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35 FRECUENCIA DE POBLADORES Y ANIMALES DOMÉSTICOS DEL CASERÍO DE CHIRINOS (PIURA) CON ANTICUERPOS A TRYPANOSOMA CRUZI ENTRE ABRIL A DICIEMBRE DEL 2000* Julissa García M, Luisa Lázaro M, Jerson Chía P, Mermes Escalante A. RESUMEN García MJ, Lázaro ML, Chía PJ, Escalante AH. Frecuencia de pobladores y animales domésticos del caserío de Chirinos (Piura) con anticuerpos a Trypanosoma cruz; entre abril a diciembre del 2000. Rev perú Parasitol. 2002;16(1):35-40. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la frecuencia de pobladores así como de Cavia porcellus, Ovis oríes y Canis familiaris del caserío de Chirinos - Piura (40°23"10' Latitud Sur y 75°45"15'Longitud Oeste) que presenta n anticuerpos a Trypanosoma cruz/, entre abril y diciembre del 2000, en relación a ciertos factores epidemiológicos. La muestra estuvo constituida por 304 pobladores, 42 ejemplares de C. porcellus (cobayo), 40 de O. oríes (oveja) y 30 de C. familiaris (perro). De cada individuo se obtuvo una muestra sanguínea, cuyo suero fue procesado por la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) utilizando como antígenos, epimastigotes de T. cruz/ cultivados en el medio BHI. Se encontró serología positiva en 35 pobladores (11,5 %) siendo mayor en aquellos procedentes de Barrios Altos (16,7 %) respecto a los de Barrios Bajos (7,2 %); cuya diferencia estadística fue significativa (p<0,05); sin embargo, no se encontró diferencia significativa de la serología positiva en relación con el sexo, ni con relación a grupos etéreos (p>0,05). De los 112 animales domésticos examinados, se encontró mayor porcentaje de serología positiva en perros (40 %) y en cobayos (38,1 %), siendo menor en ovejas (12,5 %). Se encontró diferencia significativa entre perros y los cobayos con relación a las ovejas (p<0,05). Con relación al título de anticuerpos se encontró que los perros alcanzaron serología positiva hasta 1/32, y en el resto de animales y humanos hasta 1/16. Se concluye que los pobladores de Chirinos presentaron serología positiva a T. cruz/ en un 11.5%, los perros 40%, los cobayos 38.1% y las ovejas 12.5%, siendo los títulos de anticuerpos para perros 1/32 y para el hombre y los demás mamíferos 1/16. Falta verificar si existen personas con enfermedad de Chagas y si los animales se comportan como reservónos de la mencionada enfermedad. Palabras clave: Trypanosoma cruz/, Inmunofluorescencia indirecta, humano, perro, cobayo, oveja. ABSTRACT García MJ, Lázaro ML, Chia PJ, Escalante AH. Frecuence in peoples and domestic animáis of Chirinos (Piura) with Trypanosoma cruzí between April-Dicember 2000. Rev perú Parasitol. 2002;16(1):35-40. The present work had like objective to determine the frequency of settlers as well as of Cavia porcellus, Ovis oríes and Conís familiaris of the small village of Chirinos - Piura (40°23.10. South Latitudeand 75 "45.15. Longitud the West) that presents/displays antibodies to Trypanosoma cruz/, between April and December of the 2000, in relation tocertain factors epidemiologists. The sample was constituted by 304 settlers, 42 unitsof C. porcellus (cobay), 40 of O. oríes (ewe) and 30 of C. familiaris (dog). From each individual a sanguineous sample was obtained, whose serum was processed by the technique of Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) using like antigens, epimastigotes of T. cruzi cultivated in the average BHI. Was positive serología in 35 settlers (11,5 %) being greater in those coming from High Districts (16,7 %) with respect to those of Slums (7,2 %); whose statistical difference was significant (p<0,05); nevertheless, was not significant difference of the positive serología in relation to sex, ñor in relation to etéreos groups (p>0,05). Of the 112 examined domestic animáis, was greater percentage of positive serología indogs (40%) and cobay (38,1 %), being smallerinewes (12,5%). Was significant difference between dogs and the cobay onesin relation to the ewes (p<0,05). With relation to the title of antibodies one was that the dogs reached positive serología until 1 /32, and in the rest of animáis and humans until 1/16. Oneconcludes that the settlers of Chirinos presented/displayed positive serología to T. cruz/in 11,5 %, dogs 40%, cobay 38,1 % and ewes 12,5%, being the tilles of antibodies for dogs 1/32 and the man and other mammals 1/16. Lackto verify if people with disease of Chagas exist and if the animáis behave like reservorios of the mentioned disease. Key words: Trypanosoma cruzi, Indirect Inmunofluoresce, human, dog, cobayo, sheep. