideration, various experimental reports on culture media and batch and 
continuous operation conditions were validated. Once the batch kinetic data, were 
obtained, the continuous operation was performed with the aim of evaluating the steady 
state flux distribution of the different external, internal and intermediate metabolites, e. g. 
glycerol, nitrogen (asparagine), CA, oxygen and aminoacids. Flux measurements were 
completed directly, by analytical techniques and indirectly by metabolic flux analysis 
(MFA), for a determined system, and flux balance analysis (FBA), for an undetermined 
system. MFA and FBA were calculated by means of a mathematical model of the system, 
under steady-state conditions, employing the computational package CellNetAnalyzer®. 
The results, related to metabolic flux quantification, were useful for quantitatively 
deciphering the metabolic map of clavulanic acid biosynthesis; they also did allow 
performing an analysis of metabolic flux distribution under diverse conditions, and to 
advise strategies for proposing feasible bottlenecks that eventually would guide further 
studies of metabolic control analysis and genetic improvements for the synthesis of CA in 
Streptomyces clavuligerus. It is expected that knowing the controlling steps, CA titers 
during fermentation would increase by virtue of genetic modification and feeding 
strategies, thus contributing to reduce the costs of production. 
 
19 
 
INTRODUCCIÓN 
 
Las enfermedades infecciosas constituyen uno de los principales problemas de salud 
pública en el mundo por la alta morbilidad y mortalidad que generan. Para la población 
adulta se tiene un índice de mortalidad (número de fallecidos/1000 habitantes) 12 por 
malaria y 15 por tuberculosis [1]. Este problema se ha venido combatiendo desde hace 
cerca de 60 años con el uso de antibióticos, donde el descubrimiento de la penicilina, dio 
origen a toda una familia de antibióticos, entre los que se encuentran los β-lactámicos. 
La elevada exposición de los microorganismos a los antibióticos ha generado que 
ocurran mutaciones naturales conduciendo a estos microorganismos a desarrollar 
mecanismos de resistencia a los antibióticos. Este fenómeno ha obligado a la comunidad 
científica a conducir investigaciones para obtener nuevos antibióticos y para mejorar los 
procesos existentes para su obtención. La resistencia a los antimicrobianos se ha 
convertido rápidamente en un grave problema de salud pública, con repercusiones 
económicas, sociales y políticas de alcance mundial [2, 3]. 
El mecanismo de resistencia más frecuente entre las bacterias es la de no verse afectadas 
por la presencia de antibióticos β-lactámicos, esto ocurre debido a la excreción de 
enzimas β-lactamasas, que desdoblan el antibiótico impidiendosu acción. Para este tipo 
de resistencia se ha encontrado una sustancia denominada Ácido Clavulánico (AC) que 
actúa como inhibidor de las enzimas β-lactamasas, impidiendo que el antibiótico sea 
desdoblado [4]. El AC posee baja actividad como antibiótico, pero es un potente 
inhibidor de estas enzimas, por lo que se usa en conjunto con un antibiótico β-
lactámico, en formulaciones farmacéuticas. 
20 
 
El AC se produce mediante cultivo sumergido de la bacteria Streptomyces clavuligerus 
(Sc) que emplea glicerol como su principal fuente de carbono, obteniéndose una 
titulación menor a 1 g L
-1 
[5]. Este bajo nivel de producción hace que el AC tenga un 
alto valor en el mercado causando dificultad de acceso para la población de bajos 
recursos (la formulación combinada de amoxicilina y AC tiene un precio de mercado 40 
veces mayor que el del antibiótico genérico amoxicilina). Por estas razones, se han 
realizado múltiples investigaciones orientadas a incrementar la producción de AC 
mediante la mejora del microorganismo y el proceso. Entre las estrategias que se han 
empleado se encuentran tecnologías clásicas como mutagénesis aleatoria y 
determinación de condiciones operacionales adecuadas para los cultivos, y otras 
tecnologías más recientes como son la ingeniería genómica e ingeniería metabólica (IM) 
[6]. 
La IM ha adoptado el nombre de ingeniería, dado que involucra dos aspectos esenciales 
de ella, el análisis y la síntesis de procesos. En este caso, los procesos son las actividades 
metabólicas que la célula lleva a cabo por medio de su metabolismo. En la célula se 
llevan a cabo un gran número de reacciones que son acopladas y reguladas por otra serie 
de reacciones y por sistemas selectivos de transporte membranal. La IM emerge a 
comienzos de los 90s [6, 7]. Clásicamente, el mejoramiento de especies de 
microorganismos (MO) para obtener metabolitos secundarios de interés industrial se han 
basado en técnicas genéticas de selección y mutagénesis aleatoria, conllevando esto 
muchos años de investigación, por lo que se pretende mediante IM racionalizar el 
proceso de mejoramiento al disminuir el espectro de posibilidades de alteraciones 
moleculares de la especie [8, 9]. Una de las herramientas empleadas para hacer IM es el 
análisis de flujos metabólicos (AFM) que permite a partir de un modelo metabólico 
21 
 
