T2033-63-04P1

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Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología 
Departamento de Desarrollo de Purificación 
 
Desarrollo de un proceso de purificación y obtención del 
Ingrediente Farmacéutico Activo de la Eritropoyetina 
humana recombinante 
Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Farmacéuticas 
 
Autor: Ing. Rolando Páez Meireles 
 
Tutor: Dr.Raul Diaz Betancourt 
Asesora: Dra. Ofelia Bilbao 
 
Ciudad de la Habana 
2003
 
Dedicatoria 
 
 A mis padres y hermano. 
 A mi hija Jennifer 
 mi esposa 
 
 
Mercedes
Texto escrito a máquina
Y a mi compañera en la vida, 
Mercedes
Texto escrito a máquina
Mercedes
Texto escrito a máquina
Sumario
 
 
SUMARIO 
Una de las etapas más importantes en el desarrollo de un producto biofarmacéutico, 
específicamente el relacionado con las proteínas recombinantes lo constituye el 
establecimiento de los procesos de purificación. En este trabajo se presenta una 
estrategia para el desarrollo del proceso de obtención de la Eritropoyetina humana 
recombinante, así como todos los aspectos que garantizan su calidad y seguridad como 
producto farmacéutico. Como parte de este trabajo se estableció un proceso de 
purificación nuevo y patentable a escala analítica, con una pureza final por SDS-PAGE 
superior al 95%. El recobrado del mismo fue superior al 20 % con los valores del 
contenido de ácido siálico y la actividad biológica adecuada. En este proceso se tuvo en 
consideración los aspectos necesarios de validación viral y las necesidades de calidad de 
este producto. Se realizó el escalado del mismo con resultados satisfactorios, lo cual 
permitió la producción del material de referencia, el establecimiento de las 
especificaciones de calidad y la producción de los primeros lotes de la materia prima 
activa, empleada en los estudios de estabilidad. Además como parte del mejoramiento 
del proceso establecido, se realizó por primera vez un estudio amplio de las variables que 
influyen en la agregación de esta molécula. En este estudio se demostró que la 
interacción de la Epohr con la matriz de hidrofobicidad y el etanol induce la agregación de 
la misma. Además se presentaron los resultados experimentales que demuestran que los 
agregrados se forman por interacciones no covalentes. Por ultimo se realizó un estudio 
de prefactibilidad económica del proceso desarrollado, teniendo en consideración la 
construcción de una planta en Cuba y otra en un país del tercer mundo donde se realiza 
una transferencia tecnológica. Para ambos escenarios los valores del tiempo de 
recuperación de la inversión, el valor presente neto y la tasa interna de retorno fueron los 
adecuados.
índice 
ÍNDICE 
GLOSARIO DE TÉRMINOS Páginas 
 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 1 
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................................................... 4 
1.1 Caracterización de la Eritropoyetina ........................................................................................................ 4 
1.1.1 Fisiología de la Eritropoyetina ............................................................................................................... 4 
1.1.2 Propiedades físicas y químicas ............................................................................................................... 5 
1.1.3. Principales usos clínicos de la Epohr ................................................................................................... 7 
1.1.4 Métodos de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante ............................................... 9 
1.1.5 Agregación ............................................................................................................................................. 10 
1.2 Generalidades de los Procedimientos Utilizados .................................................................................... 13 
1.2.1 Técnicas Cromatográficas .................................................................................................................... 13 
1.2.2 Cromatografía de Intercambio Iónico ................................................................................................. 13 
1.2.3. Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas ................................................................................. 15 
1.2.4. Cromatografía de Exclusión Molecular ............................................................................................. 17 
1.3 Desescalado y escalado de procesos cromatográficos ............................................................................ 19 
1.4 Control de Calidad del proceso de recobrado y purificación ................................................................ 21 
2. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................................... 27 
2.1 Condiciones del cultivo celular................................................................................................................ 27 
2.2 Proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante a escala analítica .................... 27 
2.3 Escalado del proceso de purificación .................................................................................................... 29 
2.4 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación ..................................... 31 
2.5 Técnicas analíticas ................................................................................................................................... 32 
2.6 Estudio de prefactibilidad de la producción de la Eritropoyetina humana recombinante. . … .......36 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 38 
3.1. Diseño de la estrategia de desarrollo del ingrediente activo ................................................................. 38 
3.1.1 Preparación de la estrategia de purificación ...................................................................................... 40 
3.1.2 Desarrollo del proceso de purificación a escala analítica .................................................................. 41 
3.1.3 Escalado del proceso de purificación ................................................................................................. 53 
3.1.4 Producción del Material de referencia ............................................................................................... 56 
3.1.5 Establecimiento de las especificaciones de calidad ............................................................................ 56 
3.1.6 Producción de los primeros lotes del Ingrediente Farmacéutico Activo ......................................... 57 
3.2 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación ..................................... 59 
3.2.1 Parámetros que influyen en la agregación de la Epohr ................................................................... 62 
3.2.2 Determinación de la influencia de la columna de hidrofobicidad sobre la agregación de la 
Eritropoyetina humana recombinante ........................................................................................................... 68 
3.2.3 Influencia del Tween 20 sobre la agregación de la Eritropoyetina humana recombinante ........... 71 
3.3 Estudios de Prefactibilidad de la producción de la Epohr.................................................................... 74 
4. CONCLUSIONES ............................................................................................................................................. 795. RECOMENDACIONES.................................................................................................................................... 80 
6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................................. 81 
7. AUTOBIBLIOGRAFÍA RELACIONADA CON LA TESIS ......................................................................... 92 
8. AUTOBIBLIOGRAFÍA NO RELACIONADA CON LA TESIS .................................................................. 95 
9. ANEXOS ............................................................................................................................................................. 97 
 
 
Glosario de términos
 
GLOSARIO DE TÉRMINOS 
 
 
 
ADN Ácido desóxirribonucleico 
AS ácido siálico 
Atm atmósfera 
BPP Buenas Prácticas de Producción 
CHO Células de Ovario de Hámster Chino 
Cys cisteína 
DC Dicroismo circular 
CIGB Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología 
ELISA Inmunoensayo enzimàtico sobre fase sólida 
Epoh Eritropoyetina humana 
Epohr Eritropoyetina humana recombinante. 
FDA del inglés, Food and Drug Administration. 
FL Flujo lineal 
FPLC del inglés, Fast performance liquid chromatography 
AG diferencia de energía libre 
GF Gel filtración 
AH diferencia de entalpia 
HPLC cromatografía líquida de alta resolución 
kDa 1000 Da 
min minutos 
IFA Ingrediente Farmacéutico Activo 
IRC Insuficiencia Renal Crónica 
MM Miles de millones 
NaAc Acetato de Sodio 
Nm nanómetro 
PBS solución salina tamponeada con fosfato 
PM pesos moleculares 
PPM parte por millón 
RP fase reversa 
rpm revoluciones por minutos 
SA Sulfato de amonio 
Introducción 
 
 
INTRODUCCIÓN. 
En la actualidad los mayores esfuerzos en la industria biotecnológica se concentran en transformar 
los resultados científicos en éxitos comerciales. A diferencia de otras industrias, la Biotecnología 
moderna es una industria relativamente joven y requiere de un largo período de tiempo (10-12 
años) para desarrollar sus productos e introducirlos en el mercado. Adicionalmente, las barreras 
regulatorias que garantizan la seguridad de los biofármacos y el costo de desarrollo de estos 
productos, aumentan considerablemente cada día. En Cuba, desde finales de la década del 80, la 
ciencia (y muy especialmente la Biotecnología moderna) se transformó vertiginosamente de una 
ciencia que asimilaba el conocimiento mundial, a una ciencia que comenzó a generar tecnologías. 
La política de gobierno con respecto a esta rama propició alcanzar un fuerte potencial científico 
técnico, planteándose como retos importantes disminuir el tiempo de desarrollo de los productos y 
buscar soluciones a los problemas de la gran tecnología, para así satisfacer necesidades técnicas, 
económicas y sociales del país. Para que un nuevo producto farmacéutico pueda ser empleado en 
seres humanos debe cumplir con un gran número de regulaciones nacionales e internacionales, 
que garanticen la calidad y por consiguiente su seguridad y eficacia. Para lograr este objetivo, todo 
nuevo fármaco debe transitar por diferentes etapas de desarrollo que garanticen su éxito final. 
Una de las etapas más importantes es el desarrollo de los procesos de purificación, pues estos 
garantizan en primer lugar la pureza final del principio activo y con ello la calidad del producto final, 
su seguridad y eficacia. 
La Eritropoyetina humana es uno de los factores imprescindibles para la homeostasia del 
organismo. Las células de los riñones son capaces de detectar los cambios en la presión parcial 
de oxígeno y desencadenar los mecanismos para la síntesis de dicha hormona (Guyton, 1992), 
viéndose afectado los niveles en aquellos individuos con Insuficiencia renal crónica, los cuales 
requieren tratamientos prolongados para revertir completamente la anemia (Gansewort y 
colaboradores, 1996). 
En el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología se aisló el gen de esta hormona y se clonó en 
células de Ovario de Hámster Chino . En este sistema de expresión, la glicosilación de las 
proteínas es altamente conservativa con el sistema de glicosilación del retículo endoplasmático de 
las células humanas, lo cual garantiza una actividad 
biológica adecuada, dada la relación que existe entre esta última y el patrón de glicosilación de la 
molécula. (Morimoto,1996). 
Teniendo en cuenta la necesidad de desarrollar una tecnología que garantice la obtención, 
calidad, seguridad y eficacia de la Eritropoyetina humana recombinante (Epohr), se postuló la 
siguiente hipótesis del trabajo: 
Introducción 
 
