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ANTIGENICIDAD DE FRAGMENTOS RECOMBINANTES DE LA SUBUNIDAD 200L DE LA PROTEÍNA MSP-1 DE Plasmodium vivax JIMMY BECERRA ENRIQUEZ UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2010 ANTIGENICIDAD DE FRAGMENTOS RECOMBINANTES DE LA SUBUNIDAD 200L DE LA PROTEÍNA MSP-1 DE Plasmodium vivax JIMMY BECERRA ENRIQUEZ Trabajo de Grado para optar al título de Biólogo Director SÓCRATES HERRERA VALENCIA, MD. Director Instituto de Inmunología del Valle Universidad del Valle UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2010 ii UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA JIMMY BECERRA ENRÍQUEZ “ANTIGENICIDAD DE FRAGMENTOS RECOMBINANTES DE LA SUBUNIDAD 200L DE LA PROTEÍNA MSP-1 DE Plasmodium vivax” TEMAS: - GENÓMICA - PROTEÓMICA - INMUNOLOGÍA 2010 iii Nota de aprobación El trabajo de grado titulado “Antigenicidad de fragmentos recombinantes de la subunidad 200L de la proteína MSP-1 de Plasmodium vivax ”, presentado por el estudiante JIMMY BECERRA ENRIQUEZ, para optar al título de biólogo, fue revisado por el jurado y calificado como: Aprobado _________________________ SOCRATES HERRERA VALENCIA Director _________________________ Jurado iv A mis padres y mis hermanos: “Estar preparado es importante, saber esperar lo es aún más, pero aprovechar el momento adecuado es la clave de la vida” Arthur Schnitzler v AGRADECIMIENTOS A mis padres Donato Becerra y Carmen Enríquez por todo el apoyo que me han brindado y por estar siempre contribuyendo en mi formación integral. A todos mis hermanos y en especial a Ovidio Becerra quien me demostró su apoyo incondicional durante todo el proceso de mi formación. Al Dr. Sócrates Herrera y a la Dra. Myriam Arévalo por aceptarme en su grupo de investigación, por su apoyo y orientación durante la realización de este trabajo. Al Centro Internacional de Vacunas, al Instituto de Inmunología del Valle y a Colciencias por brindar el soporte financiero. A Diana Echeverry, Fabián Carrillo, Andrea Díaz y Juana Vergara por aportarme su conocimiento y experiencia en el desarrollo de este trabajo. A mis compañeras de laboratorio, Alejandra Tobón y Tania Cristina Gaviria quienes estuvieron atentas a colaborarme y apoyarme en los momentos que más los necesité. A familiares y amigos que de una u otra forma contribuyeron durante este proceso. vi TABLA DE CONTENIDO Página 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2 3. MARCCO TEÓRICO 5 3.1 El problema de la malaria 5 3.2 La malaria en América 6 3.3 La malaria en Colombia 7 3.4 La malaria en Brasil 8 3.5 Ciclo de vida del parásito 9 3.6 Antígenos candidatos a vacuna contra la malaria 11 3.7 Proteína MSP-1 11 4. OBJETIVOS 16 4.1 General 16 4.2 Específicos 16 5. MATERIALES Y MÉTODOS 17 5.1 Amplificación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 por PCR 17 5.2 Ligación de los fragmentos en pcDNA3.1/V5-His-TOPO 18 5.3 Purificación de insertos y vectores 18 5.4 Ligación de los fragmentos en el vector pET-24a(+) 19 5.5 Preparación de bacterias E. coli químicamente competentes 19 5.6 Transformación de bacterias E. coli químicamente competentes 20 5.7 Miniprep (Extracción de ADN plasmídico) 21 5.8 VERIFICACIÓN DE LA CLONACIÓN Y MARCOS DE LECTURA 22 5.8.1 Análisis con enzimas de restricción 22 5.8.2 PCR 22 5.8.3 Secuenciación 22 5.9 EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS Pv200L-1 y Pv200L-3 23 5.9.1 Expresión proteica a pequeña escala 23 5.9.2 Gel de acrilamida 23 5.9.3 Inmunoblot 24 vii 5.10 EXPRESIÓN A MEDIANA ESCALA 25 5.10.1 Inducción de la expresión 25 5.10.2 Aislamiento de las proteínas 25 5.10.3 Purificación y cuantificación 26 5.11 DETERMINACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD 27 5.11.1 Sueros 27 5.11.2 Pruebas ELISA 27 6 RESULTADOS 28 6.1 Amplificación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 por PCR 28 6.2 CLONACIÓN Y ANALISIS DE LOS FRAGMENTOS 29 6.2.1 Clonación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en pcDNA3.1/V5-His-TOPO 29 6.3 Purificación de insertos y vectores 31 6.4 Clonación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en el vector pET-24a(+) 33 6.5 EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS Pv200L-1 y Pv200L-3 36 6.5.1 Expresión proteica a pequeña escala 36 6.6 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS PROTEICOS A MEDIANA ESCALA 38 6.7 Cuantificación del producto 39 6.8 DETERMINACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD 40 6.8.1 Reconocimiento de los tres fragmentos por sueros de individuos de área endémica de Colombia 40 6.8.2 Reconocimiento de los tres fragmentos por sueros de individuos de área endémica de Brasil 41 7 DISCUSIÓN 45 8 CONCLUSIONES 50 9 PERSPECTIVAS 51 BIBLIOGRAFÍA 52 viii LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1: Distribución de la malaria en el mundo 5 FIGURA 2: Casos de malaria por P. falciparum y P. vivax en Colombia entre el periodo 1960-2006. 