Diferenciación Genética en Pristimantis jubatus

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DIFERENCIACIÓN GENÉTICA MITOCONDRIAL EN POBLACIONES DE 
Pristimantis jubatus (ANURA: STRABOMANTIDAE) EN EL PARQUE 
NACIONAL NATURAL MUNCHIQUE, CORDILLERA OCCIDENTAL, COLOMBIA 
 
 
 
 
 
OSCAR EDUARDO OSPINA TOBÓN 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA MITOCONDRIAL EN POBLACIONES DE 
Pristimantis jubatus (ANURA: STRABOMANTIDAE) EN EL PARQUE 
NACIONAL NATURAL MUNCHIQUE, CORDILLERA OCCIDENTAL, COLOMBIA 
 
 
 
 
 
OSCAR EDUARDO OSPINA TOBÓN 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009
 ii 
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA MITOCONDRIAL EN POBLACIONES DE 
Pristimantis jubatus (ANURA: STRABOMANTIDAE) EN EL PARQUE 
NACIONAL NATURAL MUNCHIQUE, CORDILLERA OCCIDENTAL, COLOMBIA 
 
OSCAR EDUARDO OSPINA TOBÓN 
 
Proyecto de Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar 
al título de Biólogo con mención en Genética 
 
Director 
HEIBER CÁRDENAS HENAO 
Biólogo, M. Sc. 
 
Codirector 
JUAN CARLOS GARCÍA RAMIREZ 
Ecólogo M. Sc. Cand. 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009
 iii 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
 
 
 
OSCAR EDUARDO OSPINA TOBON, 1987 
 
 
 
 
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA MITOCONDRIAL EN POBLACIONES DE 
Pristimantis jubatus (ANURA: STRABOMANTIDAE) EN EL PARQUE NACIONAL 
NATURAL MUNCHIQUE, CORDILLERA OCCIDENTAL, COLOMBIA 
 
 
 
 
 
MATERIAS O TEMAS: Diversidad nucleotídica y haplotipica, Pristimantis jubatus, 
Citocromo Oxidasa I (COI), Parque Nacional Natural Munchique, diversidad 
críptica, Genética de Poblaciones, migración, tamaño poblacional
 iv 
NOTA DE APROBACIÓN 
 
El trabajo titulado “DIFERENCIACIÓN GENÉTICA MITOCONDRIAL EN 
POBLACIONES DE Pristimantis jubatus (ANURA: STRABOMANTIDAE) EN EL 
PARQUE NACIONAL NATURAL MUNCHIQUE, CORDILLERA OCCIDENTAL, 
COLOMBIA” presentado por el estudiante OSCAR EDUARDO OSPINA TOBON, 
para optar por el titulo de Biólogo con mención en Genética, fue revisado por el 
jurado y calificado como: 
 
 
Aprobado 
 
___________________________________ 
M. Sc. Heiber Cárdenas Henao 
Director 
 
___________________________________ 
M. Sc. cand. Juan Carlos García Ramírez 
Codirector 
 
___________________________________ 
Jurado
 v 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“A mi madre que me ha enseñado a vivir con 
sabiduría, a mi padre que ha sido ejemplo de 
vida en muchos aspectos y a la montaña por 
permitirme disfrutarla y mostrarme que es vivir.” 
 
 
 
 
 
 
Lo más maravilloso del ADN es su capacidad 
para equivocarse un poco. Si no tuviera ese 
atributo tan especial, todavía seriamos bacterias 
anaeróbicas y no existiría la música. 
-Lewis Thomas- 
 vi 
AGRADECIMIENTOS 
Es seguro que sin la ayuda de tantas personas, este trabajo no habría sido 
culminado. Debo empezar agradeciendo a mi madre Janeth Tobón, sin ella todo 
mi proceso habría sido casi imposible. A mi padre Luis Ospina por el apoyo que 
me ha brindado. A mis otros familiares, especialmente a mi Tía Francy Tobón por 
estar siempre al tanto de mis dificultades durante toda mi carrera. A la Bióloga y 
amiga Pamela Carvajal por su importante apoyo moral durante todo el trabajo que 
me permitía tomar aliento y seguir adelante. Mil gracias a mi codirector Juan 
Carlos García por ser más que un tutor, por ser un amigo. A Ángela Mendoza por 
trabajar hombro a hombro conmigo. Al Profesor Heiber Cárdenas por su apoyo, 
por sus importantes consejos académicos y de vida. 
 
Agradezco especialmente al Profesor Wilmar Bolivar por su importante ayuda 
científica. A Huber Pino, del PNN Munchique por facilitar el trabajo y acceso en la 
zona de estudio. Gracias a todos mis amigos de Biología porque de alguna 
manera han transformado positivamente mi manera de vivir, por compartir tantas 
experiencias que de seguro han sido constructivas y en su debido momento por 
los consejos respecto a esta investigación. Finalmente, agradezco al Grupo de 
Estudios Ecogenéticos y Biología Molecular y a la Universidad del Valle por 
financiar este proyecto.
 vii 
TABLA DE CONTENIDO 
Pagina 
1. RESUMEN…………………………………………………………………....... 1 
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….... 2 
3. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………. 7 
4. OBJETIVOS…………...………………………………………………………. 12 
4.1. Objetivo general………......……………………………..…………….. 12 
4.2. Objetivos específicos…..…………………………………………….... 12 
5. HIPOTESIS DE TRABAJO………..…………………….………………....… 12 
6. MATERIALES Y MÉTODOS……......………………………….……….....… 13 
6.1. Área de estudio………………..………...……………………......…… 13 
6.2. Descripción de la especie……………..…………………………....… 15 
6.3. Método de muestreo………………...………………………………... 17 
6.4. Trabajo de laboratorio…………………………………………….…… 18 
6.5. Análisis de datos………………………...…………………………….. 19 
7. RESULTADOS……………………………….……………………………...... 22 
7.1. Datos generales del muestreo……………...…….………....………. 22 
7.2. Diversidad genética………...……...………………………………..... 23 
7.3. Estructura genética y flujo génico………….....………………....….. 28 
7.4. Tamaño efectivo poblacional…………………………....………....... 30 
8. DISCUSION…………………………………………………….…………....... 31 
8.1. Diversidad genética……...……………………………………….…… 31 
8.2. Estructura genética…………....……………………………….....…… 37 
8.3. Tamaño efectivo poblacional…...…………………………………..... 39 
 viii 
9. CONCLUSIONES…………………………………………………….......…… 41 
10. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS……………………………….. 42 
11. LITERATURA CITADA……………………………………………………..... 43 
 ix 
LISTA DE FIGURAS 
Pagina 
FIGURA 1: Orden de los genes en el ADN mitocondrial de anfibios….…....… 6 
FIGURA 2: Localización del Parque Nacional Natural Munchique, 
Departamento del Cauca, Colombia…………………………..…… 14 
FIGURA 3: Zona boscosa del sector La Romelia, Parque Nacional Natural 
Munchique…………………………………………………………..… 15 
FIGURA 4: Exposición del cráneo donde se muestran las crestas de 
 P. jubatus…………………………………………………………….... 16 
FIGURA 5: Pristimantis jubatus, individuo colectado en el Parque Nacional 
Natural Munchique, Cauca – Colombia…………………………..... 17 
FIGURA 6: Mapa de la zona de muestreo donde se indican los tres 
 puntos de las poblaciones……………………………………...….... 18 
FIGURA 7: Sitios informativos marcados en azul de las 29 secuencias…...... 25 
FIGURA 8: Árbol construido con el método Neighbor-joining para todas 
 las secuencias…………………………………………………......…. 26 
FIGURA 9: Árbol construido con el método Neighbor-joining para todas 
 las secuencias excepto la muestra 134…………………………..... 27 
 x 
LISTA DE TABLAS 
Pagina 
TABLA 1: Datos ambientales con las desviaciones estándar (DV) 
en cada uno de los trayectos…………………………………......…… 22 
TABLA 2: Distancias entre cada trayecto de cada una de las 
poblaciones…………………………………………………………...… 22 
TABLA 3: Estimadores de diversidad genética para P. jubatus……...…....…. 24 
TABLA 4: Riqueza alélica después de rarefacción para n=6……………......… 28 
TABLA 5: Diversidad genética de cada una de las poblaciones……........…… 28 
TABLA 6: Estimadores de estructuración genética de las poblaciones…....… 29 
TABLA 7: Análisis de varianza para las 29 secuencias……………………....... 29 
TABLA 8: Análisis de varianza para todos los datos excepto la 
secuencia 134…………………………………………………….......… 30 
 1 
1. RESUMEN 
La diversidad y estructura genética de tres localidades en las que habita 
Pristimantis jubatus del Parque Nacional Natural Munchique (Cauca, Colombia) 
fue evaluada mediante el uso de secuencias del gen mitocondrial Citocromo 
Oxidasa subunidad I. Para estas localidades separadas entre si por 
aproximadamente 2.4 Km,se encontró una gran diversidad genética representada 
en cuatro haplotipos y una diversidad nucleotídica de 0.00629 que en la secuencia 
de aminoácidos constituían mutaciones sinónimas. Las tres poblaciones escogidas 
se comportaron como una unidad panmíctica, es decir, no se observó 
diferenciación genética y estructura poblacional significativa. La secuencia de la 
muestra 134 parece albergar alta diversidad críptica dado el alto grado de 
divergencia con respecto al resto de individuos. El grupo de datos de secuencias 
con la muestra 134 rechazo la hipótesis nula de neutralidad para la prueba de 
Tajima. Al excluirla, se reestableció la neutralidad en las secuencias. Los datos 
sugieren un tamaño efectivo poblacional muy grande comparable con los 
estimados en trabajos similares, reafirmando que en Terrarana las especies son 
muy abundantes aun cuando se trate, en muchos casos, de especies endémicas. 
La información plasmada en esta investigación tiene gran valor para el 
planteamiento de nuevas estrategias de conservación y mantenimiento de la gran 
diversidad genética existente en P. jubatus. 
 
