3140-0415458

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EVALUACIÓN DE CEPAS DE LEVADURAS NATIVAS OBTENIDAS DE UN 
MOSTO DE PANELA ORIGINARIO DE LA FINCA EL RINCON, UBICADA EN 
EL MUNICIPIO DE OCAMONTE (SANTANDER DEL SUR) 
PARA POTENCIAL OBTENCION DE ETANOL 
 
 
 
 
 
 
 
LUISA FERNANDA CORTES CASTRO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
ABRIL DE 2009 
EVALUACIÓN DE CEPAS DE LEVADURAS NATIVAS OBTENIDAS DE UN 
MOSTO DE PANELA ORIGINARIO DE LA FINCA EL RINCON, UBICADA EN 
EL MUNICIPIO DE OCAMONTE (SANTANDER DEL SUR) 
PARA POTENCIAL OBTENCIÓN DE ETANOL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LUISA FERNANDA CORTES CASTRO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
ABRIL DE 2009 
EVALUACIÓN DE CEPAS DE LEVADURAS NATIVAS OBTENIDAS DE UN 
MOSTO DE PANELA ORIGINARIO DE LA FINCA EL RINCON, UBICADA EN 
EL MUNICIPIO DE OCAMONTE (SANTANDER DEL SUR) 
PARA POTENCIAL OBTENCION DE ETANOL 
 
 
 
 
 
LUISA FERNANDA CORTES CASTRO 
 
 
 
 
 
Trabajo de grado presentado como requisito 
parcial para optar al título de Bióloga 
 
 
 
 
 
 
DIRECTORA 
LUZ MARINA FLOREZ Ph.D 
Ing. Química 
Ph.D. Ciencias Químicas 
 
 
 
CODIRECTORA 
CELINA TORRES MSc 
Ing. Agrónoma 
MSc. Fitopatóloga 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
ABRIL DE 2009 
Agradecimientos 
 
 
Este logro es para Dios, quien me ha dado la vida y me ha dado la salud, gracias a 
Él y su infinita misericordia. Es Él quien rige mi vida y a Él le debo TODO 
 
A mis padres, por su constante ayuda, comprensión, apoyo y AMOR. 
Porque a pesar de los obstáculos siempre me brindaron palabras de aliento, me 
inculcaron que a pesar de los problemas debemos seguir adelante dando lo mejor 
de sí mismos y cumplir nuestras metas. Sin ellos, este trabajo no tendría el mismo 
sabor. 
 
A mi hermanita por su apoyo. Ella y su fortaleza son un ejemplo para mí. 
 
A Migue…mi asistente de laboratorio, mi amigo, mi apoyo, mi confidente, mi 
novio…sin ti, todas las noches de llanto y desesperación habrían sido tan duras, tu 
amor y compresión me dieron fuerzas para no desfallecer. 
 
A la profesora Luz Marina, por su dirección en la tesis, por su apoyo y por la gran 
oportunidad que me brindó cuando me abrió las puertas del la UAO y todos sus 
beneficios. 
 
A la Profesora Celina, quien me apoyó cuando decidí emprender este reto, y me 
brindó toda la asesoría necesaria. 
 
A Jóse Luis, ya que él fue el nexo que me acercó a esta oportunidad, tus 
consejos, enseñanzas y tranquilidad permitieron que esta tesis fuera una realidad. 
 
A Diana, por su ayuda y colaboración en el laboratorio de Biomédica de la UAO. 
Ella y sus gestiones fueron las que varias veces me sacaron de apuros. 
 
A mi Grupo Pastoral, por sus oraciones, apoyo y gran amor. 
 
A la Comunidad Emmanuel mi “Familia Espiritual”, porque sus oraciones también 
me permitieron alcanzar este logro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TABLA DE CONTENIDO 
Página 
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 1 
2. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………….. 4 
2.1. Levaduras………………………………………………………………….. 4 
2.1.1. Importancia de las levaduras……………………………………… 6 
2.1.2. Saccharomyces cerevisiae………………………………………… 7 
2.1.2.1. Requerimientos nutricionales……………………………… 10 
2.1.2.2. Requerimientos físico-químicos…………………………… 11 
2.1.2.3. Composición química………………………………………. 11 
2.1.3. Género cándida…………………………………………………….. 12 
2.1.3.1. Cándida guilliermondii……………………………………… 13 
2.2. La fermentación……………………………………………………………. 13 
2.2.1. Fermentación alcohólica…………………………………………… 14 
3. OBJETIVOS…………………………………………………………………….. 16 
3.1. Objetivo General…………………………………………………………… 16 
3.2. Objetivos específicos……………………………………………………… 16 
4. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………. 17 
4.1. Aislamiento y purificación de levaduras………………………………… 17 
4.1.1. Toma y tratamiento de muestra…………………………………… 17 
4.1.2. Caracterización morfológica y bioquímica……………………….. 17 
4.2. Estudio fisiológico…………………………………………………………. 18 
4.2.1. Cinética de crecimiento……………………………………………. 18 
4.2.2. Fermentaciones…………………………………………………….. 19 
4.3. Técnicas analíticas………………………………………………………… 19 
4.3.1. Conteo de células…………………………………………………... 19 
4.3.2. Turbidimetría…………………………………………………………. 20 
4.4. Expresión y manejo de resultados………………………………………. 20 
5. RESULTADOS 
5.1. Aislamiento de levaduras………………………………………………… 21 
5.2. Cinéticas de crecimiento…………………………………………………. 22 
5.2.1. Cálculo de la tasa de crecimiento………………………………… 23 
5.3. Manejo de Resultados……………………………………………………. 24 
6. DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 32 
7. CONCLUSIONES……………………………………………………………… 36 
8. RECOMENDACIONES……………………………………………………….. 37 
9. LITERATURA CITADA……………………………………………………….. 38 
ANEXO A……………………………………………………………………………. 41 
ANEXO B……………………………………………………………………………. 42 
ANEXO C……………………………………………………………………………. 43 
ANEXO D……………………………………………………………………………. 44 
ANEXO E…………………………………………………………………………….. 47 
ANEXO F…………………………………………………………………………….. 49 
ANEXO G…………………………………………………………………………….. 50 
LISTAS DE TABLAS 
Páginas 
TABLA 1: Clasificación taxonómica de Saccharomyces Cerevisiae………. 7 
TABLA 2: Características generales de las levaduras………………………. 8 
TABLA 3: Composición química de las levaduras en base seca…………… 11 
TABLA 4: Especies de levaduras identificadas, biocódigo 
 correspondiente y nomenclatura utilizada en el trabajo………… 21 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Páginas 
FIGURA 1: Ecuación de Gay-Lussac…………………………………………… 5 
FIGURA 2: Fases de crecimiento de un microorganismo…………………… 6 
FIGURA 3: Ruta metabólica de la fermentación alcohólica……………….… 10 
FIGURA 4: Diagrama de flujo de inoculación……………………………….… 19 
FIGURA 5: Cinéticas de crecimiento de las cepas aisladas………………… 22 
FIGURA 6: Curvas de crecimiento de las cepas aisladas…………………… 24 
FIGURA 7: Curva de crecimiento cepa B……………………………………… 25 
FIGURA 8: Linealización curva de crecimiento cepa B……………………… 25 
FIGURA 9: Comportamiento cepa B…………………………………………… 26 
FIGURA 10 Curva de crecimiento cepa b1……………………………………... 27 
FIGURA 11 Linealización curva de crecimiento cepa b1……………………… 27 
FIGURA 12 Comportamiento cepa b1…………………………………………… 28 
FIGURA 13 Curva de crecimiento cepa A4…………………………………….. 28 
FIGURA 14 Linealización curva de crecimiento cepa A4…………………….. 29 
FIGURA 15 Comportamiento cepa A4…………………………………………. 29 
FIGURA 16 Curva de crecimiento cepa Sc…………………………………… 30 
FIGURA 17 Linealización curva de crecimiento cepa Sc…………………… 30 
FIGURA 18 Comportamiento cepa Sc………………………………………… 31 
FIGURA 19 Comparativo de la D.O respecto al tiempo de las 4 cepas 
 Evaluadas…………………………………………………………… 31 
 
