DL50 do veneno de Bothrocophias myersi

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EVALUACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DEL VENENO DE 
Bothrocophias myersi (SQUAMATA: SERPENTES) 
 
 
 
 
 
 
DANIEL GÓEZ VALENCIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009I
EVALACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DEL VENENO DE Bothrocophias 
myersi (SQUAMATA: SERPENTES) 
 
DANIEL GÓEZ VALENCIA 
 
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de biólogo 
con mención en zoología 
 
Director 
Carlos Andrés Galvis Rizo 
Biólogo 
 
 
Codirector 
Alan Giraldo López Ph. D. 
Biólogo 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
ii 
 
NOTA DE APROBACION 
El trabajo de grado titulado “EVALACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) 
DEL VENENO DE Bothrocophias myersi (SQUAMATA: SERPENTES)” presentado 
por el estudiante DANIEL GÓEZ VALENCIA, para optar al título de biólogo con 
mención en zoología, fue revisado por el jurado y calificado como: 
 
Aprobado 
 
 
 
Carlos Andrés Galvis Rizo 
Director 
 
 
 
Alan Giraldo López 
Codirector 
 
 
 
Estevan Osorio Cadavid 
Director Programa Académico de Biología 
iii 
 
DEDICATORIA A mi mamá (Cruz E. Valencia Bravo), jamás habría sido posible 
sin tu apoyo. A mi papá (Pedro P. Góez Romero) gracias por enseñarme a vivir. A 
los que estuvieron allí para mostrarme el camino y no dejarme perder; y a los que 
me abandonaron y me dieron la espalda. A todos aquellos que influenciaron mi 
vida positiva o negativamente, porque por sus ejemplos, positivos o negativos, he 
podido aprender a vivir lo suficientemente bien como para que ahora se me 
presente el titulo de biólogo… 
 
…A los que simplemente no lo creyeron posible. 
 
Y a mí. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
AGRADECIMIENTOS A la Fundación Zoológica de Cali por la financiación de este 
proyecto de investigación, especialmente a Carlos Andrés Galvis rizo, Germán 
Corredor, Gustavo Caicedo y Arelis Santiago. A La Universidad del Valle, 
específicamente a Alan Giraldo López en la sección de Zoología, al personal de 
los Laboratorios de Biología, y a Santiago Castaño en la Escuela de Fisiología. A 
Fancisco Ruiz y Ricardo Vanegas del Instituto Nacional de Salud; a Darwin Ortiz 
Laboratorio de Calidad Nutricional en el CIAT y a Diego Álvarez. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
TABLA DE CONTENIDO 
Página 
NOTA DE APROBACION……………………………………………………….. ii 
 
DEDICATORIA…………………………………………………………………… iii 
 
AGRADECIMIENTOS……………...…………………………………………… iv 
 
LISTAS DE TABLAS …………...……………………………………………… vi 
 
LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………….... vii 
 
1. RESUMEN………………………………………………………………………... viii 
 
2. INTRODUCCION………………………………………………………………… 1 
 
3. MARCO TEORICO………………………………………………………………. 5 
 
4. OBJETIVOS………………………………………………………..…….……….. 9 
 4.1. General…………………………………………………………………… 9 
 4.2. Específicos…………………………...……………….………………….. 9 
 
5. HIPOTESIS…………………..……………………………………………….…….. 9 
 
6. MATERIALES Y METODOS…………….…………………………………….…. 10 
 6.1. Organismo estudiado……..…………………………………………...... 10 
 6.2. Modelo biológico experimental..………………………………….….… 12 
 6.3. La dosis letal media o DL 50…………………….………..……..…….. 14 
 6.4. Obtención del veneno y cálculo de las dosis a evaluar.…….….…... 14 
 6.5. Manipulación e inoculación de los ratones….…….…………………. 18 
 6.6. Calculo de la dosis letal media (DL 50)………..……………………... 19 
 
7. RESULTADOS….…………………………………………………..…………...… 21 
 
8. DISCUSION…………….………………………………………………………..…. 24 
 
9. LITERATURA CITADA……………….………………………………..…………. 31 
 
ANEXO A………….…….…………………………………………………………….. 34 
vi 
 
 
LISTA DE TABLAS 
Página 
TABLA 1: Resultados obtenidos en el primer ensayo………………………....... 21 
 
TABLA 2. Resultados obtenidos para el cálculo de la DL50………………….... 22 
 
TABLA 3. Resultados obtenidos en el tercer ensayo……………………………. 23 
 
TABLA 4. Resultados obtenidos en el cuarto ensayo…………………………… 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Página 
FIGURA 1. Distribución geográfica de las especies del género 
 Bothrocophias……………………………………………………… 11 
 
FIGURA 2. Tabla dinámica implementada en el INS para el cálculo 
 de la DL50…………………………………………………………… 16 
 
FIGURA 3. Procedimiento seguido para la manipulación e inyección de los 
 ratones durante el ensayo…………………………………………. 19 
 
FIGURA 4. Ratón afectado, presentando hemorragia ocular………………. 22. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
 
1. RESUMEN 
En Colombia, la investigación con respecto de los venenos de las serpientes, es 
relativamente escasa. Situación preocupante debido a la gran cantidad de 
serpientes venenosas en nuestro medio y a una tasa de incidencia de 7,4/100 000 
habitantes. En este trabajo se evaluó la dosis letal media del veneno de 
Bothrocophias myersi (2001) mediante el método de Spearman-Karber, y se 
realizaron observaciones sobre los efectos visibles de este veneno, buscando 
comparar su accionar con la información reportada para otras serpientes de la 
misma familia. Se obtuvo un valor estimado para la DL50 de 106,66 µg con un 
intervalo de confianza (95%) entre 97,14 µg – 117,12 µg, sobre ratones ICR - CD1 
de 18-20g. También se pudo observar que el efecto principal del veneno de esta 
serpiente fue la hemorragia, ya que algunas de las unidades experimentales 
presentaron hemorragia ocular prominente que terminaba por matar los individuos 
afectados hasta 72 horas después de la inyección del veneno. 
 
1 
 
2. INTRODUCCION 
Con el incremento de las poblaciones humanas y la consiguiente extensión de la 
frontera agrícola se genera un creciente número de encuentros entre serpientes y 
humanos. Estos encuentros generalmente desencadenan la muerte de la 
serpiente, aunque en algunas ocasiones puede terminar en una mordedura que 
puede ser inofensiva o producir envenenamiento. En diferentes lugares del 
mundo, los envenenamientos por mordeduras de serpientes constituyen un 
problema de salud pública (Warrell 1992, Chiappaux 1998, citados por Rucavado 
et al 2004). En este sentido, se estima que la mortalidad global causada por 
mordeduras de serpientes oscila entre 50 000 a 100 000 casos por año, aunque el 
número es difícil de estimar y se considera subestimado debido a los muchos 
casos en que los pacientes reciben tratamiento tradicional y pueden morir sin 
reporte oficial (Teakston et al. 2003). 
 
En Colombia cada año son reportados aproximadamente 2 000 accidentes 
ofídicos, con una tasa de incidencia de 7.4/100 000 habitantes. Los 
departamentos con mayor incidencia de mordedura de serpientes son: Antioquia, 
Chocó, Meta, Norte de Santander, Casanare, Caldas y Cauca 
(http://www.minproteccionsocial.gov.co). Siendo la mayoría de los accidentes 
ofídicos (entre un 90– 95%) causados por serpientes de la familia Viperidae. Ante 
este panorama, incluso en Colombia, los accidentes con serpientes se tornan en 
un problema de salud pública especialmente en áreas rurales (Gaviria et al. 2005, 
Sells 2003). Esta problemática se intensifica debido a que existe un alto grado de 
desconocimiento sobre el tema ofídico, lo que ocasiona que muchos casos no 
sean adecuadamente tratados, o se presenten subestimaciones de su gravedad, 
2 
 
lo que sumado a la relativamente alta morbilidad puede resultar en un incremento 
en la tasa de mortalidad (C. Galvis com. pers.). 
 
Lo anterior plantea la necesidad de recopilar información en aras de incrementar 
nuestro conocimiento, tanto en el aspecto clínico de los efectos del veneno como 
también sobre la biología y ecología de las serpientes. Lo cual en últimas se verá 
reflejado en incremento de la prevención y una mejor atención de los casos de 
accidente ofídico, para así reducir la tasa de incidencia. 
 
Desafortunadamente aún se encuentran especies que podrían considerarse de 
importancia médica, pero, de las que no se tiene conocimiento,o el conocimiento 
es muy reducido. Este es el caso de Bothrocophias myersi (Gutberlet & Campbell 
2001), una especie de serpiente venenosa clasificada taxonómicamente en la 
Familia Viperidae cuya localidad típica está definida en los departamentos del 
Cauca y Valle del Cauca (Colombia) (Campbell & Lamar 2005), y fue 
recientemente descrita por Gutberlet & Campbell (2001), existiendo pocos 
registros sobre su biología, ecología, e incluso sobre el efecto de su veneno. 
 
Al igual que muchos otros miembros de la familia Viperidae, el género 
Bothrocophias, presenta características fenotípicas compartidas entre las 
especies integrantes. Una de ellas es la glándula del veneno, la cual produce una 
sustancia viscosa que, en términos generales, estaría compuesta por un grupo de 
enzimas, toxinas, y péptidos cortos disueltos en agua. Esta sustancia es la 
encargada de la muerte y pre-digestión de sus presas. Por esta razón, su efecto 
podría estar relacionado con sus hábitos alimentarios, así como también de la 
3 
 
edad del individuo que se evalúe y de la población de referencia, tal como lo 
reportaron Alape- Girón et al. (2008) para dos poblaciones de Bothrops asper en 
Costa rica.” 
 