8 FIGURA 3: Ciclo de vida de Plasmodium.10 FIGURA 4: Esquema de los fragmentos proteolíticos de la MSP-1 de P. falciparum 12 FIGURA 5: Esquema de la PvMSP-1 y la subunidad Pv200L fragmentada 14 FIGURA6: Análisis de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 amplificados por PCR convencional. 29 FIGURA 7: Análisis de restricción con enzimas PvuII y BamHI en Pv200L-1 y Pv200L-3. 30 FIGURA 8: Amplificación de los fragmentos en pcDNA3.1. 31 FIGURA 9: Fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 generados por digestión con enzimas de restricción. 32 FIGURA 10: Plásmido pET24a(+) digerido con enzimas de restricción. 32 FIGURA 11: Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-3 y pET24a(+). 33 FIGURA 12: ADN plasmídico recombinante de pET24a(+) + Pv200L-1 y pET24a(+) + Pv200L-3. 34 FIGURA 13: Producto de la doble digestión con enzimas de restricción NdeI y XhoI en Pv200L-1 y Pv200L-3 en gel de agarosa al 1.2% 34 FIGURA 14: Producto de digestión con enzimas de restricción PvuII y VspI en Pv200L-1 y Pv200L-3. 35 FIGURA 15: Amplificación por PCR de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3. 36 FIGURA 16: Expresión de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en E. coli BL21 (DE3) Lys 37 ix FIGURA 17: Análisis de los fragmentos proteicos; Pv200L-1 y Pv200L-3 por la técnica de inmunoblot. 37 FIGURA 18: Fragmento Pv200L-1purificado por IMAC y analizado por SDS-PAGE 38 FIGURA 19: Fragmento Pv200L-1purificado por IMAC y analizado por SDS-PAGE 39 FIGURA 20: Curva de calibración y ecuación para determinar las concentraciones de Pv200L-1 y Pv200L-3 39 FIGURA 21: Reconocimiento de los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 por sueros de individuos de área endémica en Colombia 40 FIGURA 22: Reconocimiento de los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 por sueros de individuos de área endémica en Brasil 41 FIGURA 23: Fragmentos que reaccionaron con sueros de Colombia representados en diagramas de caja. 42 FIGURA 24: Fragmentos que reaccionaron con sueros de Brasil representados en diagramas de caja. 43 FIGURA 25: Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 que reaccionaron con sueros de Colombia y Brasil. 44 x LISTA DE TABLAS Página TABLA 1: Oligonucleótidos diseñados para cada uno de los fragmentos 17 TABLA 2: Fragmentos esperados al digerir con enzimas de restricción (PvuII y BamHI) los plásmidos recombinantes con cada uno de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 30 TABLA 3: Fragmentos esperados al digerir con enzimas de restricción PvuII y VspI 35 TABLA 4: Títulos de anticuerpos contra Pv200L-1 con sueros de Colombia y Brasil 45 xi ANEXOS Página Anexo 1 Mapa del plásmido pcDNA3.1/V5-His-TOPO 55 Anexo 2 Mapa del plásmido pET24a(+) 55 Anexo 3 Secuencia nucleotídica de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en el plásmido pcDNA3.1 56 Anexo 4 Secuencia nucleotídica de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en el plásmido pET24a (+) 58 1 1. RESUMEN La MSP-1 (merozoite surface protein 1) es una proteína del estadío sanguíneo involucrada en los procesos de invasión de Plasmodium a los glóbulos rojos. Esta proteína ha sido intensamente estudiada y con base en sus características inmunológicas se considera como un candidato para el desarrollo de una vacuna contra la malaria. Un fragmento de la región N-terminal de la MSP-1 de P. vivax que se ha denominado Pv200L es considerado como una subunidad altamente antigénica e inmunogénica que induce protección parcial contra la infección en primates. El objetivo de este estudio fue determinar y comparar la antigenicidad de tres fragmentos correspondientes a la subunidad Pv200L. Para tal propósito se clonaron dos fragmentos; Pv200L-1 y Pv200L-3 (en un vector de expresión en procariotas (pET-24a(+)), se expresaron en bacterias Escherichia coli y se purificaron para determinar su antigenicidad mediante la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). El fragmento Pv200L-2 expresado previamente fue analizado usando la misma técnica. Para la técnica ELISA se utilizaron sueros de individuos de áreas endémicas de Colombia y Brasil que habían sido infectados por P. vivax. En este estudio se mostró que los sueros de individuos de Colombia reconocieron los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 en frecuencias de 94,5%, 85,45% y 98,1% respectivamente. Mientras que los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 fueron reconocidos en un 100% por los sueros de Brasil, el fragmento Pv200L-2 fue reconocido por el 70%. También se observó que en ambos grupos de sueros, el nivel de reconocimiento de Pv200L-1 es significantemente mayor que los otros dos fragmentos, siendo el nivel antigénico similar en los dos países (p=0.086241). El reconocimiento de los fragmentos Pv200L-2 y Pv200L-3 en los dos países no se diferencian entre sí [(p=0.23) y (p=0.114003)] respectivamente. No obstante Pv200L-3 presentó diferencias de reconocimiento entre los sueros de Colombia y Brasil (p=0.017006). En conclusión, los tres fragmentos mostraron ser antigénicos, siendo Pv200L-1 más predominante que los fragmentos Pv200L-2 y Pv200L-3, los cuales presentaron niveles de antigenicidad más bajos. Pese a estas diferencias entre los fragmentos, la antigenicidad de cada uno de estos entre países fue similar a excepción de Pv200L-3, el cual mostró ser más antigénico para Colombia que para Brasil. Estos resultados muestran que los tres fragmentos contribuyen a la inmunogenicidad del candidato a vacuna Pv200L. 2 2. INTRODUCCIÓN La malaria sigue siendo una de las enfermedades infecciosas de mayor incidencia en el mundo. Se ha estimado que alrededor de 300 a 500 millones de casos ocurren cada año con 1-3 millones de muertes en este periodo de tiempo (Kim, et al. 2006). De las cuatro especies del parásito causante de la malaria en humanos, Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum son las de mayor prevalencia en el mundo. P. falciparum es considerada la de mayor riesgo debido a las altas tasas de mortalidad que presenta. Sin embargo la malaria causada por P. vivax genera altas tasas de morbilidad, con 70-80 millones de casos clínicos anualmente, principalmente en Asia y América Latina, lo cual genera una sensible carga socioeconómica en áreas endémicas (Mendis et al. 2001). En América, aproximadamente el 74% de las infecciones son causadas por P. vivax (PAHO & WHO 2007), y en Colombia se reporta el 65% de casos clínicos anualmente (Higgs & Sina 2005). Por esta razón, es de gran importancia conocer la biología, el genoma y el proteoma de este parásito que facilite la identificación de posibles candidatos de vacunas efectivas que contrarresten esta enfermedad. El ciclo de vida de Plasmodium es morfológica y antigénicamente complejo, con distintas formas tanto en el hospedero humano como en el mosquito vector (Guevara et al., 1997), esto promueve que la respuesta inmune desarrollada contra este microorganismo pueda ser evadida y por consiguiente, estrategias de control dirigidas contra los diferentes estadíos del parásito son la clave para la posible erradicación de esta enfermedad infecciosa. 3 Ya se ha identificado una variedad de antígenos de los diferentes estadíos del ciclo de vida del parásito, los cuales están siendo evaluados como posibles candidatos de vacuna contra la malaria. Según el estadío del ciclode vida en que se presentan los antígenos, estos se clasifican en antígenos de la fase pre-eritrocítica, eritrocítica y esporogónica (Jones & Hoffman 1994). Entre los antígenos de la fase eritrocítica se encuentra la proteína de la superficie del merozoito-1 (MSP1), la cual ha sido ampliamente estudiada como un potencial blanco para la inmunidad protectora (Holder 1988). La MSP-1 es una proteína de 195 kDa aproximadamente que se expresa en todas las especies de Plasmodium en el estadio eritrocítico (Holder et al 1992). En P. vivax se ha encontrado que ésta proteína contiene un fragmento denominado Pv200L, que corresponde a la región N-terminal y presenta una alta homología con la región Pf190L de la MSP-1 de P. falciparum (Valderrama et al., 2005). Dicho fragmento tiene la capacidad de unirse a la proteína espectrina, componente del citoesqueleto submembranal de los glóbulos rojos, y dicha interacción es necesaria para el desarrollo intraeritrocítico del parásito (Herrera et al., 1993). El papel de la Pv200L en los procesos de invasión de los glóbulos rojos aún no es claro. Sin embargo, teniendo en cuenta que esta proteína presenta homología con la proteína MSP-1 de P. falciparum, su función biológica podría ser similar a la Pf190L (Valderrama et al., 2005). El fragmento Pv200L expresado como proteína recombinante en E. coli, ha mostrado una notoria antigenicidad, dados los altos niveles de anticuerpos IgG contra Pv200L en sueros de individuos de áreas endémicas (Valderrama et al., 2005). Este fragmento puede dividirse en tres subregiones de acuerdo a la variabilidad de la secuencia en diferentes aislados, regiones conservada, variable y semiconservada, las cuales han sido 4 clonadas en un sistema eucariótico y subclonadas en un sistema procariótico para evaluar su antigenicidad por separado. De las tres subregiones solo la región variable ha sido expresada y ha mostrado ser antigénica y demostrando la presencia de epítopes B. Estos son reconocidos tanto por anticuerpos en sueros de ratones que han sido inmunizados con la proteína Pv200L como por anticuerpos adquiridos naturalmente de individuos de área endémica (Echeverry 2009). Teniendo en cuenta el estudio realizado con la sub-unidad proteica Pv200L utilizando sueros de individuos de área endémica de colombia (Valderrama et al., 2005), y sueros de individuos de la región Amazónica de Brasil (Storti et al., 2010), además del estudio con el fragmento variable Pv200L-2 (Echeverry 2009), en el presente trabajo se propuso expresar los fragmentos proteicos Pv200L-1 y Pv200L-3 (constante y semi-conservado respectivamente) para realizar los estudios correspondientes de antigenicidad utilizando sueros de Colombia y Brasil, y detectar nuevos potenciales epítopes B que permitan evaluar estos fragmentos como candidatos para el desarrollo de una vacuna contra la malaria. 