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42 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 42 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN Gilda Ruíz Gómez,1 Diana Andamayo Flores,2 Diana Castillo Andamayo3 El presente trabajo de investigación se realizó con la finalidad de determinar la influencia de la altura en los niveles plasmáticos de óxido nítrico, utilizando pollo como animales de experimentación, mediante la cuantificación de sus metabolitos estables: nitrito y nitratos con el método de Griess. Se demostró que los niveles plasmáticos de óxido nítrico en pollos so- metidos a la altura (3.273 msnm) varían significati- vamente, en comparación con los que permanecen a nivel del mar. Se utilizaron 300 pollos: 150 trasladados a la altura y 150 criados a nivel del mar. Los pollos de ocho días de edad presentaron variaciones notorias en sus niveles plasmáticos de óxido nítrico, elevándose los niveles el primer día, disminuyendo el segundo, elevándose más aún el tercer día y disminuyendo al cuarto y quinto día. Se concluye que la altura influye significativamente en los niveles plasmáticos de óxido nítrico en pollos. Palabras clave: altura; óxido nítrico; niveles plasmáticos Influencia de la altura en los niveles plasmáticos de óxido nítrico en animales de experimentación (1) Escuela de Farmacia y Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Peruana Los Andes. Huancayo, Perú. (2) Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Privada de Huancayo. Huancayo, Perú. (3) Centro de Investigación de Medicina Tradicional. Lima, Perú. Enviar correspondencia a: Gilda Ruíz Gómez. Loreto 569. Huancayo, Perú. Dirección electrónica: gilda_ruiz@yahoo.es Recibido: marzo 2013. Revisado: mayo 2013. Aceptado: julio 2013 This research work was conducted in order to determine the influence of the height in the plasma levels of nitric oxide, used as experimental animals chickens by measuring its stable metabolite: nitrite and nitrate by the Griess method. Showed that plas- ma levels of nitric oxide in chickens subjected to the altitude (3,273 m) vary significantly, compared to the remaining sea level. 300 chickens were used: 150 transferred to height and 150 reared sea level. Chic- kens eight days old showed noticeable variations in plasma levels of nitric oxide, rising levels on the first day, decreasing the second, rising further decreasing the third day and the fourth and fifth day. We conclu- de that the height significantly influence on the plas- ma levels of nitric oxide in chickens. Keywords: height, nitric oxide, plasma levels RESUMEN ABSTRACT 43 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 43 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN La causa exacta del mal de altura es desconoci- da, los investigadores han planteado varias teorías e hipótesis. Cynthia Beall et al.1 encontraron niveles elevados de óxido nítrico (NO) en pulmones de dos poblaciones de las alturas de Bolivia y el Tibet. Ade- más, otros investigadores han reportado que exis- ten mecanismos de adaptación a la altura y conclu- yen que la adaptación a esta estimula la producción del óxido nítrico; tales efectos podrían evidenciar los efectos benéficos de la adaptación, dependientes del NO.2 El NO es un gas tóxico poderoso por su estruc- tura de radical libre, cuya molécula está constituida por un átomo de nitrógeno y uno de oxígeno; po- see un electrón libre, que le confiere una enorme reactividad química; es extremadamente lábil, por lo que su vida media está entre 5 y 15 segundos.3 El óxido nítrico, por ser un radical libre, se une al oxígeno dando dos productos principales que son: nitritos (NO2) y nitratos (NO3). 