En términos generales, los venenos de serpientes se han caracterizado en su 
acción a través de los años. Por ejemplo, el veneno de las serpientes de la familia 
Elapidae es considerado neurotóxico, debido a la acción de α-neurotoxinas que 
actúan a nivel pre y post-sináptico generando parálisis y toxicidad muscular en el 
individuo inoculado (Rosso et al. 1996 & Alape-Girón et al. 1996). En este sentido, 
los envenenamientos por mordeduras de serpientes de la familia Viperidae son 
caracterizados por efectos locales más drásticos, que incluyen necrosis, edema y 
dolor; así como alteraciones sistémicas implicando hemorragias, coagulopatías, 
fallas renales y shock; condiciones que se desarrollan rápidamente después del 
accidente y con frecuencia resultan en secuelas permanentes (Pereira et al. 2004, 
Acosta et al. 2004). 
 
Es importante mencionar que el interés en la caracterización del veneno de una 
serpiente, es el primer paso para entender su rol ecológico, toda vez que de la 
efectividad del veneno depende la posibilidad de alimentarse y por consiguiente 
de sobrevivir. Adicionalmente, el incremento de la probabilidad de encuentro 
Hombre-Serpiente pone de manifiesto otro elemento a considerar en el estudio 
del veneno de las serpientes, y es la producción de anti-venenos. En este sentido, 
la estandarización de los métodos para evaluar la acción de los venenos 
propuesta por la Organización Mundial para la Salud - OMS (Theakston & Reid 
1983), constituye un punto de partida, para la evaluación apropiada de estas 
4 
 
sustancias en aras de conocer y desarrollar terapias que sean más efectivas en 
los laboratorios interesados en el tema a nivel mundial. 
 
Aunque el efecto del veneno es causado por una variedad de componentes del 
mismo, entre los que se encuentran fosfolipasas A2, miotoxínas de bajo peso 
molecular y metaloproteinasas, entre otros (Fernández et al. 2006), y Los 
procedimientos descritos por la OMS frecuentemente son utilizados en pruebas 
con fracciones de venenos; en el presente trabajo no se evaluó la acción 
específica de cada componente, sino del veneno en conjunto como una unidad de 
riesgo potencial. Para este propósito se analizó el accionar del veneno de B. 
myersi utilizando como modelo de estudio ratones (Mus musculus) de la cepa 
ICR-CD1 albinos, de acuerdo con lo establecido por la OMS para este tipo de 
estudios, comparando los resultados con el accionar del veneno de otras especies 
de este género. 
5 
 
 
3. MARCO TEORICO 
En América latina, los venenos de serpientes han sido estudiados a lo largo de 
aproximadamente 125 años. Los primeros reportes datan de 1884 y 1911 cuando 
J.B. de Lacerda y Vital Brazil realizaron los primeros trabajos en este tema 
(Lacerda 1884 y Brazil 1911, citados por Guttierrez 2002), pocos años después de 
la invención de la seroterapia antiofídica en Francia (Vital Brazil 1987, Bon 1996). 
Desde entonces, y no solo en América latina, sino en todo el mundo se han 
encaminado esfuerzos hacia un mejor entendimiento de estas sustancias. Estos 
esfuerzos, generalmente han sido dirigidos a la caracterización de la acción del 
veneno desde un punto de vista clínico; donde se busca desarrollar sueros 
antiofídicos eficientes para contrarrestar los efectos de las toxinas, nuevas 
herramientas de investigación y drogas de uso clínico potencial (Alape-Giron et al. 
2009). 
Sin embargo, estas observaciones también podrían considerarse desde una 
perspectiva biológica, donde el rol del veneno al relacionarse directamente con las 
características reveladas por su accionar sobre una posible presa, ayudan a 
esclarecer algunos aspectos directamente implicados en su letalidad, y por ende 
en su valor adaptativo en términos de incrementar la supervivencia de la especie, 
al mejorar sus posibilidades en la consecución de presa y alimento. 
 
En términos generales los venenos de serpiente son sustancias viscosas, 
producidas en las glándulas del veneno que poseen todas las especies de las 
familias Viperidae, Elapidae e Hydrophiidae; y algunas especies de la familia 
6 
 
Colubridae (Kardong 1996).En el caso particular de la familia Viperidae, estas 
sustancias están compuestas de proteínas que pertenecen a unos pocos grupos 
proteicos incluyendo enzimas: serinas, proteinasas, metaloproteinasas Zn2+, L- 
aminoácido oxidasa, fosfolipasas A2; y proteinas sin actividad enzimática como: 
desintegrinas, lectinas tipo C, péptidos natriureticos, miotoxinas, Toxinas CRISP, 
factores de crecimiento nervioso y vascular del endotelio, e inhibidores de 
proteinasas tipo cistatina y Kunitz (Alape-Giron et al. 2009, Gutiérrez et al. 
2005).De acuerdo con Kardong (1996) y Chiappaux (1991), la función principal del 
veneno es la de matar o inmovilizar la presa, además de asistir en la digestión de 
la misma. 
 
La aparición del veneno en el linaje de las serpientes ha sido identificado antes de 
la diversificación de los Colubroideos actuales, con posterior pérdida de la 
glándula de veneno en algunos grupos (Fry & Wüster 2004). Desde el punto de 
vista biológico, los venenos representan una innovación crítica en la evolución de 
los ofidios, ya que permitieron la transición desde una forma mecánica (la 
constricción) a una química (veneno) para la captura y digestión de las presas 
(Álape-Girón et al. 2009). 
 
La complejidad actual de los venenos de serpientes ha evolucionado desde un 
reducido set de proteínas con funciones fisiológicas normales, que fueron 
reclutadas en el proteóma del veneno antes de la diversificación de las serpientes 
“avanzadas” (Superfamilia: Colubroidea) y modificadas a lo largo de su historia 
(Fry & Wüster 2004). Por lo tanto, la composición de los venenos puede retener 
información respecto de su historia evolutiva, y por ende tiene un alto valor 
7 
 
taxonómico (Alape-Giron et al. 2009). En este contexto, no sorprende que el 
accionar de los venenos de las serpientes tienda a ser generalizado en niveles 
taxonómicos tan amplios como el de Familia. Entre las serpientes venenosas, las 
representantes de la familia Viperidae son las responsables por la mayoría de los 
accidentes ofídicos en Latinoamérica (Hardy 1994, Acosta et al. 2004, Benghini et 
al. 2004, Lira et al. 2007). Por tal motivo son las serpientes más estudiadas en 
nuestro medio. Los institutos de investigación más destacados en los que se han 
hecho trabajos en este tema a lo largo del último siglo son el Butantán en Brasil y 
el Clodomiro Picado en Costa Rica (Hardy 1994, Guttierrez 2002, Lira et al. 2007), 
así como también algunos grupos de investigación argentinos (Acosta et al. 
2004). 
 
Para lograr su objetivo, los venenos de los viperidos producen unacombinación 
de los siguientes efectos: cardiotóxico, miolitico, coagulante (o anticoagulante), 
activador o inhibidor hemostático y/o hemorrágico (Chiappaux, 1991). Estas 
actividades desencadenan una combinación de efectos locales y sistémicos que 
generan la muerte del organismo afectado. Los efectos locales visibles más 
importantes son: dolor intenso, edema eritematoso, equimosis, flictenas 
hemorrágicos y necrosis con infección secundaria; y las alteraciones sistémicas 
más frecuentes incluyen: toxicidad vascular, renal y hemorragias (Lovera, A 
2006). 
 
Uno de los efectos más difundidos entre los venenos de serpientes de la familia 
Viperidae (subfamilias Viperinae y Crotalinae) es la hemorragia. Con algunas 
excepciones, estos venenos inducen intoxicaciones caracterizadas por 
8 
 
hemorragia que puede presentarse localmente en el lugar de la inoculación del 
veneno, contribuyendo a la isquemia local y a la pobre regeneración de los 
tejidos; afectando sistemáticamente múltiples órganos y originando serias 
complicaciones como choque cardiovascular (Girón et al. 2008). El resultado 
visible de este efecto es la extravasación, que ocurre al nivel de las vénulas y los 
capilares, produciendo grandes modificaciones con alteraciones prominentes en 
la morfología de las células endoteliales. Estas alteraciones fueron observadas 
como resultado de ensayos con la fracción correspondiente a las 
metaloproteinasas de los venenos de varias especies (Gutiérrez et al. 2005). 
Mientras que fracciones como las correspondientes a las Fosfolipasas A2, están 
más relacionadas con toxicidad en los tejidos musculares (Gutiérrez & Ownby 
2003). 
9 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1. General: 
Evaluar, mediante ensayos in vivo la dinámica de la acción letal del veneno de 
Bothrocophias myersi. 
 
4.2. Específicos: 
Obtener valores de DL50 para el veneno de B. myersi bajo condiciones 
experimentales. 
Describir el accionar del veneno de B. myersi bajo condiciones experimentales 
 
5. HIPOTESIS 
Ha: El veneno de Bothrocophias myersi presenta una respuesta tóxica similar a la 
descrita para los venenos de viperidos. 
Ho: El veneno de Bothrocophias myersi no presenta una respuesta tóxica similar 
a la reportada para los venenos de viperidos. 
10 
 
 
6. MATERIALES Y METODOS 
6.1. Organismo estudiado 
Las serpientes de la familia Viperidae son importantes componentes ecológicos 
de los bosques neo-tropicales y con frecuencia son consideradas en términos de 
la potencia de su veneno (Hardy 1994), aunque existen escasos datos publicados 
sobre su ecología y/o la capacidad de sus venenos. Estas serpientes han radiado 
en casi todo tipo de hábitat terrestre; siendo ubicuas en terrenos tan variados 
como desiertos, bosques boreales, bosques nublados y bosques húmedos 
tropicales, entre otros. Algunos viperidos son semiacuaticos o arborícolas pero la 
mayoría presentan cuerpos relativamente pesados y son de hábitos terrestres 
(Campbell & Lamar 2004). 
 