establecido y mediante el uso de procedimientos matemáticos calcular los flujos 
metabólicos intracelulares. A través de la comparación de diferentes cambios en los 
valores de los flujos, se puede conocer o prever los efectos de perturbaciones 
ambientales o genéticas sobre los metabolitos de interés. La metodología empleada para 
llevar a cabo el AFM va desde la recopilación de información para el modelado 
metabólico pasando por el desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas 
simulaciones hasta el análisis de las variaciones de los flujos intracelulares como 
respuesta a perturbaciones [6, 8]. 
Se han realizado importantes avances en el estudio de las variables ambientales que 
afectan la síntesis de AC y condiciones operacionales del proceso de fermentación. Entre 
estos avances están el establecer que el glicerol y fuentes de nitrógeno complejas como 
la harina de soja son nutrientes favorables para incrementar la titulación de AC y 
lograr minimizar los efectos de represión catabólica por glicerol o amonio mediante 
operación en continuo y en lote alimentado [5, 6, 9, 10, 11]. Los valores de producción 
de AC observada en las diferentes investigaciones reportadas en la literatura, muestran 
una gran variabilidad dependiendo de las condiciones de cultivo, el mejoramiento de la 
cepa, el tipo de nutrientes, etc., y oscilan entre 50 y 1000 mg L
-1 
[5, 6]. También se ha 
trabajado en la identificación de la vía metabólica y los genes involucrados en la 
producción de AC, lo cual ha permitido establecer en mayor detalle la influencia de la 
arginina y el glicerol en la biosíntesis de AC, establecer la importancia del ciclo de la 
urea en esta bacteria, conocer las enzimas y los genes en la vía de biosíntesis de AC, y 
conocer que a partir de ácido clavamínico (un intermediario en la vía de síntesis de AC) 
22 
 
se producen también otras clavamas que se ha encontrado, tienen propiedades anti 
fúngicas y antibacteriales [9, 11]. 
Pocos trabajos con Sc se han orientado a la optimización del metabolismo para 
identificar los efectos o las relaciones entre unos flujos metabólicos respecto de otros y 
así orientar los flujos hacia la vía deseada, trabajos que se logran a través del uso del 
AFM [9,12]. Esto se puede explicar porque solo hasta hace pocos años se han 
confirmado ciertas reacciones de biosíntesis para la producción de AC [9,12] y tan sólo 
en el 2011 se obtuvo un modelo metabólico a escala genómica de S. clavuligerus [13, 
14]. Con esta nueva información es posible seguir realizando investigaciones que 
permitan hacer inferencias importantes sobre el comportamiento de este 
microorganismo, no sólo en la producción de una clavama como el AC, sino también en 
la producción de otras como alanilclavama y en la producción de cefamicina 
Existen pocos trabajos orientados al planteamiento de modelos matemáticos que 
describan el comportamiento cinético del Streptomyces [6, 15] y los que hay han sido 
propuestos para cultivos en medios químicamente definidos, estos modelos son de gran 
importancia pues permiten analizar posibles fenómenos involucrados en el crecimiento 
como inhibiciones, sustratos limitantes, importancia del consumo de sustrato para 
mantenimiento celular, etc. Así como emplearlos para predecir la producción de 
metabolitos y crecimiento celular a diferentes condiciones ambientales deseadas. Por lo 
anterior, el planteamiento de modelos cinéticos que ajusten a los resultados 
experimentales permitirá avanzar en el entendimiento del proceso tendiente a 
incrementar la producción de AC. En esta misma dirección, son relevantes los estudios 
para evaluar el efecto de la limitación de los nutrientes esenciales sobre el crecimiento 
23 
 
celular y la producción de AC, sin embargo hay pocos estudios relacionados que 
emplean la técnica de AFM [16], también se han realizado trabajos analizando el efecto 
de suplementar al medio de cultivo aminoácidos, especialmente de la familia del 
aspartato, analizando sus efectos mediante el uso de AFM [12], o empleando modelos de 
caja negra [6, 17], pero no se ha determinado la incidencia que tiene el tipo de 
aminoácido sobre el metabolismo global y como un efecto combinado entre los 
aminoácidos y el metabolismo central del carbono sirve para detectar puntos críticos del 
proceso. 
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en donde se indica que tanto las fuentes de C 
y N y algunos aminoácidos afectan significativamente la producción de AC, se propone 
como hipótesis de trabajo que es posible plantear un modelo matemático que describa el 
proceso de crecimiento y producción de AC como función de algunos de estos factores 
así como la posibilidad del empleo de las técnicas de AFM para identificar los efectos de 
estos mismos factores en el metabolismo celular que finalmente conduzcan a generar 
efectos en la síntesis de AC. 
Con base en la hipótesis planteada se propusieron los siguientes objetivos para 
desarrollar en esta Tesis: 
Objetivo General: 
Evaluar y modelar la producción del Ácido clavulánico (AC) por fermentación de 
Streptomyces clavuligerus (Sc) e identificar el efecto sobre el modelo metabólico de Sc 
de los principales factores que afectan la producción de AC. 
Objetivos específicos: 
24 
 
1) Identificar y modelar la cinética de fermentación de Sc en un reactor de tanque 
agitado a escala de laboratorio; 
2) Establecer las posibles rutas bioquímicas en Sc para la producción del AC, de 
acuerdo con los reportes en la literatura.3) Evaluar el comportamiento de flujos metabólicos de la ruta bioquímica propuesta en 
función de cambios en los flujos de algunos aminoácidos y de las fuentes de C, N, 
P, O 
La presentación de este trabajo de investigación está estructurado en capítulos, en los 
cuales los dos primeros corresponden a aspectos teóricos que permitieron la justificación 
de este trabajo y la orientación del trabajo experimental para lograr los objetivos 
propuestos. Los capítulos 3, 4 y 5 corresponden al trabajo experimental realizado para 
lograr los objetivos propuestos, mencionados anteriormente y están estructurados en 
formato de artículo, donde se incluye resumen, introducción, resultados y discusión, 
conclusiones y referencias empleadas. A continuación se darán algunos aspectos que se 
abordaran con mayor detalle en cada uno de los capítulos: 
En el capítulo 1 se presenta un contexto del problema de la salud pública causada por 
enfermedades infecciosas generadas por microorganismos patógenos que tienden a 
desarrollar resistencia a los antibióticos y cómo el AC ha entrado a jugar un papel 
protagónico para contrarrestar dicha resistencia. 
En el capítulo 2 se presenta un marco teórico general sobre los aspectos relacionados 
con la producción del AC, incluyendo las condiciones de crecimiento y mantenimiento 
de Sc, así como las condiciones de producción de AC incluyendo el modelado del 
proceso. Sobre el modelado del proceso se tuvieron en cuenta los conceptos teóricos de 
25 
 