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana es una parasitosis zoonótica causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y trasmitida por diversas especies de insectos hematófagos de la sub familia Triatominae (Fam. Reduvidae).1'2 Esta enfermedad constituye uno de los principales problemas de salud pública en 17 países de América donde se estima que existen aproximadamente 24 millones de personas infectadas y que más de 100 millones se encuentran en riesgo de adquirirla.3-5 El diagnóstico se basa en la detección del parásito (diagnóstico directo) y en la búsqueda de moléculas relacionadas con la respuesta inmune contra el parásito Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo. E- mail: lissagame@hotrnail.com (diagnóstico indirecto), por ello, la utilización de determinadas pruebas dependerá mucho de la fase evolutiva de la enfermedad.6 El xenodiagnóstico, el hemocultivo y la gota gruesa son algunos de los métodos de utilidad en la etapa crónica, pues en esta etapa puede detectarse a T. cruzi en la sangre periférica; en cambio, los métodos indirectos son de vital importancia para ayudar al diagnóstico de la enfermedad en circunstancias en que el parásito es de difícil visualización directa y para evaluar el tratamiento terapéutico.1,7 Entre las diversas pruebas serológicas disponibles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas se hallan la Reacción de Hemaglutinación Indirecta (HAI), la Prueba de Inmunoensayo Enzimático (ELISA) y la Reacción de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ésta última altamente eficiente en la detección de anticuerpos específicos.6,8 La zona Nor Occidental del Perú ha sido considerada libre de la enfermedad de Chagas, a pesar que se han efectuado algunas investigaciones que revelan la 36 presencia del parásito y del vector. Específicamente en Piura, en 1950, se investigó la distribución geográfica de la enfermedad de Chagas revelando la presencia de ejemplares sólo en los ámbitos extra o peridomiciliaria, de los cuales muy pocos estuvieron infectados con T. cruzi; sin embargo, no se logró diagnosticar caso alguno de enfermedad en humanos.9 En 1984 se investigó la enfermedad de Chagas en las localidades de Suyo, Chirinos y Surpampa del distrito de Suyo, Provincia deAyabaca, detectándose infección por T. cruz; en los pobladores por xenodiagnóstico, frotis sanguíneo, gota gruesa y serología; así mismo, se comprobó la presencia de P. chinai en el 1,0 % de las viviendas visitadas, encontrándose, por primera vez, infección natural por T. cruzi en un espécimen de esta zona. De las 169 personas estudiadas se encontró nueve casos positivos de infección por T. cruzi, seis de ellos fueron diagnosticados por xenodiagnóstico y tres por Reacción de fijación del complemento (RFC); sin embargo, no se encontró infección en Canis familiaris (perro), Felís catus (gato) y Equus as/ñus (asno), que fueron investigados por xenodiagnóstico.10 En 1992 se realizó un estudio serológico para detectar anticuerpos contra el T. cruz/ por las técnicas de hemaglutinación pasiva y ELISA en 35 pobladores de Sapillica de la Provincia de Ayabaca siendo los resultados negativos.11 Las publicaciones realizadas hasta la fecha con relación a la tripanosomiasis en el norte del Perú, permiten comprender que el agente etiológico está presente en algunas especies de triatominos, que algunos mamíferos se comportan comohuéspedes reservónos y algunas personas han sido infectados por T. cruz/; sin embargo, no se