En este taxón se encuentra un grupo complejo de serpientes, inicialmente 
considerado como Bothrops, posteriormente como Bothriopsis y más adelante 
ubicadas taxonómicamente en el nuevo género Bothrocophias por Gutberlet & 
Campbell (2001). Sin embargo (Wüster et al. 2008), mediante un análisis de 
secuencias génicas relacionadas con el veneno, no encontraron evidencia 
suficiente para separar las serpientes analizadas del género Bothrocophias de las 
del género Bothrops, aunque recomienda mantener la separación taxonómica 
para evitar confusiones a nivel médico. El género Bothrocophias está compuesto 
por cuatro especies distribuidas geográficamente en el norte de Suramérica (ver 
figura 1). Entre estas, existen dos especies muy emparentadas, anteriormente 
consideradas una sola especie, B campbelli que se distribuye en Ecuador y B. 
myersi que presumiblemente se distribuye en gran parte del chocó biogeográfico 
11 
 
colombiano, aunque solo existen reportes para la región pacifica de los 
departamentos del Cauca y el Valle del Cauca (Gutberlet & Campbell 2001). 
 
Figura 1. Distribución geográfica de las especies del género Bothrocophias. 
Fuente: Gutberlet & campbell.2001. 
 
 
El conocimiento relativo a la biología o ecología de B. myersi es escaso. 
Solamente se cuenta con unos pocos individuos en cautiverio, provenientes de 
localidades como Piangüita y Chucheros municipio de Buenaventura, 
Departamento del Valle del Cauca, Colombia. De acuerdo con observaciones 
12 
 
realizadas en estas localidades, esta especie es de hábito terrestre, siendo 
encontrada generalmente bajo troncos caídos, en el sotobosque del bosque 
húmedo tropical, bajo condiciones de alta humedad (W. Bolívar Obs. Pers.). Estos 
registros además demuestran que puede ser observada entre 0 y 50 m de altura 
sobre el nivel del mar, aunque Campbell & Lammar (2004) la sitúan 
altitudinalmente entre 75–200 m. Lamentablemente no se tiene conocimiento 
sobre sus hábitos alimentarios en ambiente natural, aunque algunas especies del 
mismo género, como B. hyoprora (Amazonas) y B. campbelli (Ecuador) se 
alimentan principalmente de roedores y lagartos (Campbell & Lamar 2004). Sin 
embargo, algunos individuos B myersi que se encuentran en cautiverio en la 
Fundación Zoológica de Cali, han sido exitosamente alimentados con roedores 
(C. Galvis com. pers.). 
 
6.2. Modelo biológico experimental 
El modelo de estudio utilizado en este trabajo para evaluar la acción del veneno 
de B. myersi fueron los ratones Mus musculus. Estos ratones, además de semejar 
presas potenciales para la mayoría de las serpientes, presentan una alta tasa 
reproductiva, llegando a producir camadas de hasta 15 crías. La cepa ICR-CD1 
ha sido seleccionada para pruebas de toxicidad aguda debido a que es producto 
de exo-cría. Por consiguiente presenta una consanguinidad baja, que se traduce 
en que ésta representa de alguna forma la variación poblacional, elemento 
importante al considerar el efecto tóxico de una sustancia mediante el cálculo de 
la dosis letal media. Ya que sin esta variación, el efecto que la sustancia genere 
debería ser el mismo para todos los individuos y bajo estas circunstancias no 
sería posible calcular la dosis letal media. Otro beneficio adicional, es que 
13 
 
aumenta la posibilidad de reproducir las condiciones del experimento lo que 
representa un beneficio en la medida en que exhibe resultados comparables en 
los laboratorios interesados en el tema a nivel mundial. 
 
Los ratones se mantuvieron en cajas plásticas con capacidad para 15 litros con 
alimento y agua suficientes. El interior de las cajas fue tapizado con viruta de pino 
sin tratar, esto desestima cualquier efecto que puedan tener los químicos con que 
se trata la madera sobre la salud de los ratones. Además se mantuvieron en un 
lugar aislado reduciendo así el efecto de variables no controlables o indeseables 
en los experimentos realizados, que pudieran ocasionar alteraciones en los 
resultados de los ensayos. Toda manipulación de individuos en las cajas de 
contención se realizó utilizando una bata de laboratorio, gafa protectoras de 
acetato y guantes de nitrilo, manteniendo las condiciones asepsia requerida. 
Además, se evitó el uso de barniz de uñas o perfumes que pudieran generar 
olores molestos a los animales. 
 
Cabe destacar que el uso de animales vivos en este tipo de ensayos está 
fundamentado en la necesidad de medir la toxicidad y el efecto patológico total de 
un veneno (Sells 2003), ya que un organismo vivo y funcional representa mejor 
las condiciones reales de un envenenamiento. Esto es importante si se considera 
que normalmente estos estudios están encaminados a probar tratamientos para el 
beneficio humano. 
 
 
 
14 
 
6.3. La dosis letal media o DL50 
La dosis letal media (DL50) será entendida de acuerdo a Kardong (1996), quien la 
define como una medida de la toxicidad de una sustanciacualquiera (en este 
caso veneno de B. myersi), relativo a una población objeto, usualmente animales 
de laboratorio (para este trabajo M. musculus albinos de la cepa ICR-CD1). En 
este contexto es importante definir que se considerará el veneno como una 
sustancia que contribuye a la supervivencia del organismo que la produce, en 
términos de su rol biológico (ver Kardong 1996). 
 
Para estimar el DL50 se utilizó el método de Spearman-Karber. De acuerdo con 
Bross (1950), este método es el que genera mejores resultados incluso cuando se 
trabaja con tamaños de de muestra pequeños. Además, es el más simple 
computacionalmente y el más difundido en investigaciones de toxicidad aguda. 
Mediante este método se establece la curva de dosis respuesta a partir de un 
numero de grupos de ratones (cada uno compuesto por 5 ratones), el cual es 
inoculado con diferentes cantidades de veneno. Un rango de efectos es 
observado donde la menor cantidad inyectada de veneno produce 100% de 
supervivencia y la mayor cantidad de veneno inyectado resulta en el 100% de 
mortalidad, siendo requerido un mínimo de tres grupos intermedios con número 
variable de muertes (Sells 2003). 
 
6.4. Obtención del veneno y cálculo de las dosis a evaluar 
El veneno fue obtenido a partir del ordeño una hembra adulta de la especie B. 
myersi depositada en la colección viva de la Fundación Zoológica de Cali. La 
serpiente fue motivada a morder una membrana de para-film cubriendo un 
15 
 
beacker de 100 mL, donde se deposito el veneno de la mordida. Acto seguido se 
procedió a hacer presión sobre la zona donde deberían estar ubicadas las 
glándulas del veneno y así se maximizó la cantidad de veneno obtenido mediante 
un evento de manipulación de la serpiente. 
 
Todo el material de vidrio utilizado para la contención y preparación de soluciones 
de veneno durante los ensayos biológicos en el laboratorio de Ecología Animal de 
la Universidad del Valle, fue previamente esterilizado de acuerdo con el protocolo 
realizado durante la colecta del veneno. Este procedimiento consistió en lavar con 
jabón en polvo, enjuagar con agua de grifo y con ácido nítrico. Posteriormente se 
lavó el material con agua des-ionizada, se enjabonó con jabón neutro, se lavó con 
agua des-ionizada nuevamente y se pasó por solución de Folch y etanol/metanol. 
Finalmente se enjuagó con agua des-ionizada, se secó en una estufa a 100 °C 
durante 8 - 10 horas, y se introdujo a un ciclo del Autoclave. 
 
Para calcular las dosis de veneno a ser utilizadas durante cada ensayo se generó 
una tabla dinámica de Excel donde se consignaron los datos más relevantes del 
experimento realizado (ver Anexo A). Cabe destacar que se tomó como plantilla la 
tabla dinámica implementada en el Instituto Nacional de Salud (INS). En esta 
tabla se resumen los volúmenes a medir, los volúmenes a inocular, y la 
concentración de las soluciones, entre otros (Figura 2). 
 
16 
 
 
Figura 2.Tabla dinámica implementada en el INS para el cálculo de la DL50. 
 
Para el desarrollo de los ensayos se definió la concentración del veneno: 
 
Donde : representa el volumen de veneno en el ensayo i adicionado a la 
solución, (el volumen inicial es decidido por el investigador) y x: la cantidad de 
veneno a pesar en el ensayo i. Esta cantidad de veneno se define como: 
 
 
Donde representa el titulo del veneno para el ensayo. El titulo inicial es 
decidido por el investigador. : El volumen de la solución final a inocular por 
ratón y , es el volumen total por ensayo. Salvo , que es decidido por el 
investigador; los demás valores para el cálculo de la concentración inicial del 
veneno son constantes. Por esta razón es posible, a partir de cualquier valor en la 
17 
 
tabla, determinar la concentración de la solución del veneno con la que se va a 
desarrollar el ensayo. 
 