PALABRAS CLAVE: Diversidad genética, estructura genética, ranas, tamaño 
poblacional, panmixia.
 2 
2. INTRODUCCION 
La diversidad de la vida soporta todo tipo de estudios biológicos pero también es 
un tema de difícil ocupación (Hebert et al. 2003a), más aun en el trópico donde la 
diversidad biológica es uno de los temas de discusión principal dado que aun no 
se conocen sus orígenes y la forma en como ha evolucionado. Se cree que la alta 
diversidad de especies en el trópico se debe a la reciente y rápida acumulación de 
estas por elevadas tasas de especiación (Richardson et al. 2001, Haffer 1969) o a 
la preservación de los diferentes grupos taxonómicos en el tiempo debido a bajas 
tasas de extinción (Fischer 1960). Estos patrones de especiación-extinción en el 
trópico pueden ser explicados en parte por la aparición de la Cordillera de los 
Andes, la emergencia del Istmo de Panamá y las fluctuaciones de vegetación y 
clima en el Pleistoceno (Wüster et al. 2005). Los procesos geológicos antes 
mencionados que podrían modular la gran cantidad de especies en el trópico han 
ocasionado que los grupos taxonómicos menores (e. g. género, especie) se 
diferencien genéticamente a escala local y diverjan mas allá del nivel de especie 
nominal (Garcia-Paris et al. 2000) presentando diferencias morfológicas, 
ecológicas, fisiológicas o de cualquier otro tipo que podrían dar lugar a diversidad 
críptica. 
 
Los anfibios son una muestra clara de la gran diversidad que existe en el trópico, y 
estudios genéticos y morfológicos en poblaciones de anfibios dan cuenta de ello. 
Solo en Suramérica y América Central existen aproximadamente 2750 especies 
de anfibios representando el 48% del total mundial (Young et al. 2004). Ha sido 
realmente difícil caracterizar y entender esta diversidad, especialmente la que 
 3 
existe en las ranas de desarrollo directo (o “eleutherodactilinas” sensu Lynch 
1971). Hedges et al. (2008) y Frost et al. (2006) estiman que existen 
aproximadamente 800 especies en este grupo del cual se conoce muy poco de 
sus relaciones filogenéticas y casi nada de la variación genética de las 
poblaciones. Uno de los géneros más grandes de este grupo es Pristimantis 
(Jiménez de la Espada 1871) incluyendo cerca de 400 especies (Hedges et al. 
2008). En Colombia, sobre los bosques de tierras altas y bajas, las ranas del 
género Pristimantis son el grupo más diverso de anfibios (Arroyo et al. 2005), no 
obstante, muchas de estas ranas no han sido descritas debido a que presentan 
una alta variabilidad fenotípica dentro de poblaciones y una escasa divergencia 
morfológica entre especies (Crawford & Smith 2005), por lo que la diversidad 
críptica sería un componente muy importante. 
 
En el Parque Nacional Natural Munchique ubicado sobre la Cordillera Occidental 
en el Departamento del Cauca, Colombia, los bosques de tierras altas presentan 
también numerosas especies pertenecientes a Pristimantis de las que no se 
conoce su diversidad genética intra e interpoblacional. Una de estas especies es 
la rana, Pristimantis jubatus (García & Lynch 2006) catalogada como NT (Near 
threatened = Casi amenazada) según la lista roja de la IUCN debido a la limitada 
distribución que presenta (al punto de considerarse endémica), por lo cual 
constituye un caso importante de partida para el entendimiento de la diversidad 
genética de las especies de ranas en Colombia. 
 
 4 
Estudiar las poblaciones de P. jubatus y su diversidad intra e interpoblacional 
mediante una aproximación genética, teniendo en cuenta la alta diversidad críptica 
que presenta Pristimantis y la evolución morfológica tan poco marcada que existe 
en los anfibios (Elmer et al. 2007a, Vences et al. 2005, Stuart et al. 2006, Bain et 
al. 2003), es de importancia primaria para cualquier estrategia de conservación 
(Driscoll 1998a, Alford & Richards 1999) especialmente cuando muchas especies 
anfibias se encuentran amenazadas y las poblaciones de anfibios en varios puntos 
el planeta presentan descensos significativos en su número de individuos. 
Colombia no ha sido la excepción, dado que allí también ha sido reportado tal 
fenómeno (Velásquez et al. 2008, Lynch & Grant 1998). Se cree que el cambio 
climático (Pounds & Crump 1994) y patógenos en áreas con niveles variables de 
intervención humana (Berger et al. 1998, Daszak et al. 2003) son agentes 
importantes en la extinción de las poblaciones de anfibios durante los últimos 
años, pero en muchos casos no se conocen las causas de este fenómeno (Stuart 
et al. 2004). Todos estos riesgos de extinción hacen de P. jubatus objeto clave 
para el análisis de su diversidad genética y de sus posibilidades de conservación a 
posteriori teniendo en cuenta que es una especie con distribución geográfica 
restringida, limitada básicamente en su localidad típica. 
 
Para aproximarse a la diversidad genética de P. jubatus, se puede tomar ventaja 
del hecho que toda esta gran diversidad está jerárquicamente estructurada y es 
posible estudiar la variación genética dentro de las poblaciones de esta especie, lo 
que permite obtener información considerable de la historia de este grupo y su 
región geográfica (Bermingham & Martin 1998, Berminghan & Avise 1986). Con 
 5 
este fin, una primera aproximación para entender la dinámica de poblaciones 
podría basarse en el estudio de ciertos fragmentos en el ADN mitocondrial 
(ADNmt), molécula que se hereda por vía uniparental y que permite indagar sobre 
la diversidad y estructura de las poblaciones (Hajibabaei et al. 2007). 
 
El gen de la enzima Citocromo Oxidasa Subunidad I (COI) presente en el ADNmt 
(Figura 1), tiene una evolución lo suficientemente rápida como para discriminar la 
evolución de especies cercanas a la vez que permite estudiar la variación dentro 
de las poblaciones de una especie (Hebert et al. 2003b), especialmente aquellas 
de evolución genética rápida como lo son las especies de anfibios (Vences et al. 
2005). Los estudios que usan la secuencia de COI contribuyen al entendimiento 
de la diferenciación de poblaciones (Futuyma 2003) y los procesos migratorios y 
vicariantes que afectan dichas unidades (Berminghan & Avise 1986). Estos 
fragmentos de ADN permiten también el desarrollo del “código de barras” (Hebert 
et al. 2003a, Hebert et al. 2003b) para especies como P. jubatus que podrían ser 
de difícil identificación morfológica. 
 