 
 
RESUMEN 
Los combustibles a partir de biomasa (biocombustibles) han sido denominados como la 
clave de una forma de energía renova ble para el transporte; En el área de la 
producción de bioetanol, la búsqueda de nuevas especies de microorganismos, al igual 
que novedosas materias primas y procesos de trasformación han venido 
desarrollándose con el tiempo. El siguiente trabajo se plantea dentro de la temática de 
nuevos microorganismos eficientes en la producción de etanol, para el caso, levaduras 
nativas aisladas directamente de mostos para la producción de bebidas artesanales a 
partir de la panela. Inicialmente se aislaron 16 cepas diferentes y se realizaron pruebas 
de asimilación de etanol, y de fermentación con campana de Durham. Se 
seleccionaron, las cepas con capacidad fermentativa y éstasfueron identificadas por 
pruebas de asimilación de carbohidratos ( API 20 BioMerieux) Se identificaron 2 
especies con capacidad potencial de producir Etanol: Saccharomyces cereviceae con 3 
biocódigos diferentes (2040072, 2040073, 2040032) y Candida guilliermondii. Se 
realizaron gráficas de crecimiento, y pruebas fermentativas con cada una de las 4 
levaduras habiéndose encontrado que 3 de ellas potencialmente pueden ser utilizadas 
en el proceso de producción de bioetanol ya que sus tiempos de duplicación son muy 
cortos y tienen buena producción de biomasa. 
 
 
 
1 
 
1. INTRODUCCION 
El crecimiento constante del consumo global de energía plantea problemas 
urgentes por resolver. Un tercio (1/3) del total de la demanda energética, la suple 
un grupo muy pequeño de países, lo que constituye un problema de seguridad 
energética para los países dependientes (Goldemberg, 2000) y más teniendo en 
cuenta que son fuentes no renovables. Por otro lado encontramos problemas de 
carácter ambiental, originados por el consumo de combustibles fósiles, entre los 
que se encuentran, la polución localizada del aire y los gases de efecto 
invernadero. Datos de 1994 hablan de una emisión de 77'104.000 toneladas de 
dióxido de carbono, de las cuales, el 71,8% procede de la quema de estos 
combustibles (Goldemberg, 2000). 
Un cambio climático drástico afectaría las costas de muchos países por el 
incremento de al menos un metro en el nivel del mar, y por variaciones en 
temperatura y precipitación. Un aumento de la temperatura de 1 a 2 grados 
significaría que el 50 por ciento del país sería vulnerable a cambios en sus fuentes 
de agua y la desaparición del 95 por ciento de los nevados, así como el 75 por 
ciento de sus páramos (El tiempo, julio 9 de 2004). Un posible camino para 
manejar estos problemas es el desarrollo de fuentes de energía limpias y 
sustentables (Hamelinck et al., 2005). 
La biomasa dinamiza en forma importante a la economía mundial. La agricultura y 
los productos de la industria agroforestal proveen de una gran cantidad de 
elementos para la alimentación, vestido, empaques y comunicaciones, en 
2 
 
categorías que van desde la materia prima en bruto hasta los subproductos 
químicos elaborados de gran valor (Carvalho et al., 2002; Carvalho et al., 2005) y 
es una fuente renovable de electricidad y combustibles, siendo una fuente de 
oferta económica, ambiental y de ventajas estratégicas (Wyman, 1996). 
En décadas pasadas la industria productora de etanol, se convirtió en sinónimo 
de “energía química” (Voit, 2002). Levaduras y otros microorganismos (por 
procesos fermentativos y/o procesos físicos y químicos) se utilizaron sobre gran 
cantidad de materiales, tanto de desecho como derivados de la producción 
agroindustrial y/o agroforestal, como sustratos para la producción de azúcares y 
subsecuentemente para la fermentación alcohólica. Dentro de los materiales 
usados más eficientemente para la fermentación alcohólica, se encuentran las 
melazas y los almidones (procedentes del maíz y la yuca, principalmente); junto 
con otra serie de elementos que han hecho parte de la historia de la producción de 
etanol como parte de las bebidas; la remolacha, las uvas y la papa. 
El proceso básico para la producción de alcohol a partir de azúcares, es realizado 
por microorganismos entre los que se hallan bacterias y levaduras. Dentro de las 
bacterias, la más novedosa en este uso es Zymomona mobilis y entre las 
levaduras, la gran mayoría pertenecen al género Saccharomyces. 
El metabolismo fermentativo de las levaduras, resulta una ventaja adaptativa para 
organismos básicamente aeróbicos (no estrictos); así, durante estrés anóxico, las 
levaduras pueden regenerar el NAD+ utilizado durante el proceso de glucólisis, sin 
el cual no podrían seguir esta vía metabólica. (Mathews, 2002) 
3 
 
El alcohol que se produce a partir de la caña de azúcar utiliza para su 
fermentación un microorganismo que ha presentado problemas ya que no se ha 
adaptado bien a diferentes substratos, lo que afecta el rendimiento de la reacción. 
Su manejo ha sido difícil y no se conoce mucho acerca de su manejo y 
condiciones que la afectan. 
A este problema se suma que no hay muchas ofertas de levaduras fermentadoras 
en el país a pesar de su gran utilización en procesos de fermentación casera como 
“el guarapo”. Por lo tanto, es de suma importancia empezar a conocer, 
caracterizar, aislar y purificar cepas nativas adaptadas a nuestro medio, que 
puedan tener un alto potencial fermentativo. 
Este trabajo de investigación se propuso caracterizar cepas de levaduras con el 
objetivo de verificar cual o cuales de ellas tienen gran capacidad fermentativa que 
se adapten a nuestro ecosistema tropical, de rápido crecimiento y alta producción 
de biomasa para su potencial producción de etanol. 
La hipótesis que se planteó en este trabajo de investigación fue encontrar 
diferencias en el comportamiento de las levaduras aisladas y caracterizadas a 
partir de un mosto de panela en relación al potencial de producción de etanol. 
 