Para definir la siguiente dilución es necesario conocer un volumen específico de 
veneno (Vi), de tal manera que: 
 
 
Donde FD es el factor de dilución. Este factor de dilución corresponde a un valor, 
usualmente entre 1 y 2, que es definido por el investigador para establecer la 
distancia entre una dilución y la otra, generando diluciones seriadas. Requisito 
indispensable para el correcto cálculo de la DL50. Cabe resaltar la importancia en 
la elección del factor de dilución ya que algunos venenos presentan un rango muy 
reducido entre la cantidad de veneno que no produce ningún efecto y aquella que 
produce el 100% de muertes, con lo que se hace necesario tener un punto de 
referencia a la hora de ajustar el experimento. 
 
Una vez definidos los insumos anteriores, es posible establecer los títulos a 
utilizar durante el ensayo como: 
 
 
Los títulos (Ti) de veneno, representan la cantidad de veneno inyectada a cada 
ratón, en cada uno de los grupos generados en el desarrollo del ensayo. Después 
de calcular el Ti para cada uno de los grupos y definir FD; es posible deducir la 
cantidad de veneno necesaria para el desarrollo total de la prueba. 
 
18 
 
Las cantidades de veneno previamente calculadas se pesaron en una balanza 
analítica. Se taró la balanza con un vaso de precipitado de 100 mL y se 
adicionaron las cantidades de veneno a pesar utilizando una espátula de 
odontología, que además de ajustarse al tamaño necesario, no presenta estática 
lo cual evita perdidas de veneno. Al terminar este proceso se limpiaron todos los 
implementos de pesaje; la balanza con una brocha pequeña y la espátula con 
solución salina. Posteriormente, se añadió solución salina en el vaso de 
precipitado para realizar la solución estándar de veneno, y se mezcló utilizando 
una plancha magnética a baja velocidad durante 5 minutos para garantizar una 
mezcla homogénea. A partir de la solución estándar de veneno, se procedió a 
realizar la serie de diluciones en una secuencia de tubos de ensayo en volúmenes 
equivalentes a 4,0 ml. Los volúmenes de veneno utilizados para realizar las 
diluciones se midieron utilizando micropipetas de 100-1000uL y de 10-100 ul para 
incrementar la precisión. Todas las diluciones fueron dispuestas por cinco 
segundos en un Vortex para garantizar una mejor homogenización, y 
almacenadas en jeringas estériles de 3.0 ml para su utilización en los ensayos. 
 
6.5. Manipulación e inoculación de los ratones 
Para la manipulación e inyección de los ratones se siguieron las indicaciones 
metodológicas del instituto nacional de salud de acuerdo a los POE´s 
(procedimiento operativo estándar) del área de animales de laboratorio. En 
términos generales se captura y sostiene el ratón por la cola con los dedos índice 
y pulgar (Figura 3a), posteriormente se coloca sobre una superficie en la que el 
ratón se pueda sostener (como una rejilla), para luego pasar la cola entre los 
dedos anular y meñique, y sostenerla con estos mientras se captura el ratón por 
19 
 
el cuello con los dedos índice y pulgar (Figura 3b). A continuación se levanta el 
ratón y se ubica boca arriba para ser inyectado intra-peritonealmente, con una 
aguja calibre 27 preferiblemente, en un ángulo de 45° aprox (Figura 3c). Al 
realizar la inyección, se asegura que la aguja se introduzca por debajo de la piel, 
para luego introducirla al interior de la cavidad gástrica por debajo de los 
músculos abdominales y del peritoneo. Una vez realizada la inoculación, se 
verificó que no hubiera derrames. En caso de hubiera derrames la unidad 
experimental era descartada y se iniciaba el procedimiento nuevamente. 
 
A B C 
 
Figura 3. Procedimiento seguido para la manipulación e inyección de los ratones 
durante el ensayo. A. Captura. B. Manipulación. C. Inoculación. 
 
6.6. Calculo de la dosis letal media (DL50) 
La dosis letal media fue calculada mediante el método método de Spearman-
Karber, considerando las muertes ocurridas 48h después de la inyección como: 
 
Donde, m es el log DL50, x100 es el log de la dosis que produce el 100%de 
muertes y que presenta 100% de muertes para toda dosis superior, n es el 
número de ratones usado para cada dosis, d es el factor de dilución y es la 
20 
 
sumatoria de las muertes ocurridas en todas las dosis incluyendo x100 y x0. Los 
intervalos de confianza de m se definen como: 
 
donde V(m) es: 
 
 
Los ratones usados en las pruebas fueron seleccionados al azar entre la totalidad 
de los ratones producidos y ubicados en grupos de 5 ratones, cada grupo fue 
expuesto a una dosis diferente de veneno calculada mediante la tabla dinámica y 
las muertes leídas 24 y 48 horas después de la inyección. Adicionalmente se 
realizaron observaciones de las muertes ocurridas 72 horas después de la 
inoculación. 
21 
 
 
7. RESULTADOS 
Se realizaron un total de 4 ensayos para la dosis letal media del veneno de B. 
myersi. El primero buscaba identificar una línea base sobre la cual se iba a 
plantear el resto de las pruebas. El titulo inicial de trabajo fue de 30 µg con un 
factor de dilución FD=1,2. La dosis máxima a la que no se produjo ninguna muerte 
fue 51,84. Lamentablemente no se pudo calcular la DL50 debido a que no hubo 
concentraciones que produjeran el 100% de muertes (Tabla 1). 
 
Tabla 1. Resultados obtenidos en el primer ensayo. 
 Muertes 
 
Titulo 
(µg) # 
ratones 24 h 48 h 
1 30,000 5 0 0 
2 36,000 5 0 0 
3 43,200 5 0 0 
4 51,840 5 0 0 
5 62,208 5 1 1 
6 74,650 5 2 2 
7 89,580 5 3 3 
8 Control (-) 5 0 0 
 
Teniendo como referencia el resultado del primer ensayo, se procedió a ampliar el 
rango de concentraciones de veneno, de tal forma que se incrementara la 
cantidad de veneno inyectada a cada ratón, utilizando un FD de 1,15. Se 
estableció que la dosis máxima a la que no se produjo ninguna muerte fue 75,207, 
la dosis mínima a la que se produce un 100% de mortalidad es 131,538, 
registrándose un total de 10 muertes durante todo el ensayo (Tabla 2). De 
acuerdo con estos resultados, la dosis letal media estimada para el veneno de B. 
22 
 
myersi fue de 106,66 µg, con un intervalo de confianza (95%) entre 97,14 µg – 
117,12 µg. 
Tabla 2. Resultados obtenidos para el cálculo de la DL50. 
 Muertes 
 
Titulo (µg) 
# ratones 24 h 48 h 
1 43,000 5 0 0 
2 49,450 5 0 0 
3 56,868 5 0 0 
4 65,398 5 0 0 
5 75,207 5 0 0 
6 86,488 5 1 1 
7 99,462 5 1 1 
8 114,381 5 3 3 
9 131,538 5 5 5 
10 Control (-) 5 0 0 
 
Un efecto prominente del veneno de esta serpiente es la hemorragia (Fig. 6). 
Durante el transcurso del ensayo, algunos de los ratones presentaron sangrado 
prominente a través de los ojos con una coloración rojo claro, prominente 
sangrado interno y eversión ocular de la cuenca óptica. Todos los ratones en que 
se presentaron estos signos murieron, en algunos casos hasta 72 horas después 
de la inyección del veneno. 
 
Figura 4. Ratón afectado, presentando hemorragia ocular. 
 
23 
 
 
Aunque se hicieron dos ensayos más para confirmar el estimado de DL50 (Tabla 
3 y Tabla 4), no se alcanzaron concentraciones que produjeran el 100% de 
muertes. Probablemente, las condiciones de almacenamiento del veneno 
alteraron su actividad, por lo que se recomienda evaluar en un trabajo posterior el 
efecto que pueden llegar a tener las condiciones de almacenamiento sobre la 
actividad del veneno en esta especie. No se pudieron realizar más ensayos, 
debido al agotamiento del stock de veneno disponible para este trabajo. 
 
Tabla 3. Resultados obtenidos en el tercer ensayo 
Muertes 
 título # ratones 24 h 48h 
1 50,00 5 0 0 
2 57,50 5 0 0 
3 66,13 5 0 0 
4 76,05 5 0 0 
5 87,45 5 0 0 
6 100,57 5 0 0 
7 115,66 5 1 1 
8 133,01 5 2 2 
9 control (-) 5 0 0 
 
Tabla 4. Resultados obtenidos en el cuarto ensayo. 
Muertes 
 título # ratones 
24 h 
 
48h 
1 50,00 5 0 0 
2 57,50 5 0 0 
3 66,13 5 0 0 
4 76,05 5 0 0 
5 87,45 5 0 0 
6 100,57 5 0 0 
7 115,66 5 1 1 
8 133,01 5 3 3 
9 control (-) 5 0 0 
24 
 
 
8. DISCUSION 
La DL50 es una medida de la toxicidad utilizada en muchos ámbitos para evaluar, 
el efecto nocivo de una sustancia sobre animales de laboratorio. Esta prueba 
provee la línea base sobre la que se estima la dosis efectiva media (DE50), 
ensayo utilizado en las pruebas de efectividad de los sueros antiofídicos en la 
inhibición del efecto producido por los venenos de serpientes. Por lo tanto la 
evaluación de la DL50 del veneno de B. myersi, debido a la falta de conocimiento 
que se tiene sobre esta especie, constituye un punto de partida para la evaluación 
de esta sustancia de importancia médica. 
 