dos tipos de modelado, uno cinético y otro metabólico. Se presentan algunos modelos 
de tipo cinético que se han aplicado para la producción de antibióticos, entre los que se 
encuentran modelos tipo Monod y Contois. Sobre el modelado metabólico se presentan 
los aspectos que se deben tener en cuenta para su concepción hasta algunas de las 
diferentes posibilidades de desarrollo matemático que existen y se han aplicado a este 
tipo de microorganismo. 
En el capítulo 3, se presentan los estudios de producción de AC con diferentes medios 
de cultivo: Medios complejos y medios químicamente definidos. También se propone un 
modelo cinético y se evalúa su capacidad de ajuste a resultados experimentales, 
permitiendo así la identificación de algunas características del proceso con respecto al 
crecimiento y a la producción de AC. 
En el capítulo 4, Se evaluó la distribución de flujos metabólicos de Sc. empleando un 
modelo metabólico reducido, de 60 reacciones con 47 metabolitos, a partir de datos 
experimentales obtenidos en cultivos quimióstato a dos tasas de dilución. Este trabajo 
permitió analizar la producción de AC usando una cepa salvaje de Sc y diversas 
estrategias de enriquecimiento de medios. Adicionalmente se estudió la distribución de 
flujos metabólicos como resultado directo de la adición de aminoácidos y cambio de tasa 
de dilución, permitiendo hacer una descripción cuantitativa del efecto de la variación de 
flujos metabólicos individuales sobre la acumulación de AC. 
En el capítulo 5 se estudió ―in silico‖ el comportamiento de los flujos metabólicos de Sc 
para la producción de AC en función de cambios en las condiciones nutricionales del 
cultivo tales como consumo de fuente de carbono, nitrógeno, fósforo y oxígeno 
empleando como función objetivo maximización del flujo de ATP. Para esto se empleó 
26 
 
un modelo metabólico ampliado de 100 reacciones con 91 metabolitos, en el cual la 
reacción de biosíntesis de biomasa de Sc es más detallada que la empleada en el 
capítulo cuarto, se consideró un mayor número de aminoácidos y macromoléculas. . 
Este trabajo permitió hacer una descripción cuantitativa del efecto de la variación de los 
flujos de los nutrientes sobre la generación de biomasa y la acumulación de AC e 
identificar los cambios en los flujos internos de mayor importancia. 
 
27 
 
BIBLIOGRAFIA 
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en febrero de 2013. 
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antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y 
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clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus,‖ Biochemical Engineering Journal, vol. 
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of clavulanic acid biosynthesis with the aid of metabolic flux analysis,‖ Enzyme and 
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[13] I. Borodina, P. Krabben and J. Nielsen, ―Genome-scale analysis of Streptomyces 
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[14] M. Medema, M. Alam, W. Heijne, et al, ―Genome-wide gene expression changes in an 
industrial clavulanic acid overproduction strain of Streptomyces clavuligerus,‖ Microbial 
biotechnology, vol. 4, no. 2, pp. 300–05, 2011. 
[15] A. Baptista-Neto, E. Gouveia, A. Badino-Jr and C. Hokka, ―Phenomenological model of 
the clavulanic acid production process utilizing Streptomyces clavuligerus,” Braz. J. 
Chem. Eng, vol. 17, no. 4–7, 2000. 
28 
 
[16] S. Kirk, C. Avignone-Rossa and M. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic 
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖ Biotechnology 
Letters, vol. 22, pp. 1803–09, 2000. 
[17] L. Domingues, J. Teodoro, C. Hokka, A. Badino and M. Araujo, ―Optimisation of the 
glycerol-to-ornithine molar ratio in the feed medium for the continuous production of 
clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus,‖ Biochemical Engineering Journal, vol. 
53, no. 1, pp. 7–11, 2010. 
29 
 
CAPÍTULO 1. 
 
SALUD PÚBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. 
 
En 1928, el científico británico Alexander Fleming observó los efectos antibióticos del 
moho Penicillium notatum. El producto de este hongo aparentemente modesto mostró 
ser tan eficaz para combatir infecciones anteriormente consideradas mortales, que 
desencadenó una revolución sanitaria sin precedentes en los anales de las ciencias 
médicas. De esa primera muestra surgiótoda una familia de antibióticos derivados de la 
penicilina. Entre los antibióticos descubiertos posteriormente figuran las 
estreptomicinas, tetraciclinas, quinolonas, antimicóticos, antiparasitarios y, más 
recientemente, antivíricos. Estos medicamentos, llamados colectivamente 
«antimicrobianos» han evitado muchas muertes, han reducido tanto la morbilidad como 
las enfermedades nosocomiales (intrahospitalarias) [1, 2]. 
 