cuenta con datos precisos sobre la presencia de infecciones por este protozoo en humanos y animales domésticos de Chirinos - Suyo, caserío ubicado en la zona tropical, donde se encuentran las condiciones apropiadas para el desarrollo de esta enfermedad. En tal sentido, se justifica la realización del presente trabajo el cual estuvo dirigido a responder la siguiente interrogante ¿Cuál es la frecuencia de pobladores y especímenes de Conís familiaris (perro), Ovis aries (oveja) y Cavia porceüus (cobayo) del caserío de Chirinos, Suyo (Ayabaca, Piura) con anticuerpos a T. cruzi, entre abril y diciembre del 2000 y su relación al barrio de procedencia, la edad y el sexo de los pobladores?. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Población estudiada El estudio se realizó desde abril a diciembre del 2000 en pobladores y ejemplares de C. familiaris (perro), O. aries (oveja) y C. porceüus (cobayo) del caserío de Chirinos (40° 23" 10' de LS, 75°45"15' LO), el cual pertenece al d istrito de Suyo a la provincia de Ayabaca, y al departamento de Piura; con una extensión de 12 km, se ubica a 9 km de Suyo, la capital del distrito y a 15 Km de Macará (Ecuador). Tiene una altitud de 3 000 m, presenta temperaturas que varían de 24 °C a 30 °C; su clima es variado con fuertes l luvias en los meses de febrero a mayo y clima caluroso el resto del año. El ámbito de este caserío es netamente rural y semirrural, con aproximadamente 1 350 habitantes, distribuidos en 200 viviendas ubicadas entre los Barrios Bajos (Chirinos) y Barrios Altos (La Pareja). Ambos barrios presentan viviendas de adobe con techo de tejas, paredes de adobe sin enlucir, con grietas o resquebrajaduras. Los pobladores tienen como principal actividad la agricultura y crían dentro de sus casas animales domésticos, como cobayos y perros; .frecuentemente,los"corrales de las ovejas y cabras se encuentran aledaños a sus viviendas. 2. Muestra y muestreo La muestra estuvo constituida por 304 personas y 112 animales, correspondiendo 30 de ellos a perros, 40 a ovinos y 42 a cobayos procedentes de B. Bajos (Chirinos) y 177 a B. Altos (La Pareja). Para elegir a los pobladores que conformaron la muestra se determinó primero el número total de viviendas de la zona (aproximadamente 200 casas); luego se realizó un sorteo, seleccionando al azar 100 casas, donde se muestreo el 50 % del total de los habitantes, y a un número variable de animales según su disponibilidad, tratando de que sea representativa de la población total: perros (50 %), ovejas (10 %) y los cobayos se compraron de la mayoría de casas muestreadas. 3. Procedimiento 3.1. Inmunofluorescencia a. Extracción de sangre Se obtuvo aproximadamente 3 mL de sangre por punción venosa en vacutainer, cuyos tubos convenientemente rotulados se transportaron en cajas de tecknopor con bolsas de hielo al laboratorio. La muestra sanguínea de perros y ovinos se obtuvo de la vena femoral, y la de los cobayos por punción cardiaca. b. Obtención del suero sanguíneo La separación de los sueros se realizó por centrifugación a 1500 rpm por 3 minutos, los que fueron colocados en frascos de Eppendorf para ser conservados en congelación (-20 °C) hasta su procesamiento. c. Preparación de antígenos Los antígenos se prepararon a partir de epimastigotes de T. cruzi, obtenidos del medio bifásico BHI enriquecido con sangre desfibrinizada de conejo, a partir de una cepa proporcionada por el Laboratorio de Parasitología de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa. Cuando el crecimiento de los parásitos estuvo en fase logarítmica, aproximadamente a los siete días de cultivo, los epimastigotes fueron lavados tres veces por centrifugación y decantación con solución buffer fosfato salino (PBS), pH 7,2, luego fueron fijados formaldehído al 2 % por 18 horas a temperatura ambiente y, finalmente, lavados dos veces mas con PBS para eliminar el fijador. Para determinar la concentración óptima por campo microscópico se suspendió el sedimento con 2 mL de PBS, colocando una gota de dicha suspensión entre lámina