Debido a las consideraciones éticas implícitas en el uso de animales vivos para su 
cálculo, muchos autores están trabajando en la producción de metodologías que 
no involucren el uso de animales vivos para las pruebas de toxicidad. Sin 
embargo hasta que sean oficialmente validados, el uso de ratones en este tipo de 
pruebas sigue siendo el reglamentario por autoridades como la Organización 
Mundial para la Salud (Sells 2003, WHO 1981). 
 
Considerando la importancia biológica del veneno en términos de su rol, la dosis 
letal media (DL50) para el veneno de B. myersi se evaluó desde dos perspectivas 
íntimamente relacionadas. A saber, desde una perspectiva donde la respuesta de 
los individuos dentro de una población hace que se genere una afectación 
diferencial, en términos de la muerte de estos individuos; lo cual trae como 
consecuencia la segunda perspectiva que involucra la cantidad de veneno 
25 
 
necesaria para que el efecto, principalmente digestivo de este, sea lo 
suficientemente fuerte como para matar al 50% de la población de referencia. 
El hecho de que se hayan presentado individuos muertos e individuos vivos en 
algunas de las concentraciones usadas en los ensayos, que además es requisito 
indispensable para el cálculo de la DL50; sugiere que existen variaciones con 
respecto de la respuesta de los individuos a las dosis evaluadas. A propósito, 
Repetto (1997) propone que esta respuesta depende de un conjunto de 
condiciones y circunstancias como son los procesos de transformación de las 
sustancias antes y durante la intoxicación, así como los mecanismos de defensa 
del individuo, todo lo cual está determinado por las características genéticas de 
cada uno. También influyen otros factores internos y externos como las 
circunstancias fisiológicas. 
 
Por otro lado es importante mencionar que los síntomas del efecto tóxico (en este 
caso la muerte del individuo), solo se ponen de manifiesto cuando la 
concentración del agente tóxico sobrepasa ciertos límites a nivel del receptor 
(Gutierrez & Lopez 2001). Esta observación es importante ya que a partir de ella, 
se puede deducir que debe existir un mecanismo mediante el cual, el organismo 
puede generar su defensa en contra de la acción del veneno, y que algunos 
individuos que en general presentan una mejor respuesta son los que logran 
sobrevivir, lo cual demuestra que es relevante la variación poblacional a la hora 
de considerar el efecto tóxico agudo del veneno de las serpientes. 
 
Tomando como referencia el estudio de los venenos desde un punto de vista 
clínico, y considerando los avances generados en los últimos años en busca de 
26 
 
terapias antiofídicas cada vez más efectivas. La respuesta inmune que se genera 
con la mordedura de una serpiente ha sido utilizada en la producción de sueros 
antiofídicos. Donde el suero obtenido a partir plasma sanguíneo de caballos, 
ovejas, cabras y otros animales que han pasado por un proceso de inmunización; 
es depurado y las inmunoglobulinas G extraídas (Beghini 2004, WHO 1981). 
 
Es posible afirmar que muchos avances se han logrado en el campo de los 
venenos de serpiente, lográndose la producción de sueros capaces de 
contrarrestar su acción, pero aún falta mucho por establecer. Es importante 
destacar que este trabajo presenta los resultados del primer intento por establecer 
el DL50 del veneno de B. myersi, especie endémica del pacificocolombiano. En 
este contexto, no se puede dejar de lado que la variación existente en la 
composición del veneno, en algunos casos hasta al nivel individual, permite 
generar tratamientos específicos para la atención de las víctimas de accidentes 
ofídicos y los síntomas que estas presentan, para localidades específicas 
(Chiappaux 1991). Por lo tanto, es necesario poner a prueba el efecto del veneno 
de individuos de diferentes localidades, para poder así establecer el efecto 
general del veneno. 
 
La cantidad de veneno necesaria para que el efecto, principalmente digestivo del 
veneno, sea lo suficientemente fuerte como para matar al 50% de la población de 
referencia fue de 106,66 µg. Sin embargo el valor de la dosis letal media, como 
medida de la toxicidad, es una propiedad del veneno. Las propiedades pueden 
sugerir, pero por sí solas, no pueden confirmar con certeza si las características 
mostradas tienen significancia biológica (Kardong 1996). En este contexto, dos 
27 
 
observaciones obvias (pero importantes) que se pueden apreciar en este trabajo 
son: 1. el veneno de B. myersi está involucrado en la inmovilización de la presa, y 
2. para el caso de las serpientes adultas de esta especie, al igual que para el 
resto de la familia Viperidae, un objetivo muy importante del veneno es la pre-
digestión de las presas. 
 
Estas dos conclusiones se fundamentan en que la cantidad de veneno que se 
requiere para producir un efecto letal en ratones M musculus entre 18 y 20g en el 
lapso de 48 horas (131,538 µg, dosis mínima observada a la que ningún individuo 
sobrevive) equivale a 1/400 de la cantidad total de veneno que puede llegar a ser 
extraído de un individuo adulto (54 100 µg para el individuo evaluado). Por lo 
tanto, es posible pensar que una cantidad mucho mayor de veneno inyectada en 
los ratones podría producir la muerte en mucho menos tiempo, además de que se 
registró aletargamiento en el patrón de movimiento en los ratones inoculados, lo 
cual debería incrementar la posibilidad de captura de una presa potencial. 
 
La extravasación prominente en el área ocular que produce el veneno de B. 
myersi en los ratones, es una muestra del efecto hemorrágico de este. Alape-
Giron et al. (2009) señalan que las victimas de mordeduras de B. asper exhiben 
daño local del tejido, caracterizado por dermonecrosis, formación de ampollas, 
edema, hemorragia local, mionecrosis y; en casos severos, desfibrinogenación, 
trombocitopénia, hipoagregación plaquetaria y sangrado distante del sitio de la 
mordida. Si bien no se puede definir con certeza cada uno de estos efectos en el 
veneno de B.myersi mediante el experimento desarrollado, se observó un 
prominente sangrado en varios de los sujetos experimentales inoculados, 
28 
 
condición que ha sido descrita en los análisis del efecto de los venenos de otras 
especies de esta familia, como Bothrops asper y Bothrops jararacussu (Acosta et 
al. 2004, Lira, M. et al. 2007). 
 
De acuerdo con Kardong (1996), Gutiérrez J. M (2002) y Wüster et al. (2008) la 
digestión tiene gran importancia para las serpientes adultas de la familia 
Viperidae. Poseer una secreción como el veneno, que según lo observado en 
B.myersi ostenta un efecto digestivo notable, presenta una ventaja posterior a la 
captura de la presa. Así, el veneno de B. myersi, que resultaría costoso de 
producir en términos energéticos, reduce la cantidad de energía empleada en la 
digestión, además de limitar los movimientos de la presa, aumentando las 
posibilidades de captura. 
 
Sin embargo, el lanzamiento característico de las serpientes de la familia 
Viperidae hacia la presa, no puede ser visto como estereotipado o programado, 
ya que las presas vivas, generalmente exhiben patrones estocásticos de 
movimiento, por lo que la serpiente no puede saber exactamente donde va a 
poner sus colmillos hasta que golpean la presa (Cundall D. 2009). En este 
sentido, existiría una alta probabilidad de que se produzcan errores al depositar el 
veneno en la presa. Por lo tanto, poseer un veneno que produzca muertes en las 
presas potenciales a concentraciones bajas, aumenta las posibilidades de captura 
de la presa, en caso de un ataque poco efectivo a un animal en movimiento. 
 
Ante este panorama, es imposible creer que una adquisición evolutiva tan efectiva 
en la captura y pre-digestión de las presas como el veneno, no pueda representar 
29 
 
un valor agregado en las posibilidades de supervivencia de B.myersi, al igual que 
para todas las serpientes que lo poseen. Por lo tanto, la eficacia biológica de la 
especie es incrementada al poseer un veneno, sin olvidar que éste por sí solo no 
es garantía de la captura de una presa. 
 
Los resultados obtenidos, aunque ofrecen una aproximación a la DL 50 del 
veneno de B. Myersi, no pueden tomarse como datos decisivos, ya que como 
pudo observarse, en el segundo ensayo se aumento la dosis máxima a la que no 
se presenta ninguna muerte, si se compara con el primer ensayo; Esto pudo 
deberse a la pérdida de potencia el veneno debido a deficiencias en el 
almacenamiento. Lo cual demuestra que son necesarios más ensayos en aras de 
generar un estimado más preciso. Además, como ya se mencionó, es necesario 
incluir en este análisis individuos de diferentes localidades, para que la muestra 
represente mejor la variación de la especie. 
 
Bothrocophias myersi, al ser una especie recientemente descrita, posee muy 
pocos datos publicados sobre su biología o ecología, así como sobre la 
composición del veneno y la relación entre los componentes del mismo y el efecto 
que producen. No obstante, este es un buen primer paso en aras de tener un 
mejor conocimiento sobre estos efectos. Adicionalmente, estudios sobre la 
ecología de la especie podrían ofrecer una visión más amplia del veneno, al 
relacionar el veneno con su objeto primordial, que es la captura de las presas. 
 