 
 
 
4 
 
2. MARCO TEORICO 
2.1. Levaduras 
Las levaduras son microorganismos Eucariotes ubicados en el Phylum de los 
ascomicetos; típicamente se encuentran de forma unicelular pero pueden 
presentarse como asociaciones celulares o en forma filamentosa en algún estado 
de su crecimiento. La reproducción se da por fisión binaria, gemación o 
sexualmente. Las células son ovoides y sus tamaños varían desde algunas micras 
hasta 25-30 micras. (Herrera, 1990) 
Se diferencian de las bacterias por tener la estructura típica de un Eucariote: un 
citoplasma con organelos similares a organismos vegetales superiores no 
fotosintéticos (mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplasmático, ribosomas, 
vacuolas, gránulos de reserva y un núcleo delimitado por una membrana). Las 
células además están protegidas por una pared rígida, son microorganismos 
carentes de movilidad. 
Durante su desarrollo necesitan compuestos carbonados y nitrogenados para 
sintetizar sus proteínas y ácidos nucléicos. Toda levadura degrada glucosa, 
fructosa y manosa en presencia de oxigeno, por medio de un metabolismo 
oxidativo produciendo dióxido de carbono y vapor de agua; esta vía es muy 
energética y permite a las levaduras multiplicarse. Algunas pueden degradar, 
además, glucósidos por un metabolismo fermentativo que conduce a la producción 
de CO2 y Etanol en ausencia de Oxigeno. (Figura 1) 
 
5 
 
 
Figura 1. Ecuación de Gay – Lussac (Leveau, 2000) 
En el metabolismo glucosídico de las levaduras, vale la pena destacar los efectos 
Crabtree y Pasteur. El primero es la represión de la respiración en presencia de 
oxigeno causada por un aumento en la concentración lo que provoca un descenso 
en el consumo de oxigeno y un aumento en la producción de etanol. El segundo, 
es la activación del catabolismo glucosídico en ausencia de oxigeno. (Bourgeois, 
1991). 
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido 
ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y 
vitivinícola, así como por su capacidad de producir etanol. 
Este microorganismo muestra 4 fases de crecimiento bien definidas cuando se 
cultiva en medio líquido con glucosa como fuente de carbono: la fase latencia, la 
fase exponencial, fase estacionaria y la fase de muerte celular (Madigan, 2003) 
(Figura 2); la fase lag es un periodo de adaptación en el cual la célula se prepara 
para dividirse (Tortora, 1986). 
C6H12O6 2CH3CH3OH+2CO2 
6 
 
 
Figura 2. Fases de crecimiento de un microorganismo (Madigan, 2000). 
 
Durante la fase logarítmica las células alcanzan su máxima velocidad de 
duplicación y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce 
etanol. Al disminuir la concentración de glucosa, las células atraviesan por la fase 
estacionaria y sepresenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no 
hay división celular. En esta fase, las células acumulan carbohidratos de reserva 
como trehalosa y glucógeno (Madigan, 2000). 
2.1.1. Importancia de las Levaduras. 
 Las levaduras han sido utilizadas por el hombre desde hace varios milenios, 
algunas veces sin saberlo, en particular en la fabricación de bebidas alcoholizadas 
y pan. Sólo con los trabajos de Pasteur, al final del siglo pasado, se puso en 
evidencia la importancia de estos microorganismos. 
Su fácil cultivo y la inocuidad de un gran número de especies de levaduras han 
hecho de éstos, los microorganismos más estudiados para producir bebidas, pan, 
fuente de proteínas y vitaminas en alimentación animal y humana. Su buen 
7 
 
conocimiento permitió la producción de proteínas como la hormona de 
crecimiento y la vacuna contra la hepatitis B (Bourgeois, 1991). 
2.1.2. Saccharomyces cerevisiae 
Saccharomyces cerevisiae es la especie de levaduras utilizada por excelencia 
para la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo 
de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no 
presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación 
produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas 
concentraciones de azúcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y 
características de floculación y sedimentación para el procesamiento posterior 
(Carballo, 2000). La clasificación taxonómica de la levadura se observa en la 
Tabla 1. 
Tabla 1. Clasificación Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae. 
Dominio Eukaria 
Reino Fungi 
Phylum Ascomycota 
Clase Ascomycetes 
Subclase Hemiascomycetidae 
Orden Endomycetales 
Familia Sacchaomycetaceae
Subfamilia Saccharomycetaidae
Genero Saccharomyces 
Especie Cerevisiae 
 Fuente: (Carballo, 2000). 
8 
 
Las levaduras, son organismos eucarióticos unicelulares, por lo tanto sus 
estructuras se encuentran formadas por pared celular, núcleo diferenciado y 
organelos como ribosomas y mitocondrias; la formación de una cápsula de 
polisacáridos, la ausencia o presencia de vacuolas y el desarrollo de las 39 
mitocondrias dependen de las condiciones fisicoquímicas y de la edad del cultivo 
(Tuite y Oliver 1991). Las características generales de las levaduras se resumen 
en la Tabla 2. 
Tabla 2. Características generales de las levaduras 
CARACTERISTICAS VALORES 
Dimensiones 4 – 8 Micras
Tiempo de Duplicación 1 – 3 Horas 
pH (rango óptimo) 4,5 – 5,5 
Nitrógeno 7,5 – 8,5 % 
Proteína 35 – 40 % 
Ácidos Nucléicos 6 – 12 % 
Carbohidratos 30 – 45 % 
Fuente: Ospina y Palacios, 1994. 
Saccharomyces cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o 
blanco, apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares. La temperatura 
óptima de crecimiento es de 25 a 30ºC. Puede producir ascosporas cuando hay 
requerimientos nutricionales adecuados. 
Sus dimensiones son: 2.5 – 10 micras de ancho y 4.5 – 21 micras de largo. 
Microscópicamente se observan redondas y ovoides, elipsoides, a veces 
9 
 
cilíndricas y filamentosas, fermentan glucosa, galactosa, sacarosa y maltosa y no 
fermenta lactosa. Asimila galactosa, sacarosa, maltosa y rafinosa. La aireación 
óptima es de 0.6 – 0.9 vvm (volúmenes de aire por volúmenes de líquido por 
minuto) (Ariza y González, 1997). 
El nombre de Saccharomyces significa azúcar de hongos. Producen una 
fermentación vigorosa y es conocida como la levadura de la cerveza, sirve como 
fuente de enzimas (invertasa), como extracto de levadura autolisado para sustituir 
los sabores naturales del extracto de carne, hace fermentar la masa del pan, 
interviene en la fabricación del vino y como fuente de proteína, vacunas, ácidos 
grasos y aceites (Ariza y González, 1997). 
La reproducción vegetativa ocurre por mecanismos multilaterales: los 
pseudomicelios pueden ser formados por algunas especies, pero presenta 
ausencia de hifas verdaderas. En presencia del O2 las cepas pueden metabolizar 
oxidativamente sustratos como glicerol, etanol y lactato (Yepez, 1995). 
Saccharomyces cerevisiae, realizan fermentación alcohólica, en la cual el etanol 
es formado a partir de la D-Glucosa; éste azúcar es convertido en piruvato por la 
vía de Embden- Meyerhof Parnas en la cual el piruvato es descarboxilado a 
acetaldehído por la piruvato descarboxilasa y el acetaldehído reducido finalmente 
a etanol (Halasz y Laszlity, 1991) (Figura 3). Ruta Metabólica completa (ANEXO 
G) (Madigan, 2000). 
10 
 