4 Las células endo- teliales liberan continuamente pequeñas cantidades de NO que producen un nivel basal de relajación del músculo liso vascular.5 El NO es un autorregulador del flujo sanguí- neo: regula el flujo sanguíneo en el cerebro, cora- zón, pulmón, tracto gastrointestinal y riñones.5 Ajusta de forma automática el flujo sanguíneo en respuesta a cambios locales en algunas regiones del sistema vascular. Algunos de estos factores físicos a los que las células endoteliales responden con un aumento de la producción de NO son: isquemia, estrés por fricción o cizallamiento e incremento del flujo sanguíneo a través del vaso. Factores localmente liberados por el tejido ad- yacente, como bradiquinina o acetilcolina, también pueden inducir la liberación de NO en algunos vasos pero no en otros. La liberación de NO en el Influencia de la altura en los niveles plasmáticos de óxido nítrico en animales de experimentación sistema vascular también está controlada por el sis- tema nervioso autónomo.5 El óxido nítrico (NO), liberado por práctica- mente todas las células del corazón, ejerce múltiples efectos sobre la función cardíaca. Modula las res- puestas inotrópicas y cronotrópicas, el flujo de en- trada de Ca2+ y el ciclo del Ca2+ en el retículo sarco- plásmico, la transmisión autonómica, la frecuencia cardíaca, la respiración mitocondrial, el consumo miocárdico de oxígeno y la eficiencia mecánica.6 En grandes cantidades, el NO mata a cualquier tipo de célula, inhibe el crecimiento de muchos pa- tógenos, incluyendo bacterias, hongos y parásitos (en especial, patógenos intracelulares); posee ade- más, un papel importante en el sistema inmunoló- gico y en la inflamación.7 A través de este trabajo de investigación se busca evidenciar cómo influye la altura en los niveles plasmáticos de NO, cuyos re- sultados nos permitirán emplear esta relación con fines terapéuticos, en humanos y animales de países andinos. Materiales Se utilizaron 300 pollos de tipo broiler, de un día de nacidos, separados al azar en dos grupos de 150 cada uno, sin diferenciar sexo. Grupo A: Tras- ladados a Huancayo (3.273 msnm). Grupo B: Cria- dos en Lima (150 msnm). Los pollos de ambos gru- pos fueron mantenidos con alimento balanceado y agua a voluntad y un régimen de luz de 10 horas diarias Reactivos - Reactivo de Griess A: Acido sulfanílico 1%, en ácido fosfórico al 5%. INTRODUCCIÓN METODOLOGÍA 44 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 44 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN - Reactivo de Griess B: N-1-naftiletilendiamina al 0,1 %, en agua destilada. - NaOH 1 M - ZnO4 al 30% - Heparina - Zinc metálico. Equipos: - Espectrofotómetro UV - VIS RS Labo Med® - Centrífuga de 3,500 rpm. Método Se utilizó el método de Griess para la determinación de los niveles plasmáticos de NO. El fundamento de esta reacción se basa en una reacción de diazotización,* descrita por primera vez por Griess en 1879. A través de los años esta técnica ha sufrido varias modificaciones. El reactivo de Griess usa sulfanilamida y dicloruro de N-(1- naftil)-etilendiamina (NED) bajo condiciones ácidas (ácido fosfórico). Este sistema detecta el NO2- en una gran variedad de líquidos biológicos y experimentales, tales como el plasma, suero y orina y medios de cultivo celular. La sensibilidad de los nitritos depende del medio en que se encuentran. Procedimiento Las muestras obtenidas día a día se procesaron de la manera si- guiente: Obtención de la muestra. Las muestras de sangre fueron obtenidas por venopunción axilar (aprox. 