La DL50 como se abordó en este trabajo solo ofrece una visión general del 
veneno total, actualmente la investigación en este campo, busca identificar la 
30 
 
toxicidad de cada uno de los componentes del veneno con el objeto de encontrar 
tratamientos, no solo contra la mordedura de las serpientes, sino también en otros 
aspectos como, por ejemplo, problemas hemostáticos o cáncer (Gutiérrez 2002). 
Por esta razón es necesario motivar la investigación en este campo, no solo 
porque contamos con un gran número de serpientes venenosas y la tasa de 
incidencia de mordeduras de serpientes es relativamente alta (7.4/100 000), sino 
también porque es un campo prometedor y poco explorado en Colombia. 
31 
 
 
9. LITERATURA CITADA 
 
 
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EVALUACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DEL VENENO DE 
Bothrocophias myersi (SQUAMATA: SERPENTES) 
 
 
 
 
 
 
DANIEL GÓEZ VALENCIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009I
EVALACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DEL VENENO DE Bothrocophias 
myersi (SQUAMATA: SERPENTES) 
 
DANIEL GÓEZ VALENCIA 
 
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de biólogo 
con mención en zoología 
 
Director 
Carlos Andrés Galvis Rizo 
Biólogo 
 
 
Codirector 
Alan Giraldo López Ph. D. 
Biólogo 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
ii 
 
NOTA DE APROBACION 
El trabajo de grado titulado “EVALACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) 
DEL VENENO DE Bothrocophias myersi (SQUAMATA: SERPENTES)” presentado 
por el estudiante DANIEL GÓEZ VALENCIA, para optar al título de biólogo con 
mención en zoología, fue revisado por el jurado y calificado como: 
 
Aprobado 
 
 
 
Carlos Andrés Galvis Rizo 
Director 
 
 
 
Alan Giraldo López 
Codirector 
 
 
 
Estevan Osorio Cadavid 
Director Programa Académico de Biología 
iii 
 
DEDICATORIA A mi mamá (Cruz E. Valencia Bravo), jamás habría sido posible 
sin tu apoyo. A mi papá (Pedro P. Góez Romero) gracias por enseñarme a vivir. A 
los que estuvieron allí para mostrarme el camino y no dejarme perder; y a los que 
me abandonaron y me dieron la espalda. A todos aquellos que influenciaron mi 
vida positiva o negativamente, porque por sus ejemplos, positivos o negativos, he 
podido aprender a vivir lo suficientemente bien como para que ahora se me 
presente el titulo de biólogo… 
 
…A los que simplemente no lo creyeron posible. 
 
Y a mí. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
AGRADECIMIENTOS A la Fundación Zoológica de Cali por la financiación de este 
proyecto de investigación, especialmente a Carlos Andrés Galvis rizo, Germán 
Corredor, Gustavo Caicedo y Arelis Santiago. A La Universidad del Valle, 
específicamente a Alan Giraldo López en la sección de Zoología, al personal de 
los Laboratorios de Biología, y a Santiago Castaño en la Escuela de Fisiología. A 
Fancisco Ruiz y Ricardo Vanegas del Instituto Nacional de Salud; a Darwin Ortiz 
Laboratorio de Calidad Nutricional en el CIAT y a Diego Álvarez. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
TABLA DE CONTENIDO 
Página 
NOTA DE APROBACION……………………………………………………….. ii 
 
DEDICATORIA…………………………………………………………………… iii 
 
AGRADECIMIENTOS……………...…………………………………………… iv 
 
LISTAS DE TABLAS …………...……………………………………………… vi 
 
LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………….... vii 
 
1. RESUMEN………………………………………………………………………... viii 
 
2. INTRODUCCION………………………………………………………………… 1 
 
3. MARCO TEORICO………………………………………………………………. 5 
 
4. OBJETIVOS………………………………………………………..…….……….. 9 
 4.1. General…………………………………………………………………… 9 
 4.2. Específicos…………………………...……………….………………….. 9 
 
5. HIPOTESIS…………………..……………………………………………….…….. 9 
 
6. MATERIALES Y METODOS…………….…………………………………….…. 10 
 6.1. Organismo estudiado……..…………………………………………...... 10 
 6.2. Modelo biológico experimental..………………………………….….… 12 
 6.3. La dosis letal media o DL 50…………………….………..……..…….. 14 
 6.4. Obtención del veneno y cálculo de las dosis a evaluar.…….….…... 14 
 6.5. Manipulación e inoculación de los ratones….…….…………………. 18 
 6.6. Calculo de la dosis letal media (DL 50)………..……………………... 19 
 
7. RESULTADOS….…………………………………………………..…………...… 21 
 
8. DISCUSION…………….………………………………………………………..…. 24 
 
9. LITERATURA CITADA……………….………………………………..…………. 31 
 
ANEXO A………….…….…………………………………………………………….. 34 
vi 
 
 
LISTA DE TABLAS 
Página 
TABLA 1: Resultados obtenidos en el primer ensayo………………………....... 21 
 
TABLA 2.Resultados obtenidos para el cálculo de la DL50………………….... 22 
 
TABLA 3. Resultados obtenidos en el tercer ensayo……………………………. 23 
 
TABLA 4. Resultados obtenidos en el cuarto ensayo…………………………… 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Página 
FIGURA 1. Distribución geográfica de las especies del género 
 Bothrocophias……………………………………………………… 11 
 
FIGURA 2. Tabla dinámica implementada en el INS para el cálculo 
 de la DL50…………………………………………………………… 16 
 
FIGURA 3. Procedimiento seguido para la manipulación e inyección de los 
 ratones durante el ensayo…………………………………………. 19 
 
FIGURA 4. Ratón afectado, presentando hemorragia ocular………………. 22. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
 
1. RESUMEN 
En Colombia, la investigación con respecto de los venenos de las serpientes, es 
relativamente escasa. Situación preocupante debido a la gran cantidad de 
serpientes venenosas en nuestro medio y a una tasa de incidencia de 7,4/100 000 
habitantes. En este trabajo se evaluó la dosis letal media del veneno de 
Bothrocophias myersi (2001) mediante el método de Spearman-Karber, y se 
realizaron observaciones sobre los efectos visibles de este veneno, buscando 
comparar su accionar con la información reportada para otras serpientes de la 
misma familia. Se obtuvo un valor estimado para la DL50 de 106,66 µg con un 
intervalo de confianza (95%) entre 97,14 µg – 117,12 µg, sobre ratones ICR - CD1 
de 18-20g. También se pudo observar que el efecto principal del veneno de esta 
serpiente fue la hemorragia, ya que algunas de las unidades experimentales 
presentaron hemorragia ocular prominente que terminaba por matar los individuos 
afectados hasta 72 horas después de la inyección del veneno. 
 
1 
 
2. INTRODUCCION 
Con el incremento de las poblaciones humanas y la consiguiente extensión de la 
frontera agrícola se genera un creciente número de encuentros entre serpientes y 
humanos. Estos encuentros generalmente desencadenan la muerte de la 
serpiente, aunque en algunas ocasiones puede terminar en una mordedura que 
puede ser inofensiva o producir envenenamiento. En diferentes lugares del 
mundo, los envenenamientos por mordeduras de serpientes constituyen un 
problema de salud pública (Warrell 1992, Chiappaux 1998, citados por Rucavado 
et al 2004). En este sentido, se estima que la mortalidad global causada por 
mordeduras de serpientes oscila entre 50 000 a 100 000 casos por año, aunque el 
número es difícil de estimar y se considera subestimado debido a los muchos 
casos en que los pacientes reciben tratamiento tradicional y pueden morir sin 
reporte oficial (Teakston et al. 2003). 
 
En Colombia cada año son reportados aproximadamente 2 000 accidentes 
ofídicos, con una tasa de incidencia de 7.4/100 000 habitantes. Los 
departamentos con mayor incidencia de mordedura de serpientes son: Antioquia, 
Chocó, Meta, Norte de Santander, Casanare, Caldas y Cauca 
(http://www.minproteccionsocial.gov.co). Siendo la mayoría de los accidentes 
ofídicos (entre un 90– 95%) causados por serpientes de la familia Viperidae. Ante 
este panorama, incluso en Colombia, los accidentes con serpientes se tornan en 
un problema de salud pública especialmente en áreas rurales (Gaviria et al. 2005, 
Sells 2003). Esta problemática se intensifica debido a que existe un alto grado de 
desconocimiento sobre el tema ofídico, lo que ocasiona que muchos casos no 
sean adecuadamente tratados, o se presenten subestimaciones de su gravedad, 
2 
 
lo que sumado a la relativamente alta morbilidad puede resultar en un incremento 
en la tasa de mortalidad (C. Galvis com. pers.). 
 
Lo anterior plantea la necesidad de recopilar información en aras de incrementar 
nuestro conocimiento, tanto en el aspecto clínico de los efectos del veneno como 
también sobre la biología y ecología de las serpientes. Lo cual en últimas se verá 
reflejado en incremento de la prevención y una mejor atención de los casos de 
accidente ofídico, para así reducir la tasa de incidencia. 
 
Desafortunadamente aún se encuentran especies que podrían considerarse de 
importancia médica, pero, de las que no se tiene conocimiento, o el conocimiento 
es muy reducido. Este es el caso de Bothrocophias myersi (Gutberlet & Campbell 
2001), una especie de serpiente venenosa clasificada taxonómicamente en la 
Familia Viperidae cuya localidad típica está definida en los departamentos del 
Cauca y Valle del Cauca (Colombia) (Campbell & Lamar 2005), y fue 
recientemente descrita por Gutberlet & Campbell (2001), existiendo pocos 
registros sobre su biología, ecología, e incluso sobre el efecto de su veneno. 
 
Al igual que muchos otros miembros de la familia Viperidae, el género 
Bothrocophias, presenta características fenotípicas compartidas entre las 
especies integrantes. Una de ellas es la glándula del veneno, la cual produce una 
sustancia viscosa que, en términos generales, estaría compuesta por un grupo de 
enzimas, toxinas, y péptidos cortos disueltos en agua. Esta sustancia es la 
encargada de la muerte y pre-digestión de sus presas. Por esta razón, su efecto 
podría estar relacionado con sus hábitos alimentarios, así como también de la 
3 
 
edad del individuo que se evalúe y de la población de referencia, tal como lo 
reportaron Alape- Girón et al. (2008) para dos poblaciones de Bothrops asper en 
Costa rica.” 
 