5 3. MARCO TEÓRICO 3.1 El problema de la malaria La malaria sigue siendo una de las enfermedades contagiosas más importantes en el mundo, principalmente en regiones subtropicales de África sub-Sahariana, donde el parásito predominante es P. falciparum; y en Asia, Oceanía y América Latina donde prevalece P. vivax, incluyendo así una carga anual entre 350-500 millones de casos clínicos, más de un millón de muertes y es causante de un crecimiento económico reducido en las áreas de transmisión (WHO 2008). Ciento nueve países eran endémicos para la malaria en el 2008, 45 de los cuales corresponden al continente Africano y 21 al territorio de las Américas (WHO 2008). Figura 1. Distribución de la malaria en el mundo. Tomado de WHO: http://mosquito.who.int/cmc_upload/0/000/016/101/Malaria2005_map.pdf http://mosquito.who.int/cmc_upload/0/000/016/101/Malaria2003_map.pdf 6 La prevención y el control de la malaria se han intentado por mucho tiempo, y aunque las campañas contra esta enfermedad fueron inicialmente útiles en muchas áreas, la generación de resistencia en el parásito a medicamentos y en el mosquito vector a los insecticidas, combinado con las dificultades en implementar y mantener esquemas de control efectivos ha contribuido al resurgimiento de la enfermedad en muchas partes del mundo (Simonetti 1996). Los patrones de la transmisión de la enfermedad varían considerablemente entre las diferentes regiones a causa de las variaciones en los parásitos y los mosquitos relacionadas con las condiciones ecológicas y factores socioeconómicos tales como la pobreza, el acceso efectivo a la atención de salud y los servicios de prevención (WHO & UNICEF 2005). 3.2 La malaria en América Como en otras regiones, la malaria en las Américas se considera una enfermedad re- emergente debido a la propagación de la resistencia de los parásitos a los medicamentos antipalúdicos y a las dificultades para poner en marcha y mantener los programas de control del vector transmisor (Rojas et al., 2005). Según la Organización Panamericana de la Salud, la malaria aún afecta a 21 países y territorios de las Américas. Del total de 835 millones de habitantes de la región, 293 millones viven en áreas con algún grado de riesgo de transmisión de la enfermedad y 203 millones viven en zonas donde la transmisión es frecuente (PAHO & WHO 2007). P. vivax es la especie más prevalente en esta región, con un 70% de todos los casos(PAHO 2008). Entre los países de las Américas con mayor transmisión de malaria se encuentran Colombia y Brasil (PAHO 2008). 7 3.3 La malaria en Colombia La malaria es un problema de salud pública muy extendido en Colombia. El 65% del territorio colombiano está ubicado a menos de 1600 metros sobre el nivel del mar donde viven aproximadamente entre 18 - 24 millones de personas expuestas al riesgo de contraer la enfermedad o morir a causa de ella. Aunque la mortalidad por malaria ha disminuido en forma significativa en los últimos decenios, la morbilidad reveló una tendencia creciente durante los últimos 40 años (http://www.paho.org/spanish/hcp/hct/mal/cartagena-4-col.pdf) Consulta: 12 Diciembre 2009). Entre las áreas de Colombia particularmente en riesgo de transmisión de malaria se encuentran la región baja del río Cauca, la Costa Pacífica, la región alta del río Sinú, la región de Urabá y la Amazonía (WHO & UNICEF 2005). La región del Pacífico es la que registra el mayor número de casos de malaria (Mantilla et al., 2009). Los programas de vigilancia de la malaria en Colombia desde 1960 han sido basados en exámenes de sangre y seguimiento clínico de casos positivos. Durante el periodo 1960- 1998, los casos en Colombia tendieron a incrementarse, excediendo los 187,000 en 1998 (Figura 2). Este problema es importante no solo por el número alto de casos, sino también por la relación que hay entre las áreas suburbanas más pobladas y las condiciones climáticas y geográficas favorables para el desarrollo del vector. Mantilla (op. Cit.). 