 
Es posible desarrollar un nuevo proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante 
que sea escalable, que permita obtener un ingrediente activo con todos los atributos de calidad 
requerido para el Registro Sanitario y que posibilite una producción comercial económicamente 
rentable. 
Para demostrar la validez de esta hipótesis se concibió el siguiente objetivo general: 
Establecer un nuevo proceso de obtención de la Eritropoyetina humana 
recombinante que permita su producción a escala comercial. 
Para lograr el cumplimiento de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos 
específicos: 
1. Estudiar los diferentes pasos de purificación y seleccionar las condiciones de operación 
que permitan obtener la Epohr con la calidad necesaria para su comercialización. 
2. Realizar un estudio de prefactibilidad económica del proceso desarrollado para una planta 
de producción construida en Cuba y otra en un país de tercer mundo. 
3. Realizar los estudios de producción a escala piloto necesarios, que permitan el registro 
sanitario del producto y faciliten la implementación del proceso desarrollado a escala 
productiva. 
Este trabajo tiene los siguientes aspectos novedosos 
■ Se logró desarrollar un proceso de purificación de la Epohr, novedoso y diferente a los 
reportados en la literatura (patentado), que permitió obtener un producto final con alta 
calidad y actividad biológica. 
■ Se logró demostrar por primera vez que el efecto conjunto de la cromatografía de 
interacciones hidrofóbicas y el etanol producen la agregación de la Epohr, aspecto no 
reportado en la literatura. 
Los resultados obtenidos en este trabajo facilitaron la obtención de una patente (CU- 
81/96, 1996) y del Registro Sanitario de la Epohr (Registro sanitario Epohr,CIGB, 
 
 
 
 
 
 
 
Introducción 
 
 
 
2002 ) y su aplicación práctica ha permitido que ya se esté produciendo por el Centro de Ingeniería 
Genética y Biotecnología y comercializando y exportando por Heber Biotec S.A., lo cual posee un 
importante significado social y económico para el país. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
4
 
 
 
 
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 
1.1 Caracterización de la Eritropoyetina 
1.1.1 Fisiología de la Eritropoyetina 
La producción de hematíes del sistema circulatorio es un sistema dinámico en el cual el oxígeno 
tisular es capaz de desencadenar determinados mecanismos para la regulación de los eritrocitos 
en sangre. En condiciones normales, una disminución de los niveles de oxígeno induce un 
aumento de la producción de la hormona eritropoyética, la cual eleva los niveles de células rojas 
eliminándose la hipoxia (Guyton, 1992). 
Las células encargadas de la síntesis de la eritropoyetina humana responden a los cambios en la 
capacidad de oxigenación, en la presión parcial de oxígeno y en la afinidad de la sangre por este 
último. De manera general, la disminución de la capacidad de transporte de oxígeno provoca un 
aumento en la producción y secreción de la Epoh, por otra parte, la disminución de la presión de 
oxígeno inspiratoria aumenta exponencialmente su concentración sérica, mientras que la 
disminución de la afinidad de la sangre por el oxígeno está eventualmenteasociada a una 
disminución de los niveles de la misma (Erslev y colaboradores, 1987; Jelkmann, 1986). 
En una persona normal, entre el 80 % y el 90 % de toda la Epoh circulante es de origen renal, el 
resto se produce principalmente en el hígado y en menor escala en los macrófagos de la médula 
ósea (Vogt y colaboradores, 1989; Rich y colaboradores, 1982) y en el bazo (Jelkmann y 
colaboradores, 1990). Además, en murinos se ha encontrado síntesis en las glándulas salivares 
(Fava y colaboradores, 1979; Clemons y colaboradores, 1987). 
Uno de los posibles sitios formadores de Epoh dentro del riñón son las células mesangiales de los 
glomérulos, cuya localización adyacente a los capilares glomerulares asegura que se hallen 
bañadas por sangre arterial. Esto es importante porque permite que se detecten los niveles de 
oxígeno en la sangre arterial, no en la venosa. Otros experimentos sugieren que las células 
epiteliales de los túbulos renales también secretan Epoh, en cuyo caso la sangre anémica sería 
incapaz de entregar suficiente oxígeno a las células tubulares y ello estimularía la producción de 
Epoh para aumentar los niveles de eritrocitos (Guyton, 1992). 
Aún existen opiniones diferentes con respecto al sitio exacto de síntesis de Epoh en el riñón, los 
estudios inmunohistoquímicos y los de hibridización in situ no han brindado una respuesta clara a 
esta importante cuestión. La mayoría de los autores están a favor 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
 
 
 
de un origen peritubular en las células del endotelio, pero también existen evidencias para un 
origen tubular (Jelkmann, 1986). 
En el estadio fetal y hasta un poco después del nacimiento, el sitio de producción de la Epoh es el 
hígado, quien luego se mantiene como principal productor extrarrenal de la hormona. La 
producción hepática puede aumentar ante estímulos como hipoxia, recuperación de daño hepático, 
hepatectomía parcial, intoxicación con tetracloruro de carbono o ligadura de los conductos biliares. 
Se ha propuesto que la regeneración del hígado activa el llamado Factor Hematopoyético Hepático 
que estimula la producción de Epoh en los hepatocitos (Fried y colaboradores, 1984; Cotes, 1989). 
1.1.2 Propiedades físicas y químicas 
La Eritropoyetina es una hormona glicoproteíca con características ácidas. Tiene una migración 
aparente en geles de poliacrilamida de aproximadamente 34-37 kDa. La fracción proteica 
comprende alrededor de un 60% y consta de 166 aminoácidos. El resto corresponde a la fracción 
carbohidrática que está distribuida en cuatro cadenas de oligosacáridos, de los cuales tres son del 
tipo N-glicosilada en las posiciones 24, 38 y 83 que corresponden al aminoácido asparagina (Asp). 
La restante es del tipo O- glicosilada que aparece en la posición 126 en presencia de serina (Ser). 
Además, la estructura presenta 2 puentes disulfuro formados entre los aminoácidos de Cys de las 
posiciones 7-161 y 29-33 respectivamente (Lai y colaboradores, 1995). 
Numerosos trabajos han sido realizados sobre la importancia de la composición y la estructura de 
los azúcares para las glicoproteínas, los cuales han revelado que los mismos pueden estar 
relacionados con la estabilidad conformacional, la susceptibilidad de la molécula a la actividad 
proteolítica, sus características de unión a receptores, su cinética de transporte intracelular, 
secreción y aclaramiento del plasma entre otras (Dordal y colaboradores, 1985; Tsuda,1990; 
Takeuchi y colaboradores, 1990). En el caso de la Epoh se ha podido esclarecer que su elevado 
contenido de azúcares le brinda una alta resistencia frente a agentes desnaturalizantes como el 
cloruro de guanidinio y una gran estabilidad conformacional frente a condiciones extremas de pH y 
temperatura, determinándose también que ninguna de estas características está correlacionada 
con el contenido de ácido siálico de la molécula (Owers y colaboradores, 1991). 
Las cadenas de carbohidratos presentan Fucosa, Mañosa, N-acetilglucosamina, Galactosa, y ácido 
N-acetilneuramínico y tienen una gran importancia en la resistencia de la Epoh a la inactivación 
térmica. La eliminación de las mismas resulta en una 
 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
 
 
 
agregación de la proteína, sin embargo no es necesaria su presencia para la unión al receptor y la 
activación del progenitor eritrocítico (Lai y colaboradores, 1995). 
Cada tipo de cadena de oligosacáridos presenta una composición de carbohidratos diferente, con 
excepción del ácido siálico que constituye el residuo terminal de ambos. La carga negativa de este 
residuo le confiere las características ácidas a la molécula, la cual presenta un punto isoeléctrico 
entre 4,11 y 3,31, coincidiendo con el contenido de ácido siálico entre 9,5 y 13,8 moles de ácido 
siálico / mol de proteína. Se ha observado una relación lineal entre la cantidad de ácido siálico y la 
actividad biológica in vivo, pero el incremento no se cumple por encima de 12,4 moles de ácido 
siálico /mol de proteína. Esto se comprobó al incubar Epoh con pocas cantidades de ácido siálico 
con alfa 2,6 sialo transferasa la cual incrementó el contenido de ácidos con su respectivo aumento 
de la actividad in vivo, pero no in vitro (Morimoto y colaboradores, 1996). También se ha sugerido 
que la cantidad de antenas que presenta la molécula en la posición N garantiza una mayor 
actividad in vivo (Misaizu y colaboradores, 1995). Sobre la base de estas características de 
composición de carbohidratos, la Epoh se presenta en la naturaleza con muchas isoformas (o 
glicoformas) diferentes. La desialilación de esta molécula resulta en una pérdida completa de su 
actividad biológica in vivo, mientras que se mantiene idéntica e incluso mejora la actividad biológica 
in vitro. Se ha sugerido que este comportamiento se debe a un mejor aclaramiento de la hormona 
desialilada por el receptor asialoglicoproteina hepático, el cual reconoce los residuos galactosa 
terminales que en condiciones normales están bloqueados por el ácido siálico. Por tanto la 
presencia de este último es de vital importancia para la activación in vivo ya que la preserva de un 
rápido aclaramiento del torrente sanguíneo (Fratantoní y colaboradores, 1994).Darling y 
colaboradores (Darling y colaboradores, 2002) demostraron que el ácido siálico y la glicosilación 
tienen un impacto directo sobre la cinética de unión al receptor. Moléculas con menor contenido de 
ácido siálico tienen una menor afinidad por el receptor. 
El patrón de N- y O-glicosilación ha sido profundamente estudiado, estando formado el primero por 
oligosacáridos di, tri y tetrantena, predominando estos últimos, los cuales pueden estar total o 
parcialmente sialilados (Hokke y colaboradores, 1995). Los residuos de ácido siálico se encuentran 
hacia la periferia del complejo y están enlazados a Gal por enlace alfa 2-3. Pueden aparecer 3 
tipos de ácido siálico [ácido N- acetil neuramínico (95 %), N-glicol neuramínico (2 %) y N-acetil 9-0 
acetil neuramínico (3 %)] y en caso de sialilación parcial, la distribución de estos azúcares no es 
aleatoria.
Revisión bibliográfica
 