En términos generales, los venenos de serpientes se han caracterizado en su 
acción a través de los años. Por ejemplo, el veneno de las serpientes de la familia 
Elapidae es considerado neurotóxico, debido a la acción de α-neurotoxinas que 
actúan a nivel pre y post-sináptico generando parálisis y toxicidad muscular en el 
individuo inoculado (Rosso et al. 1996 & Alape-Girón et al. 1996). En este sentido, 
los envenenamientos por mordeduras de serpientes de la familia Viperidae son 
caracterizados por efectos locales más drásticos, que incluyen necrosis, edema y 
dolor; así como alteraciones sistémicas implicando hemorragias, coagulopatías, 
fallas renales y shock; condiciones que se desarrollan rápidamente después del 
accidente y con frecuencia resultan en secuelas permanentes (Pereira et al. 2004, 
Acosta et al. 2004). 
 
Es importante mencionar que el interés en la caracterización del veneno de una 
serpiente, es el primer paso para entender su rol ecológico, toda vez que de la 
efectividad del veneno depende la posibilidad de alimentarse y por consiguiente 
de sobrevivir. Adicionalmente, el incremento de la probabilidad de encuentro 
Hombre-Serpiente pone de manifiesto otro elemento a considerar en el estudio 
del veneno de las serpientes, y es la producción de anti-venenos. En este sentido, 
la estandarización de los métodos para evaluar la acción de los venenos 
propuesta por la Organización Mundial para la Salud - OMS (Theakston & Reid 
1983), constituye un punto de partida, para la evaluación apropiada de estas 
4 
 
sustancias en aras de conocer y desarrollar terapias que sean más efectivas en 
los laboratorios interesados en el tema a nivel mundial. 
 
Aunque el efecto del veneno es causado por una variedad de componentes del 
mismo, entre los que se encuentran fosfolipasas A2, miotoxínas de bajo peso 
molecular y metaloproteinasas, entre otros (Fernández et al. 2006), y Los 
procedimientos descritos por la OMS frecuentemente son utilizados en pruebas 
con fracciones de venenos; en el presente trabajo no se evaluó la acción 
específica de cada componente, sino del veneno en conjunto como una unidad de 
riesgo potencial. Para este propósito se analizó el accionar del veneno de B. 
myersi utilizando como modelo de estudio ratones (Mus musculus) de la cepa 
ICR-CD1 albinos, de acuerdo con lo establecido por la OMS para este tipo de 
estudios, comparando los resultados con el accionar del veneno de otras especies 
de este género. 
5 
 
 
3. MARCO TEORICO 
En América latina, los venenos de serpientes hansido estudiados a lo largo de 
aproximadamente 125 años. Los primeros reportes datan de 1884 y 1911 cuando 
J.B. de Lacerda y Vital Brazil realizaron los primeros trabajos en este tema 
(Lacerda 1884 y Brazil 1911, citados por Guttierrez 2002), pocos años después de 
la invención de la seroterapia antiofídica en Francia (Vital Brazil 1987, Bon 1996). 
Desde entonces, y no solo en América latina, sino en todo el mundo se han 
encaminado esfuerzos hacia un mejor entendimiento de estas sustancias. Estos 
esfuerzos, generalmente han sido dirigidos a la caracterización de la acción del 
veneno desde un punto de vista clínico; donde se busca desarrollar sueros 
antiofídicos eficientes para contrarrestar los efectos de las toxinas, nuevas 
herramientas de investigación y drogas de uso clínico potencial (Alape-Giron et al. 
2009). 
Sin embargo, estas observaciones también podrían considerarse desde una 
perspectiva biológica, donde el rol del veneno al relacionarse directamente con las 
características reveladas por su accionar sobre una posible presa, ayudan a 
esclarecer algunos aspectos directamente implicados en su letalidad, y por ende 
en su valor adaptativo en términos de incrementar la supervivencia de la especie, 
al mejorar sus posibilidades en la consecución de presa y alimento. 
 
En términos generales los venenos de serpiente son sustancias viscosas, 
producidas en las glándulas del veneno que poseen todas las especies de las 
familias Viperidae, Elapidae e Hydrophiidae; y algunas especies de la familia 
6 
 
Colubridae (Kardong 1996).En el caso particular de la familia Viperidae, estas 
sustancias están compuestas de proteínas que pertenecen a unos pocos grupos 
proteicos incluyendo enzimas: serinas, proteinasas, metaloproteinasas Zn2+, L- 
aminoácido oxidasa, fosfolipasas A2; y proteinas sin actividad enzimática como: 
desintegrinas, lectinas tipo C, péptidos natriureticos, miotoxinas, Toxinas CRISP, 
factores de crecimiento nervioso y vascular del endotelio, e inhibidores de 
proteinasas tipo cistatina y Kunitz (Alape-Giron et al. 2009, Gutiérrez et al. 
2005).De acuerdo con Kardong (1996) y Chiappaux (1991), la función principal del 
veneno es la de matar o inmovilizar la presa, además de asistir en la digestión de 
la misma. 
 
La aparición del veneno en el linaje de las serpientes ha sido identificado antes de 
la diversificación de los Colubroideos actuales, con posterior pérdida de la 
glándula de veneno en algunos grupos (Fry & Wüster 2004). Desde el punto de 
vista biológico, los venenos representan una innovación crítica en la evolución de 
los ofidios, ya que permitieron la transición desde una forma mecánica (la 
constricción) a una química (veneno) para la captura y digestión de las presas 
(Álape-Girón et al. 2009). 
 
La complejidad actual de los venenos de serpientes ha evolucionado desde un 
reducido set de proteínas con funciones fisiológicas normales, que fueron 
reclutadas en el proteóma del veneno antes de la diversificación de las serpientes 
“avanzadas” (Superfamilia: Colubroidea) y modificadas a lo largo de su historia 
(Fry & Wüster 2004). Por lo tanto, la composición de los venenos puede retener 
información respecto de su historia evolutiva, y por ende tiene un alto valor 
7 
 
taxonómico (Alape-Giron et al. 2009). En este contexto, no sorprende que el 
accionar de los venenos de las serpientes tienda a ser generalizado en niveles 
taxonómicos tan amplios como el de Familia. Entre las serpientes venenosas, las 
representantes de la familia Viperidae son las responsables por la mayoría de los 
accidentes ofídicos en Latinoamérica (Hardy 1994, Acosta et al. 2004, Benghini et 
al. 2004, Lira et al. 2007). Por tal motivo son las serpientes más estudiadas en 
nuestro medio. Los institutos de investigación más destacados en los que se han 
hecho trabajos en este tema a lo largo del último siglo son el Butantán en Brasil y 
el Clodomiro Picado en Costa Rica (Hardy 1994, Guttierrez 2002, Lira et al. 2007), 
así como también algunos grupos de investigación argentinos (Acosta et al. 
2004). 
 
Para lograr su objetivo, los venenos de los viperidos producen una combinación 
de los siguientes efectos: cardiotóxico, miolitico, coagulante (o anticoagulante), 
activador o inhibidor hemostático y/o hemorrágico (Chiappaux, 1991). Estas 
actividades desencadenan una combinación de efectos locales y sistémicos que 
generan la muerte del organismo afectado. Los efectos locales visibles más 
importantes son: dolor intenso, edema eritematoso, equimosis, flictenas 
hemorrágicos y necrosis con infección secundaria; y las alteraciones sistémicas 
más frecuentes incluyen: toxicidad vascular, renal y hemorragias (Lovera, A 
2006). 
 
Uno de los efectos más difundidos entre los venenos de serpientes de la familia 
Viperidae (subfamilias Viperinae y Crotalinae) es la hemorragia. Con algunas 
excepciones, estos venenos inducen intoxicaciones caracterizadas por 
8 
 
hemorragia que puede presentarse localmente en el lugar de la inoculación del 
veneno, contribuyendo a la isquemia local y a la pobre regeneración de los 
tejidos; afectando sistemáticamente múltiples órganos y originando serias 
complicaciones como choque cardiovascular (Girón et al. 2008). El resultado 
visible de este efecto es la extravasación, que ocurre al nivel de las vénulas y los 
capilares, produciendo grandes modificaciones con alteraciones prominentes en 
la morfología de las células endoteliales. Estas alteraciones fueron observadas 
como resultado de ensayos con la fracción correspondiente a las 
metaloproteinasas de los venenos de varias especies (Gutiérrez et al. 2005). 
Mientras que fracciones como las correspondientes a las Fosfolipasas A2, están 
más relacionadas con toxicidad en los tejidos musculares (Gutiérrez & Ownby 
2003). 
9 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1. General: 
Evaluar, mediante ensayos in vivo la dinámica de la acción letal del veneno de 
Bothrocophias myersi. 
 