Figura 3. Ruta Metabólica de la fermentación alcohólica 
2.1.2.1. Requerimientos nutricionales 
Saccharomyces cerevisiae requiere ciertos nutrientes y condiciones ambientales 
para su apropiado crecimiento y reproducción. Algunos elementos son 
básicamente necesarios como por ejemplo carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno 
y fósforo (Ospina y Palacios, 1994). 
El carbono sirve como fuente de energía y como material constitutivo de la masa 
celular. El nitrógeno se encuentra en la célula formando parte esencial de las 
proteínas, aminoácidos y ácidos nucléicos; el fósforo se encuentra en los ácidos 
nucléicos, en la lecitina y en diversos compuestos fosforilados que participan 
activamente en los procesos de degradación oxidativa y de intercambio energético 
(ATP, ADP, AMP, NADP). Para que las fuentes de Nitrógeno, Fósforo y Carbono 
11 
 
presentes en el sustrato sean aprovechados por la levadura se requiere que se 
encuentren en forma asimilable (Ospina y Palacios, 1994). 
2.1.2.2. Requerimientos físico-químicos 
El crecimiento de S. cerevisiae se ve favorecido por un pH próximo a 4.0 – 5.0 y 
no se desarrollan bien en medio alcalino a menos que se hayan adaptado al 
mismo. A pesar de la tolerancia bastante amplia de esta levadura para las 
variaciones de pH a partir de los sustratos habitualmente usados en los medios 
de cultivo, forman productos en especial ácidos que influyen en el crecimiento 
celular, producción enzimática y utilización de glucosa. Así por ejemplo, algunas 
investigaciones han observado que con un pH inicial del medio a valores entre 4.0 
y 4.5 se obtiene mejor crecimiento y utilización de glucosa (Tuite y Oliver, 1991). 
2.1.2.3. Composición química 
Las levaduras contienen un 75% de agua y un 25% de materia seca 
aproximadamente. La composición de la materia seca de la levadura se presenta 
en la Tabla 3. 
Tabla 3. Composición química de las levaduras en base seca 
COMPONENTES PORCENTAJE (%)
Ceniza 7 
Carbohidratos 43 
Proteína 48 
Grasa 2 
Fuente: Haehn, 1991. 
12 
 
Las sustancias minerales de las levaduras representan por lo general un 5 – 9% 
del peso seco. Los componentes principales son ácido fosfórico, alrededor del 
50% y potasio del 30% (Haehn, 1991). 
Las sustancias nitrogenadas de la levadura representan unas dos terceras partes 
de su peso seco (30 – 75%), contienen entre 5 y 12% de Nitrógeno (Castellanos, 
1991). Estas sustancias se reparten en un 64% de proteína, 10% de peptonas y 
aminoácidos, 8% de amonio, 10% de purina y el resto consiste en pirimidinas y 
vitaminas. El contenido normal de aminoácidos 43 depende de la alimentación, de 
la cantidad de oxígeno, de la temperatura del cultivo, etc. (Tuite y Oliver, 1991). 
2.1.3. Género Cándida 
El género Cándida es la causa más común de micosis oportunistas de todo el 
mundo. También es un colonizador frecuente de la piel y las mucosas. Cándida es 
un miembro de la flora normal de la piel, la boca, la vagina, y heces. Además de 
ser un agente patógeno y un colonizador, que se encuentra en el medio ambiente, 
especialmente en las hojas, flores, agua y suelo. Aunque la mayoría de las 
especies de Cándida tienen estados anamorfos, se han conocido algunas con 
estados teleomorfos (Sutton, 1998) 
El género Cándida incluye alrededor de 154 especies. 
En el Congo, se realizó un estudio de la flora implicada enla producción de etanol 
durante el “Rouissage” (incubación de las raíces de yuca en agua, realizada con el 
fin de eliminar los compuestos cianogénicos de los tubérculos); se encontraron 
13 
 
levaduras del género Cándida como las responsables de la producción de etanol. 
Éste género compone la flora típica de las fermentaciones alimentarias (Dufour, 
1992). 
2.1.3.1. Cándida guilliermondii 
Las colonias de Candida guilliermondii son planas, húmedas, suaves y con una 
superficie levemente amarilla (Larone, 1995). Microscópicamente se pueden 
observar formaciones de pseudohyfas y pseudomicelio. En Corn Meal Agar se 
pueden observar pequeñas blastosporas. 
Es una especie que se ha utilizado para la producción de xilitol. (Barbosa, 1988) 
2.2. La fermentación 
Desde el punto de vista bioquímico, la fermentación es un proceso catabólico que 
ocurre básicamente en ausencia de oxígeno. Aquí hay que hacer una aclaración, 
pues existen también las denominadas fermentaciones oxidativas (o “falsas” 
fermentaciones), donde aunque el oxígeno juega un papel importante, la cadena 
respiratoria no lo hace. Este proceso catabólico está constituido por reacciones 
biológicas de oxido-reducción con la producción concomitante de energía en forma 
térmica (esta catálisis es exergónica) y química (ATP y NADPH). Debido a la 
ausencia de oxígeno como aceptor final de electrones este papel lo cumplen 
compuestos orgánicos; esta degradación de sustratos orgánicos suele incluir vías 
catabólicas bien definidas, como en el caso de los glúcidos, donde vía glucólisis se 
obtienen los intermediarios para el paso final de la fermentación alcohólica o 
14 
 
láctica. Cuando esta catálisis da lugar a sustancias alcalinas tiene por nombre 
putrefacción. 
Existe una condición básica para que una sustancia sea fermentable y es su 
capacidad para producir compuestos intermedios oxidables y reducibles, es decir, 
no puede ser ni muy oxidada ni muy reducida. Un ejemplo muy bueno de este tipo 
de compuestos y el que más es usado por los organismos fermentadores, son los 
azúcares. (Arellano, 2001; Mathews, 2001) 
Durante las fermentaciones se puede generar un rendimiento energético, y es de 
hecho una fuente de energía celular, no tan eficiente como la respiración en los 
organismos aerobios, pues el rendimiento en ATP es mayor en el proceso 
respiratorio. En los organismos que pueden operar su metabolismo 
facultativamente en ausencia de oxígeno, la fermentación constituye una ventaja 
adaptativa. 
2.2.1. Fermentación alcohólica 
En condiciones anaeróbicas en las levaduras y como resultado de la evolución 
adaptativa, el NAD+ se regenera a través de la transformación de piruvato en 
etanol; esta transformación da lugar a la fermentación alcohólica. El piruvato 
proviene de la ruta de la glucólisis. El proceso de producción de etanol posterior a 
la obtención del piruvato consta de dos reacciones enzimáticas, produciendo 
además CO2 y calor, lo que da originalmente por resultado la denominación de 
fermentación por su “hervir” (burbujeo por el CO2) (Kollerlup, 1995). 
15 
 
En virtud de las anteriores consideraciones bibliográficas, el presente proyecto se 
orientó hacia el estudio de nuevas cepas de levadura con potencial utilización para 
producción de Etanol. 
 