 6 
 
Figura 1. Orden de los genes en el ADN mitocondrial de anfibios. 
 
En esta investigación, mediante el uso de secuencias del gen mitocondrial 
Citocromo Oxidasa I se evaluó la diversidad y estructuración genética de tres 
poblaciones de P. jubatus. Este conocimiento permitirá tomar decisiones sobre las 
estrategias de conservación necesarias para una especie endémica del PNN 
Munchique.Las estimaciones de tamaño poblacional efectivo, tasas de migración 
y flujo génico consignadas aquí son importantes para conocer el estatus de la 
especie y predecir la tendencia de estas poblaciones. Adicionalmente, el análisis 
de la diversidad intraespecífica permite dilucidar la diversidad críptica o la 
plasticidad fenotípica que puede encontrarse en este grupo. La conservación de 
especies como P. jubatus promueve el interés por zonas involucradas en planes 
de conservación In situ como en el PNN Munchique. Ademas, esta investigación 
es pionera en el descubrimiento de la diversidad genética del grupo de ranas del 
genero Pristimantis en Colombia. 
 7 
3. MARCO TEORICO 
Conciente de la inmensa cantidad de ranas de desarrollo directo, Lynch (1971) 
intento agrupar las especies de ranas “leptodactiloides” conocidas en aquel 
momento (dentro de las cuales de agrupaban las especies de desarrollo directo) 
basado principalmente en caracteres osteológicos y musculares, obteniendo 60 
géneros que fueron repartidos en siete subfamilias. Cuatro de estas subfamilias 
(Ceratophryinae, Elosiinae, Leptodactylinae y Telmatobiinae) se encontraban en 
los trópicos. Lynch (1971) propuso que Telmatobiinae dio origen a las tribus 
Grypiscini y Eleutherodactylini; esta última a su vez contenía el género 
Eleutherodactylus que agrupaba gran parte de la diversidad de las ranas de 
desarrollo directo y que constituía un problema taxonómico importante para la 
herpetología. Aun sin resolver la taxonomía de Eleutherodactylus, Lynch (1976) 
propuso 10 grupos de especies de este género agrupados en cuatro “unidades 
infragenéricas” (1A, 1B, 2A y 2B). Sin embargo, las categorías antes mencionadas 
no parecían mostrar las relaciones evolutivas entre las especies, simplemente 
intentaban organizar la plétora de organismos como un aporte para facilitar su 
estudio sin ningún significado natural (Lynch 1976, Lynch & Duellman 1997). 
 
Un intento posterior para resolver la gran diversidad de Eleutherodactylus en las 
Indias Occidentales fue realizado por Hedges (1989) añadiendo al análisis 
morfológico, datos de electroforesis de la hemoglobina y la mioglobina. Con estos 
datos logró dar un poco mas de forma a lo resultados obtenidos por Lynch (1971, 
1976). No obstante, quedaban sueltas muchas discordancias entre los caracteres 
morfológicos aceptados en el momento y los datos de electroforesis. 
 8 
Los estudios anteriores llevaron a que el uso de aproximaciones genéticas y 
herramientas moleculares (y en algunos casos también morfológicas) fueran 
expandiéndose, lo que ha venido vislumbrando poco a poco la resolución del gran 
problema taxonómico que constituye Eleutherodactylus y sus relaciones 
evolutivas. Algunas de las respuestas al tema ha sido el agrupamiento de las 
especies de ranas “eleuterodactilinas” (sensu Lynch 1971) con Brachycephalidae 
en una sola familia mediante el uso de secuencias de ADN de las proteínas 
histonas, subunidades ribosomales 16S, 12S y caracteres morfológicos (Frost et 
al. 2006). No obstante, la gran diversidad de especies de este grupo de 
organismos hace necesario que la cantidad de especimenes muestreados para 
inferir filogenias, sea proporcional. Con un mayor número de individuos, Heinicke 
et al. (2007) retomaron los nombres de géneros Pristimantis, Craugastor y 
Eleutherodactylus para agrupar las especies de ranas “eleuterodactilinas” 
pertenecientes a los clados que habitan en Suramérica, América Central y el 
Caribe, respectivamente. Los grupos acuñados por Heinicke et al. (2007) fueron 
reafirmados por Hedges et al. (2008) basados en una gran cantidad de datos 
morfogenéticos, incluyéndolos en un nuevo taxón llamado Terrarana (que 
agruparía a las ranas de desarrollo directo). 
 
Sin la realización de todos estos estudios mencionados anteriormente que 
intentaban aportar a la resolución de la taxonomía y sistemática de las ranas de 
desarrollo directo, no podría abrirse lugar a escudriñar la diversidad genética y 
cripticismo que existe en las poblaciones de estas ranas y de otras especies no 
pertenecientes a Terrarana. De esta manera, estudios sobre Genética de 
 9 
poblaciones de anfibios han tomado gran fuerza debido a la necesidad de adquirir 
nuevos datos y conocimiento a cerca de las especies, que permitan planear 
estrategias de conservación. Estos estudios podrían definir unidades (e. g. 
poblaciones) fundamentales para la protección dada su diversidad genética, 
adicionalmente permitiría la identificación de otras especies que por sus 
características crípticas pueden estar bajo manejos inadecuados. Una muestra de 
la información que pueden arrojar los estudios poblacionales sobre su dinámica es 
el realizado por Karakousis & Kyriakopoulou (1995), el cual se basó en aloenzimas 
y mediciones morfométricas para poblaciones de Bufo viridis en el norte y centro 
de Grecia, encontrando poca diferenciación entre poblaciones de esta especie 
debido a altas tasas de migración. Para la especie Bufo bufo, Scribner et al. (2001) 
en Gran Bretaña mediante el uso de varios marcadores moleculares como 
aloenzimas, microsatélites y minisatélites se obtuvieron resultados similares. Esto 
tiene implicaciones en las medidas de conservación considerando la amplia 
distribución de las posibles variantes genéticas en el territorio estudiado. Vences 
et al. (2005) encontraron para la familia Mantellidae, divergencias intraespecíficas 
muy elevadas (10 a 14%) tanto a nivel intra como interpoblacional, debidas 
probablemente a una marcada estructuración filogeográfica de las especies con 
haplotipos característicos de las distintas subpoblaciones. 
 
En América, estudios similares a los de Frost et al (2006) y Hedges et al. (2008) 
en Terrarana apenas comienzan a desentrañar los aspectos poblacionales de 
estas ranas y sus posibles orígenes. Darst & Canatella (2004) con fragmentos de 
los genes 16S y 12S encontraron que el grupo hermano del género Craugastor 
 10
podría ser Brachycephalus. Para Physalaemus pustulosus estudiada con base en 
datos de aloenzimas y el gen Citocromo Oxidasa I (Weigt et al. 2005), se propuso 
que su expansión se debió a la formación del istmo de América Central. De 
manera similar, Elmer et al. (2007a, 2007b) basados en microsatélites y el gen 
mitocondrial Citocromo B (cytb) han argumentado que Pristimantis ockendeni 
posee una alta diversidad genética y que la divergencia de los clados que se 
encuentran diferenciados en la actualidad se dio en el mioceno y no fue producto 
de los refugios del pleistoceno. Garcia-Paris et al. (2000) estudiando salamandras 
(del género Bolitoglossa especialmente) llegaron a la conclusión que las 
poblaciones de este grupo presentan una gran diferenciación genética, ecológica y 
fisiológica que pudo contribuir a la divergencia morfológica y la formación de 
especies. 
 