y laminilla para observarla al microscopio con objetivo de 10X, debiendo observarse aproximadamente- 100 parásitos por campo. Se colocó una gota de la suspensión de epimastigotes en cada uno de los círculos delimitados en las láminas de inmunofluorescencia, las cuales fueron colocadas a 37 °C para lograr secar l a gota y luego ser guardadas en cajas portaláminas a - 20 °C, hasta su uso. 37 d. Ejecución de la prueba La prueba de IFI fue realizada, de acuerdo a lo propuesto por Escalante y Plasencia (1995), cuyos pasos fundamentales fueron los siguientes: a) Se usó un control salino (PBS pH 7,2), un control nulo, un control positivo a las diluciones, 1/4, 1/8, 1/16 y 1/32, y un control negativo a las diluciones 1/4y1/16. b) Los sueros problemas también se utilizaron a las diluciones, 1/4, 1/8, 1 /16 y 1732 colocando una gota (0,01 mL) sobre los antígenos incubando a 37 °C durante 30 minutos en cámara húmeda. c) Las láminas se lavaron dos veces con PBS pH 7,2, durante cinco minutos en cada vez. d) Para detectar la presencia de anticuerpos en los sueros utilizados se agregó al área delimitada 0,01 mL de anti IgG humana marcada con fluoresceina a la dilución de 1/64, para ser incubadas a 37 °C por 30 minutos en cámara húmeda. e) La parte del conjugado no fijado se eliminó lavando dos veces la lámina con PBS pH 7,2, durante cinco minutos. f) Se secó la lámina con papel de filtro y se cubrió con laminillas las áreas delimitadas usando como liquido de montaje glicerina tamponada (una parte de glicerina y nueve partes de buffer carbonato pH9,5). g) Se observó la reacción al microscopio de fluorescencia a 40X. e. Criterios de lectura Se consideraron positivas a las muestras que presentaron fluorescencia de coloración amarillo - verdosa nítida en las membranas de más del 50 % de las membranas de los parásitos. En los casos que no hubo fluorescencia del parásito, y que presentaron una tonalidad de color ladrillo opaco, se consideraron como negativos. f. Tratamiento estadístico Se construyeron cuadros de frecuencias porcentuales de pobladores muestreados con anticuerpos a T. cruzi teniendo en cuenta el sexo, edad y barrio en la que residen los pobladores. Estas fueron sometidas la prueba estadística de Comparación de Proporciones, utilizando la distribución normal, con un nivel de significancia de 0,05. RESULTADOS Se encontró que, de los 304 sueros de pobladores examinados, 35 (11,5 %) presentaron serología positiva a T. cruzi, siendo significativamente mayor (p<0,05) el porcentaje hallado en pobladores de Barrios Altos (16,7 %) que de los habitantes en Barrios Bajos, que alcanzó sólo el 7,2 % (Cuadro 1). Cuando se relacionó el porcentaje de seropositividad y los grupos etáreos de los pobladores se encontró que fue mayor en el grupo de 11 a 20 años (14,7 %), seguido por el de 31 a 40 (12,5%) y menor en los grupos de 21 a 30 años y de 51 años a más, con 9,1 % (Cuadro 2). Sin embargo, estos valores no alcanzaron significancia estadística. En relación con el sexo, se encontró una frecuencia de 13,9 % en pobladores del sexo masculino y 9,6 % en pobladores del sexo femenino (Cuadro 3); pero tampoco existen diferencias significativas. De los 112 animales domésticos examinados como probables reservorios de T. cruzi, se encontró mayor porcentaje de serología positiva en perros (40 %), cobayos (38,1 %) y menor porcentaje en ovejas (12,5 %), existiendo diferencia significativa entre los perros y los cobayos con relación a las ovejas (Cuadro 4) De los 416 sueros analizados, en relación con el título de anticuerpos se encontró que fue mayor en perros, 1/32 y el menor 1/16 pertenece a humanos, cobayos y ovejas (Cuadro 5). DISCUSIÓN La mayor frecuencia encontrada de anticuerpos enpobladores de Barrios Altos (La Pareja) se debería a la mayor presencia de vectores y reservorios en esta zona por ser mayormente rural donde todos los pobladores crían en sus domicilios, animales domésticos como cobayos, palomas, gallinas y perros en el interior de las viviendas; asimismo los pobladores reconocen haber encontrado al insecto en sus viviendas, manifestando casi en su totalidad haberlo visto por las camas o paredes resquebrajadas de sus habitaciones. La menor frecuencia en pobladores de Barrios Bajos se debería a que sus viviendas son de adobe enlucido y no crían animales en el interior de su domicilio, además desconocen al vector o lo confunden con otros chinches fitófagos. Todo esto se debe a la falta de educación sanitaria sobre esta enfermedad y de otras que pueden estar presentes en este caserío. 