8 Figura 2. Casos de malaria por P. falciparum y P. vivax en Colombia entre el periodo 1960-2006. (Tomado de Mantilla et al., 2009). Las dos especies de parásito predominantes son P. falciparum y P. vivax, representando al menos el 99% de los casos de malaria en Colombia. P. falciparum es predominante en la región del Pacífico, mientras que P. vivax prevalece en las demás regiones del país. Mantilla (op. Cit.). Este último es el responsable del 65-70% de los casos clínicos reportados anualmente (Carmona-Fonseca et al., 2006). 3.4 La malaria en Brasil En Brasil la malaria es uno de los principales problemas de salud pública. De un total de 457.570 casos reportados en el 2007, el 79.6% fue causado por P. vivax, el 19.3 por P. falciparum, el 0.1% por P. malarie y el 1% es causado por infecciones mixtas (La Corte et al., 2009). La transmisión ocurre principalmente en la región Amazónica,donde entre el 10-15% de la población se encuentra en riesgo (WHO, 2008). Una característica importante de la epidemiología de la malaria en Brasil es que todos los casos no son homogéneos en 9 toda la región; depende de factores socio-demográficos y factores ambientales (Souza- Santos et al., 2008). La incidencia de la enfermedad está muy relacionada con la ocupación de nuevas áreas, además de las condiciones favorables para el mosquito vector y los movimientos migratorios, los cuales hacen que el riesgo de transmisión de ésta enfermedad se incremente (Gomes et al., 2008). 3.5 Ciclo de vida del parásito La fase del ciclo de vida de Plasmodium que se desarrolla en el ser humano se inicia cuando el mosquito Anopheles hembra se alimenta e inocula esporozoitos en el huésped humano. Éstos esporozoitos rápidamente hacen su recorrido desde el sitio de inoculación hasta el hígado; en un lapso de tiempo menor a 60 minutos (Jones & Hoffman 1994). Una a dos semanas después de que los esporozoitos han invadido los hepatocitos cada uno de éstos ha sufrido una enorme multiplicación asexual, que lleva a la generación de un esquizonte hepático del cual derivan aproximadamente unos 30.000 (Jones & Hoffman 1994). Cuando las células del hígado infectadas se rompen, los merozoitos entran a la circulación sanguínea e invaden los eritrocitos. Una vez en el eritrocito, el parásito sufre una serie de cambios morfológicos que conlleva a la formación de un estadío de anillo (trofozoito) para dar origen a un esquizonte eritrocítico, que al romperse produce nuevamente merozoitos que salen de los glóbulos rojos y viajan dentro del torrente sanguíneo para invadir nuevos eritrocitos. Algunos de los parásitos se diferencian en gametocitos masculinos (flagelados) o femeninos, los cuales luego son tomados por el mosquito al alimentarse. 10 Una vez los gametocitos son tomados por el mosquito, el microgametocito (masculino) sufre una exflagelación en el intestino medio del mosquito para dar origen a 8 microgametos, mientras que el macrogametocito madura y da origen al macrogameto (femenino), luego de lo cual la fertilización puede ocurrir y la formación de cigotos móviles llamados ooquinetos. Los ooquinetos penetran la pared del intestino medio desarrollando un gran número de ooquistes, dentro de los cuales se forman los esporozoitos. Tras la ruptura del ooquiste los esporozoítos son liberados en el hemocele del mosquito en donde encuentran las glándulas salivares y se localizan para ser inoculados nuevamente al hospedero durante la alimentación dando continuidad al ciclo de infección (Fig. 3) (Jones & Hoffman 1994). Figura 3. Ciclo de vida de Plasmodium. (Jones & Hoffman 1994). En el ciclo de vida de P. vivax existen particularidades importantes tales como la diferenciación de algunos parásitos a una forma capaz de permanecer en estado latente dentro de los hepatocitos durante largos periodos (los hipnozoitos), los cuales son 11 responsables de futuras recaídas después de una infección natural; por otro lado, la forma sanguínea invade preferiblemente reticulocitos (formas inmaduras de los glóbulos rojos) (Galinski & Barnwell 2008), lo cual es la principal limitación para lograr su cultivo en el laboratorio. 3.6 Antígenos candidatos a vacuna contra la malaria Múltiples antígenos correspondientes a los distintos estadíos del parásito han sido descritos como blancos candidatos a vacuna contra la malaria (Jones & Hoffman 1994). Entre los principales antígenos identificados y estudiados del estadío pre-eritrocítico se encuentran las proteínas CSP, TRAP, SSP, LSA-er1; en la fase sexual se han identificado proteínas tales como la Ps230, Ps47, Ps36, Ps38 y Ps48/45; mientras que en la fase eritrocítica se encuentran las proteínas MSP-1, MSP-2, RESA, AMA-1, EBA-175 (Jones & Hoffman 1994). Las proteínas de la superficie del merozoito denominadas MSPs, son las que median el reconocimiento y unión al eritrocito, siendo de gran interés puesto que el bloqueo de su función detiene el ciclo del parásito y por lo tanto tienen un gran potencial como candidatas de vacuna (Stafford et al., 1996). 