Para el género Pristimantis, una buena cantidad de estudios se han realizado en 
América central, especialmente en Panamá. Las tasas de sustitución de 
nucleótidos para genes mitocondriales con respecto a nucleares ya han sido 
estimadas en este género (e. g. Crawford 2003a). Estudios como este han dado 
cabida a otros que correlacionan los tiempos de divergencia de estas especies con 
sus hábitats. Crawford & Smith (2005) utilizando marcadores genéticos 
mitocondriales y nucleares, lograron trazar las posibles rutas de migración de 
ranas del género Craugastor hacia América Central abriendo la posibilidad de 
ancestros independientes de América del Sur y del Norte. Para P. ridens, se 
encontró que el establecimiento de poblaciones del lado Caribe del Istmo de 
Panamá es reciente y provienen de poblaciones ancestrales del lado Pacifico 
 11
(Wang et al. 2008). El uso de genes mitocondriales (como el COI), también ha 
permitido realizar inferencias sobre los tamaños poblacionales y explicaciones 
sobre cómo el tipo de bosquetiene gran importancia en la dispersión de genes a 
largo plazo (Crawford 2003b; Crawford et al. 2007). En la actualidad P. jubatus 
(objeto de este estudio) ha sido pobremente estudiada y no se han hecho estudios 
en los que se realice un aporte al conocimiento de su diversidad genética y a la 
estructura poblacional.
 12
4. OBJETIVOS 
4.1. Objetivo general 
Caracterizar la diferenciación genética de tres poblaciones de Pristmantis jubatus 
en el Parque Nacional Natural Munchique. 
 
4.2. Objetivos específicos 
- Estimar la variación genética intrapoblacional e interpoblacional para P. jubatus 
mediante la comparación de secuencias del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I 
(COI). 
- Evaluar el grado de estructuración poblacional de P. jubatus a través del gen 
COI. 
 
5. HIPOTESIS DE TRABAJO 
Debido a la aparente separación geográfica de las tres poblaciones seleccionadas 
y por consiguiente, los grados variables de aislamiento reproductivo y flujo génico, 
las tres poblaciones de P. jubatus estudiadas en el suroccidente colombiano se 
comportan como unidades genéticamente distinguibles para el gen mitocondrial 
COI y por lo tanto, el origen materno de los individuos de una determinada 
población, será diferente, existiendo una posible estructura genética y un patrón 
de distribución de haplotipos correspondiente a la distribución geográfica de los 
individuos de cada población. 
 13
6. MATERIALES Y METODOS 
6.1. Área de estudio 
El PNN Munchique, se encuentra ubicado en el municipio de El Tambo (2° 21’ a 2° 
55’ Norte y 76° 51’ a 77° 10’ Oeste), Departamento del Cauca, Colombia, sobre la 
vertiente oeste de la Cordillera Occidental (Figura 2) y pertenece a la Región 
Biogeográfica del Chocó. Posee aproximadamente 44 484 ha y su altura varia 
entre los 500 msnm sobre el Litoral Pacifico hasta los 3107 msnm en el Cerro 
Santa Ana. Se pueden registrar temperaturas entre 5 °C y 27 °C y una humedad 
relativa promedio del 87%. La precipitación media anual alcanza valores 
superiores a los 4000 mm, presentando un patrón de lluvias unimodal-biestacional 
con los valores más bajos entre los meses de junio y agosto y los más altos entre 
octubre y diciembre (Acevedo 1994). En la zona, se puede observar un proceso de 
fragmentación del bosque debido a la construcción de las vías de acceso, tala de 
árboles para uso doméstico, venta de madera y adecuación de tierras para 
pastoreo y cultivos. Igualmente, dado el incremento de los cultivos ilícitos y la 
inmigración de personas provenientes de otras regiones se esta ejerciendo una 
gran presión sobre esta localidad (Garcia et al. 2005). 
 14
 
Figura 2. Localización del Parque Nacional Natural Munchique, Departamento del 
Cauca, Colombia. 
 
Los muestreos fueron realizados en el sector La Romelia localizado a 2600 msnm, 
corresponde a la zona de vida Bosque muy Húmedo Montano Bajo (Figura 3) 
conforme a Holdridge (1967), la zona permanece cubierta de una densa niebla 
registrándose una humedad relativa superior al 90%, una temperatura promedio 
de 15 ºC y una precipitación media anual cercana a 4000 mm (García et al. 2005). 
 
 15
 
Figura 3. Zona boscosa del sector La Romelia, Parque Nacional Natural 
Munchique. 
 
6.2. Descripción de la especie 
Pristimantis jubatus pertenece a la familia Strabomantidae (Hedges et al. 2008) y 
su localidad tipo es el PNN Munchique, sector La Romelia (Municipio de El Tambo, 
Cauca - Colombia) entre los 2550 y 2750 msnm. El nombre “jubatus” proviene del 
latín “crestado” y hace referencia a las crestas craneales que presenta esta 
especie (Figura 4), lo cual es considerado un carácter derivado (Lynch 2000). 
Lynch (1998) planteó la posibilidad de una cercanía filética entre P. kelephas y P. 
calcaratus. Posteriormente, García & Lynch (2006) argumentaron que P. jubatus y 
las dos especies antes mencionadas presentan distribución alopátrica (P. 
kelephus en la Serranía de Los Paraguas, P. calcaratus en Los Farallones de Cali 
y P. jubatus en Munchique), siendo estas posibles especies relacionadas en las 
cuales las pústulas dorsales pueden ser consideradas como una sinapomorfia. 
 
 16
 
Figura 4. Exposición del cráneo donde se muestran las crestas de P. jubatus. 
 
García & Lynch (2006) consideran que los alguno de los caracteres diagnósticos 
de P. jubatus son: dorso con algunas pústulas sobre el sacro, tímpano prominente, 
hocico redondeado en vista dorsal y lateral, canto rostral cóncavo y redondo, 
tubérculo cónico en el parpado superior, tubérculos ulnares subcónicos y por 
supuesto, las crestas craneales. En vida (Figura 5), presenta un rango de 
coloración del naranja al café, ocre o café crema, usualmente con un patrón en 
forma de W negro en el dorso, el vientre es crema o amarillo dorado con puntos 
marrones o gris. Esta especie se ha encontrado en bosque nublado con 
humedades relativas cercanas al 90%, localizada sobre la vegetación y bajo 
coberturas vegetales mayores al 80%. Se sugiere que la reproducción de esta 
especie es continua debido a la abundancia de juveniles que presentan sus 
poblaciones, hecho que podría explicarse por la humedad continua en los 
microhabitats y la ausencia de una estación totalmente seca permitiendo la 
supervivencia de las larvas (García & Lynch 2006). Según la IUCN, la clasificación 
en la Lista Roja es Near Threatened (NT, casi amenazada) debido a su pequeño 
Foto: García 
 17
rango de distribución, sin embargo, la información sobre esta especie es muy 
escasa. 
 
Figura 5. Pristimantis jubatus, individuo colectado en el Parque Nacional Natural 
Munchique, Cauca – Colombia. 
 
6.3. Método de muestreo 
La captura de individuos de P. jubatus se realizó usando la metodología descrita 
por Crump & Scott (1994) la cual se basa en encuentros visuales en interior de 
bosques. Previo a la colecta se trazaron tres trayectos de longitud variable (entre 
200 y 300 m) en tres puntos ubicados en el Sector La Romelia del PNN 
Munchique (Figura 6) conocidos como Observatorio (punto uno), Santa Ana (punto 
dos) y Charguayaco (punto tres) donde se habían definido las poblaciones 
separadas por una distancia promedio de 2.4 Km y entre las cuales se encontraba 
una carretera antigua que atraviesa el Parque con deslizamientos de tierra. El 
trabajo de colecta se llevó a cabo desde las 19:00 hasta las 00:00 horas. En cada 
trayecto se tomaron datos de humedad, temperatura ambiental (Higrotermómetro 
Oakton), temperatura del suelo (Termómetro Taylor), coordenadas, altitud (GPS 
Garmin E-Trex) y altura a la cual se encontraba el individuo en el bosque. 
Foto: García 
 18
 
Figura 6. Mapa de la zona de muestreo donde se indican los tres puntos de las 
poblaciones. 
 
Por cada población se colectaron no más de 13 de individuos, los cuales fueron 
sumergidos en una solución de Cloretone (2 cm3 de cloretone en 250 mL de agua) 
antes de realizar las disecciones pertinentes a la extracción del hígado y muslo. 
Los tejidos tomados de las ranas se colocaron en buffer de colecta (Tris-HCl 1 M, 
EDTA 0.5 M, NaCl 5 M y SDS al 20%) para la posterior extracción del ADN. 
 