Después de la gran cantidad de descubrimientos efectuados entre 1930-1970, vinieron 
unas décadas donde han sido menos los hallazgos en la lucha contra las enfermedades 
infecciones. La búsqueda de nuevas moléculas que logren contrarrestar las enfermedades 
infecciosas continúa, y se han realizado grandes avances en el desarrollo y 
mejoramiento de los procesos existentes para incrementar los rendimientos [1]. Los 
antibióticos β-lactámicos aún siguen aportando en el mejoramiento de la calidad de vida, 
dado que se continúa investigando en el incremento en los rendimientos en los procesos 
existentes como en el descubrimiento de nuevas moléculas [3]. 
30 
 
Las enfermedades infecciosas constituyen la tercera causa de muertes en el mundo, en 
especial en los países de bajos recursos económicos. El mayor problema se tiene con la 
malaria y la tuberculosis con unos índices de mortalidad (número de muertos por cada 
cien mil habitantes) de 12 y 15 respectivamente y los índices de morbilidad fueron de 
3000 y 128 por cada cien mil habitantes por año, respectivamente [4, 5]. Para niños 
menores de cinco años, se tiene un índice de mortalidad de 65 por cada mil nacidos 
vivos. América Latina se encuentra entre las regiones con más alta incidencia de brotes 
nosocomiales producidos por bacterias que presentan resistencia a múltiples antibióticos 
[6]. Colombia como gran territorio tropical tiene per se una alta incidencia de 
enfermedades infecciosas, siendo estas relevantes en todos los grupos de edad. Se tiene 
proyectada para el quinquenio de 2010 a 2015 una mortalidad infantil en menores de 
cinco años de 12.5 por mil nacidos vivos [7]. 
La forma de contrarrestar una infección es mediante el uso del antibiótico que se 
clasifican de acuerdo con su función sobre la célula, más que de acuerdo con su 
estructura química. Un antibiótico puede buscar la inhibición de la síntesis de la pared 
celular (β-lactámicos, polipéptidos o glucopéptidos), de la síntesis de proteínas 
(macrólidos, lincosaminas, aminoglucósidos, tetraciclinas y anfenicoles), del 
metabolismo bacteriano (sulfonamidas), la actividad o síntesis del ácido nucleico 
(aminoglucósidos, tetraciclinas, macrolidos, etc.) o alteración en la permeabilidad de la 
membrana celular [8, 9]. Sin embargo, las bacterias pueden generar mecanismos de 
resistencia que las protegen contra la acción de los antibióticos [10]. Las infecciones 
causadas por bacterias resistentes a los antibióticos β-lactámicos son tratadas con 
frecuencia con dos drogas: Una es la penicilina que inhibe la síntesis de la pared celular 
de las bacterias patógenas y el otro es un inhibidor de las β-lactamasas evitando así la 
31 
 
hidrólisis de la penicilina [8]. Hay tres inhibidores de β-lactamasas de uso clínico AC, 
Sulbatam y Tazobactam, el primero producido a partir de S. clavuligerus y los otros 
obtenidos por síntesis química. En la tabla 1.1 se presenta las diferentes formulaciones 
de estos inhibidores con alguna β-lactamasa de uso comercial de acuerdo con la 
indicación médica y el microorganismo susceptible de provocar la enfermedad [9, 11]. 
Las aplicaciones y usos de estos inhibidores y nombres comerciales cambian de acuerdo 
con los países y las regiones [8, 11], por ejemplo en varios países Europeos, Japón e 
India se utiliza más Cefoperazone-Sulbatam, el cual no se comercializa en E.U. (Estados 
Unidos) [11], . Dada la importancia de encontrar nuevas moléculas activas que 
contrarresten las enfermedades infecciosas, se están realizando estudios para demostrar 
la eficacia clínica de nuevos inhibidores como son penems, derivados de monobactamas 
de penicilinas y cefalosporinas [11, 12]. 
1.1. LOS ANTIBIOTICOS β-LACTÁMICOS 
1.1.1. Generalidades. 
Los antibióticos β-lactámicos representan el grupo de antibióticos más numeroso y de 
mayor uso en la clínica. Su nombre se debe a la presencia de un anillo β-lactámico en su 
estructura conformado por un oxígeno en la posición β con respecto a un nitrógeno (ver 
figura 1.1). De acuerdo con los radicales que se unen al anillo se derivan diversos 
subgrupos, los cuales se mencionarán más adelante. Pero antes se describirá el 
mecanismo general de cómo estos antibióticos logran destruir la bacteria infecciosa. 
Las bacterias tienen una pared conformada en parte por peptiduglucano que tiene como 
función la estabilidad osmótica y proteger la célula. Este compuesto no está presente en 
32 
 
Tabla 1.1. Formulaciones comerciales, prescripciones médicas y microorganismos 
susceptibles de provocar enfermedades infecciosas [11]. 
Formulación 
β-lactámico- 
inhibidor 
 β-lactámico 
Nombre 
comercial / 
manufactura 
Indicación clínica 
aprobada 
Eficacia clínica demostrada 
para estos microorganismo 
susceptibles de provocar 
enfermedades 
Amoxicilina- 
clavulanato 
Augmentin / 
GlaxoSmithKline 
Otitis media 
 
Neumonía, sinusitis 
bacteriana 
 
 
Infecciones en la piel 
Infecciones en el tracto 
urinario 
S. pneumoniae, H. influenzae, 
Moraxella catarrhalis 
H. influenzae,M. catarrhalis, K y S. 
pneumoniae, methicillin- 
susceptible,S. aureus, 
 
S. aureus, E. coli, Klebsiella sp. 
E. coli, Klebsiella spp., 
Enterobacter sp 
Ticarcilina- 
clavulanato 
Timentin / 
GlaxoSmithKline 
Infecciones vías respiratorias 
 
Infecciones óseas y 
articulares 
Infecciones en la piel 
Infecciones en el tracto 
urinario 
 
 
Infecciones ginecológicas 
Infecciones intra-abdominales 
S. aureus, H. influenzae, 
 Klebsiella sp. 
 