16 
 
3. OBJETIVOS 
3.1. Objetivo General 
Evaluar microbiológicamente las cepas de levaduras obtenidas de un mosto de 
panela para la potencial obtención de etanol. 
3.2. Objetivos Específicos 
3.2.1. Aislar y purificar las cepas de levaduras presentes en el mosto de panela. 
3.2.2. Determinar diferencias entre las cepas de mayor rendimiento en relación 
con la biomasa producida. 
3.2.3. A partir de los datos obtenidos seleccionar, la o las cepas óptimas para la 
potencial producción de etanol a partir de glucosa. 
 
 
17 
 
4. MATERIALES Y METODOS 
Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en el laboratorio de 
Biotecnología y de Ingeniería Biomédica de la Universidad Autónoma de 
Occidente. Con el apoyo del Grupo de Investigación en Biocombustibles 
(GRUBIOC). 
4.1. Aislamiento y purificación de levaduras 
4.1.1. Toma y tratamiento de muestra 
La muestra inicial de mosto, se tomó de un trapiche ubicado en el Departamento 
de Santander, Localidad de Ocamonte, Finca el Rincón, en un recipiente de vidrio 
estéril y sellado. 
Se realizaron diluciones del mosto original de 10-5, 10-6, 10-7 con agua destilada 
estéril. De éstas diluciones se realizaron siembras en cajas de Petri con Agar 
Malta (Anexo A) y antibiótico (Clorferanicol), para evitar crecimiento bacteriano. 
Para inocular cada caja de Petri se añadieron 0.1 mL de las soluciones anteriores 
y se homogenizó utilizando perlas de vidrio estériles. Las cajas se incubaron a 
30°C por 48 horas. 
4.1.2. Caracterización morfológica y bioquímica 
Se aislaron colonias cuya nomenclatura fue por orden de aislamiento con 
similaridad en morfología. (Anexo B) 
18 
 
Una vez obtenidas las diversas colonias puras se seleccionaron 7 para ser 
caracterizadas. Esta selección se basó en dos criterios: Prueba de fermentación 
en campana de Durham y prueba de asimilación de Etanol (Anexo C). Aquellas 
cepas que tenían buena producción de CO2 y que no asimilaban Etanol, fueron las 
escogidas. 
Finalmente se enviaron al Laboratorio de Microbiología de la Universidad del Valle, 
donde se realizaron la identificación de las levaduras por medio de las galerías de 
identificación API 20 C BioMerieux, método utilizado para la identificación de 
levaduras de interés clínico (Anexo D). 
4.2. Estudio fisiológico 
4.2.1. Cinéticas de crecimiento 
El medio de cultivo utilizado para las cinéticas de crecimiento fue YPD (Anexo A) 
La esterilización se realizó a 120°C por 20 minutos. 
La cepa utilizada fue cultivada previamente en un erlenmeyer de 250 mL con un 
volumen de medio de cultivo de 100 mL e incubada por 18 horas a 33°C para su 
activación. Posteriormente, se realizó otro inóculo similar al primero, se agregó 
1ml del inóculo inicial y se incubó en las mismas condiciones. El segundo inóculo 
se utilizó para inocular el medio de cultivo final. (Figura 4) 
19 
 
 
Figura 4. Diagrama de flujo de inoculación. 
La cepa fue cultivada por 20 horas sobre una plancha de calentamiento y agitación 
a una velocidad de 100 rpm y una temperatura de 33°C en un erlenmeyer de 
500 mL conteniendo 300 mL de medio de cultivo. 
Se tomaron muestras cada hora y se midieron parámetros de evaluación de 
biomasa y turbidimetría. 
4.2.2. Fermentaciones 
Se realizó el mismo procedimiento inicial para las cinéticas de crecimiento. 
La cepa fue cultivada por 48 horas sobre una plancha de calentamiento y agitación 
con una velocidad de 900 rpm por las primeras 12 horas, las siguientes 36 horas 
la velocidad disminuyó a 100rpm y una temperatura de 33°C en un erlenmeyer de 
1000 mL conteniendo 300 mL de medio de cultivo. 
Se tomaron muestras las primeras 12 horas, se selló el erlenmeyer para garantizar 
así un estado de total anaerobia y se midieron parámetros de evaluación de 
turbidimetría. 
 
20 
 
4.3. Técnicas analíticas 
4.3.1. Conteo de Células 
El número de células fue obtenido por conteo a partir de una dilución de células y 
tinción simple con azul de metileno sobre una cámara de Neubauer. (Anexo E) 
4.3.2. Turbidimetría 
La absorbancia de las muestras fue medida en un espectrofotómetro Thermo 
Genesys 10 UV a una longitud de onda de 650 nm. 
3.4. Expresión y manejo de resultados 
Se realizó una grafica que relacionara los datos de turbidimetría con el número de 
células transformado en Log10; se linealizó y se reemplazaron los datos de 
turbidimetría obtenidos en las fermentaciones finales, y por extrapolación, se 
hallaron los datos de biomasa en dichas pruebas. 
21 
 
5. RESULTADOS 
5.1. Aislamiento de levaduras 
De la muestra inicial se aislaron 16 levaduras, alas cuales se les realizaron 
pruebas confirmativas de fermentación en campana de Durham y asimilación de 
etanol. 
Finalmente se seleccionaron 7 levaduras y se enviaron al Laboratorio de 
Microbiología de la Universidad del Valle, donde se realizó el estudio de las 
levaduras por medio de las galerías de identificación API 20 C BioMerieux, método 
utilizado para la identificación de levaduras de interés clínico. (Anexo D). 
Se identificaron 2 especies de levaduras. Saccharomyces cerevisiae (con 3 
biocódigos diferentes) y Candida guilliermondii (Anexo F), en total cuatro 
levaduras, las 3 restantes se repetían con algunas de las 4 seleccionadas. 
La nomenclatura utilizada para cada una de las levaduras seleccionadas se 
remonta al inicio de la parte experimental y se relaciona con las especies y el 
biocódigo según la identificación API 20C, en la Tabla 4. 
 