38 Respecto al grupo etéreo de los pobladores, no existe significancia estadística, presentando igual probabilidad de contraer la infección tanto los niños, adultos y ancianos; pero a la vez cabe mencionar el alto porcentaje de personas seropositivas de corta edad encontradas en este caserío, si se tiene en cuenta que la gravedad de la enfermedad aumenta al presentarse en edades más tempranas de la vida. Además se debe resaltar que habiendo una gran cantidad de jóvenes en esta comunidad, los que no hayan presentado seropositividad de todas formas constituyen una importante población en riesgo de contraer la infección. Estos resultados no concuerdan con trabajos realizados en el departamento de Lambayeque,12,13 y Uruguay donde 5924 muestras de sueros, encontraron una mayor seroprevalencia en pobladores mayores de 12 años.10 En relación con el sexo tampoco existen diferencias signif icativas al aplicar la prueba estadística, presentando así la misma probabilidad de contraer infección tanto los hombres como las mujeres; hay que notar que la picadura del triatomino es indolora y ocurre en las noches, generalmente cuando el sujeto duerme pudiendo ser picado el hombre o la mujer.13 Estos resultados no concuerdan con trabajos realizados en otros países, por ejemplo en Brasil donde se ha realizado numerosos estudios, vemos que el 70,8 % de infectados se da en individuos del sexo masculino y un 29.2 % al sexo femenino, lo cual se debería, a que Chirinos es una zona netamente rural donde las labores agrícolas son realizadas tanto por hombres y mujeres de cualquier edad. Dado el importante rol que desempeñan los animales domésticos en la epidemiología de la enfermedad de Chagas, tuvimos interés, en comprobar su presencia en las viviendas, habiéndose encontrado que se les cría en corrales 39 adyacentes a las habitaciones o dentro de ellos; en mayor número se analizaron los cobayos, en razón de ser considerados como uno de los reservorios de mayor importancia epidemiológica en nuestro país, porque aproximadamente el 90% de los pobladores de las zonas semirrurales y rurales los crían dentro del domicilio,5,15-20 hecho que coincide con este caserío; sin embargo con el método aplicado (examen en fresco), no se encontró infección por T. cruzi en ninguno de ellos, lo cual no descarta la posibilidad de que estos actúen como reservorios de T. cruzi en esta zona, siendo necesario continuar los estudios usando técnicas de mayor sensibilidad; ya que por examen en fresco, la detección de los tripanosomas en la circulación se hace dificultosa, cuando se trata de una parasitemia leve, como generalmente ocurre en animales reservorios. Los perros son los principales huéspedes reservorios en el ambiente doméstico debido a que se han encontrado tasas desde 4.5 hasta 100 % de infección en las zonas rurales de países sudamericanos; lo que se asemeja a este caserío, ya que se encontró elevados porcentajes de C. familiaris seropositivos a T. cruzi, lo que señala a este animal como importante reservorio debido a la parasitemia persistente a cualquier edad y también a la infección congénita y lactogénica,2 generalmente los reservorios principales como perros y gatos no muestran signos de infección. Entre los reservorios domésticos también se analizaron las ovejas por ser criadas en este caserío en corrales aledaños a los ambientes de la casa. El porcentaje de O. oríes seropositivos en este caserío es mayor a 8.32 % de 133 ovinos examinados a T. cruzi mediante IFI en La libertad donde se presentaron títulos de 1/2 en todos los