6.4. Trabajo de laboratorio 
Para el análisis se usó el gen mitocondrial de la proteína Citocromo Oxidasa I 
(COI) cuya secuencia tiene una longitud aproximada de 658 nucleótidos. El ADN 
Imagen: García (Modificado) 
 19
fue extraído mediante el kit “Qiagen DNEasy” de Qiagen. La amplificación del gen 
anteriormente mencionado se realizó con los primers “forward-reverse”: 
 
HCO (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3') y 
LCO (5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3') 
 
El programa de amplificación consistió de un paso inicial de 3 min a 96 ºC; 35 
ciclos de 20 s a 92 ºC, 30 s a 52 ºC, 40 s a 72 ºC con extensión de 2 s cada ciclo y 
un paso final de 10 min a 72 ºC. Cada PCR contenía Buffer de Taq 1X (con KCl, 
proveído por Fermentas), MgCl2 2.5 mM, dNTPs 0.3 mM, 0.3 µM de cada primer 
(HCOy LCO), 0.63 U de Taq polimerasa (Fermentas) y 2 µL de ADN sin diluir (por 
cada reacción de20 µL). Los productos de PCR fueron purificados usando el kit 
“QIAquick PCR purification” de Qiagen, luego se enviaron a “Macrogen Corea” 
para su secuenciación. 
 
6.5. Análisis de datos 
Se estimaron los promedios y las desviaciones estándar para las temperaturas del 
aire y del suelo, la humedad relativa y altura a la cual se encontraban los 
individuos en la vegetación en cada uno de los trayectos. Las distancias entre 
cada trayecto se calcularon mediante la herramienta Geo Calculator del software 
DIVA-GIS. 
 
En total para todas las poblaciones se analizó el ADN de los tejidos de 29 
individuos de P. jubatus distribuidos así: 13 para la población uno, seis para la 
 20
población dos y 10 para la población tres. Las secuencias obtenidas fueron 
editadas mediante el software ChromasPro v. 1.42 (Technelysium Ltd) y alineadas 
usando MEGA v. 4.0.2 (Tamura et al. 2007). Con este mismo software se 
construyeron árboles usando las distancias genéticas de Tajima-Nei (Tajima & Nei 
1984) mediante el método de Neighbor-joining (Saitou & Nei 1987) y se revisaron 
las secuencias de aminoácidos en busca de mutaciones no sinónimas. 
 
Luego de la alineación y creación de árboles las secuencias fueron analizadas con 
el software DnaSP v. 5.00 (Rozas et al. 2003), se calculo la diversidad haplotípica 
(h), la diversidad nucleotídica (π, Nei & Li 1979), número de sitios segregantes, 
número de mutaciones y la tasa de mutación por sitio segregante (θw, Watterson 
1975). Con el fin de analizar si la variación encontrada era de carácter neutral se 
estimó el estadístico D mediante el “Test de Tajima” (Tajima 1989). Con el 
software Contrib 1.02 se obtuvo la riqueza alélica de las poblaciones después de 
rarefacción para conocer si el número de muestras era suficiente. 
 
Posteriormente se evaluó la diferenciación genética de las poblaciones con los 
estadisticos HST, KST (Hudson et al. 1992), Snn (Hudson 2000) y el FST redefinido 
para datos de secuencias de ADNmt, o NST (Lynch & Crease 1990). Mediante este 
último estimador se obtuvo el número de migrantes por generación Nm. Para 
reafirmar los valores de estructura poblacional se realizó un análisis de varianza 
Molecular o AMOVA (Excoffier et al. 1992) implementado en el software Arlequín 
3.11 (Excoffier et al. 2005). 
 21
Adicionalmente, con base en el modelo neutral de equilibrio (Kimura 1968), el 
tamaño poblacional efectivo de la especie fue estimado a partir de la siguiente 
fórmula: 
µ
θ
=
2
N We 
Donde µ es la tasa de mutación relativa, la cual ha sido estimada para Craugastor 
por Crawford (2003a).
 22
7. RESULTADOS 
7.1. Datos generales del muestreo 
Los individuos se encontraban sobre hojas, la temperatura del suelo estuvo 
alrededor de los 10.2 ºC mientras que la temperatura promedio registrada en el 
aire fluctuó entre 11.6 y 14.9 ºC acompañada de una humedad relativa promedio 
cercana al 93.7%. En la localidad llamada “Observatorio” donde se ubico el 
trayecto uno, se capturaron 13 individuos; seis individuos para el trayecto 2 en la 
localidad de “Santa Ana” y 10 capturas para el trayecto 3 en “Charguayaco” (Tabla 
1). 
 
Tabla 1. Datos ambientales con las desviaciones estándar (DV) en cada uno de 
los trayectos. 
Trayecto 
Temperatura 
prom. suelo 
(°C) 
Temperatura 
prom. del aire 
(°C) 
Humedad 
relativa prom. 
(%) 
Número de 
capturas 
1 10.0 (DV: 0.0) 11.6 (DV: 0.4) 97.3 (DV: 3,9) 13 
2 10.4 (DV: 0.5) 13.8 (DV: 1.0) 92.6 (DV: 2,4) 6 
3 10.2 (DV: 0.6) 14.9 (DV: 0.5) 91.3 (DV: 1,3) 10 
 
Las distancias entre cada una de las poblaciones (trayectos) definidas en este 
estudio se encontraron alrededor de los 2.4 Km (DV: 1.0). Las poblaciones más 
distantes fueron las 1 y 3 con una distancia de 3.4 Km y las mas cercanas fueron 
las 1 y 2 que distaban en 1.5 Km (Tabla 2). 
 
Tabla 2. Distancias entre cada trayecto de cada una de las poblaciones. 
Trayectos Distancia (Km) 
1 y 2 1.5 
1 y 3 3.4 
2 y 3 2.2 
 
 23
7.2. Diversidad genética 
Las secuencias tenían una longitud total de 616 nucleótidos después de la edición 
y el ensamble de ambos lados de la secuencia. La traducción desde el segundo 
nucleótido usando el código genético para vertebrados mostró que todas las 
mutaciones resultaron ser silenciosas. No se encontró ningún codón de parada ni 
gaps. 
 
El alineamiento mostró que en las 29 muestras existen cuatro haplotipos con una 
diversidad haplotipica (h) de 0.525 (DV: 0.087). De los 616 sitios, se hallaron 566 
sitios invariables y 50 sitios polimórficos. A partir de los sitios polimórficos se 
observó 48 singletons (sitios variables no informativos). Para todos los sitios 
polimórficos, se encontró un total de 51 mutaciones. La diversidad nucleotidica (π, 
Nei & Li 1979) o número promedio de diferencias por sitio entre dos secuencias 
fue de 0.00629 (DV: 0.00498). La tasa de mutación (θw) por sitio calculada con el 
método de Watterson (1975) con base en el número de sitios polimórficos fue de 
0.02067 (DV: 0.00694). Los estimados encontrados indican que existe alta 
diversidad nucleotídica y haplotípica para las 29 secuencias de P. jubatus. De 
acuerdo con el “Test de Tajima” (Tajima 1989) las mutaciones encontradas no 
eran de carácter neutral (D=-2.63306, P<0.001) (Tabla 3). 
 
Al excluir del análisis la secuencia 134 (Tabla 3), se obtuvo que de los 616 sitios 
analizados, 614 eran monomórficos. La diversidad de los tres haplotipos fue de 
0.489 (DV: 0.086). La diversidad nucleotídica (π) fue de 0.00085 (DV: 0.00018) y 
 24
la tasa de mutación (θw) por sitio de 0.00083 (DV: 0.00062). El “Test de Tajima” 
mostró que las mutaciones eran de tipo neutral (0.05092; P>0.10). 
 
Tabla 3. Estimadores de diversidad genética para P. jubatus. 
 Con muestra 134 Sin muestra 134 
Número de haplotipos 4 3 
Diversidad haplotipica (h) 0.525 (DV: 0.087) 0.489 (DV: 0.086) 
Sitios polimorficos 50 2 
Sitios informativos 2 2 
Diversidad nucleotidica (π) 0.00629 (DV: 0.00498) 0.00085 (DV: 0.00018) 
Tasa de mutación 0.02067 (DV: 0.00694) 0.00083 (DV: 0.00062) 
Test de Tajima (D) -2.63306 (P<0.001) 0.05092 (P>0.10) 
 
Para ambos análisis (con o sin la secuencia 134), dos sitios constituían sitios 
variables informativos en las posiciones 166 y 229. Los dos sitios variables 
informativos muestran aparentemente una transición entre una adenina y una 
guanina (Figura 7). 
 