Tabla 4. Especies de levaduras identificadas, biocódigo correspondiente y 
nomenclatura utilizada en el trabajo. 
Especie de levadura Biocódigo Nomenclatura 
Saccharomyces cerevisiae 2040072 B 
Saccharomyces cerevisiae 2040073 A4 
Saccharomyces cerevisiae 2040032 b1 
Candida Guilliermondii 6776373 Sc 
 
 
22 
 
5.2. Cinéticas de crecimiento 
Las condiciones de crecimiento para las cinéticas se basaron en la temperatura 
óptima de las levaduras y sus requerimientos nutricionales. 
El estudio cinético de cada una de las cepas se puede observar en la Figura 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura Cinéticas de crecimiento de las cepas aisladas (a).Cepa A4, (b).Cepa B, 
(c). Cepa b1, (d). Cepa Sc 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Cinéticas de crecimiento de las cepas aisladas (a).Cepa A4, (b).Cepa B, 
(c).Cepa b1, (d).Cepa Sc 
 
 
(b) 
 
 
 
 
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0 10 20 30
D
.O
 (6
50
 n
m
)
# 
C
ls
 L
og
 1
0
Tiempo (Horas) Biomasa
Absorvancia
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0 10 20 30
D
.O
 (6
50
 n
m
)
# 
C
ls
 L
og
 1
0
Tiempo (Horas) 
Biomasa
Absorvancia
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0 5 10 15 20 25
D
.O
 (6
50
 n
m
)
# 
C
ls
 L
og
 1
0
Tiempo (Horas)
Biomasa
Absorvancia
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 5 10 15
D
.O
 (6
50
 n
m
)
# 
C
ls
 L
og
 1
0
Tiempo (Horas) Biomasa
Absorvancia
(a) 
(c) (d) 
(b) 
23 
 
5.2.1. Cálculo de la tasa de crecimiento. 
El crecimiento de una población microbiana se puede representar por: 
 
La velocidad especifica de crecimiento o tasa de crecimiento µ (h-1), es constante 
durante la fase de crecimiento exponencial y corresponde a la pendiente del 
gráfico semilogarítmico de la fase exponencial: 
 
Relacionado con µ, existe otro parámetro importante que es el tiempo de 
duplicación. Éste se define como el intervalo de tiempo entre dos duplicaciones 
sucesivas: 
 
En la Figura 6. Se puede observar la curva de crecimiento de las cuatro diferentes 
cepas con su tiempo de duplicación respectivo. 
Obsérvese la diferencia entre las cepas del Género Saccharomyces y el Género 
Cándida. El tiempo de duplicación de las cepas del género Saccharomyces no 
sobrepasa las 2 horas, a diferencia de la cepa del género Cándida, cuyo tiempo de 
duplicación es de 3,02 horas. 
 
 
µ = dx/dt
µ = dLnD.O/dt
td = Ln2/µ 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Curvas de crecimiento de las cepas aisladas (a).Cepa A4, (b).Cepa B, 
(c).Cepa b1, (d).Cepa Sc. 
 
5.3. Manejo de resultados 
En las Figuras 7, 10, 13, 16 se observa la curva de crecimiento de la cepa B, b1, 
A4 y Sc respectivamente en donde se compara el número de células en Log10 
(Biomasa) con la densidad óptica (Absorbancia 650nm). 
 
 
 
y = 0,5556x - 5,1606
R² = 0,9855
-5,000
-4,000
-3,000
-2,000
-1,000
0,000
1,000
0 10 20 30
Ln
 D
.O
 (6
50
nm
)
Tiempo (Horas)
μ=0,5556 h-1
td=1.24 h
y = 0,504x - 5,1467
R² = 0,9863
-5,00
-4,00
-3,00
-2,00
-1,00
0,00
1,00
0 5 10 15 20 25
Ln
 D
.O
 (6
50
nm
)
Tiempo (Horas)
μ=0,504 h-1
td=1.37 h
y = 0,4422x - 4,557
R² = 0,9927
-4,5
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
0 5 10 15 20 25
Ln
 D
.O
 (6
50
nm
)
Tiempo (Horas)
μ=0,4422 h-1
td=1.56 h
y = 0,2295x - 5,13
R² = 0,9329
-6,00
-5,00
-4,00
-3,00
-2,00
-1,00
0,00
0 5 10 15
Ln
 D
.O
 (6
50
nm
)
Tiempo (Horas)
μ=0,2295 h-1
td=3.02 h
(a) (b) 
(c) 
(d) 
25 
 
 
 Figura 7. Curva de crecimiento cepa B. 
Para la óptima linealización de la curva de crecimiento, y ya que las cepas 
presentan dos comportamientos distintos, se linealizaron por separado. Las dos 
linealizaciones de cada cepa, se observan en la figura 8, figura 11, figura 14, 
figura 17. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Linealización curva crecimiento cepa B. (a) Primera parte, (b) Segunda 
parte 
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
# 
ce
lu
la
s 
(L
og
10
)
D.O (650 nm)
(b) (a) 
y = 11,934x + 2,3854
R² = 0,9385
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080
# 
ce
lu
la
s 
(L
og
10
)
D.O (650 nm)
y = 1,3331x + 3,073
R² = 0,9789
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,500 1,000 1,500
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
26 
 
Con la regresión linear obtenida, en su ecuación, reemplazamos el valor de X con 
los valores de D.O, resultado de las fermentaciones finales. 
En las figuras 9, 12, 15, 18, se observa el comportamiento de las cepas en las 
pruebas de fermentación finales. La figura 9(a), 12(a), 15(a), 18 (a), muestra el 
comportamiento de las cepas en relación del tiempo; mientras que en las figuras 
9(b), 12(b), 15 (b), 18(b), se puede observar el comportamiento de las cepas con 
relación al número de muestras, representando el mismo comportamiento con un 
eje X diferente, ya que a pesar de que no es viable de que las muestras estén en 
el eje x, se observa mejor el comportamiento de la cepa. 
En la Figura 19 se observa el comportamiento de las 4 cepas simultáneamente y 
se observa claramente la diferencia en el aumento de la D.O que existe entre los 
Géneros de Saccharomyces y Cándida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Comportamiento cepa B. (a) En relación al tiempo. (b) en relación con el 
número de muestra 
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 20 40 60
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Tiempo (Horas)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 5 10 15
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Muestra
(a) (b) 
27 
 
 
 
 Figura 10. Curva de crecimiento cepa b1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 11. Linealización curva crecimiento cepa b1. (a) Primera parte, 
 (b) segunda parte 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
 
y = 20,23x + 2,027
R² = 0,9118
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
) 
D.O (650 nm)
y = 1,1284x + 3,3198
R² = 0,9385
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650nm)
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Comportamiento cepa b1. (a) En relación al tiempo. (b) en relación con 
el número de muestra 
 
 
 
Figura 13. Curva de crecimiento cepa A4. 
 
 
 
 
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650nm)
 
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 10 20 30 40 50 60
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Tiempo (Horas)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 5 10 15
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Tiempo (Horas)
29 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Linealización curva crecimiento cepa A4. (a) Primera parte, (b) 
segunda parte 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Comportamiento cepa A4. (a) En relación al tiempo. (b) en relación con 
el número de muestra 
 
 
y = 11,017x + 2,2913
R² = 0,9511
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
y = 0,9393x + 3,5515
R² = 0,9442
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
 
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 60
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Tiempo (Horas)
0
2
4
6
8
10
12
14
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Muestra
30 
 
 
Figura 16. Curva de crecimiento cepa Sc. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17. Linealización curva crecimiento cepa Sc (a) Primera parte, (b) 
segunda parte 
 
 
 
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm) 
Cepa Sc Completa
y = 47,825x + 2,0097
R² = 0,8338
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0,000 0,010 0,020 0,030
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
y = 5,3839x + 3,2144
R² = 0,9748
3,30
3,40
3,50
3,60
3,70
3,80
3,90
0,000 0,050 0,100 0,150
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
D.O (650 nm)
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 18. Comportamiento cepa Sc. (a) En relación al tiempo. (b) en relación con 
el número de muestra 
 