4.2. Específicos: 
Obtener valores de DL50 para el veneno de B. myersi bajo condiciones 
experimentales. 
Describir el accionar del veneno de B. myersi bajo condiciones experimentales 
 
5. HIPOTESIS 
Ha: El veneno de Bothrocophias myersi presenta una respuesta tóxica similar a la 
descrita para los venenos de viperidos. 
Ho: El veneno de Bothrocophias myersi no presenta una respuesta tóxica similar 
a la reportada para los venenos de viperidos. 
10 
 
 
6. MATERIALES Y METODOS 
6.1. Organismo estudiado 
Las serpientes de la familia Viperidae son importantes componentes ecológicos 
de los bosques neo-tropicales y con frecuencia son consideradas en términos de 
la potencia de su veneno (Hardy 1994), aunque existen escasos datos publicados 
sobre su ecología y/o la capacidad de sus venenos. Estas serpientes han radiado 
en casi todo tipo de hábitat terrestre; siendo ubicuas en terrenos tan variados 
como desiertos, bosques boreales, bosques nublados y bosques húmedos 
tropicales, entre otros. Algunos viperidos son semiacuaticos o arborícolas pero la 
mayoría presentan cuerpos relativamente pesados y son de hábitos terrestres 
(Campbell & Lamar 2004). 
 
En este taxón se encuentra un grupo complejo de serpientes, inicialmente 
considerado como Bothrops, posteriormente como Bothriopsis y más adelante 
ubicadas taxonómicamente en el nuevo género Bothrocophias por Gutberlet & 
Campbell (2001). Sin embargo (Wüster et al. 2008), mediante un análisis de 
secuencias génicas relacionadas con el veneno, no encontraron evidencia 
suficiente para separar las serpientes analizadas del género Bothrocophias de las 
del género Bothrops, aunque recomienda mantener la separación taxonómica 
para evitar confusiones a nivel médico. El género Bothrocophias está compuesto 
por cuatro especies distribuidas geográficamente en el norte de Suramérica (ver 
figura 1). Entre estas, existen dos especies muy emparentadas, anteriormente 
consideradasuna sola especie, B campbelli que se distribuye en Ecuador y B. 
myersi que presumiblemente se distribuye en gran parte del chocó biogeográfico 
11 
 
colombiano, aunque solo existen reportes para la región pacifica de los 
departamentos del Cauca y el Valle del Cauca (Gutberlet & Campbell 2001). 
 
Figura 1. Distribución geográfica de las especies del género Bothrocophias. 
Fuente: Gutberlet & campbell.2001. 
 
 
El conocimiento relativo a la biología o ecología de B. myersi es escaso. 
Solamente se cuenta con unos pocos individuos en cautiverio, provenientes de 
localidades como Piangüita y Chucheros municipio de Buenaventura, 
Departamento del Valle del Cauca, Colombia. De acuerdo con observaciones 
12 
 
realizadas en estas localidades, esta especie es de hábito terrestre, siendo 
encontrada generalmente bajo troncos caídos, en el sotobosque del bosque 
húmedo tropical, bajo condiciones de alta humedad (W. Bolívar Obs. Pers.). Estos 
registros además demuestran que puede ser observada entre 0 y 50 m de altura 
sobre el nivel del mar, aunque Campbell & Lammar (2004) la sitúan 
altitudinalmente entre 75–200 m. Lamentablemente no se tiene conocimiento 
sobre sus hábitos alimentarios en ambiente natural, aunque algunas especies del 
mismo género, como B. hyoprora (Amazonas) y B. campbelli (Ecuador) se 
alimentan principalmente de roedores y lagartos (Campbell & Lamar 2004). Sin 
embargo, algunos individuos B myersi que se encuentran en cautiverio en la 
Fundación Zoológica de Cali, han sido exitosamente alimentados con roedores 
(C. Galvis com. pers.). 
 
6.2. Modelo biológico experimental 
El modelo de estudio utilizado en este trabajo para evaluar la acción del veneno 
de B. myersi fueron los ratones Mus musculus. Estos ratones, además de semejar 
presas potenciales para la mayoría de las serpientes, presentan una alta tasa 
reproductiva, llegando a producir camadas de hasta 15 crías. La cepa ICR-CD1 
ha sido seleccionada para pruebas de toxicidad aguda debido a que es producto 
de exo-cría. Por consiguiente presenta una consanguinidad baja, que se traduce 
en que ésta representa de alguna forma la variación poblacional, elemento 
importante al considerar el efecto tóxico de una sustancia mediante el cálculo de 
la dosis letal media. Ya que sin esta variación, el efecto que la sustancia genere 
debería ser el mismo para todos los individuos y bajo estas circunstancias no 
sería posible calcular la dosis letal media. Otro beneficio adicional, es que 
13 
 
aumenta la posibilidad de reproducir las condiciones del experimento lo que 
representa un beneficio en la medida en que exhibe resultados comparables en 
los laboratorios interesados en el tema a nivel mundial. 
 
Los ratones se mantuvieron en cajas plásticas con capacidad para 15 litros con 
alimento y agua suficientes. El interior de las cajas fue tapizado con viruta de pino 
sin tratar, esto desestima cualquier efecto que puedan tener los químicos con que 
se trata la madera sobre la salud de los ratones. Además se mantuvieron en un 
lugar aislado reduciendo así el efecto de variables no controlables o indeseables 
en los experimentos realizados, que pudieran ocasionar alteraciones en los 
resultados de los ensayos. Toda manipulación de individuos en las cajas de 
contención se realizó utilizando una bata de laboratorio, gafa protectoras de 
acetato y guantes de nitrilo, manteniendo las condiciones asepsia requerida. 
Además, se evitó el uso de barniz de uñas o perfumes que pudieran generar 
olores molestos a los animales. 
 
Cabe destacar que el uso de animales vivos en este tipo de ensayos está 
fundamentado en la necesidad de medir la toxicidad y el efecto patológico total de 
un veneno (Sells 2003), ya que un organismo vivo y funcional representa mejor 
las condiciones reales de un envenenamiento. Esto es importante si se considera 
que normalmente estos estudios están encaminados a probar tratamientos para el 
beneficio humano. 
 
 
 
14 
 
6.3. La dosis letal media o DL50 
La dosis letal media (DL50) será entendida de acuerdo a Kardong (1996), quien la 
define como una medida de la toxicidad de una sustancia cualquiera (en este 
caso veneno de B. myersi), relativo a una población objeto, usualmente animales 
de laboratorio (para este trabajo M. musculus albinos de la cepa ICR-CD1). En 
este contexto es importante definir que se considerará el veneno como una 
sustancia que contribuye a la supervivencia del organismo que la produce, en 
términos de su rol biológico (ver Kardong 1996). 
 
Para estimar el DL50 se utilizó el método de Spearman-Karber. De acuerdo con 
Bross (1950), este método es el que genera mejores resultados incluso cuando se 
trabaja con tamaños de de muestra pequeños. Además, es el más simple 
computacionalmente y el más difundido en investigaciones de toxicidad aguda. 
Mediante este método se establece la curva de dosis respuesta a partir de un 
numero de grupos de ratones (cada uno compuesto por 5 ratones), el cual es 
inoculado con diferentes cantidades de veneno. Un rango de efectos es 
observado donde la menor cantidad inyectada de veneno produce 100% de 
supervivencia y la mayor cantidad de veneno inyectado resulta en el 100% de 
mortalidad, siendo requerido un mínimo de tres grupos intermedios con número 
variable de muertes (Sells 2003). 
 
6.4. Obtención del veneno y cálculo de las dosis a evaluar 
El veneno fue obtenido a partir del ordeño una hembra adulta de la especie B. 
myersi depositada en la colección viva de la Fundación Zoológica de Cali. La 
serpiente fue motivada a morder una membrana de para-film cubriendo un 
15 
 
beacker de 100 mL, donde se deposito el veneno de la mordida. Acto seguido se 
procedió a hacer presión sobre la zona donde deberían estar ubicadas las 
glándulas del veneno y así se maximizó la cantidad de veneno obtenido mediante 
un evento de manipulación de la serpiente. 
 
Todo el material de vidrio utilizado para la contención y preparación de soluciones 
de veneno durante los ensayos biológicos en el laboratorio de Ecología Animal de 
la Universidad del Valle, fue previamente esterilizado de acuerdo con el protocolo 
realizado durante la colecta del veneno. Este procedimiento consistió en lavar con 
jabón en polvo, enjuagar con agua de grifo y con ácido nítrico. Posteriormente se 
lavó el material con agua des-ionizada, se enjabonó con jabón neutro, se lavó con 
agua des-ionizada nuevamente y se pasó por solución de Folch y etanol/metanol. 
Finalmente se enjuagó con agua des-ionizada, se secó en una estufa a 100 °C 
durante 8 - 10 horas, y se introdujo a un ciclo del Autoclave. 
 
Para calcular las dosis de veneno a ser utilizadas durante cada ensayo se generó 
una tabla dinámica de Excel donde se consignaron los datos más relevantes del 
experimento realizado (ver Anexo A). Cabe destacar que se tomó como plantilla la 
tabla dinámica implementada en el Instituto Nacional de Salud (INS). En esta 
tabla se resumen los volúmenes a medir, los volúmenes a inocular, y la 
concentración de las soluciones, entre otros (Figura 2). 
 
16 
 
 
Figura 2.Tabla dinámica implementada en el INS para el cálculo de la DL50. 
 
Para el desarrollo de los ensayos se definió la concentración del veneno: 
 
Donde : representa el volumen de veneno en el ensayo i adicionado a la 
solución, (el volumen inicial es decidido por el investigador) y x: la cantidad de 
veneno a pesar en el ensayo i. Esta cantidad de veneno se define como: 
 
 
Donde representa el titulo del veneno para el ensayo. El titulo inicial es 
decidido por el investigador. : El volumen de la solución final a inocular por 
ratón y , es el volumen total por ensayo. Salvo , que es decidido por el 
investigador; los demás valores para el cálculo de la concentración inicial del 
veneno son constantes. Por esta razón es posible, a partir de cualquier valor en la 
17 
 
tabla, determinar la concentración