 
 
También se ha reportado la presencia de cadenas repetitivas de N-acetil lactosamina en la 
superficie externa del complejo, no conociéndose la importancia que pueda éste tener, si tiene 
alguna, constituyendo su presencia una característica singular para la molécula, pues dicho tipo de 
glicosilación no es común en las glicoproteínas séricas. 
La distribución de los azúcares ramificados en la molécula recombinante es de la siguiente 
manera: 
AZÚCARES TETRANTENA— 77-85% (de estos el 85% pueden estar fucosilados) 
AZÚCARES TRIANTENA-— 13-17% 
AZÚCARES BIANTENA ----------- 1-6% 
La aparición de estos azúcares en los tres sitios de N-glicosilación es al azar (heterogeneidad del 
sitio), solo encontrándose una cierta especificidad en el sitio Asn 38, donde no aparecen azúcares 
biantenas. Seha descrito que los sitio de N- glicosílación estabilizan la Epohr mediado por las 
interacciones hidrofóbicas (Toyoda y colaboradores, 2002). 
El patrón de O-glicosilación es sencillo y consta de los siguientes oligosacáridos: 
Neu5Acα 2-3 Gaiβ 1-3 Gal Nac-ol y 
Neu5Acα 2-3 Galβ 1-3(NeuAc 2-6) Gal Nac-ol 
Una comparación realizada por Takeuchi y colaboradores (Takeuchí y colaboradores, 1988), entre 
la molécula recombinante expresada en células de ovario de hámster chino y la molécula humana 
colectada a partir de la orina de pacientes, concluyeron que no existen diferencias significativas en 
las características de glicosilación de ambas moléculas. Se encontró solo pequeñas divergencias 
en la Epoh, donde además de la unión α 2-3 del ácido siálico también se encontraron enlaces α 2-
6 pero en menor proporción. 
Desde el punto de vista de la estabilidad de la molécula, se puede señalar que es generalmente 
estable en soluciones acuosas en un rango de pH de 5 a 9 y a temperaturas entre 0 y 5 °C, aunque 
resulta relativamente estable a pH ácido y mayores temperaturas (Keighly y Cowy, 1995). 
1.1.3. Principales usos clínicos de la Epohr. 
- Anemia de la Insuficiencia Renal Crónica. 
El principal órgano que sintetiza la Epoh es el riñón. Cualquier lesión renal que afecte las células 
responsables de la síntesis de Epoh causará una anemia hiporregenerativa. La anemia es una de 
las complicaciones más frecuentes e importantes de la insuficiencia renal crónica y su intensidad 
aumenta conforme empeora la función renal. 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
8
 
 
 
Clínicamente se manifiesta cuando el aclaramiento de creatina es menor de 30-40 mL x min-1x 
(1,73 m2)-1. Normalmente es de tipo normocítico y normocrómico, en particular si no se asocian 
otros factores como déficit de hierro o toxicidad por aluminio. 
Más del 90 por ciento de los pacientes en diálisis crónica presentan anemia y la mayoría 
suficientemente grave para requerir tratamiento. En los pacientes urémicos los niveles plasmáticos 
de Epoh pueden ser bajos, normales o altos, pero son inapropiadamente bajos cuando se ajustan 
al grado de anemia. En los pacientes anéfricos se observan niveles más bajos de Epoh y la 
eritropoyesis está intensamente disminuida (Radtke y colaboradores, 1979). 
Dado que el principal factor causal implicado en la anemia de la IRC es la inadecuada síntesis de 
Epoh, el tratamiento de elección es la administración exógena de la Epohr. En la práctica se 
dispone de dos vías de administración, la intravenosa y la subcutánea. La intravenosa fue la 
primera en utilizarse y la más utilizada en la actualidad. Las dos vías han demostrado su eficacia y 
seguridad, pero la vía subcutánea consigue resultados similares con una reducción de la dosis 
entre el 26 y 30 por ciento y unas dosis de mantenimiento un 27-45 por ciento menores que las 
que se precisan por vía intravenosa, con el consiguiente ahorro económico. 
En el caso de la vía intravenosa es aconsejable comenzar con una dosis de 40-50 Ul / Kg tres 
veces por semana y ajustar la dosis de mantenimiento según el ritmo de respuesta y el hematocrito 
que se pretenda alcanzar en cada paciente. Cuando se usa la vía subcutánea se comienza con 
una dosis de 20-30 Ul / Kg tres veces por semana y se ajusta la dosis según el ritmo de respuesta; 
con el uso de esta vía la influencia del número de dosis en la eficiencia del tratamiento es menor y 
puede conseguirse un buen control de la anemia con 1 ó 2 dosis semanales, si la dosis total 
semanal no excede las 120 Ul / Kg. El hematocrito diana que se pretende alcanzar con el 
tratamiento de Epohr es de 30 a 33 por ciento, aunque existe una tendencia de obtener valores 
entre 35 y 36 por ciento. Antes de iniciar el tratamiento hay que descartar la existencia de factores 
que induzcan mala respuesta al fármaco, así como otras causas de anemias y constatar la 
ausencia de déficit de hierro. Cuando la anemia está agravada por déficit hierro y ácido fólico, es 
necesaria la administración suplementaria del elemento correspondiente (Sanz y Botella, 1997). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
 
 
 
 
- Uso clínico del la Epohr en Oncología. 
La Eritropoyetina humana recombinante es capaz de corregir la anemia relacionada con el cáncer y 
la quimioterapia aumentando los niveles de hemoglobina y reduciendo las necesidades de 
transfusiones. La vía de administración recomendada es la subcutánea en dosis de 150 a 300 Ul / 
Kg de peso, dependiendo de la respuesta obtenida (Díaz-Rubio, 1997, Oette y colaboradores, 
2001, Egerer y colaboradores, 2003, Leyland, 2003). 
- Uso clínico del la Epohr Diabetes mellitus 
El tratamiento de la anemia con Epohr en pacientes con nefropatía diabética es bien tolerado y se 
acompaña de escasas complicaciones. Los pacientes con diabetes e insuficiencia renal crónica 
responden de manera similar que los pacientes no diabéticos (Sánchez y colaboradores, 1997). 
- Uso clínico del la Epohr en pacientes quirúrgicos 
La transfusión de sangre autóloga es una alternativa a la transfusión de sangre alogénica en los 
procedimientos de cirugía electiva en los cuales se prevé la necesidad de transfundir una unidad 
de sangre o más. La donación preoperatoria de sangre autóloga entraña el riesgo de que el 
paciente desarrolle anemia, por lo que la administración de Epohr se ha convertido en un 
complemento de este tipo de donación (Mercuriali, 1997). 
- Uso clínico del la Epohr en el SIDA 
En diversos países como Estados Unidos, Canadá y Austria, la Epohr está aprobada para el 
tratamiento de la anemia moderada o grave asociada a la propia infección por el VIH o a la 
administración de algún medicamento mielinotóxíco (Gatell, 1997). 
1.1.4 Métodos de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante 
Miyake y colaboradores (Miyake y colaboradores, 1977) realizaron 7 pasos para 
purificar la Epoh, estos incluían tratamiento con fenol, precipitación con etanol, Cromatografía en 
Intercambio Aniónico, Cromatografía en Filtración en Gel y cromatografía de adsorción. A partir de 
este momento se desarrollaron muchos métodos para la purificación de Epoh (Sieber e Iscore, 
1977; Krystal y colaboradores, 1986). 
Sieber y colaboradores (1977) utilizaron en su procedimiento adsorción en ácido benzoico y 
cromatografías en: DEAE sefarosa, ConA sefarosa, Sephadex G100 y PHA sefarosa. Krystal y 
colaboradores (Krystal y colaboradores, 1986) purificaron la Epohr
Revisión bibliográfica
1
 
 
 
utilizando cinco pasos cromatográficos: afinidad en CM afigel Azul, cromatoenfoque, WG lectina 
sefarosa, RP-HPLC en columna fenyl y SDS-PAGE preparativo. 
Hewick y Seehra (Hewick y Seehra, 1987) desarrollaron un procedimiento que permite purificar 
tanto Epoh como Epohr. Ellos realizaron una purificación inicial utilizando el método de Miyake y 
colaboradores; luego realizaron una cromatografía en RP-HPLC que les permitió obtener una Epoh 
pura a partir de diferentes fuentes. La columna de RP-HPLC utilizada fue una columna C4 y la 
elusión la realizaron utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo. Lai y Strickland (Lai y Strickland, 
1987) patentaron un método para la purificación de Epohr. Estos autores realizaron una 
Cromatografía de Intercambio Iónico en DEAE-agarosa y una cromatografía en RP-HPLC 
(columna C4, elusión con gradiente lineal de etanol), finalmente realizaron una cromatografía en 
filtración en Gel. Ghanem y colaboradores (Ghanem y colaboradores ,1994), purificaron Epohr 
producida en células linfoblastoides utilizando dos pasos cromatográficos. El primero consistió en 
una cromatografía de afinidad donde se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-Epohr inmovilizado 
en sefarosa y el segundo fue una cromatografía de intercambio iónico en DEAE sefacril. 
1.1.5 Agregación 
La Eritropoyetina humana recombinante como otros productos de uso terapéutico, debe estar en 
condiciones tales en las queno se produzcan agregaciones solubles o insolubles de formas 
oligoméricas, debido fundamentalmente a las implicaciones que esto podría tener en la actividad 
biológica y en la antigenicidad. 
Para ello investigadores como Yoshiyuki y colaboradores (Yoshiyuki y colaboradores, 1992) han 
estudiado diferentes condiciones que influyen sobre el proceso de agregación de la Epohr. 
En primer lugar está la influencia de la temperatura en distintas concentraciones de sales y pH. A 
temperaturas por encima de los 60 °C se produce rápidamente un cambio determinando por 
Dicroísmo Circular , atribuible a la formación de agregados irreversibles de hasta 20 moléculas de 
Epoh (450 kDa). Por debajo de los 60 °C no se detectaron durante más de un mes de incubación, 
aunque dímeros y oligómeros pudieron ser visibles tempranamente (específicamente a 40°C), los 
cuales están asociados a un desplegamiento parcial de la molécula que originaría interacciones 
intermoleculares. 
Anneli y colaboradores (Anneli y colaboradores, 1995) plantearon que a 37°C, en un período de 4 
a 13 días, hay un incremento de dímeros y conformaciones de alto peso 
 