S. aureus 
 
S. aureus, Klebsiella sp, E. coli 
E. coli, Klebsiella sp, P. 
aeruginosa, Citrobacter sp, 
Enterobacter cloacae, Serratia 
marcescens, S. aureus 
Prevotella melaninogenicus, 
Enterobacter sp, 
E. coli, K. pneumoniae, S. aureus, 
S. epidermidis 
 
E. coli, K. pneumoniae, B. fragilis 
Ampicilina- 
sulbactam 
Unasyn / Pfizer 
 
a 
Infecciones en la piel 
 
 
Infecciones intra-abdominales 
 
Infecciones ginecológicas 
S. aureus, E. coli, Klebsiella sp,P. 
mirabilis, 
B. fragilis, Enterobacter sp, A. 
calcoaceticus 
 
E. coli, Klebsiella sp., Bacteroides 
sp, Enterobacter sp 
E. coli, Bacteroides sp 
Piperacilina- 
tazobactam 
Zosyn / Wyeth Apendicitis 
 
Piel y tejidos blandos 
infecciones, incluyendo 
infecciones del pie diabético 
 
Endometriosis posparto o 
inflamación pélvica 
 
Neumonía 
 
Nosocomiales 
(intrahospitalarias) 
 
E. coli, Bacteroides sp 
 
S. aureus 
 
 
 
E. coli, 
 
 
H. influenza 
 
S. aureus, A. baumannii, H. 
influenzae, K. pneumoniae, 
P. aeruginosab 
33 
 
los eucariotas. El petidoglucano está conformado por unidades glucosídica (N-acetil–D-
glucosamina y N-acetil-ácido murámico), las cuales se entrelazan por transglucosidasas. 
 
Hay unas cadenas laterales pentapéptidos unidas al N-acetil-ácido murámico la cual es 
entrelazada con otra molécula igual por la enzima transpeptidasa, PBP (penicillin-
binding-proteins) confiriéndole a la célula una pared protectora. El anillo β-lactámico es 
estéricamente similar al pentapéptido unido a N-acetil-ácido murámico por lo que la 
PBP lo asume como sustrato propio y lo integra en su síntesis de peptidoglucano, siendo 
este proceso infructuoso evitando que se forme la pared celular y favoreciendo la lisis 
osmótica [2, 8, 11]. 
1.1.2. Clasificación de los antibióticos. 
Los antibióticos de mayor importancia, incluyendo el AC que es inhibidor de β-
lactamasas se muestran enla figura 1.1 y son: 
a) Las penicilinas: Tienen como núcleo químico el anillo 6-aminopenicilánico o núcleo 
penam que consta a su vez de un anillo de tiazolidina (un anillo aminofenílico de los 
tiazoles), enlazado a un anillo β-lactámico y un grupo amino. Los compuestos difieren 
entre sí por la estructura de su cadena lateral unida al grupo amino, el cual le confiere 
las propiedades farmacológicas. Entre las penicilinas comerciales están los productos 
Penicilina G, Amoxicilina, Ampicilina, [9, 11]. 
b) Las cefalosporinas: (derivados del ácido 7-aminocefalosporánico): son 
antimicrobianos similares a la penicilina en su estructura y modo de acción, poseen un 
anillo de dihidrotiazina de seis átomos en lugar del anillo de tiazolina de cinco átomos 
característico de las penicilinas, enlazado a un anillo ß-lactámico y un grupo amino. Sin 
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_6-aminopenicil%C3%A1nico
http://es.wikipedia.org/wiki/Cadena_lateral
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_amino
34 
 
 
 
 
 
 
 penicilinas cefalosporinas 
 
S
N
CH2R
COOH
O
NH
R2
O
R1
 
cefamicinas cefamicina C 
 
 
 
 
 monobactamas carbapenems 
 
O
N
O
R
R1 
clavamas ácido clavulánico 
Figura 1.1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos: La naturaleza de 
los sustituyentes R es responsable de cambios en las propiedades químicas y 
biológicas de las moléculas. 
O
N
S
COOH
NHCR
O
CH3
CH3
1
2
34
56
7
R1
O
N
SNHC
O
R2
OOH
7
8
1
3
4
2
5
6
SO3H
O
N
NHCR
O
O
OH
O
N
C
S-R
.
R1
O
N
O
CO2H
CH2
H
OH
S
N
COOH
O
OCH3
OCONH2
NH
O
NH2
COOH
35 
 
embargo presentan más resistencia a las β-lactamasas y tienen un espectro de actividad 
antibacterial más amplio que las penicilinas, gracias al desarrollo de modificaciones 
semisintéticas de los radicales R1 y R2 [2, 13]. Entre los productos comerciales esta la 
Cefalexina. Las cefamicinas son similares a las cefalosporinas, la única diferencia es 
que tienen un grupo metoxi en el ácido 7-aminocefalosporánico. Son producidas por 
hongos productores de β-lactamasa (Cephalosporium acremonium ), sin embargo se 
han encontrado especies de Streptomyces (como clavuligerus) productoras tanto de 
penicilinas como de cefalosporinas [2, 13]. Un producto comercial es la Cefamicina C, 
con un anillo ß-lactámico, un anillo dihidrotiacínico, una cadena lateral de ácido α-
aminoadípico, un grupo metoxi en el carbono C-7, y un grupo carbamato en C-3. 
c) Otros β-lactámicos no convencionales son las monobactamas, carbapenems, 
clavamas y nocardicinas. El principal mecanismo de acción de estos compuestos es la 
inhibición de la síntesis de la pared celular por lo que alteran la integridad de la 
membrana citoplasmática impidiendo la síntesis de proteínas y la síntesis de los ácidos 
nucleicos. Las monobactamas son antibióticos ß-lactámicos mono cíclicos que 
interactúan con las PBP induciendo la formación de largas estructuras bacterianas 
filamentosas. En caso de ser alérgico a la penicilina se usa una monobactama 
[3,14].Clavamas es una familia de compuestos con una estructura básica de anillos 
similar al del ácido clavulánico, pero son opuestos en su configuración estereoquímica. 
La clavamas diferentes al AC poseen estructura 3S, 5S por lo que carecen de actividad 
inhibidora de ß-lactamasas, pero algunos poseen actividad anti fúngica o antibacteriana. 
Como modelo, la alanil-clavama posee actividad bacteriostática frente a bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas y frente a hongos, mediante la inhibición de la enzima 
homoserina transacetilasa, que participa en la biosíntesis de metionina [3, 14]. 
36 
 