 
 
 
 25
 
Figura 7. Sitios informativos marcados en azul de las 29 secuencias. 
 
Los árboles construidos con las distancias de Tajima-Nei (Tajima & Nei 1984) 
utilizando el método de Neighbor-joining (Saitou & Nei 1987) (Outgroup: P. hectus 
y P. brevifrons) mostraron que las secuencias se agrupaban por haplotipos pero 
no por poblaciones (Figura 8) 
 
 26
 
Figura 8. Árbol construido con el método Neighbor-joining para todas las 
secuencias. 
 27
Las gran diferencia de la muestra 134 con respecto a las otras se corroboró al 
observar la topología construida excluyendo dicha secuencia, de hecho, constituye 
un haplotipo diferente (Haplotipo 4). Sin embargo, en general la topología se 
conservaba cuando se retiraba la secuencia número 134 (Figura 9). 
 
Figura 9. Árbol construido con el método Neighbor-joining para todas las 
secuencias excepto la muestra 134. 
 28
La riqueza alélica después de rarefacción estimada mediante Contrib 1.02 para 
una muestra de seis individuos fue de 2.069 para la uno, 1.000 para la población 
dos, y 0.600 para la tres (Tabla 4). 
 
Tabla 4. Riqueza alélica después de rarefacción para n=6. 
 Población 
 1 2 3 
Alelos (Haplotipos) 4 2 2 
Riqueza alélica después de rarefacción 2.069 1.000 0.600 
 
7.3. Estructura genética y flujo génico 
Cada una de las tres poblaciones presentaba al menos una secuencia de los 
haplotipos dos y tres. Solo la población uno presentaba dos haplotipos privados(uno y cuatro) representados en las muestras 120, 133 y 134. Los datos revelan 
que la población 1 (con o sin la muestra 134) es la mas diversa (Tabla 5). 
 
Tabla 5. Diversidad genética de cada una de las poblaciones. 
Población 
Número 
haplotipos 
Div. Haplotipica (h) Div. nucleotidica (π) 
Sin muestra 134 3 0.62121 0.00116 1 
Con muestra 134 4 0.67949 0.01326 
2 2 0.60000 0.00097 
3 2 0.20000 0.00032 
 
Las poblaciones no mostraron estructuración genética basado en los estadísticos 
HST, KST (Hudson et al. 1992) y Snn (Hudson 2000) realizando una prueba de 
permutaciones para 1000 replicas (Tabla 6). 
 
 
 
 29
Tabla 6. Estimadores de estructuración genética de las poblaciones. 
 Estimador (Significancia) 
 HST KST Snn 
Con 134 0.0491 (0.1670ns) 0.0053 (0.1760ns) 0.3811 (0.1850ns) 
Sin 134 0.0516 (0.1650ns) 0.0404 (0.1890ns) 0.3810 (0.1850ns) 
 
Adicionalmente el estimador NST (Lynch & Crease 1990) mostró que tampoco 
existía estructuración genética entre las poblaciones (NST = 0.01209). Mediante el 
mismo estimador se tuvo que la tasa de migrantes por generación fue de 40.86. 
Sin la secuencia 134 el NST arrojo un valor de 0.07421. La estimación de la tasa de 
migrantes por generación fue de 6.24. 
 
El análisis de varianza molecular, AMOVA (Excoffier et al. 1992) corroboró la 
panmixia de las poblaciones con un FST = -0.03271 (Valor P = 0.65982 ± 0.01255). 
Adicionalmente se encontró que dentro de las poblaciones se encuentra el 100% 
de la variación (Tabla 7). 
 
Tabla 7. Análisis de varianza para las 29 secuencias. 
Fuente de 
variación 
g. l. 
Suma de 
cuadrados 
Componente 
de varianza 
Porcentaje de 
variación 
FST Valor P 
Entre 
poblaciones 
2 2.996 -0.06708 -3.27 -0.03271 
0.65982 
± 0.01255 
Dentro de 
poblaciones 
26 55.062 2.11777 103.27 
Total 28 58.058 2.05069 
 
Al realizar el análisis de varianza excluyendo la secuencia 134 se encontró 
igualmente que no existía estructura poblacional (FST = 0.05895; Valor P = 
0.19062 ± 0.00868). La variación entre poblaciones correspondió al 5.89% el 
 30
restante de la variación total (94.11%) fue explicado por la variación dentro de 
poblaciones (Tabla 8). 
 
Tabla 8. Análisis de varianza para todos los datos excepto la secuencia 134. 
Fuente de 
variación 
g. l. 
Suma de 
cuadrados 
Componente 
de varianza 
Porcentaje de 
variación 
FST Valor P 
Entre 
poblaciones 
2 0.792 0.01586 5.89 0.05895 
0.19062 
± 0.00868 
Dentro de 
poblaciones 
25 6.331 0.25325 94.11 
Total 27 7.123 0.26912 
 
7.4. Tamaño efectivo poblacional 
A partir de la tasa de mutación (θw) por sitio y el estimado de tasa de mutación 
relativa (µ = 19.65x10-9) basado en el gen mitocondrial ND2 efectuado por 
Crawford (2003a), se obtuvo que el tamaño poblacional teniendo en cuenta todas 
las secuencias fue de 5.26x105 individuos. Excluyendo la muestra 134 en el 
estimado de θw y con la misma tasa de mutación (µ) mencionada, se encontró que 
el tamaño poblacional fue de 2.11x104 individuos. 
 31
8. DISCUSION 
8.1. Diversidad genética 
En la población del “Observatorio” se obtuvo el mayor número de capturas, 
además se presentó la mayor humedad relativa (97.3%, DV: 3.9), lo cual podría 
brindar un microhabitat adecuado para esta especie (García & Lynch 2006). En las 
otras dos poblaciones que presentaban menor humedad relativa y mayor 
temperatura, se colectaron menos individuos, corroborando lo anterior. No 
obstante, el trayecto muestreado en la población de “Charguayaco” se encontraba 
sobre una quebrada, lo que pudo aumentar la cantidad de individuos colectados 
con respecto a la población de “Santa Ana”. La temperatura del suelo no pareció 
tener relación con la cantidad de individuos de P. jubatus dado que fue muy similar 
entre cada trayecto. 
 
Con el método de rarefacción, se pudo conocer si la cantidad de muestras 
obtenidas representaban una fracción significativa de la población (Acinas 2007). 
El estimado de riqueza alélica después de rarefacción determina el número de 
alelos diferentes encontrados cuando los haplotipos son muestreados en una 
población de tamaño fijo (Petit et al. 1998, Leberg 2002).Para las 29 secuencias, 
la riqueza alélica esperada (Petit et al. 1998) en una población de seis individuos 
es de 1.000, indicando que se pudo cubrir la diversidad existente ya que se 
encontraron dos o más haplotipos en cada población. Por lo tanto, el tamaño 
muestral fue aceptable para realizar las estimaciones necesarias en esta 
investigación. 
 
 32
Aunque las comparaciones interespecificas de los niveles de diversidad genética 
pueden ser poco informativas debido a las diferencias ecológicas, geográficas o 
de marcadores moleculares (especialmente en genes no homólogos), estos 
paralelismos no dejan de ser valiosos para poner en contexto los resultados de 
esta investigación y son elemento importante, por ejemplo, para la biogeografía 
comparativa dado que los patrones identificados independientemente entre taxa 
pueden ser usados para evaluar hipótesis evolutivas (Elmer et al. 2007b). 
 
