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83 ¿UNA HISTONA QUIMÉRICA EN LA CROMATINA DE Trypanosoma cruzí? N. GALANTI*, C.. TORO*, C. WERNSTEDT** Y U. HELLMAN** * Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. ** Ludwing Institute for Cáncer Research, Uppsala, Sweden. Las histonas son proteínas pequeñas, muy básicas, carentes de triptofano y muy conservadas durante la evolución biológica. Constituyen el núcleo central en la organización, compactación y funcionamiento de la cromatina en eucariontes. Durante la caracterización sistemática de las histonas de T. cruzi, hemos descrito una histona 6, separada por PAGE-Tritón-urea-ácido, de una preparación de histonas de T. cruzi. En nuestros estudios de extracción de histonas de cromatina de T. cruzi con concentraciones crecientes de cloruro de sodio, así como en los experimentos de estimación de pesos moleculares, no nos fue posible asignar la banda b a ninguna de las histonas conocidas. Por ejemplo, esta proteína presentó características de extracción de la cromatina con cloruro de sodio, similares a las histonas del núcleo nucleosomal; no obstante, comenzaba a ser extraída a concentraciones menores (0.6 M). El peso molecular estimado para la banda b fue de 16 kDa; el peso molecular de la histona de timo más cercana era de 15,3 kDa para la H3 de timo. En estudios de purificación de las histonas de T. cruzi por HPLC en fase reversa, esta histona fue sólo parcialmente purificada. No obstante, se concentra en un pico que es eluído al inicio de la gradiente, después del pico que corresponde a histona Hl. Es decir, presenta características de histona del núcleo nucleosomal, pero con un importante grado de polaridad. Considerando que esta proteína tiene su amino terminal bloqueado, y que no pudo purificarse apropiadamente por HPLC, preparamos cromatina de T. cruzi, extrajimos las histonas de esta cromatina y separamos estas proteínas básicas por PAGE-Tritón-urea-ácido. La banda b, proveniente de varios geles, fue cortada y digerida parcialmente con tripsina. Los péptidos obtenidos de dos cepas de T. cruzi (Tul O y ZPerú), se aislaron por HPLC en fase reversa, y diez de ellos se analizaron en un secuenciador automático de aminoácidos. Cuatro de los péptidos obtenidos, uno de ellos de 26 aminoácidos, presentan homología con secuencias de histona H3 de T. cruzi. Otros dos péptidos, mostraron homología con una proteína encontrada en suero de enfermos chagásicos (antígeno de Levin). Finalmente, otros cuatro péptidos no alinearon con proteína alguna. Uno de los péptidos, de 9 aminoácidos, presenta 7 residuos con homología a histona H3 de T. cruzi y dos aminoácidos (WX) no homólogos. Estudiando este péptido por espectrometría de masa, se obtuvieron resultados que permiten avanzar una proposición atractiva. Así, la diferencia entre el valor experimental obtenido para la secuencia total del péptido (WXPGTVALR= 1072.8) y el peso molecular de la sumatoria de los aminoácidos conocidos de esa se- cuencia (W-PGTVALR=899), ES DE 173.8. Este valor puede obtenerse postulando que X es un ácido gamma carboxiglutámico (Glu, 129.1 + COOH, 44 = 173.1). Este residuo fue descrito en la década de 1970 y ha sido encontrado en relativamente pocas proteínas. Por otra parte, se ha encontrado en nucleosomas de hígado de rata una histona H2 A, que presenta un amino terminal con 64% de identidad a H2 A, pero unido covalentemente a un péptido largo cuya secuencia de aminoácidos no corresponde a histona alguna. Más aún, en cromatina de Tetrahymena se ha descrito la presencia de dos histonas H3 (H3F y H3 S). La H3 S presenta mayor peso molecular y menor movilidad electroforética (S=slow) que la H3F (F=fast). Se ha probado que la H3F deriva de la H3 S por proteólisis y liberación de un péptido no identificado. Es decir, se ha encontrado histonas quiméricas tanto en un mamífero como en un ciliado. Una posibilidad de explicar nuestros resultados es considerar que una variante de histona H3, con diferente movilidad electroforética a la proteína principal, comigra en los geles TAU-PAGE con el antígeno de Levin. Otra posibilidad es que la banda b corresponde a una histona quimérica, constituida por la región globular de la histona H3, un péptido de enlace y el antígeno de Levin. Las secuencias que no homologaron a proteína alguna pueden 84 corresponder a regiones no identificadas del antígeno mencionado, que ha sido sólo parcialmente secuenciado. Es muy poco probable que la histona b corresponda a dos o más proteínas diferentes, considerando; 1) las características definidas de la banda b en PAGE; 2) nuestros resultados de secuenciación aminoacídica de otras proteínas del mismo gel, que resultaron corresponden a una sola histona por banda; 3) la comparación del mapa peptídico entre las bandas b de dos cepas diferentes de T. cruzi (Tul O Zl Perú), que solo difieren claramente en un péptido y 4) la presencia de un péptido quimérico con un ácido gamma-carboxiglutámico en posición amino terminal y una secuencia homologa a histona H3 en la región carboxilo terminal de dicho péptido, que sugiere la presencia de un motivo de enlace entre dos proteínas diferentes. La proposición que hacemos sobre la posible presencia en T. cruzi de una histona del núcleo nucleosomal unida por enlace covalente a otro péptido, que ha sido caracterizado en enfermos chagásicos, puede tener importancia para entender la ubicación de la histona H3 en el nucleosoma, después de la síntesis de esta proteína, así como su degradación. Al respecto, ninguna de las secuencias analizadas en la proteína b homologó a ubicuitina. Adicionalmente, nuestra proposición puede dar indicios sobre el origen del antigeno de Levin en enfermos chagásicos crónicos. Financiado por SAREC y Fondecyt-Chíle.
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