Entre las calvamas, está el ácido clavulánico, una molécula inhibidora de β-lactamasas. 
Se han realizado diversos estudios para determinar la eficacia clínica de varios 
inhibidores de β-lactamasas bacterianas (AC, sulbactam, tazobactam) donde se ha 
demostrado que el AC tiene mayor efectividad sobre bacterias aerobias y anaerobias 
[13-15]. 
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBIÓTICOS. 
El problema de resistencia de microorganismos Gram negativos a los antimicrobianos β-
lactámicos se describe a partir de 1960, cuando aparecieron cepas de Escherichia coli 
productoras de β-lactamasas. Posteriormente también se describieron Klebsiella 
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, resistentes a β-lactámicos 
por producción de β-lactamasas[11, 16]. La resistencia a los antibióticos es un ejemplo 
de como las bacterias desarrollan de forma natural nuevos fenotipos a través de 
combinaciones de mecanismos difíciles de predecir y los cuales pueden estar 
influenciados por el ambiente, el cual juega un papel importante en la selección y 
mantenimiento de tales fenotipos [10, 14]. 
Los antibióticos son empleados para eliminar la capacidad de reproducción 
bacteriananas atacando partes específicas en su estructura. Sin embargo estas bacterias 
pueden generar mecanismos que las protegen de la actividad de los antibióticos. Entre 
los mecanismos de resistencia que han sido identificados se encuentran: i) La 
producción de enzimas principalmente en bacterias Gram negativas que destruyen el 
antibiótico, especialmente de la familia de β-lactámicos y aminoglucósidos, ii) Cambios 
en los sitios activos de las PBP que disminuyen la afinidad por los antibióticos β-
lactámicos, esta información se pasa a través de transformación natural y recombinación 
37 
 
de DNA con otros organismos confiriéndoles a las células resistencia. iii) El desarrollo 
de proteínas complejas capaces de bombear el antibiótico hacia fuera de la célula, iv) 
Modificaciones en la molécula de la célula que es objetivo del antibiótico [10, 11]. 
Las de β-lactamasas se clasifican en cuatro clases: A, B, C y D. Las pertenecientes a las 
clases A, C y D poseen serina (SER) como el nucleófilo en un sitio activo, mientras que 
en la de clase B un ión metálico (Zn
2+
) es responsable de la inactivación de las β-
lactamasas. En Enterobacteriaceae (por ejemplo, en Escherichia coli y Klebsiella 
pneumoniae) las β-lactamasas más frecuentes pertenecen a la clase A [19]. En la 
actualidad la mayor parte de estudios están orientados a entender el mecanismo de 
acción de β-lactamasas tipo A, donde algunas de ellas son inhibidas irreversiblemente 
por AC, Sulbatam y Tazobactam [8, 11]. 
Las β-lactamasas (E.C. 3.5.2.6) son enzimas bacterianas periplásmicas (hidrolasas) que 
son producidas principalmente en bacterias del género Enterobacteriaceae y son 
responsables de la resistencia que estas bacterias presentan frente a la penicilina, 
cefalosporina y carbapenems. Las enzimas hidrolizan el anillo β—lactámico, el cual 
inactiva las propiedades antibacteriales de la molécula. En la figura 1.2 se presenta de 
forma esquemática el mecanismo de reacción de hidrólisis de un genérico de penicilina 
denominado como antibiótico activo (AA) con la enzima β-lactamasa (E). Con la 
reacción horizontal se representa como la enzima β-lactamasa reacciona con parte de la 
estructura del antibiótico denominada ácido 6-aminopenicilánico, del cual se derivan las 
penicilinas, desdoblando esta estructura (antibiótico inactivo) y regenerándose la 
enzima, esto se da en varias etapas que son mostradas en detalle en las referencias [11, 
17]. Para evitar la destrucción del antibiótico, este se aplica en combinación con algún 
inhibidor de las β-lactamasas (I) (reacción vertical en la figura 1.2), las β-lactamasas 
38 
 
reaccionan con el anillo β-lactámico de estos inhibidores formando el complejo EI de 
forma covalente e irreversible, quedando disponible la penicilina para ser enlazada a la 
PBP y provocar la destrucciónde la célula por lisis osmótica [11, 17]. 
 
Figura 1. 2. .Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis 
catalizada por β-lactamasa (parte superior) e inhibidores de β-lactamasa en la 
parte inferior [17]. 
 
1.3. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE β-LACTÁMICOS 
 
El desarrollo de diversas formulaciones requiere de una alta producción industrial de AC 
[15, 18, 19]. Los antibióticos generaron ventas por USD 42 mil millones en el mercado 
global, en 2009. Aproximadamente el 50% de las ventas corresponden a productos β-
lactámicos incluyendo penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas, ácido 
clavulánico y carbapenems [3]. El AC obtuvo un crecimiento anual del 4% entre 2005 y 
2010 [20], 
Muchos β-lactámicos de uso clínico son sintetizados químicamente por procedimientos 
costosos y generando con bajos rendimientos [3], Es por esto que para producir 
antibióticos a gran escala se combinan procesos fermentativos mediante los cuales se 
Antibiótico Activo Antibiótico Inactivo 
Enzima (E) 
+ 
Inhibidor (I) 
Complejo EI 
K2 >> K1 
K1 
K2 
39 
 