 
 
 
 
 
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molecular con grupos tioles libres, jugando un papel importante el tiempo que fueron incubadas las 
muestras. 
A pH 7 no se produce la asociación de las moléculas debido a que la hormona está cargada 
negativamente y se favorecen las repulsiones electrostáticas, no siendo así a valores de pH 
alcalinos, donde se forman agregados covalentes; ni a pH ácidos, donde se forman agregados no 
covalentes de hasta 1 700 kDa. Lo anterior es atribuible al decremento de la repulsión 
electrostática entre las moléculas y el desplegamiento a causa de la desnaturalización, adquiriendo 
las moléculas propiedades antipáticas que contribuyen a una estructura micelar. A altas 
concentraciones de cloruro de sodio se produce la supresión de las repulsiones electrostáticas 
intermoleculares causantes de los agregados (Davis y colaboradores, 1987). 
El mecanismo de agregación covalente propuesto por Anneli y colaboradores (Anneli y 
colaboradores, 1995) y Derby y colaboradores (Derby y colaboradores, 1996), en los tratamientos, 
por calor indica que se produce una ruptura del puente disulfuro formado entre Cys 7 y Cys 161 y 
no se afecta la unión Cys 29 y Cys 33, con una posterior reoxidación. Esto origina puentes 
disulfuro intermoleculares entre Cys 7 y Cys 7, entre Cys 161 y Cys 161 y en menor proporción 
entre Cys 7 y Cys 161, por lo que surgen homodímeros 7-7 y 161-161 y se puede encontrar entre 
un 20 ~ 25 % de las Cys 7 y Cys161 libres, los que almacenados por tiempos largos a - 20 °C 
pueden pasar a homodímeros. Quizás este sea uno de los pasos hacia la formación del multímero. 
Además se demostró por tiol fluorescencia, que en los monómeros no tratados no aparecen 
grupos tioles libres (Wang y colaboradores, 1985). 
El dímero formado aún puede mantener alguna actividad biológica, aunque mucho más reducida, 
cuando se compara con la actividad del monómero no tratado. Esta puede ser determinada por el 
procedimiento de Cotes y Bangham (Cotes y Bangham, 1961) y resulta en 84 000 ± 6000 U / A 
280 y en 25 000 ± 6000 U / A 280 respectivamente, indicando este valor algún daño inducido por el 
calor, tal como una desialización parcial u otra modificación de la parte carbohidrática o una 
alteración en la cadena peptídica (Derby y colaboradores, 1996) 
El hecho que disminuya en un 30 % la actividad sugiere que la causa es el puente disulfuro 7 / 
161, el cual es crítico para la actividad in vivo (Boissel y colaboradores, 1993) y no así el puente 
disulfuro 29 / 33, además de que los residuos 151-161 se encuentran altamente conservados entre 
mamíferos (Wen y colaboradores, 1993). 
 
 
 
 
 
 
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No obstante todo lo anterior, Arthur y colaboradores (Arthur y colaboradores, 1998) publicaron un 
artículo en el que mostraron que modificaciones químicas convierten a la Epohr en un dímero con 
una vida media de más de 24 horas con respecto a la Epoh circulante y un aumento del 
hematocrito notable en ratones. Este dímero formado no utiliza las Cisteínas propias de la 
molécula, si no que intervienen en el mismo los nuevos grupos tioles añadidos. 
Esto permite que el dímero tenga 26 veces más actividad biológica y sea mucho más efectivo que 
el monómero después de varias dosis, pudiendo jugar un importante papel en la terapia (Spivak y 
Hogans, 1989). 
El efecto de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas sobre la estructura de las proteínas ha 
sido ampliamente reportado y estudiado (Wu y colaboradores 1986; Figueroa y colaboradores, 
1986; Nelu y colaboradores, 1989; Tibbs y Fernandez, 2003). Se ha observado que en proteínas 
como la (β -lactoglobulina, un incremento en el tiempo de incubación en matrices hidrofóbicas no 
contribuye al aumento de la agregación de la molécula, pero a concentraciones mayores de 5 mg / 
ml_ se forman precipitados en la elusión. Esto es a causa de la interacción hidrofóbica entre la 
matriz y las zonas hidrofóbicas de la superficie de la proteína, que pudiera indisponer las 
interacciones entre las proteínas, al actuar la superficie de la columna hidrofóbica como un 
competidor en la formación de altos agregados (Nelu y colaboradores, 1989).La cromatografía de 
interacciones hidrofóbicas también indujo cambio en la estructura terciaria de la Alpha-Lactalbumin 
(Tibbs y Fernandez, 2003). 
Se ha descrito que el etanol puede inducir agregación en biomoléculas como la fitohemaglutinina, 
la p lactoglobulina y el pepsinógeno (Jirgensons, 1982; Dufour y colaboradores, 1994; Makarov y 
colaboradores, 1995). Se ha revelado que la p lactoglobulina en agua presenta grandes cantidades 
de estructuras de hojas p en su interior. En alrededor del 20 % de etanol la molécula se despliega y 
se observan la formación de estructuras β aisladas, además el incremento del etanol hasta 50% 
hace que estructuras a hélices juegan un mayor papel. 
Renard y colaboradores (Renard y colaboradores, 1999) indicó que el alcohol al 50 % induce la 
agregación de beta-lactoglobulina caracterizada por la formación de puentes de hidrógeno 
intermolecular entre las estructuras de hojas β. 
Se conoce que los procesos de agregación de las proteínas son fenómenos no deseados para los 
productos farmacéuticos. Para esto, se han realizados numerosos estudios encaminados a su 
eliminación o reducción empleando fundamentalmente el
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efecto desagregante de algunos detergentes (Bam y colaboradores, 1998; Kerwin y colaboradores, 
1998, Lotte y colaboradores, 1998). De forma más específica se ha estudiante el mecanismo de 
acción del Tween 20 sobre los procesos de agregación, las cuales incluyen, en primer lugar, la 
adsorción de este detergente a las moléculas de proteína, evitando la interacción proteina-proteina 
y la competencia del mismo en la adsorción sobre la interfase aire-líquido o sólido-líquido (Tandon 
y Horowitz, 1987; Sluzky y colaboradores, 1991; Timasheff, 1994). 
1.2 Generalidades de los Procedimientos Utilizados 
1.2.1 Técnicas Cromatográficas 
Dentro de los problemas actuales que confronta la bio-ingeniería moderna de proteínas 
recombinantes está lograr la purificación de un producto con elevados niveles de pureza, 
estabilidad, reproducibilidad y consistencia, los cuales ofrezcan respuesta a la creciente demanda 
de productos farmacéuticos en el mundo. 
Alcanzar este objetivo requiere más de una técnica de purificación cromatogràfica, la cual es un 
eslabón final y en muchos casos forman parte de los pasos esenciales en la cadena de 
recuperación de un producto determinado. La gran variedad de técnicas cromatográficas que 
existen actualmente, se debe al desarrollo tecnológico alcanzado hasta el presente. 
Entre las técnicas más utilizadas se puede encontrar una gran variedadde tipos, que además de 
diferenciarse en el principio de separación, también pueden presentar distintos grados de 
resolución y capacidad. 
Un sistema cromatogràfico está constituido fundamentalmente por una columna, donde se empaca 
el gel o matriz que consiste en un material inerte de elevado grado de hidratación llamado fase 
estacionaria. Además, por una solución o muestra disuelta en un tampón apropiado nombrado fase 
móvil, un monitor (de luz ultravioleta, conductividad o pH), un registrador y una bomba, que es la 
encargada de suministrar la energía necesaria para poner en movimiento el proceso a través del 
flujo. 
1.2.2 Cromatografía de Intercambio Iónico 
Actualmente, el intercambio iónico es la técnica cromatogràfica más frecuentemente usada para la 
separación y purificación de proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos y otras 
biomoléculas (Levison y colaboradores, 1998; Kent, 1999; Yamamoto y Miyagawa, 1999; Gebauer 
y colaboradores, 1999; Levison y colaboradores, 1999; Hallgren, 1999; Hallgren y colaboradores, 
2000; Knudsen y colaboradores, 2001; Bai y colaboradores, 2000; Kim y Kuga, 2001; Li y 
colaboradores, 2002; Holm y colaboradores, 2002; Sauter y colaboradores, 2003; Urban y 
 
 
 
 
 