En P. ockendeni se han encontrado diversidades de magnitud similar (h=0.4707, 
π= 0.00122) a las de este estudio, sin embargo, en el caso del estimado realizado 
por Elmer et al. (2007b) con el gen mitocondrial Citocromo b (cytb), se trataba de 
un número de secuencias mucho mayor al usado en esta investigación. 
Adicionalmente, Crawford (2003b) encontró que entre las especies Craugastor 
persimilis, C. bransfordii, C. polyptychus y C. stejnegerianus, la diversidad 
nucleotidica más alta (0.00749) la presentó esta última usando el gen mitocondrial 
NADH deshidrogenasa subunidad 2 (ND2) el cual es, igualmente, un estimado 
similar al encontrado para P. jubatus. Para especies de ranas no pertenecientes a 
Terrarana, como Rana luteiventris se encontró que la diversidad haplotipica del 
gen cytb oscilaba entre 0.64 y 0.93. La diversidad nucleotidica varió entre 0.0008 y 
0.0106. Lo anterior demuestra gran variación para las poblaciones de esta rana, 
que alcanzaban valores de diversidad genética extremadamente altos (Funk et al. 
2008). En el grupo Mantella betsileo se estimaron diversidades haplotipicas entre 
0.40 y 0.83, Vences et al. (2004) también argumentaron que se trataba de niveles 
altos de diversidad genética para el gen cytb. Las diferencias de los estudios 
 33
anteriormente citados con respecto a esta investigación deben observarse con 
precaución dado que este gen (cytb) parece presentar una alta diversidad en 
anfibios (Vences et al. 2004). 
 
Al igual que en los valores estimados de diversidad genética, también se 
encontraron altas tasas de mutación con respecto a las de otros estudios. Se 
observó que la tasa de mutación es concordante con la alta diversidad nucleotidica 
obtenida en las 29 secuencias de P. jubatus. El estimado de θw fue de 0.02067, un 
valor alto si se compara con los valores estimados por Crawford (2003b) para 
especies del genero Craugastor (C.persimilis, C. bransfordii, C. polyptychus y C. 
stejnegerianus) que oscilaban entre 0.00076 y 0.00983. 
 
Los datos de diversidad anteriormente citados son de magnitud similar a los 
estimados para P. jubatus. No obstante, tomando en cuenta que para esta 
investigación se consideró un número de secuencias menor, se puede decir que la 
diversidad genética para P. jubatus es bastante alta especialmente tratándose de 
una especie endémica. Adicionalmente el gen mitocondrial COI, usado en esta 
investigación, tiene una evolución lenta y muchos de sus cambios dan lugar a 
mutaciones sinónimas en la secuencia de aminoácidos (Goebel et al. 1999) como 
se pudo observar en esta investigación. Por lo tanto, esto también corrobora que 
en la especie estudiada tiene gran diversidad genética puesto que para un gen 
que presenta poco cambio, se encontró gran variación en secuencia en 
comparación con otros estudios en los que se usan genesde evolución más 
rápida. 
 34
El estudio realizado por Dixo et al. (2009) muestra que los procesos de 
fragmentación han tenido impacto en la variación genética de la especie Rhinella 
ornata, observando que para la región control del ADNmt, se encontró una 
diversidad haplotipica de 0.658 en fragmentos de bosque aislados y de 0.945 en 
un área control de bosque continuo. Además, la diversidad nucleotídica estimada 
en el mismo estudio varió de 0.018 en fragmentos, con algún grado de 
conectividad, hasta 0.009 para fragmentos con escasa conectividad. Una situación 
similar podría pasar con P. jubatus ya que aunque en la zona muestreada se ha 
conservado una buena cantidad de variabilidad genética, esta puede perderse por 
los procesos de fragmentación y deforestación que todavía son incipientes salvo la 
carretera que separa la localidad llamada “Observatorio” de las otras dos. 
 
Si se asumiera que el individuo 134 fuera otra especie (aunque morfológicamente 
es P. jubatus) dado que solo el responde por 48 de los 50 sitios polimorficos, las 
28 secuencias restantes aportan una buena cantidad de variación, si se tiene en 
cuenta que se trata de una especie hasta el momento endémica y que el gen 
estudiado presenta poca variabilidad, como se dijo anteriormente. En muchos 
linajes de anfibios es común encontrar diversidad críptica (Elmer & Cannatella 
2008), especies que morfológicamente son invariables pero no en otros aspectos. 
Dado que esta investigación es pionera, no fue posible confrontar las secuencias 
con otras en estudios de la misma especie y determinar si se trataba 
genéticamente de P. jubatus. Según Funk & Omland (2003), las especies crípticas 
pueden reflejar la retención de morfologías ancestrales o la evolución convergente 
 35
de morfologías similares. Para P. jubatus, establecer cual de las dos condiciones 
ha sido la más probable requeriría más estudios 
 
En cuanto al estimador D (Tajima 1989) se pudo observar que incluyendo la 
secuencia 134, las mutaciones no se encuentran bajo el modelo neutral y que 
presuntamente existe alguna presión de selección sobre esa secuencia. Sin 
embargo, debe tenerse en cuenta que este estimador depende de la cantidad 
promedio de mutaciones por sitio (Tajima 1989), por lo tanto, la muestra 134 daría 
lugar a una sobreestimación para la prueba de neutralidad. Esto puede 
corroborarse al observar que sin la muestra 134 se tiene neutralidad para los dos 
sitios informativos que tienen las 28 secuencias restantes. 
 
Claramente, apoyado en las topologías creadas por el método de Neighbor-
joining, se puede observar que la muestra 134 se aleja de los otros 
agrupamientos. Estos agrupamientos se dieron por haplotipo y no por población, lo 
que a primera vista estaría mostrando panmixia para las poblaciones escogidas en 
esta investigación. Esta condición de agrupamiento por haplotipo y no por 
población se conserva aun sin la muestra 134, lo que corrobora que no hay 
relación entre la ubicación geográfica de los individuos capturados y la distribución 
de los haplotipos. Al parecer, el haplotipo 1 ha derivado del haplotipo 2 dado que 
son similares excepto que para el primero hay un cambio de guanina por adenina 
en el sitio informativo número 166. Adicionalmente la topología corrobora este 
hecho debido a que la rama que agrupa el haplotipo 1 deriva de la que agrupa el 
haplotipo 2 y el primero se presenta en la muestra en menor frecuencia que el 
 36
segundo, lo cual parece ser común en eventos de aparición reciente de haplotipos 
(Wiltshire et al. 2003, Beck et al. 2000). Como se dijo anteriormente, la población 
del “Observatorio” presenta una gran diversidad ya que al observar la cantidad de 
haplotipos que son exclusivos para las poblaciones, esta población presenta 
exclusividad en el haplotipo 1 y el haplotipo 4 (representado en la secuencia 134). 
 
Esta gran diversidad genética en esta especie también puede afectarse por otros 
procesos diferentes a la fragmentación de bosques. Por ejemplo, la 
quitridiomicosis parece ser la causa del declive de muchas poblaciones de 
anfibios. En Colombia sobre la Cordillera Occidental, algunas observaciones de 
ranas muertas fueron realizadas por Lynch & Grant (1998) pero no se conocía la 
causa real de tal suceso. Hoy se conoce que tanto el clima como el agente 
causante de la quitridiomicosis (Batrachochytrium dendrobatidis) tienen 
importancia capital en observaciones como las citadas anteriormente. En la misma 
zona de las observaciones realizadas por Lynch & Grant (1998), tiempo después 
Velásquez et al. (2008) confirmó la presencia del hongo en poblaciones de 
anfibios como la causa de los descensos antes mencionados. Si bien, P. jubatus 
parece tener alta diversidad genética, también es una especie endémica que ante 
cambios en las presiones de selección sus poblaciones pueden reducirse 
dramáticamente perdiendo su plasticidad y capacidad de adaptación (Pounds & 
Crump 1994). En el PNN Munchique, no se han realizado estudios para la 
detección del hongo, sin embargo, cualquier introducción recurrente de este 
patógeno (ocasionado por ejemplo, por la llegada de personas de otras zonas) 
 37
permitiría la recombinación del material genético de nuevas cepas, como lo han 
sugerido Morgan et al. (2007), haciendo a este patógeno aun más peligroso. 
 
8.2. Estructura genética 
Cada una de las poblaciones estudiadas para P. jubatus presentaron diferentes 
estimados de diversidad genética. Ya se había dicho que la población del 
“Observatorio” presenta la mayor diversidad genética con o sin la secuencia 134. 
Adicionalmente, la población de “Charguayaco” tiene la menor diversidad genética. 
Estos datos que señalan diferencias entre las diversidades genéticas y los árboles 
que muestran la agrupación de secuencias solo por haplotipos, dan cuenta a 
primera vista de la poca o nula estructuración genética existente entre las 
poblaciones escogidas para este estudio. 
 