casos, 1 /4 en seis de ellos y 1 /8 en solo cuatro.21 Este hallazgo se acopla al registro de serología positiva a T. cruzi en animales sinantrópicos del norte del Perú. Los sueros resultaron positivos hasta las diluciones de 1/32 superior a Cajamarca y La Libertad donde se reportaron títulos de 1/2 hasta 1/16;8,13 sin embargo estos títulos son bajos si los comparamos con zonas endémicas de Nicaragua, donde considera títulos iguales o superiores a 1/322 o su equivalente cercano de 1/40 utilizado frecuentemente en Chile y Brasil.4 Los autores consideran títulos altos para evitar fenómenos de reacciones cruzadas con otras infecciones producidas por otros protozoos;14'22 para descartar esta posibilidad los sueros positivos a T. cruzi fueron analizados por IFI con antígenos de promastigotes de Leishmania, siendo los resultados negativos. También estos títulos bajos, pueden indicar infecciones leves lo cual concuerda con la oportunidad de sufrir de los pobladores una única infección o reinfecciones múltiples, al estar los triatominos parasitados con T. cruzi en su ámbito o región geográfica. Aquí en Chirinos se ha encontrado los insectos parasitados, además pobladores y reservorios domésticos positivos a T.cruzi, por ejemplo el perro con títulos de 1/32 por IFI, lo cual nos conduce a una probable infección tripanosómica la que depende fundamentalmente de la convergencia, en determinado tiempo y lugar, del agente etiológico, del insecto vector, del hospedero animal o humano y del susceptible, todo dentro de un contexto geográfico favorable y dentro de un conjunto de factores sociales, económicos y culturales reflejados en este caserío por la falta de educación sanitaria y bajos recursos en general. Este conjunto de factores permite en forma óptima la nidificación, alimentación y reproducción de los vectores y de los reservorios y la convivencia de los mismos, con la comunidad humana. El presente trabajo pretende demostrar una visión panorámica sobre la epidemiología de la enfermedad de Chagas en esta parte del norte peruano. El hallazgo de serología positiva en pobladores y animales domésticos del caserío de Chirinos por la técnica de IFI refleja altos porcentajes de individuos con anticuerpos, lo que nos hace suponer que probablemente la incidencia de esta enfermedad sea mayor en la sierra de Piura, ya que presenta todas las condiciones epidemiológicas favorables para su difusión, siendo necesario continuar con trabajos cuyos resultados nos permitan tener un alcance clínico real de esta enfermedad en nuestro país. Se recomienda hacer estudios clínicos complementarios para determinar si los supuestos chagásicos hacen realmente la enfermedad además consideramos indispensable efectuar estudios epidemiológicos y de vigilancia en la población animal con el fin de establecer la real prevalencia de la infección y el rol patógeno en los reservorios domésticos, y así poder determinar si el área referida corresponde o no a una nueva zona chagásica en el Perú. CONCLUSIÓN Los pobladores de Chirinos presentaron serología positiva a T. cruzi en un 11,5 %, los perros 40 %, los cobayos 38,1 % y las ovejas 12,5 %; siendo los títulos de anticuerpos para perros 1 /32, y para el hombre y los demás mamíferos 1/16. LITERATURA CITADA 1. AtíasA, NeghmeA. Parasitología Clínica. 3ra. Ed. Santiago de Chile: Edit. Mediterráneo. 1991:509. 2. Organización Mundial de la salud (OMS). Control de la Enfermedad de Chagas. Informe Técnico N° 811. Ginebra. 1991. 3. BechtDK. Adiós al insecto asesino, http:// www.paho.org/Spanish/DPI/Numero11 articulo4.htm 4. Lorca M, Thierman E. Técnica de ELISA IgGg e IgM en el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas Aguda.II:Evaluación diagnóstica del Método. Parasitol al Día. 1989;14:3-9. 5. Pessoa SB, Martins AV. 1982. Parasitología Médica, 11 va Ed. Rio de Janeiro: Edit. Guanabara Koogan. 1982:872. 6. Lorca M. Diagnóstico de la Enfermedad de Chagas por Métodos Clásico y Modernos. 6o/ perú Parasitol 1995;11:75-77. 7. 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