3.7 Proteína MSP-1 La MSP-1 es una proteína de aproximadamente 200 kDa que se expresa en todas las especies del género Plasmodium y fue descubierta por Holder y Freeman en 1982. Esta proteína es sintetizada durante el desarrollo del esquizonte y se deposita en la membrana del merozoíto como un complejo proteico derivado de un proceso proteolítico (Holder & 12 Freeman en 1982). Antes del rompimiento del esquizonte la proteína es fragmentada proteolíticamente en cuatro partes que tienen masas de 83, 30, 38 y 42 kDa (Stafford et al., 1996). Este grupo de polipéptidos permanece unido en la superficie del merozoíto por acción de fuerzas débiles, y anclado a la membrana gracias a un dominio glicosil- fosfatidilinositol (GPI) que se encuentra al final del fragmento C-terminal de 42 kDa (Blackman et al., 1990). Cuando se inicia la invasión a un nuevo eritrocito, el fragmento de 42 kDa es nuevamente separado en dos fragmentos de 33 y 19 kDa (Fig. 4). El fragmento de 19 kDa conteniendo el extremo C-terminal de la proteína (MSP-119) está involucrado en la invasión y es el único fragmento que es llevado al interior del eritrocito debido a que permanece anclado a la membrana por dicho dominio (GPI), mientras que todo el complejo molecular se desestabiliza y es desechado en el exterior de la célula (Blackman et al., 1990; Stafford et al., 1996). Figura 4. Esquema de los fragmentos proteolíticos de la MSP-1 de P. falciparum. El proceso de la invasión del eritrocito, mediado en parte por la MSP-1 se inicia con el contacto del merozoito con el eritrocito blanco seguido por su reorientación, de tal modo que el extremo apical se yuxtapone a la membrana del eritrocito, la invasión ocurre por invaginación de la membrana del mismo (Stafford, et al., 1996). 13 P. vivax preferencialmente invade reticulocitos. La interacción entre el merozoito de P. vivax y los reticulocitos es mediada también por antígenos localizados en la superficie homólogos a los correspondientes en P. falciparum. La especificidad de la unión con el reticulocito es dependiente de la presencia del receptor de Duffy en la membrana del parásito y del antígeno Duffy en la membrana del reticulocito (Rodríguez et al., 2001), Sugiriendo que estas secuencias tienen un importante papel en el ataque a la célula blanco y los procesos de invasión por parte de la Pv-MSP-1 (Rodríguez et al., 2001). La comparación de secuencias de nucleótidos del gen de la MSP-1 en diferentes clones de P. falciparum ha permitido identificar 17 bloques o dominios: siete bloques altamente variables, cinco conservados y cinco semiconservados (Tanabe et al., 1987). Además este gen muestra una alta similitud con el gen que codifica la PvMSP1 de P. vivax, que presentan una secuencia con 10 bloques relativamente conservados alternados con regiones altamente variables (Del Portillo et al., 1991). La expresión de estos dominios variables en la MSP-1 es una estrategia de evasión de la respuesta inmune usada por los parásitos Plasmodium, y por lo tanto esta variación antigénica en poblaciones naturales del parásito se puede enfocar en el estudio de las posibles implicaciones en la inmunidad adquirida de forma natural y el desarrollo de vacunas contra la malaria (Ferreira et al., 2004). La Pv-MSP-1 de P. vivax es una proteína de 1726 aminoácidos y es codificada por el gen llamado Pv200 el cual fue descrito por Del Portillo y colaboradores (1991). En este gen se han identificado dos grupos alélicos que difieren entre sí entre las cepas llamadas Belem y Salvador I. Existe evidencia que estas variantes surgieron por alteraciones ocurridas 14 durante la recombinación meiótica,en la fase sexual en el mosquito Anopheles (Figtree et al., 2000). En la proteína MSP-1 de P. vivax el fragmento llamado Pv200L es una región con potencial antigénico e inmunogénico capaz de inducir protección parcial contra los estadíos sanguíneos de P. vivax (Valderrama et al. 2005). Ésta región se localiza hacia el extremo N-terminal de la secuencia donde se ha demostrado una alta homología con la subunidad Pf190L de P. falciparum (Fig. 5) (Valderrama et al., 2005). Se ha demostrado que la Pf190L muestra una fuerte afinidad a la espectrina, una proteína de la membrana interna de los glóbulos rojos (Herrera et al., 1993). Esto sugiere que la espectrina es requerida para el desarrollo del parásito dentro del eritrocito y por lo tanto el desarrollo de inhibidores que bloquean la asociación entre la espectrina y la MSP-1, podría potencialmente impedir el crecimiento y su propagación (Herrera et al., 1993). Figura 5. Esquema de la PvMSP-1 y la subunidad Pv200L fragmentada. De acuerdo a estudios de Valderrama et al. 2005 y Storti-Melo et al. 2010, la Pv200L producida en forma recombinante (Pv200L) ha mostrado una alta antigenicidad determinada por los niveles de IgG específicas presentes naturalmente en individuos de áreas