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colaboradores, 2003). Las razones del éxito del intercambio iónico se deben a su alto poder de 
resolución, su alta capacidad, simplicidad y el control que permite el método. 
La separación en la Cromatografía de Intercambio Iónico depende de la adsorción reversible de 
moléculas solubles cargadas que son inmovilizadas por un grupo de iones de intercambio que 
tienen carga opuesta. 
Un intercambiador iónico consiste de una matriz porosa insoluble la cual está cargada con grupos 
que están enlazados a esta de forma covalente. Los grupos cargados se asocian a contraiones 
móviles (la solución de equilibrio los debe contener). Los contraiones son intercambiadores 
reversibles los cuales pueden ser intercambiados por otros iones de igual carga y mayor fuerza 
iónica, sin que se altere la matriz. Existen intercambiadores catiónicos y aniónicos. En el caso de 
los intercambiadores aniónicos la matriz está cargada positivamente y por tanto su contraión debe 
tener carga negativa y la matriz intercambia solo aniones, mientras que en el caso de los 
intercambiadores catiónicos la matriz está cargada negativamente y su contraión debe tener carga 
positiva, por lo tanto, la matriz solo intercambia cationes. 
Después de equilibrada la matriz el siguiente paso es la aplicación de la muestra y adsorción de 
esta en la matriz de intercambio, en la cual las moléculas solubles poseen una carga adecuada 
con la que desplazan al contraión y de esta manera se enlazan reversiblemente al gel. Las 
moléculas que no se enlazan a la matriz pueden ser eluídas fuera del lecho de intercambio usando 
el tampón de equilibrio. 
En la siguiente etapa las moléculas solubles son removidas de la columna a través de un tampón 
que contiene iones de mayor fuerza iónica, los cuales desplazan a estas moléculas solubles que 
se desean separar y hace que esta eluya fuera de la columna. Esto normalmente se logra 
incrementando la fuerza iónica a través del tampón o cambiando el pH. La elusión es llevada a 
cabo estableciendo un mayor grado de concentración de sal y las moléculas solubles son 
desadsorbidas de la columna en orden de su fuerza de enlace, las moléculas más débilmente 
unidas a la matriz eluyen más rápidamente (Janson y Rydén, 1998). 
Las etapas siguientes son la remoción de la columna de sustancias no eluídas bajo las condiciones 
previas del experimento y volver a equilibrar la columna para dejarla en las condiciones iniciales 
para el próximo proceso de purificación. 
Los intercambiadores se seleccionan de acuerdo a la curva de titulación de la proteína. La matriz 
puede estar formada por compuestos inorgánicos, resinas sintéticas, etc. La matriz determina 
propiedades cromatográficas tales como resolución, capacidad, 
 
 
 
 
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recobrado y también determina propiedades físicas como fuerza mecánica y propiedades de flujo. 
La naturaleza de la matriz puede afectar el comportamiento del material biológico y la preservación 
de su actividad biológica. 
En la cromatografía de intercambio iónico se puede escoger la forma de interacción de la sustancia 
de interés. Se puede elegir que lo que se enlace a la matriz principalmente sea la proteína que 
deseamos separar y que pasen a través de la columna la mayoría de los contaminantes 
(cromatografía de adsorción negativa), o que la proteína eluya de la columna. El primer método es 
generalmente el más usado pues permite un mayor grado de fraccionamiento y concentración de 
la sustancia de interés (Scopes, 1994, Murray, 1990). 
1.2.3. Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas 
La separación se basa en las diferentes propiedades hidrofóbicas que presentan las proteínas y 
péptidos en medio salino que permiten que se enlacen a una matriz hidrofílica sustituidas con 
ligandos hidrofóbicos. 
En la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas la muestra se aplica con una elevada 
concentración de sal. Las biomoléculas que se enlazan pueden ser eluídas por un gradiente lineal 
o escalonado del solvente. Para remover los componentes más hidrofóbicos se necesita de un 
lavado final con agua pura, detergentes o un solvente miscible en agua (por ejemplo: isopropanol o 
etanol) (Scopes, 1994). 
Este es uno de los métodos más poderosos en la bioquímica preparativa, lo cual está justificado 
por su amplio uso en los proceso de purificación actuales (Kato y colaboradores, 2003; Kunitani y 
colaboradores, 2003; Zanette y colaboradores, 2003; Tibbs y colaboradores, 2003; Jobby y 
Sharma, 2003; Xia y colaboradores, 2003). Su velocidad, resolución y capacidad compite con la 
cromatografía de intercambio iónico y su selectividad es complementaria a la filtración por gel o 
cromatografía de exclusión molecular. Su habilidad de limpiar endotoxinas, ácidos nucleicos y virus 
hace de ella un instrumento indispensable para la purificación de proteínas de uso farmacéutico. 
Las superficies de las proteínas contienen zonas o manchas hidrofóbicas, que es por donde ocurre 
la reacción con los ligandos hidrofóbicos que posee la matriz (Anexo 1), pero solo es posible en un 
medio que favorezca esa interacción. 
El soluto no polar "fuerza" al agua a formar una cavidad en la que el soluto se fija o coloca. En este 
proceso muchos puentes de hidrógeno se rompen y otros nuevos se forman. Las moléculas de 
agua rodean o circundan la cavidad formada, lo que produce un cambio negativo de la entalpia de 
reacción. El aumento en el nivel de ordenamiento
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16
 
 
 
de las moléculas de agua próximo al soluto explica el cambio negativo en la entropía (Scopes, 
1994). 
El cambio en la entropía es mucho mayor que el de entalpia haciendo que la variación de energía 
libre del proceso sea negativa (Scopes, 1994). 
ΔG = ΔH - T ΔS 
La interacción hidrofóbica entre la matriz (con ligandos hidrofóbicos) y las áreas homologas de una 
proteína se explica de igual forma que la interacción entre solutos no polares en agua. 
Si la variación de energía libre del proceso es negativa, entonces el mismo será 
termodinàmicamente posible. 
Tanto la entalpia como la entropía cambian con la temperatura en las interacciones hidrofóbicas. 
La fortaleza de las interacciones hidrofóbicas se ve aumentada con el aumento de las 
temperaturas de reacción (Herjertén, 1977). 
Factores que influyen en la cromatografía de interacciones hidrofóbicas: 
• Tipo de sal empleada en el tampón de aplicación. 
• Concentración de la sal. 
• Aditivos en el tampón, que afecten la polaridad. 
• Temperatura. 
• Ligando. 
Iones que promueven las interacciones hidrofóbicas: 
Aniones: S042- > Cl- > Br- > NO3- > CIO4- > I - > SCN- 
Cationes:Mg2+ >Li+ > Na+ > K+ > NH4+ 
Se ha comprobado que la variación de la efectividad de las diferentes sales para promover las 
interacciones hidrofóbicas puede explicarse mediante su contribución a la tensión superficial de la 
solución. A mayor tensión superficial se provocan interacciones hidrofóbicas más fuertes, y una 
mayor concentración de la sal implica interacciones más fuertes. 
Otros factores que influyen son la hidratación de las proteínas y la interacción proteína- sal. 
Geles 
Los ligandos están compuestos por cadenas alifáticas de diferente longitud generalmente desde 2 
hasta 12 carbonos. A diferencia de los geles de RP-HPLC , la distribución superficial del ligando en 
la superficie del gel es baja, y las condiciones de elusión suaves (Hydrophobic 
Interaction,Pharmacia Biotech, 2001) 
 
 
 
 
 
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Adsorción 
La adsorción de proteínas es favorecida por altas concentraciones de sales. Producto de las 
diferentes fortalezas de hidrofobicidad entre el gel y las proteínas, la concentración de sal 
necesaria para la adsorción varía de un ejemplo a otro. La concentración de sales debe ser menor 
que la concentración a la cual precipitan las proteínas en ese medio (Scopes, 1994). 
Orden de fortaleza iónica de alguna de las sales más utilizadas: 
Na2S04 > NaCI > (NH4)2S04 > NH4CI > NaBr > NaSCN > KSCN La sal 
sulfato de amonio es la más usada en la práctica. 
La elusión en esta cromatografía puede realizarse en forma de gradiente o en forma de paso 
escalón. Existen tres formas de elusión fundamentales (Scopes, 1994 y Hydrophobic Interaction, 
Pharmacia Biotech, 2001): 
• Disminuyendo la concentración de sales, los solutos eluyen en orden creciente de 
hidrofobicidad. 
• Cambiando la polaridad del solvente. Se puede obtener una disminución de la hidrofobicidad 
en el sistema adicionando solventes polares en el tampón de elusión (ejemplo: Alcoholes o 
etilenglicol). 
• Adicionando detergentes. Estos funcionan como disolventes proteicos. 
También se puede cambiar la especie de sal hasta lograr una concentración caotrópica o 
cambiando el pH, aunque esta última forma de elusión no tiene predicción posible. Después de 
eluídos los componentes proteicos deseados los geles pueden ser reutilizados muchas veces si 
son regenerados y conservados correctamente. La regeneración deber ser realizada con Urea 6 M 
o cloruro de guanidio. A continuación el gel debe ser equilibrado con el tampón de equilibrio si va a 
ser utilizado de inmediato o almacenado en 20 % de etanol a 4°C. Si se emplean detergentes en la 
corrida, se deben hacer lavados con diferentes alcoholes previos al almacenamiento (Scopes, 
1994; Murray, 1990). 
1.2.4. Cromatografía de Exclusión Molecular 
Las moléculas de proteínas entran a los poros que contiene la fase estacionaria. Las moléculas 
más grandes no pueden entrar a la fase estacionaria y atraviesan la cama cromatogràfica más 
rápidamente. Las moléculas pequeñas, que pueden entrar a los poros del gel, se mueven más 
lentamente a través de la columna. Por tanto, las moléculas son eluídas en orden decreciente de 
su tamaño molecular (Scopes, 1994; Murray, 1990, Gel Filtration, Pharmacia Biotech, 2001). 
 