2 mL); diariamente durante los ocho días que duró el experimento, tomando al azar 10 ani- males por día. Las muestras de sangre fueron de- positadas en tubos heparinizados y se los estabilizó colocándolos en reposo en hielo durante 10 minu- tos; luego se centrifugaron durante 15 minutos a 3.500 rpm para obtener el plasma, que fue procesa- da de inmediato. Desproteinización. La muestra problema se alcaliniza con NaOH y luego se desproteiniza con ZnSO4. Método de Griess. El desproteinizado se trata con los reactivos de Griess A y B para la formación del cromóforo magenta, se lleva a lectura en el es- pectrofotómetro UV a 520-550 nm. Una alícuota del desproteinizado se trata con Znmetálico para la reducción de nitritos a nitratos, adicionándoles los reactivos de Griess A y B, con lectura igual al anterior. Los niveles plasmáticos de óxido nítrico en po- llos sometidos a la altura varían significativamente en comparación con los que permanecen a nivel del mar. RESULTADOS (*) La diazotización (del prefijo di-, se- parar, y azote, nitrógeno en francés) es el proceso químico mediante el cual una amina aromática primaria rompe su ca- dena ciclica para convertirse en un com- puesto de diazonio. [Nota del editor]. 45 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 45 Rev Acad Peru Salud 2012;19(2) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN Los pollos trasladados a la altura (3.273 msnm) presentan variaciones notorias de sus ni- veles plasmáticos de NO verificados por la cuan- tificación de sus metabolitos estables: nitritos y nitratos, lo que concuerda con los hallazgos de Bhat y Block,8 quienes afirman que la hipoxia y el frío de las grandes altitudes producen un cua- dro patogénico similar con vasoconstricción pul- monar y trastornos circulatorios debido a que los requerimientos tisulares de oxígeno exceden al aporte disponible ambiental. Los pollos criados a nivel del mar elevan progresivamente sus niveles plasmáticos de NO, lo que concuerda con las in- vestigaciones de Angulo et al.,9 quienes reportan que los pollos aumentan significativamente sus niveles plasmáticos de NO hasta pasado el mes de edad para luego estabilizarse en un valor mucho mayor que otras especies. De acuerdo con los re- sultados obtenidos, la altura influye significativa- mente en los niveles plasmáticos de óxido nítrico en pollos broilers. DISCUSIÓN CONCLUSIONES 1. Los resultados obtenidos permiten com- prender y tratar el mal de altura que afecta la salud de las personas. 2. La altura influye significativamente en los niveles plasmáticos de óxido nítrico en pollos. 3. Los niveles plasmáticos de NO en pollos trasladados a la altura varían en forma oscilante. Los niveles plasmáticos de NO en pollos que permanecen a nivel del mar se elevan progresivamente. 1. Beall CM, Laskowski D, Strohl KP, Soria R, Villena M, Vargas E, et al. Pulmonary nitric oxide in moun- tain dwellers. Nature. 2001;414(6862):411-2. 2. Anggård E. Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. Lancet. 1994;343(8907):1199-206. 3. Flores J. Farmacología Humana. 4a ed. España: Mas- son; 2003. 4. Ferrer D, Fonseca C. Importancia biológica y par- ticipación en algunas funciones cardiovasculares y hematológicas. Medisan. 1998;2(3):45-53. 5. Gonzales V. Influencia de la diabetes experimental sobre la reactividad de las arterias basilar, carótida y renal de conejo a la endotelina-1 [tesis doctoral]. España: Universidad de Valencia; 2005. 6. Tamargo J, Caballero R, Gómez R, Núñez L, Vaquero M, Delpón E. Efectos del óxido nítrico sobre la fun- ción cardíaca. Rev Esp Cardiol Supl. 2006;6:3A-20A. 7. Peña T, Ayón M, Cueva S, Figueroa E, Vásquez M, Medina C, et al. Hipertrofia cardiaca en pollos de carne tratados con L-arginina sometidos a hipoxia. Rev Inv Vet (Perú). 2001 Supl 1: 442-5. 8. Bhat GB, Block ER. Effect of hypoxia on phospholi- pid metabolism in porcine pulmonary artery endo- thelial cells. Am J Physiol. 1992;262(5 Pt 1):L606-13. 9. Angulo HP, Espinoza J, Fernández V, Díaz D. Primer reporte sobre niveles elevados de nitritos en plasma de pollos de carne: ¿un hallazgo trascendental? Rev Cienc Vet (Perú). 2004;20(2):3-5. REFERENCIAS
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