endémicas. También se demostró una alta inmunogenicidad en ratones y monos donde se observaron títulos de IgG >10 6 . En conclusión, los resultados presentados proveen 15 evidencia que la proteína Pv200L es una nueva subunidad con potencial como candidato a vacuna. La subunidad Pv200L presenta también bloques variables y conservados (Fig. 5). En este estudio se ha dividido esta subunidad en tres sub-regiones, las cuales han sido denominadas como Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 correspondientes con las regiones conservada, variable y semi-conservada respectivamente mencionadas anteriormente. Dentro de la región semi-conservada pueden reconocerse además un bloque polimórfico y dos conservados (Ferreira et al., 2004). Estudios preliminares han mostrado que la región variable de la Pv200L (Pv200L-2) es reconocida por sueros de ratones inmunizados con la proteína Pv200L completa y también por sueros humanos de individuos provenientes de áreas endémicas diagnosticados con malaria causada por P. vivax (Echeverry 2009). Esto da soporte adicional al estudio de los fragmentos de la proteína Pv200L con el fin de delimitar la región con mayor potencial para generar una reacción inmune efectiva. 16 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Estudiar y comparar la capacidad antigénica de las regiones conservada, semi-conservada y variable de la proteína Pv200L de P. vivax, en sueros de Colombia y Brasil. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Expresar los fragmentos conservado y semi-conservado de la proteína Pv200L de P. vivax en E. coli. Evaluar la antigenicidad de los fragmentos conservado y semi-conservado de la proteína Pv200L con sueros humanos tanto de pacientes colombianos como de brasileños infectados naturalmente con P. vivax. Comparar la antigenicidad entre los fragmentos, incluido el fragmento variable y determinar cuál de ellos posee mayor potencial antigénico. HIPÓTESIS La subunidad Pv200L contiene uno o más fragmentos con alto nivel antigénico, considerándolos así candidatos promisorios para vacuna contra la malaria. 17 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Amplificación de los Fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 por PCR En este estudio se amplificaron solamente los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3, el fragmento Pv200L-2 había sido producido previamente (Echeverry, 2009). Para la amplificación de estos fragmentos se diseñaron oligonucleótidos específicos basados en el gen sintético Pv200L por análisis bioinformático. Los oligonucleótidos diseñados (Tabla 1) se alinearon por medio del programa BLASTn del servidor NCBI y se analizaron con el software PrimerSelect para determinar el anillaje y posibles estructuras secundarias (Echeverry, 2009). Tabla 1. Oligonucleótidos diseñados para cada uno de los fragmentos Subfragmento Oligonucleótidos EcPv200L-1 FB1: 5'-gcatatgATCACCATCTTCCCGTCTG-3' RB1: 5'-gctcgagTTTGTTcTTGGTGATGAAA-3' EcPv200L-3 FB3: 5'-gcatatgGAAGCTCAGAAACTGATCG-3' RB3: 5'-gctcgagGTGCGGGTAGGTTTCTTTC-3' La amplificación se realizó mediante la técnica PCR convencional siguiendo las recomendaciones generales descritas por la casa comercial productora de la enzima ADN polimerasa (Invitrogen, cat. No. 11615-010). Los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 se amplificaron en un volumen final de 25 µl. En la mezcla de cada reacción se adicionó 0,3 µl de dNTPs 25 mM, 100 ng de cada uno de los primers, 0,75 U de ADN polimerasa, 2,5 µl de buffer 10X y 0,95 µl MgCl2 50 mM. Las reacciones se realizaron en el equipo GeneAmp ® PCR System 2700 (Applied Biosystem). Los ciclos de reacción fueron los 18 siguientes: 1 ciclo de precalentamiento a 94°C durante 5 minutos, 35 ciclos de amplificación: denaturación: 30 segundos a 94°C, anillamiento: 1 minuto a 55°C y amplificación: 1 minuto a 72°C y un ciclo de finalización a 72°C durante 5 minutos (Echeverry 2009). Los productos de PCR se mantuvieron a 4°C hasta su respectivo análisis por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% 5.2 Ligación de los fragmentos en pcDNA3.1/V5-His-TOPO y análisis con enzimas de restricción Una vez amplificados los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3, los productos se ligaron en el vector de pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los insertos fueron luego extraídos por digestión con las enzimas de restricción PvuII y BamHI (Promega, Madison). Todos los pasos fueron monitoreados por electroforesis en gel de agarosa al 1.2%. 