obtiene la molécula base que es sometida subsecuentemente a modificaciones 
semisintéticas, obteniéndosen productos con adecuadas propiedades antimicrobianas y 
farmacológicas. Hoy en día, la fermentación continúa siendo el procedimiento más 
utilizado, empleando cepas mejoradas genéticamente, logrando altos rendimientos a 
costos moderados, en particular con penicilina [3]. Se pueden destacar las siguientes 
moléculas producidas a escala industrial: 
Penicilinas: La Penicilina V y Penicilina G son las únicas penicilinas naturales de uso 
clínico. Estas se obtienen a gran escala y con una alta titulación (50 g L
-1
) por el cultivo 
de Penicillium chrysogenum. Existen otras variaciones de penicilinas que se obtienen 
por modificaciones semi sintéticas [2, 3]. 
Cefalosporinas y cefamicinas: Todas las cefalosporinas comerciales de mayor difusión 
como antibiótico, son obtenidas mediante procesos semi sintéticos. Desafortunadamente 
el proceso de producción es de bajo rendimiento y costoso. En la actualidad se obtienen 
altos rendimientos de Cefalosporina C en cultivos del moho Acremonium chrysogenum 
a gran escala con una alta titulación (30 g L
-1
). Sin embargo, el compuesto presenta 
problemas de estabilidad debido a su tendencia a degradarse durante la fermentación [2, 
21]. 
Ácido clavulánico: El proceso de producción a partir de la bacteria Streptomyces 
clavuligeus es de bajo rendimiento y de alto costo. La productividad del proceso, 
depende de diversos factores, entre ellos tipo y concentración de nutrientes, condiciones 
de operación de la fermentación y mecanismos intracelulares de biosíntesis. A pesar de 
los esfuerzos de los investigadores que trabajan en el tema en el mundo, no se ha 
alcanzado valores de producción (título) de AC superiores a 1 g L
-1
[18, 22]. El mayor 
productor mundial de AC, GlaxoSmithKline, ha reportado titulaciones de 561 mg L
-1
 
40 
 
[23] y algunas empresas como Antibióticos S.A. indican que algunos métodos de 
purificación requieren que la concentración de AC en el medio de cultivo debe ser 
mayor a 1 g L
-1 
para hacerlos más eficientes [24], 
 
41 
 
REFERENCIAS 
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infectious diseases 2000,‖ 2000. http://www.who.int/infectious-disease-report/. 
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antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y 
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for its overproduction,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 88, no. 3, pp. 659–
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for its overproduction,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 88, no. 3, pp. 659–
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[19] K.- Chen, Y. Lin, J. Wu and S. Hwang, ―Enhancement of clavulanic acid production in 
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[20] A. So, N. Gupta, S. Brahmachari, I. Chopra, et al, ―Towards new business models for 
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[21] M. Jurgens, G. Seidel, and K. Schugerl, ―Production of Cephalosporin C by Acremonium 
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[22] J. Teodoro, A. Batista-Neto, M. Araujo, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of glycerol 
and ornithine feeding on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ vol. 
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[23] L. Gordon Cambell and L. Lilley, ―Clavulanic Acid Production,‖ U.S. Patent 1, 571, 
888, 1980. 
[24] T. Olleros Izard, J. L. Fernández Puentes and M. A. Moreno Valle, ―Procedimiento para 
Mejorar la Extracción de ácido clavulánico,‖ U.S. Patent 537, 158, 1984. 
 
 
 
43 
 
CAPITULO 2 
 
METABOLISMO DE S. Clavuligerus 
 
En los últimos 20 años, se han desarrollado unas estrategias de modelado del 
metabolismo celular, con el objetivo de identificar a partir deun análisis sistémico y 
racional, los cuellos de botella en las rutas de biosíntesis de metabolitos de interés. 
Eliminar estas limitaciones permitiría incrementar los rendimientos de productos así 
como encontrar nuevos productos de interés. La aplicación de estas estrategias mediante 
el uso de técnicas para el análisis racional del metabolismo celular que facilite y oriente 
las posteriores estrategias de manipulación genética con el objetivo de mejorar los 
bioprocesos, se conoce como Ingeniería Metabólica (IM). En la actualidad, la IM se 
viene aplicando con acelerado crecimiento permitiendo entender mucho mejor los 
procesos de biocatálisis orientados a maximizar el rendimiento y la productividad de 
metabolitos de interés en campos, como Biotecnología de alimentos, Biotecnología 
ambiental y, más recientemente, Biotecnología farmacéutica [1, 2, 3]. En este último 
campo se han logrado obtener titulaciones más altas de algunos β-lactámicos y el 
desarrollo de nuevos productos de interés farmacéutico [3]. La metodología incluye el 
análisis de la capacidad celular, análisis de flujos metabólicos, análisis de control 
metabólico (MCA) y síntesis de sistemas e integración de datos bioinformáticos. Dentro 
de los trabajos para el mejoramiento de la producción de compuestos β-lactámicos se 
han empleado como modelos diversas especies del género Streptomyces. Existen pocos 
44 
 