 
 
 
 
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Separación por filtración en gel: 
Existen dos tipos de separaciones principales: 
Separación de grupo 
Fraccionamiento de biomoléculas 
I. Separación de Grupo: 
Se emplea cuando existen grandes diferencias en los pesos moleculares de los componentes de la 
mezcla a separar, por ejemplo: sales y proteínas. Las moléculas mayores (en el caso ejemplificado 
son las proteínas) eluyen en el volumen muerto o vacío. 
Ventajas de la Separación de Grupo: 
• Rapidez del proceso: en 30 minutos el 100 % de la corrida. 
• Recobrado: prácticamente el 100 %. 
• Se pueden recobrar incluso 100% de moléculas pequeñas. 
• Tiempo de vida alto del gel. 
• Se puede aplicar un volumen grande de muestra (hasta aproximadamente 0,3 volúmenes de 
columna). 
• Alternativa industrial a la diálisis de proteínas. 
Aplicaciones: 
• Cambio de tampón: Las muestras son cambiadas a un tampón adecuado para realizar otra 
técnica. 
• Desalineación de proteínas, polipéptidos y polisacáridos. 
• Eliminación de fenol de preparaciones de ácidos nucleicos. 
• Terminación de reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular. 
• Eliminación de productos, cofactores, inhibidores de enzimas, etcétera. 
II. Fraccionamiento de proteínas: 
Se emplea cuando los pesos moleculares de los componentes de la mezcla a separar están en el 
mismo rango. Ejemplo: proteínas - proteínas - polipéptidos - ADN, etc. Factores a considerar al 
seleccionar un gel: 
• Para favorecer altas cargas de muestra, la porosidad y la selectividad deben ser altas y el 
diámetro de la columna adecuado para el volumen de muestra deseado. 
• Se deben emplear geles que faciliten el escalado, que se puedan empacar de forma simple, 
que puedan resistir un alto flujo y que tengan bajo costo. 
 
 
 
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• La estabilidad química del gel puede permitir la presencia de solventes orgánicos (Filtratíon Gel, 
Pharmacia Biotech, 2001). 
Teniendo en cuenta el amplio espectro de posibilidades de uso de la Cromatografía de Filtración en 
Gel, se encuentra formado parte de casi todos los procesos de obtención de principios activos 
biotecnológicos (Kaersgaard y Barington, 1998; Cox y Bunce, 1999; Kent, 1999; Cheng y 
colaboradores, 2001; Dudkiewicz y colaboradores, 2002; Guo y colaboradores, 2003; Goa y 
colaboradores, 2003). 
1.3 Desescalado y escalado de procesos cromatográficos 
El desescalado de procesos industriales es una poderosa herramienta para minimizar el tiempo y 
los costos en la investigación-desarrollo de bioprocesos y en los estudios de reto necesarios 
durante la validación del desempeño de un proceso (PDA, 1992). Este permite el estudio y 
evaluación de muchas opciones de procesos en pequeñas escalas permitiendo una rápida 
identificación de los parámetros de operación y control más importantes. Este simple procedimiento 
puede significar ahorro de tiempo y dinero (Sofer, 1996). El escalado-desescalado de un proceso 
de purificación bien diseñado debe ser directo, considerando, por supuesto, determinados 
parámetros, siendo los lineamientos generales relativamente simples (Sofer, 1996). 
El nivel del escalado en procesos de purificación tiene que asegurar que todas las condiciones de 
operación sean las mismas del proceso analítico en cuestión. En el caso particular de los sistemas 
cromatográficos, parámetros tales como: altura y diámetro de la columna, flujo lineal, tiempo de 
residencia, composición del tampón, tipo de matriz, valor de pH, temperatura, concentración de la 
proteína y composición-concentración de sales son puntos relevantes a considerar (Sofer, 1996). 
Siempre la naturaleza química de los componentes empleados en las cromatografías a pequeña 
escala debe ser la misma que a escalas superiores. Esto no siempre es factible, pero debe tenerse 
en cuenta que el no cumplimiento de ello puede repercutir en una posible afectación en el proceso 
de separación igualmente. Deben tenerse en cuenta los cambios de tampones y temperaturas 
durante el tiempo de residencia de algunas bombas a escala de laboratorio.(ej. temperatura y pH 
bajos) (Sofer, 1996). 
Lo más idóneo en el escalado de las columnas cromatográficas es mantener la altura del gel y 
aumentar el diámetro de la columna. El factor más importante es el flujo lineal que da una medida 
de la velocidad con que pasa el líquido a través de la columna expresada en centímetros por hora 
(cm/h) (Sofer, 1996). 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
2
 
 
 
 
El sistema de distribución de una columna cromatogràfica es un elemento crítico en la separación, 
siempre que sea posible, el sistema de distribución en pequeña escala debe ser similaral 
industrial. Las características químicas de los componentes a emplear deben también ser ¡guales; 
esto debe tenerse en cuenta durante la selección del material de construcción de las columnas que 
varía desde el acero inoxidable hasta el vidrio pasando por las de plástico. En todos los casos se 
requiere hacer un análisis del impacto de estos materiales sobre la pureza y calidad del producto 
(Sofer, 1996). 
Las soluciones tampones a emplear en el desescalado deben definirse previamente, ya que lo 
contrario pudiera resultar inconsistente partiendo del hecho de que se preparen las soluciones por 
métodos diferentes, es decir, con ajuste o no de pH. Esto pudiera afectar la fuerza iónica y por 
ende el perfil de elusión del producto al posibilitar la migración de impurezas además de ocasionar 
una sobrestimación de algunas de ellas. La calidad del tampón, las sales, y el agua empleada en la 
preparación de los mismos deben también guardar similitud con las empleadas a escala industrial 
(Sofer, 1996). 
La temperatura puede tener un significativo efecto en el tiempo de retención. Los cambios de 
temperatura pueden alterar la conformación de la proteína inactivándola. Si un proceso 
cromatogràfico es corrido en frío, su desescalado tiene que efectuarse en igual condición. 
Durante el proceso de desescalado se debe tener como premisa fundamental comprobar la 
eficiencia verificando por ejemplo, que la cantidad de platos teóricos no se reduce al disminuir el 
diámetro de la columna (Sofer, 1996). 
Hay que tener definido qué recuperación total del producto de interés se obtendrá a escala de 
laboratorio para determinar la cantidad total de material crudo necesario que permita obtener la 
cantidad de producto final deseado. Debe estar definida la capacidad de los medios de separación 
que se emplearán en la nueva escala, así como el tiempo de trabajo y el volumen de muestra en 
las nuevas condiciones. Además tener trazada la estrategia de separación cromatogràfica (Sofer, 
1996). 
Por lo tanto, el desescalado en cromatografía significa: 
• Un conjunto de factores proporcionalmente disminuidos. 
• Modificaciones leves de los resultados. 
• Definición final de los parámetros de escala. 
Al llevar a cabo las operaciones de desescalado cromatogràfico se observarán los siguientes 
criterios: 
Se debe disminuir: 
 
 
Revisión bibliográfica
21
 
 
 
• Diámetro de columna hasta lograr el nuevo volumen de lecho. 
• Proporcionalmente el flujo volumétrico. 
• Proporcionalmente la carga de muestra. 
• Proporcionalmente el volumen de gradiente. 
Debe mantenerse constante: 
• Altura de columna. 
• Velocidad de flujo lineal. 
• Carga de muestra / volumen de gel. 
En resumen, la dimensión del desescalado puede ser hasta la más pequeña que reproduzca 
realmente el proceso, aunque se recomienda que este sea entre el 0.1-5% de la escala real de 
proceso (Sofer y Nystrom, 1991; Sofer y Hagel, 1997). 
1.4 Control de Calidad del proceso de recobrado y purificación 
El recobrado de la proteína se basa en la utilización de técnicas de alta eficiencia como 
son: gel filtración, intercambio iónico, isoelectroenfoque, cromatografía de afinidad y el uso de 
anticuerpos específicos. El proceso de recobrado comienza con el aislamiento de la proteína 
deseada, a menudo en un estado bastante impuro. Los cultivos de células y algunas levaduras que 
excretan el producto al medio de cultivo tienen mayor ventaja, ya que con un primer paso de 
separación de las células del cultivo se facilita la purificación (Lombardero, 1988). En el caso de los 
productos derivados de E.coli se necesita romper las células bacterianas para recobrar la proteína. 
En todos los casos es muy importante desarrollar rápidamente la purificación, pues tanto los 
lisados de la bacteria como los cultivos de células y levaduras liberan proteasas que pueden 
degradar el producto deseado. 
Los niveles de pureza establecidos para productos farmacéuticos parenterales recombinantes son 
de 95% o más (USP XXIV, 2002), utilizando diferentes métodos. La pureza depende de un número 
de factores. Se debe señalar que los productos para uso crónico tienen normalmente 
requerimientos mayores de pureza que aquellos utilizados en dosis únicas o poco frecuentemente. 
Los productos biotecnológicos tienen ciertas impurezas que es necesario minimizar o eliminar en el 
proceso de purificación. Entre ellas están los virus, los ácidos nucleicos, y los materiales 
antigénicos indeseables. 
• Eliminación del ADN recombinante. 
Los productos recombinantes deben cumplir con niveles de100 pg o menos de ADN por dosis. La 
capacidad de eliminar el ADN durante el proceso de recobrado y purificación debe validarse (USP 
XXIV,2002) 
 