 
Figura 19. Comparativo de la D.O con respecto al tiempo de las 4 cepas 
evaluadas 
 
 
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0 2 4 6 8 10 12 14
D
.O
 (6
50
nm
)
Tiempo (Horas)
B
b1
A4
Sc
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0 20 40 60
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Tiempo
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0 5 10 15
# 
C
él
ul
as
 (L
og
10
)
Muestra
32 
 
6. DISCUSION 
El mosto de panela realizado en la región de Ocaña, se obtiene a partir de la 
fermentación del guarapo de caña (jugo de la caña de azúcar) y la panela, 
teniendo ambos productos alto contenido de azucares lo cual favorece el 
crecimiento varios microorganismos de levaduras entre ellas del género 
Saccharomyces y Cándida; ya que éstas levaduras se encuentran 
frecuentemente asociadas a hojas, flores, frutos y suelos. (Sutton, 1998) Y 
componen la flora típica de las fermentaciones alimentarias (Dufour, 1992) 
Saccharomyces cerevisiae es la levadura por excelencia asociada a la producción 
de alcohol, interviene en la producción del vino y la cerveza gracias a su 
metabolismo fermentativo. (Madigan, 2000) 
El género Cándida también ha sido reportado en la producción de etanol durante 
el “Rouissage” (incubación de raíces de yuca en agua para eliminar los 
compuestos cianogénicos) en el Congo. (Dufour, 1992) 
Entre las cepas que se aislaron se encontraron 3 tipos diferentes de 
Saccharomyces cerevisiae basándose en los biocódigos obtenidos de la 
identificación por medio del kit API 20C, ya que asimilan diferentes tipos de 
azucares. (Anexo D). 
En fermentaciones industriales alcohólicas, se utiliza esta especie de levadura o 
especies similares de la misma (Madigan, 2000) 
33 
 
En las Figura 5 se relaciona la absorbancia y la biomasa en escala logarítmica en 
base 10, en función del tiempo. Esto permite observar los dos comportamientos 
simultáneamente. 
En las cepas A4, B, y b1 el comportamiento de la absorbancia se ajusta a la grafica 
de crecimiento de un microorganismo (Figura 2) una fase de adaptación corta, 
fase exponencial pronunciada y fase estacionaria. No se observa la fase de 
muerte celular. Mientras que en la cepa Sc, presenta una fase de latencia 
prolongada, y una fase logarítmica lenta y no se observa fase estacionaria, ni 
muerte celular. Lo anterior debido a que solo se pudieron obtener datos las 12 
primeras horas ya que la levadura después de este tiempo se inactivaba y no 
había incremento en los valores de absorbancia ni conteo celular. 
En la Figura 6 se observa la curva de crecimiento de las cepas, y se observa, la 
tasa de crecimiento obtenida por medio de la regresión lineal del logaritmo natural 
de la densidad óptica con respecto al tiempo. 
La fase exponencial de la cepa A4 dura 9 horas, y después su crecimiento se 
detiene. Su tiempo de duplicación corresponde a 1,24 h y es la cepa con el menor 
tiempo de duplicación. Esta cepa podría tener una gran capacidad de producción 
de etanol, por su tiempo de duplicación, alcanza una gran cantidad de biomasa en 
muy poco tiempo. Lo cual, al modificar su metabolismo en anaerobiosis, esa gran 
cantidad de biomasa me podría garantizar alta producción de etanol. 
La fase exponencial de la cepa B dura 10 horas, y después su crecimiento se 
detiene. Su tiempo de duplicación corresponde a 1,37 h. Y la fase exponencial de 
34 
 
la cepa b1 dura 10 horas, y después su crecimiento se detiene su tiempo de 
duplicación corresponde a 1,56 h; Éstas cepas también tienen buena producción 
de biomasa. 
La fase exponencial de la cepa Sc (Candida guilliermondii) dura 11 horas, sin 
embargo no es un crecimiento exponencial pronunciado, y no se observa si su 
crecimiento se detiene. Su tiempo de duplicación corresponde a 3,02 h y es la 
cepa con el mayor tiempo de duplicación. Sin embargo esto es característico de 
éste género, ya que en estudios previos de para producción de xilitol (Carvalho, 
2002) esta cepa tiene el mismo crecimiento lento. 
Con los datos de las cinéticas de crecimiento, se graficó una curva de crecimiento 
con la absorbancia máxima de 0,9 ya que valores mayores no son viables 
(Saucedo, 1991). Para esto, se 
Para la linealización era necesario separar las graficas según su comportamiento 
ya que una linealización más ajustada explicaba mejor el comportamiento de cada 
cepa en relación con la D.O. 
De acuerdo a la ecuación obtenida, se aplicaba a la absorbancia de las 
fermentaciones finales. Con esto se pudo extrapolar la biomasa producida. 
En las cepas A4, B y b1 el tiempo que se encontraban en anaerobiosis era un 
tiempo en donde mermaba el crecimiento y se espera una alta producción de 
etanol (Prescott, 2002); al contrario que con la cepa Sc, pues su etapa 
exponencial se evidenció en el estado de anaerobiosis, eso indica que en 
35 
 
condiciones anaerobias no modifica su metabolismo para producción de etanol si 
no para reproducirse. El comportamiento de ésta cepa en todas las pruebas fue el 
mismo, independientemente de la fuente de Carbono que utilizáramos (Glucosa - 
Xilosa). 
36 
 
7. CONCLUSIONES 
Las cepas de levadura A4, B, b1, que fueron estudiadas en este trabajo 
presentaron un comportamiento ideal para ser catalogadas como posibles 
productoras de etanol, por su rápido crecimiento y producción de biomasa. 
La cepa Sc (Candida guilliermondii) a pesar de ser reportada como productora de 
etanol, no es recomendada, pues su crecimiento es lento, y no sería muy 
productiva ya que no tendría gran capacidad productora de etanol. 
Existen diferencias entre los tiempos de duplicación de cada Género. 
El género Cándida tiene un crecimiento lento y tiene mayor producción de 
biomasa en condiciones de anaerobia. 
La fuente de carbono que garantizó el óptimo comportamiento en crecimiento 
para las 4 cepas fue la Glucosa. 
 