trabajos en los cuales se ha aplicado IM para incrementar la titulación de ácido 
clavulánico (AC), inhibidor de β-lactamasas. 
En este capítulo se presenta una discusión sobre el metabolismo de S. calvuligerus que 
permitirá establecer el mapa o modelo metabólico que se empleará más adelante para 
trabajos de análisis de flujos metabólicos (AFM) y análisis de balance de flujos 
metabólicos (ABM). 
2.1. BIOLOGIA DE Streptomyces sp. 
2.1.1. Ciclo de Vida: 
Los Estreptomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de 
diferenciación morfológica y fisiológica. Estas bacterias son capaces de colonizar 
sustratos con restos de materia orgánica, formando una red de hifas ramificadas y 
septadas que dan lugar al ―micelio sustrato‖. Estas hifas obtienen los nutrientes de la 
degradación del material orgánico insoluble gracias a sus numerosas enzimas 
hidrolíticas [4, 5, 6]. En una primera fase, las zonas más alejadas de la fuente de 
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva (lípidos, glucógeno, etc.) hasta que 
en un determinado momento, debido a la carencia de nutrientes reciben una serie de 
señales en esta zona, que disparan la expresión de genes implicados en la formación del 
micelio aéreo. Se produce así, el desarrollo de hifas que emergen del ―micelio sustrato‖ 
para dar lugar al micelio aéreo. Estas hifas se nutren de los productos de degradación 
del micelio sustrato ―viejo‖, y en una segunda etapa sufren un proceso de curvatura, 
enrollamiento, formación de septos y engrosamiento de la pared celular para dar lugar a 
una cadena de esporas uninucleares, que se liberan al medio y que con las condiciones 
adecuadas, germinan y desarrollan un nuevo micelio sustrato [5, 6] 
45 
 
El interés científico en las bacterias del género Streptomyces radica fundamentalmente 
en dos importantes características: i) Su rico metabolismo secundario y ii) La 
diferenciación morfológica que acompaña al primero (i) y se basa en el desarrollo 
secuencial de un micelio aéreo, hifas y finalmente esporas descritas más adelante (ver 
figura 2.1). Cuando una espora de Streptomyces se libera al medio ambiente y encuentra 
las condiciones necesarias para su germinación, se pone en marcha una compleja 
maquinaria molecular capaz de llevar a cabo un control genético temporal y espacial que 
culmina con la formación de varios tejidos: micelio substrato, micelio aéreo y más 
esporas, características morfológicas y fisiológicas similares a la de los hongos. Si bien 
todas estas características asociadas a la bacteria Streptomyces son muy similares a la de 
los organismos eucariotas multicelulares, las características celulares (típica de 
procariotas) y el mecanismo de reproducción son muy diferentes. En la figura 2.1 se 
presenta en forma gráfica y sintética el ciclo de vida de Streptomyces sp, y a 
continuación se presenta en mayor detalle la forma como se lleva a cabo la interacción 
micelio-sustrato [6, 7]: 
Desarrollo del micelio sustrato: Cuando germina una espora unigenómica se forma un 
tubo de germinación mediante crecimiento apical de la pared celular. Posteriormente las 
células empiezan a desarrollar ramificaciones laterales logrando estabilizar la tasa de 
crecimiento comenzando la septación [6, 7]. Las partes de micelio más viejas 
comienzan a septarse, formando zonas apicales y sub-apicales. En las sub-apicales a 
pesar de que aún hay síntesis de ADN, y se detiene el crecimiento de la pared celular 
(en ocasiones, nuevas ramificaciones pueden aparecer en los compartimentos sub-
apicales, lo que lleva consigo la recuperación de ciertas características de la región 
apical) [6]. Poco a poco el micelio sustrato se va expandiendo, la región más vieja se va 
46 
 
aglomerando y empiezan a ocurrir cambios en la colonia que llevarán a la creación de 
micelio aéreo. 
 
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. (a) Inicialmente un 
micelio filamentoso coloniza su sustrato. (b) Tras un periodo de crecimiento asimilativo, 
las hifas aéreas crecen hacia la atmósfera. (c) Posteriormente se septan (tabicación). 
Para (d) formar cadenas de esporas pigmentadas [3]. 
 
Desarrollo del micelio aéreo: Una vez desarrollado el aglomerado de hifas sobre el 
sustrato, este se torna muy compacto en la zona central (y ancestral) donde ocurre un 
agotamiento de las reservas de nutrientes y varios tipos de estrés fisiológico comienzan a 
ejercer presión selectiva sobre la expresión de determinados genes. El 
acondicionamiento a estos fenómenos está probablemente mediado por el gen relA y 
nucleótidos polifosforilados como ppGpp [6, 8, 9]. Este fenómeno es conocido como 
respuesta estricta y se basa en los siguientes mecanismos: i) El metabolismo primario se 
(a) 
(b) 
(c) 
(d) 
47 
 
vuelve más lento; ii) comienza la inducción del metabolismo secundario (proteínas 
extracelulares, antibióticos, etc.); iii) hay un metabolismo acumulativo en la superficie 
de la colonia; iv) comienza la lisis de ciertas regiones del micelio sustrato y se inicia el 
crecimiento aéreo [6, 10]. 
Existe una muerte celular programada en la interacción micelio sustrato por la cual la 
síntesis de diversas enzimas extracelulares permite a la colonia degradar el micelio 
sustrato muerto así como otra materia orgánica remanente en el medio. La acumulación 
de los nutrientes en la superficie de la colonia, permite el crecimiento de las hifas 
aéreas de una forma saprofita (se alimentan de los segmentos aún viables del micelio 
sustrato) y posteriormente forman esporas para colonizar nuevas áreas y la síntesis de 
los compuestos biocidas del metabolismo secundario. Estos dos mecanismos otorgan 
una importante ventaja a la bacteria a la hora de dominar su nicho [10]. 
La morfología de Estreptomicetos en medio líquido no ha sido muy estudiada por 
considerar que bajo estas condiciones no hay esporulación y por ende diferenciación 
morfológica [10]. Al crecer el microorganismo en medio líquido, el ciclo de vida 
descrito anteriormente no se observa normalmente. Dependiendo del tipo de agitación, 
componentes del medio de cultivo pueden formar agregados miceliares sencillos o en 
tipo de pelet, el tamaño y la forma de éstos son relativos a la especie. En medio de 
cultivo químicamente definido se tiene un crecimiento más disperso que el presentado 
en medio de cultivo complejo con hidrolizados de harina soja. En este tipo de cultivos, 
algunos componentes del medio, como el anti-espumante,