 
Revisión bibliográfica
2
 
 
• Eliminación de antígenos de la célula hospedera. 
Se aceptan niveles entre 10 y 100 ng por dosis, para el contenido de impurezas de proteínas de 
hospedero, aunque ya aparecen en la literatura concentraciones más bajas, dadas en partes por 
millón (ppm) (Chen, 1992). 
• Eliminación o eliminación de agentes indeseables. 
Debe validarse la capacidad de eliminarlos por el proceso, estos agentes son: bacterias, hongos, 
micoplasmas y virus (White y colaboradores 1991) 
- Caracterización del material activo purificado. 
Deben mostrarse evidencias de identidad, pureza, potencia e integridad molecular del material activo 
en comparación con preparaciones de referencia (USP XXIV, 2002). Prueba para identidad y 
pureza. 
• Análisis de Aminoácidos. Se deben realizar como mínimo 3 análisis comparativos con la 
composición teórica del equivalente natural. El análisis de aminoácidos detecta solamente 
cambios sustanciales entre un 10 y un 30 % en la estructura primaria proteica. La detección 
de metionina oxidada o aminoácidos residuales que se conoce que no deben aparecer en esa 
preparación puede indicar degradación o contaminación. El método no debe ser utilizado 
como criterio de pureza, ya que presenta problemas con su exactitud. 
• Mapeo peptídico: El mapeo peptídico puede demostrar diferencias discriminatorias entre un 
producto obtenido por la vía de ADN recombinante y una muestra auténtica del producto 
natural. Unido a la composición y análisis de secuencia de cada péptido, el mapeo peptídico 
puede dar evidencias precisas de la identidad de una proteína. Está técnica puede ser usada 
para verificar la presencia incorrecta de los puentes de disulfuro en la muestra final y 
alteraciones o mutaciones en aminoácidos de la secuencia (Garnick, 1992). 
• Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio: Esta técnica permite 
separar proteínas individuales y polipéptidos de acuerdo con el peso molecular. El SDS 
disocia, solubiliza y desnaturaliza proteínas contenidas en una mezcla heterogénea, y cada 
polipéptido adquiere una carga constante por unidad de masa. Las muestras se preparan en 
condiciones desnaturalizantes con y sin agentes reductores, esto permite detectar la 
presencia de agregados en la preparación. En el paso de revelado, se recomienda utilizar dos 
formas de tinción, por lo que las muestras se preparan por duplicado. La tinción con azul de 
coomassie, se utiliza para medir con un densitómetro o un procesador de 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos
2
 
 
imágenes el por ciento de pureza, los posibles agregados y material degradado de la preparación 
(Laemmli, 1970). 
• Isoelectroenfoque: Es una técnica electroforética que separa las proteínas sobre la base de su 
carga. Este método es empleado para conocer la identidad y para asegurar la homogeneidad de 
una proteína, comparando con el patrón de bandas definido por el punto isoeléctrico. También 
puede ser usada para evaluar la estabilidad de los productos biológicos. Estas técnicas se 
realizan con marcadores de calibración para punto isoeléctrico o preparaciones de referencia 
(European Pharmacopeia, 2002). 
• Cromatografía líquidade alta resolución: Este método es usado para determinar la pureza de una 
proteína o péptido, detecta la presencia de modificaciones como acetilación, degradación y bajo 
ciertas circunstancias confirma su identidad. El HPLC puede ser utilizado en el mapeo peptídico y 
en la caracterización y cuantifícación de impurezas especificas en el producto final (European 
Pharmacopeia, 2002). 
• Espectrometría de masas: La espectrometría de masas con ionización por bombardeo con 
átomos acelerados es un método establecido para el análisis de péptidos y proteínas. Mediante 
esta técnica es posible conocer la presencia de modificaciones post-transduccionales como son: 
acilación, glicosilación, formación incorrecta de puentes disulfuro y degradación de las proteínas, 
entre otras (Besada y colaboradores, 1992). 
• Dicroismo circular: Suministra información sobre la conformación estructural en comparación con 
la molécula natural o preparaciones de referencia (Sutherland y colaboradores, 1992, Rodger y 
Ismail, 2000). 
El dicroismo circular es una técnica ideal para el estudio de moléculas quirales en solución. Se 
define como la diferencia en absorción (A) de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la 
izquierda. 
DC = Ai- Ad 
El espectro de DC puede ser medido en principio con cualquier frecuencia de radiación 
electromagnética. En la práctica la mayoría de los espectroscopios de DC utilizan la región 
ultravioleta visible (UV-visible) del espectro y la transición electrónica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
2 
 
 
En la mayoría de los espectrómetros de DC comerciales el modulador fotoelástico produce una 
luz alternada polarizada a la izquierda y hacia la derecha con un cambio de la frecuencia de 50 k 
Hz. 
Los aspectos que hay que tener en cuenta para el análisis de una muestra por DC son: 
1. El equipo de DC 
2. Características de la muestra 
3. La cubeta 
4. Rango de longitud de onda 
a. Parámetros de operación: tiempo de respuesta, velocidad de barrido, ancho de 
banda, número de lectura, etc. 
El DC es comúnmente empleado para estudiar macromoléculas en los siguientes 
ejemplos: 
1. Para probar cambios en la conformación de la macromolecular 
2. Para probar cambios en interacciones de con pequeñas moléculas. 
A valores de longitud de onda entre 250 y 300 nm (UV cercano) el espectro de DC de las 
proteínas es dominado por la contribución de los aminoácido aromáticos y de la cisternas. 
Cualquier cambio del proceso que afecte esta región puede ser estudiado mediante el DC. Para 
la estimación de la cantidad de las diferentes estructuras presentes en la proteína, se estudia el 
espectro del DC en la región del lejano UV (Rodger y Ismail, 2000) 
• 
• Dot-Blot: La determinación de trazas de ADN residual en estos productos se realiza mediante 
técnicas de hibridación usando sondas radioactivas derivadas del ADN de la célula hospedera. La 
sensibilidad del ensayo, determinada por el límite de detección visual, está de 10 a 250 pg. Este 
método solo reconoce ADN complementario a la sonda radioactiva, por lo que otros tipos de ADN 
no son detectados (Briggs y Paufeli, 1991). 
• Inmunoensayos: Constituyen un gran grupo de ensayos que dependen de la reacción antígeno-
anticuerpo. Estos ensayos incluyen los radioinmunoensayos y ELISA, estos últimos presentan la 
ventaja de no usar sustancias radioactivas en su desarrollo. Los ELISA tienen una sensibilidad 
desde 1 hasta 100 ppm y se aplican para detectar las impurezas que están presentes a bajas 
 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos
2
 
 
 
concentraciones y que no se obtienen por SDS-PAGE (Anicetti y colaboradores, 1986). 
Estos métodos son utilizados para la identificación y cuantificación de las proteínas de interés, así 
como para la cuantificación de impurezas, los cuales son incorporadas durante el proceso de 
producción. La cuantificación de proteínas que provienen de la célula hospedero se realiza mediante 
un ELISA multiantigénico, el cual requiere de un material de referencia representativo de estas 
impurezas. En este caso es importante producir los anticuerpos utilizando una corrida de producción 
sin la presencia del producto de interés (USP XXIV, 2002). 
Las técnicas de western-blot, inmuno-dot y ELISA son utilizadas para medir el nivel de contaminantes 
en el material purificado activo; ya sean contaminantes de la célula hospedera, agregados y productos 
de degradación derivados del propio producto como los niveles de anticuerpos de ratón, cuando en el 
proceso de purificación se hace uso de los anticuerpos monoclonales producidos a partir de ascitis de 
ratón (USP XXIV,2002). 
- Pruebas para la caracterización biológica del material activo. 
Las pruebas de caracterización biológica del material activo son una de las más importantes del 
producto. Estas garantizan que el producto final cumpla con la función biológica para la cual fue 
diseñada. 
• Actividad biológica: La actividad biológica se expresa por dosis o unidad. El ensayo debe 
ser realizado en comparación con un estándar de referencia internacional. En el trabajo 
de rutina se utilizan preparaciones de referencia de laboratorio calibradas con el estándar 
internacional. La determinación de la actividad específica es utilizada como criterio de 
pureza e integridad molecular (USP XXIV, 2002). 
• Inmunogenicidad: Si el producto se va a usar como vacuna, la potencia debe 
determinarse en términos de inmunogenicidad en animales experimentales adecuados. 
En este caso es necesario referir el valor de la potencia de la vacuna, a una vacuna 
estándar. Esto significa que ambas vacunas estándar y muestras se someten a ensayo 
bajo las mismas condiciones (USP XXIV, 2002). 
Los ensayos biológicos en anímales de experimentación adolecen de poca precisión y exactitud. Por 
tal motivo se realizan estudios de correlación entre los resultados obtenidos con pruebas 
fisicoquímicas y bioensayos realizados in vitro e in vivo, con el 
 
 
 
 
 