 
37 
 
8. RECOMENDACIONES 
Se recomienda realizar pruebas confirmativas que relacionen el sustrato 
consumido en relación a la biomasa producida y el etanol producido.Se recomienda seguir el proceso de investigación y someter los productos de las 
fermentaciones a pruebas de HPLC, para así conocer el porcentaje de azúcares 
consumidos en relación al etanol producido. 
Se recomienda realizar replicaciones semanales de las cepas en estudio, para 
evitar inactivación de las células y comportamiento inadecuado, a causa de la 
edad del cultivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
9. LITERATURA CITADA 
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productividad de etanol y que tolere mayores niveles de azúcar que los usados en 
40 
 
la Planta Alcoquímica Sucromiles S.A. Tesis de maestría.Pontificia Universidad 
Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia. 34-48p. 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
ANEXO A 
Para el cultivo de las cepas aisladas se utilizaron diferentes medios, entre ellos 
agar malta, agar YPD y caldo YPD, y medio de asimilación de etanol. Todos los 
medio mencionados se prepararon en 1000 mL de agua destilada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agar Malta 
Componente Cantidad
Extracto de malta 4 g 
Extracto de levadura 4 g 
Glucosa 4 g 
Agar 18 g 
Agua destilada 1000 mL 
Agar YPD 
Componente Cantidad 
Glucosa 20 g 
Peptonas 10 g 
Extracto de levadura 5 g 
Agar 10 g 
Agua destilada 1000 mL 
Caldo YPD 
Componente Cantidad
Extracto de malta 4 g 
Extracto de levadura 4 g 
Glucosa 4 g 
Agua destilada 1000 mL 
Asimilación de etanol 
Componente Cantidad 
Etanol 3 mL 
Sulfato de amonio 0,1 g 
Fosfato monopotásico 0,1 g 
Sulfato de magnesio 0,05 g 
Agua destilada 100 mL 
 
ANEX
La no
orden
Se ini
colon
Las le
descr
colon
Las ce
B5, B7
 
 
XO B 
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a aislado. 
su 
ecimiento 
A6, B, B2, B
42 
B4, 
43 
 
ANEXO C 
Para comprobar la asimilación de etanol se utilizaron como pruebas el crecimiento 
de levaduras en medio de asimilación de etanol (Anexo A) y el método de la 
campana de Durham. 
En el método de asimilación de etanol, posterior a la preparación del medio de 
asimilación se agregan 20mL del mismo en un erlenmeyer de 50 mL que se 
esteriliza, junto con el medio, durante 20 minutos a 1 atm. El agregado de etanol 
se realiza luego de ser esterilizado para evitar su evaporación. 
Se sombró la levadura y se observó durante 5 días, lo esperado es que una 
levadura verdadera no se desarrolle. 
De las 16 cepas estudiadas, 7 resultaron positivas (verdaderas) en la pruebas de 
asimilación de etanol. 
Mediante la campana de Durham se espera obtener un burbuja de dióxido de 
carbono que caracteriza a la levadura como positiva para la producción de etanol. 
Consiste en un tubo de ensayo con medio YPD al cuál se le inocula la cepa a 
estudiar, se sella y se observa durante 48 horas, en ese periodo de tiempo el 
oxígeno se consume y el etanol producido ocupa el lugar del oxígeno, y el dióxido 
de carbono resultante del metabolismo de la glucosa se deposita en la campana 
de Durham, revelando una burbuja. 
Las 7 cepas positivas para asimilación de etanol, resultaron positivas para la 
prueba de la campana de Durham. 
 
44 
 
ANEXO D 
El método de identificación API 20 C BioMerieux, es un micrométodo utilizado para 
la identificación delevaduras de interés clínico. Estas galerías estudian 19 test de 
asimilación. Las reacciones bioquímicas terminan 72 horas después de inocular 
los azucares deshidratados con una solución pura y homogénea de cada cepa e 
incubada a 30°C. La asimilación de un azúcar se traduce por la turbidez. Existe un 
blanco que es un pozo sin sustrato por lo cual no tendrá ninguna turbidez. 
Un test es positivo si posee mayor turbidez que el blanco, y un test es negativo si 
su turbidez es igual a la del blanco. 
Para realizar la identificación, los test son separados en grupos de tres partiendo 
del pozo que no posee sustrato. Dentro del grupo, a cada test le corresponde un 
valor. En el caso de obtener una respuesta positiva: 1 (al primer test del grupo), 2 
(al segundo test del grupo) y 4 (al tercero). Par los test negativos el valor de 0. 
Finalmente se realiza la suma de los tres valores de cada grupo (siete grupos) y 
se obtiene un número de 7 dígitos que constituyen el perfil numérico de la cepa, el 
cual es buscado posteriormente en el catalogo analítico Api 20C permitiendo la 
identificación de la cepa. 
 
 
 
 
 
45 
46 
 
 
 
 
 
 
Galerías API 20 C 
Cepas B A4 b1 Sc 
A
si
m
ila
ci
ón
 
Glucosa + + + + 
Glicerol - - - + 
2-Keto-D-Gluconato - - - + 
Arabinosa - - - + 
Xilosa - - - + 
Adonitol - - - + 
Xilitol - - - + 
Galactosa + + + + 
Inositol - - - - 
Sorbitol - - - + 
Methyl-D-Glucosido - - - + 
N-Acetil-Glucosamina - - - + 
Cellobiosa - - - + 
Lactosa - - - - 
Maltosa + + + + 
Sacarosa + + + + 
Trehalosa + + - + 
Melezitosa - + - + 
Rafinosa + + + + 
 
 
47 
 
ANEXO E 
La cámara de Neubauer es una placa de vidrio óptico especial que tiene el tamaño 
de un portaobjetos. 
En el campo central (fondo de la cámara) están grabadas dos cuadriculas de 
recuento separadas una de la otra por una ranura. El fondo de la cámara es 
usualmente 0,1 mm más bajo (profundidad de la cámara) que ambos campos 
adyacentes. Entre el campo central y el cubreobjetos ya colocado, existe una 
ranura de 0,1 mm. 
La cuadricula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2. Los 
4 cuadrados grandes de las esquinas señalados con una “L” están divididos en 16 
cuadrados con aristas de 0,25 mm. 
El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos con aristas de 
0,2 mm, estando cada cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados pequeños 
con aristas de 0,05 mm y una superficie de 0,0025 mm2. 
Los 5 cuadrados medianos señalados con una “E” se utilizan para recuento de las 
células. 
Tiene especial relevancia que todos los cuadrados medianos presentan en todos 
los lados líneas límite triples. La línea central es la frontera y decide si las células 
de ésta zona se deben contar o no. 
 
48 
 
 
La fórmula de valoración (factor de conversión) para el conteo total de células es: 
 
 
í í 
 á ó
 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GLUCOSA
ATP ADP
Hexoquinasa Isomerasa
PGlucosa-6- P
FosfofructokinasaPFructosa-6- PFructosa-1,6-
Gliceraldehido-3- P2
Gliceraldehido-3-P 
deshidrogenasa
Electrones 2 NAD+
2 NADH
1,3-Difosfoglicerato P
2 Pi
2 P
Aldolasa
ATP ADP
3-Fosfoglicerato- P2
Fosfoglicerokinasa
2-Fosfoglicerato- P2
2-Fosfoenolpiruvato- P2
Enolasa
2 ADP
2 ATP
PIRUVATO-2
NAD+
NADH
Lactato- Lactato 
deshidrogenasa
Piruvato Kinasa
Piruvato 
descarboxilasa
Aldehido CO2+
2 ADP
2 ATP
NADH
NAD+
Alcohol 
deshidrogenasa
ETANOL
Piruvato: formiato liasa
Acetato- + formiato-
Formiato 
hidrógeno liasa
H2 + CO2
A
N
EXO
 G
	Informe final.pdf
	ANEXO F.pdf
	ANEXO G.pdf