Ya que las poblaciones eran distantes, se esperaba que existiera estructura 
genética entre las poblaciones de P. jubatus escogidas. Sin embargo, todos lo 
estimadores usados en esta investigación mostraron que no hay tal condición, por 
el contrario, para el gen COI los datos dan cuenta de cruzamientos al azar entre 
los individuos de las localidades estudiadas. En ranas, existe gran variación en 
cuanto a la relación entre la distancia entre poblaciones y estructura genética se 
refiere. Para ranas pertenecientes a Craugastor, ampliamente distribuidas en 
Centro América, Crawford (2003b) observó marcada estructura genética para 
poblaciones alejadas entre si por 30 Km (o más) como era de esperarse para 
grandes distancias. Por otra parte, Driscoll (1998b) encontró en distancias más 
 38
pequeñas (2.5 a 7.5 Km) para dos especies del genero Geocrinia, estructura 
genética significativa. 
 
El análisis de varianza molecular (AMOVA) corrobora los estimados de los otros 
índices de estructura genética antes mencionados. Esto puede verse en que la 
mayor cantidad de variación se encontró dentro de las poblaciones y no entre 
poblaciones para los AMOVA con o sin la secuencia 134. Sin embargo, al 
observar el AMOVA sin la secuencia 134, el porcentaje de variación entre 
poblaciones sube casi a un 6% dando cuenta de la diferencia de haplotipos que 
hay entre cada par de poblaciones. Adicionalmente, se observa de nuevo que la 
diferencia de la muestra 134 es tan alta que ocasiona que toda la variación 
genética sea explicada dentro de las poblaciones. 
 
En general las especies de anfibios tienen poca vagilidad (Graham et al. 2004, 
Blaustein et al. 1994). Esto hace que en los grupos de poblaciones donde existe 
estructura genética, exista probabilidad de conservación de tal estado debido al 
bajo flujo génico. En Heleophryne natalensis encontraron tasas de migración de 
0.137 a 0.915 para poblaciones con estructuragenética (Grobler et al. 2003). Al 
contrario, Karakousis & Kyriakopoulou (1995) hallaron para la especie Bufo viridis 
una tasa de migración entre poblaciones menor que la encontrada en esta 
investigación, pero lo suficientemente significativa (Nm = 2.9) como para mostrar 
panmixia. En el caso de P. jubatus se pudo observar flujo génico de alta magnitud 
evidenciado por el número de migrantes por generación, lo que actualmente 
estaría dando cuenta de la escasa estructura genética encontrada. En anfibios, la 
 39
topografia compleja reduce la vagilidad (Elmer et al. 2007a) haciendo que se 
presenten adaptaciones a condiciones locales (Roberts et al. 2006). No obstante 
en otros casos como H. natalensis, ni siquiera existe relación geográfico-genética, 
ya que poblaciones muy distantes presentan flujo significativo y aquellas cercanas 
se encuentran aisladas (Grobler et al. 2003). La zona muestreada para P. jubatus 
parece ser lo suficientemente homogénea en sus condiciones ambientales como 
para permitir el flujo de individuos de una localidad a otra (aun cuando hubieran 
diferencias en el número de individuos colectados). 
 
Si la zona permite que el flujo genético y de migrantes no se vea obstruido como 
para estructurar las poblaciones, y adicionalmente, se evidenció gran diversidad 
genética, la población de P. jubatus podría tener gran potencial para su 
conservación. No obstante, información ecológica y de historia natural es 
necesaria para esta especie y en general para el grupo al cual pertenece 
 
8.3. Tamaño efectivo poblacional 
El tamaño efectivo de población (Ne) es aquel que representa a la población en 
cuestión en cuanto a sus propiedades genéticas (Wang 2005). En el estudio 
realizado por Crawford (2003b) este parámetro fue estimado para poblaciones de 
C. stejnegerianus y C. bransfordii dando como resultado 1.0×105 individuos y 
3.1×105 individuos, respectivamente. Crawford (2003b) consideró que se trataba 
de poblaciones muy grandes, cuyos estimados eran el resultado de la gran 
variación hallada en pequeñas áreas. 
 
 40
Los estimados de P. jubatus dieron resultados similares a los obtenidos por 
Crawford (2003b). Para una especie endémica como la de esta investigación, 
poblaciones tan grandes son un buen indicio del estado de esta especie. El 
tamaño poblacional de esta especie probablemente seria más grande dado que 
usualmente Ne es más pequeño que N (tamaño poblacional). Con el fin de no 
sobreestimar el tamaño efectivo y con cierto conservatismo, es más probable que 
el estimado realizado sin la muestra 134 sea el más acertado ya que la diversidad 
genética presentada por esta muestra podría disparar los valores de Ne, 
adicionalmente debe tenerse en cuenta que al incluir la secuencia 134, el Test de 
Tajima mostró no neutralidad para las mutaciones, violando los supuestos para la 
estimación de tamaño poblacional bajo el modelo neutral. Conocer el tamaño de 
población efectivo es de gran importancia para la conservación de esta especie ya 
que provee un estimado de cuantos individuos son relevantes para mantener la 
diversidad genética, que como se ha visto, hace de la población de P. jubatus 
aparentemente viable en el tiempo. Sin embargo, el estimado presentado aquí 
debe tomarse como una base para otras investigaciones, ya que Ne fue estimado 
con base en una tasa de mutación de un gen diferente al usado aquí. 
 41
9. CONCLUSIONES 
Los datos moleculares de las secuencias del gen COI soportan que las 
poblaciones escogidas para esta investigación constituyen realmente una sola 
población panmíctica que habita las localidades del “Observatorio”, “Santa Ana” y 
“Charguayaco”. Esta población tiene una gran diversidad genética que puede 
evidenciarse en los cuatro haplotipos encontrados y la alta diversidad nucleotídica 
hallada. El análisis de la diversidad genética sugiere la presencia de diversidad 
críptica dadas las diferencias en secuencia de la secuencia 134. 
 
La población de P. jubatus tiene un tamaño efectivo muy grande, concordante con 
las estimaciones realizadas en otros estudios realizados para otras especies. En 
general estas ranas tienen poblaciones muy grandes aun cuando estén 
restringidas a distribuciones pequeñas o endemismo. 
 
La información aquí plasmada sugiere que la población de P. jubatus estudiada 
podría ser un punto de partida viable en el tiempo para la conservación de esta 
especie. Este hecho esta apoyado en la gran diversidad genética neutral que se 
encontró y el gran tamaño efectivo, haciendo de esta población aparentemente 
saludable desde el punto de vista genético. 
 42
10. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS 
Esta investigación es pionera, ya que se desconoce de la diversidad genética del 
grupo de ranas más abundante en las montañas de Colombia. Por lo tanto, este 
estudio se constituye en una primera aproximación al entendimiento de la 
estructura genética de P. jubatus. 
 
Las conclusiones aquí presentadas están apoyadas en datos moleculares y 
aportan información significativa a la Biología de poblaciones de esta especie. Sin 
embargo, se recomienda que aspectos de fisiología y ecológicos de P. jubatus 
sean estudiados a fin de tener una visión holística de cómo se comportan las 
poblaciones de esta rana. Al combinar todos estos datos se consigue información 
valiosa para el manejo de esta especie y asegurar su viabilidad en el tiempo. Por 
el momento, los datos aquí presentados sugieren que para el manejo de esta 
población, las tres localidades tienen importancia en la representatividad de la 
diversidad genética. No obstante la localidad del “Observatorio” merece especial 
cuidado ya que allí se encontraron haplotipos únicos y la mayor diversidad 
genética. 
 
Se sugiere profundizar más en la diversidad críptica de esta especie ya que es 
posible que se puedan encontrar más haplotipos que contengan otras mutaciones. 
Por el momento seria muy apresurado sugerir otra especie para la secuencia 134 
solo con estos datos moleculares. Es necesario entonces ampliar la zona de 
muestreo y el número de genes analizados. 
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