 
Revisión bibliográfica
2 
 
 
 
fin de evaluar su posible sustitución en los análisis de control de la calidad (Vranlx, 1983). 
Pruebas de Seguridad para Biológicos. 
Las pruebas de seguridad del producto se deben realizar independientemente del tipo de producto. Se 
puede plantear que el cumplimiento de las Buenas Prácticas de producción garantiza en gran medida 
que el producto pueda ser liberado por Esterilidad y pirógeno. En el caso de las pruebas de seguridad 
y estabilidad dependen fundamentalmente del desarrollo del producto. 
• Esterilidad: Esta prueba es aplicada a las sustancias y preparaciones que de acuerdo a la 
farmacopea debe ser estériles (European Pharmacopeia, 2002).Cuando la prueba es 
satisfactoria indica solamente que no se ha encontrado ningún microorganismo contaminante. 
• Pirogenicidad: Trazas o agentes como los microbios, sustancias pirogénicas, ácidos nucleicos 
y agentes tóxicos, pueden afectar la seguridad de los productos biológicos. Hay dos caminos 
para determinar la pirogenicidad: el ensayo en conejos y la prueba del LAL (lisado de limulus 
amebocitus, específico para endotoxinas bacterianas). Este método se utiliza 
fundamentalmente para el producto en forma de Materia Prima Activa Purificada. 
• Toxicidad anormal (seguridad): Este ensayo se realiza al preparado final y se lleva a cabo en 
dos especies de animales: en ratones y en curíeles. Un lote final del producto pasa la prueba 
si no aparece ninguna de las siguientes situaciones: presencia de cualquier síntoma anormal 
o tóxico que no sea específico del producto o no se espere del mismo, decremento o 
mantenimiento de la masa total de los ratones en ensayo o de la masa individual de cada 
curiel, muerte de alguno de los animales (USP XXIV, 2002). 
• Estabilidad'. Es la vida media del producto en las condiciones de almacenamiento. Se 
recomienda realizar ensayos de estabilidad como control para cada lote producido, 
manteniendoel producto por un tiempo a una determinada temperatura (37°C) y demostrar su 
estabilidad comparando los resultados de actividad biológica o potencia con el producto 
almacenado en condiciones óptimas (4°C). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos
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2. MATERIALES Y MÉTODOS 
2.1 Condiciones del cultivo celular 
Se empleó una línea celular de Células de Ovario de Hámster Chino desarrollada en el Centro de 
Ingeniería Genética y Biotecnología que expresa la Epohr. Los cultivos celulares se crecieron en 
frascos de 175 cm2 y 1750 cm2. Las células y la expresión de la proteína se mantuvieron en medio 
"Dulbeco". Cada frasco fue cosechado en tres ocasiones con tiempos de recuperación de los 
cultivos con 5 % de suero fetal bovino. Todas las cosechas se obtienen con medio líbre de suero 
(250 mL). Las cosechas se almacenaron en frascos a -20°C y luego se mezclan para su posterior 
purificación. 
2.2 Proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante a escala analítica 
a) Establecimiento de los parámetros de operación de la Cromatografía de 
Exclusión Molecular 
El estudio de los parámetros de operación se realizó mediante un diseño factorial 32. Se analizó la 
influencia de la velocidad lineal (X1 y de carga (X2) sobre el recobrado del proceso (Y1. Los valores 
límites de las variables y las variables codificadas se ilustran en la Tabla 2.1. 
 
Para realizar las corridas experimentales, se empacó una columna XK 26/60 (PHARMACIA, 
Suecia) con 160 mL de la matriz Sephadex G-25 (coarse). Esta columna fue equilibrada con 50 
mM de NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y se le aplicó los diferentes volúmenes del 
sobrenadante proveniente del cultivo (de acuerdo a la variante experimental), al cual se le añadió 
previamente 0.01 % de Tween 20. El flujo lineal de trabajo usado fue de 30 cm/h y el equipamiento 
consistió en una bomba peristáltica (BIORAD), un detector ultravioleta (PHARMACIA, Suecia) y un 
registrador (PHARMACIA, Suecia). Las muestras correspondientes a la fracción de proteínas se 
recolectaron hasta que la señal del registrador comenzara subir nuevamente.
Tabla 2.1. Valores límites y codificación de las variables en el diseño experimental de la del 
establecimiento de la C rom atoa rafia de Exclusión Molecular. 
Variables Límite inferior Límite superior Punto Central 
Codificación -1 1 0 
Carga (%) 10 30 20 
Velocidad lineal (cm/h) 10 30 20 
Materiales y Métodos
 
 
 
Para establecer la escala analítica final de la Cromatografía de Exclusión Molecular, se empacaron 
980 mL del gel Sephadex G-25 (PHARMACIA, Suecia) en una columna XK 50/60 (PHARMACIA, 
Suecia). Esta columna fue equilibrada con 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y se le aplicó 
250 mL del sobrenadante proveniente del cultivo, al cual se le añadió previamente 0.01 % de Tween 
20. El flujo lineal de trabajo usado fue de 30 cm/h y el equipamiento consistió en una bomba 
peristáltica (BIORAD), un detector UV (PHARMACIA) y un registrador (PHARMACIA, Suecia). 
El diseño experimental fue procesado mediante el análisis de regresión existente en el programa 
Statgraphics Plus. 
b) Establecimiento de la Cromatografía de Intercambio Iónico. 
Para realizar el estudio de determinación de la condición inicial de elusión se empacó 1 mL de la 
matriz Q-Sefarosa FF (PHARMACIA, Suecia) en una columna XK16/20. Esta fue equilibrada con el 
tampón 50 mM NaAc, 0,01 % Tween 20 a pH 5. Se realizó un lavado con el mismo tampón de 
equilibrio pero a pH 4. La elusión se realizó mediante un gradiente ascendente de NaCI, empleando 
como condición inicial el tampón de equilibrio y final el de equilibrio suplementado con 1 M de NaCI. 
El volumen total del gradiente fue de 20 mL y la velocidad lineal de trabajo fue de 100 cm/h. 
Las condiciones finales de la escala analítica se realizaron aplicando el eluato de la G- 25 a la 
columna XK 26/20 (PHARMACIA, Suecia) empacada con 5 mL del Q-Sefarosa FF (PHARMACIA, 
Suecia) y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % Tween 20 a pH 5. Este proceso fue 
realizado a temperatura ambiente. Seguidamente se realizó un lavado con el mismo tampón de 
equilibrio pero a pH 4. La elusión fue realizada con 50 mM NaAc, 75 mM NaCI a pH 5. El proceso fue 
controlado mediante un detector UV a 280 nm (PHARMACIA, Suecia) y un registrador gráfico 
(PHARMACIA, Suecia). Todos los eluentes fueron colectados hasta llegar a la línea base y el flujo 
lineal de trabajo fue de 100 cm/h. Este paso se realizó en un FPLC (PHARMACIA, Suecia). 
c) Establecimiento de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas 
Al producto de intercambio iónico se le añadió sulfato de amonio hasta una concentración final del 20 
% de saturación, se agitó hasta su completa disolución. Esta fracción fue aplicada a una columna XK 
10/20 (PHARMACIA) previamente empacada con 1 mL de TSK-Butilo-650 (S) (Tosohaas, Japón) y 
equilibrada con 50 mM NaAc, 20 % (NH4)2S04 a pH 5, a un flujo lineal de 50 cm/h. Un lavado fue 
realizado con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y la Epohr fue eluída de la 
columna con 50 % 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos
29
 
 
 
de Etanol a -20 °C Este material se dejó en reposo durante 2 horas. El equipamiento utilizado fue el 
mismo que el del paso anterior. 
Para realizar los estudios de agregación se trabajó con 0.5 mL de matriz en vez de 1 mL. Las 
condiciones de trabajo fueron las mismas que las descritas anteriormente. 
d) Establecimiento de la Precipitación etanólica. 
El producto de hidrofobicidad después de 2 horas en etanol al 50 % se sometió una precipitación al 90 
% de etanol y posteriormente se centrifugó a 12 000 rpm (rotor 20- 12) durante 15 minutos. El 
precipitado se resuspendió en tampón PBS (2,7 mM KCI, 0,25M NaCI, 7,9 mM Na2HP04, 1,7 mM 
KH2P04 pH 7) en el mismo volumen inicial. 
e) Establecimiento de la cromatografía de Filtración en Gel-HPLC. 
Los estudios de agregación se realizaron mediante Filtración en Gel-HPLC (HPLC- MERCK 
HITACHI), para lo cual se empleó una columna TSK 3000 PW, 7,5 x 600 mm, equilibrada con el 
tampón PBS. El volumen de muestra aplicada fue de 50 µL en todos los casos y el flujo de trabajo fue 
de 0,4 mL/min. La lectura fue realizada a una absorbancia de 226 nm (λ.). 
f) Estudio comparativo entre las diferentes Eritropoyetinas humanas recombinantes 
Se comparó la Epohr obtenida por el proceso de purificación desarrollado con las eritropoyetinas 
comerciales RECORMOM y EPREX en cuanto a su patrón de isoformas en la focalización 
isoeléctrica. Esta se desarrolló en el sistema Fast System utilizando el procedimiento descrito en 
“Focalización Isoeléctrica”. Se utilizaron bulbos comerciales de RECORMON y EPREX donde se 
consideró una concentración de 10 µg/mL. La Epohr de estos bulbos fue desalada y concentrada 
hasta 1mg/mL. 
2.3 Escalado del proceso de purificación. 
Todos los pasos del proceso de purificación analítico fueron escalados 56 veces, exceptuando la 
Cromatografía de Exclusión Molecular la cual se aumentó en 25,5 veces. 
A continuación se exponen todos los diseños del escalado realizado para cada paso cromatográfico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos
3
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2.2. Escalado en cuanto al volumen de muestra a procesar en el proceso de 
purificación de la Epohr del CIGB 
 Escala analítica Escala piloto 
Volumen de cosecha/lote 250 mL 14 L 
Tabla 2.3. Parámetros del escalado de la etapa de G-25 del proceso de purificación de la Epohr del 
CIGB. 
Parámetro Escala analítica Escala piloto 
Altura Lecho empacado 50 cm 80 cm 
Diámetro de la columna 5 cm 20 cm 
Flujo lineal 30 cm/h 30 cm/h 
Volumen del gel 980 mL 25 L 
Carga de la columna 25 25 
No. Corridas/lote 1 2-3 
Tabla 2.4. Parámetros del escalado de la etapa de intercambio iónico del proceso de purificación de 
la Epohr del CIGB 
Parámetro Escala analítica Escala piloto 
Altura Lecho empacado 1 cm 2,8 cm 
Diámetro de la columna 2,5 cm 11,3 cm 
Flujo