5.3 Purificación de insertos y vectores El vector pET-24a(+) y el plásmido pcDNA3.1 conteniendo los insertos Pv200L-1, Pv200L-3 fueron tratados con enzimas de restricción (XhoI y NdeI) y sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1.2% (p/v). A partir de este gel se extrajeron las bandas de tamaño de 5222 pb, 392 y 389 pb correspondientes al vector y a los insertos respectivamente. La purificación se realizó usando el kit PureLink TM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada fragmento de gel con la banda se calentó durante 15 minutos a 50°C en el tampón GS1, esta mezcla se depositó en una columna “Quick Gel Extraction TM ” y se centrifugó a 10000 rpm 19 (revoluciones por minuto) durante 1 minuto. Posteriormente se descartó el sobrenadante, se adicionaron 700 µl de tampón W1 y se centrifugó a las mismas condiciones. Luego se descartó el tubo de lavado y se puso uno de recuperación donde se eluyó el ADN con 50 µl de agua estéril seguido de una centrifugación bajo las mismas condiciones anteriores. Finalmente se guardó a -20°C hasta su uso. 5.4 Ligación de los fragmentos en el vector pET-24a(+) Realizada la purificación tanto de los fragmentos como del vector pET-24a(+), se procedió a realizar la respectiva ligación usando 1 unidad de ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA), y cocientes molares Inserto:vector 3:1. Las reacciones se incubaron durante 18 horas a 4°C, para luego transformar bacterias E. coli BL21 (DE3) pLysS químicamente competentes (Invitrogen). Algunos elementos presentes en el vector pET-24a(+), además del sitio de clonación múltiple, son: Un origen de replicación Ori procariótica, y un promotor T7 que dirige la expresión del ADN insertado semejando la activación de un operón lac (inducción con IPTG), y además confiere una serie de 5 histidina para la detección de la proteína. 5.5 Preparación de bacterias E. coli químicamente competentes. Para producir bacterias E. coli BL21 (DE3) pLysS químicamente competentes, se sembró por agotamiento en medio LB (Luria Bertani) sólido y se incubó durante 16 horas a 37°C. De este crecimientose tomó una unidad formadora de colonia (UFC) y se cultivó en medio 20 LB líquido a 37°C y 250 rpm. (revoluciones por minuto) durante 16 horas. Transcurrido este tiempo, se tomó 0.5 ml del cultivo previo y se sembró en 99.5 ml de medio LB líquido a 37°C y 225 rpm. hasta alcanzar una densidad óptica (OD630) de 0.5-0.6. Estas células se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El pellet bacteriano se resuspendió en 1 ml de CaCl2 0.1 M y se dejó durante 3 horas en hielo. Transcurrido ese tiempo, se centrifugó a las mismas condiciones durante 7 minutos y se resuspendió el pellet en 4 ml de CaCl2 0.1 M con 15% de glicerol frío y estéril. Finalmente se distribuyó en alícuotas de 200 µl y se congelaron a -70°C hasta su uso. 5.6 Transformación de bacterias E. coli químicamente competentes Las bacterias E. coli BL21 (DE3) pLysS químicamente competentes preparadas en el laboratorio se transformaron por choque térmico. Se depositaron 8 µl del producto de ligación en 200 µl de bacterias competentes descongeladas y se dejaron durante 30 minutos en hielo. Transcurrido ese tiempo, las bacterias se sometieron a choque térmico durante 45 segundos a 42°C, e inmediatamente se trasladaron a hielo por un periodo de 5 minutos. A las bacterias transformadas se les adicionó 250 µl de medio LB líquido sin antibiótico y se incubaron a 37°C y 250 rpm durante 2 horas. Posteriormente se sembraron en medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 µg/ml) y se incubaron a 37°C durante 16 horas. Con los clones positivos se realizó miniprep para la producción de ADN plasmídico y verificar la clonación con los insertos de interés. 21 5.7 Miniprep Para la extracción de ADN plasmídico de los clones recombinantes, se sembró 1 UFC en 12.5 ml de medio LB líquido suplementado con kanamicina (80 µg/ml) y se incubó a 37°C y 300 rpm durante 16 horas. Transcurrido este tiempo se centrifugó a 7000 rpm a 4°C durante 1 minuto. El sobrenadante se descartó y se resuspendió el pellet en 200 µl de solución I (50 mM glucosa, 25 mM tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0), se agregaron 200 µl de solución II (0.2 N NaOH, 1% SDS) para la lisis de las células y luego se agregaron 200 µl de solución III (Acetato de potasio 5 M, Ácido acético glacial 3 M) para precipitación de los restos celulares y el ADN genómico bacteriano. La mezcla se agitó por inversión, se dejó en hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se mezcló con fenol-cloroformo-alcohol- isoamílico preparado en una proporción 25:24:1, se mezcló en vórtex y se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó la fase superior acuosa y se adicionaron 500 µl de cloroformo-alcohol-isoamílico en una proporción 24:1 y se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se tomó luego la fase superior del tubo, se adicionó 55 µl de acetato de sodio 3M y 605 µl de isopropanol, se guardó a -70°C durante 3 horas y se centrifugó a las mismas condiciones anteriores. Finalmente el producto obtenido se lavó con etanol al 70%, se resuspendió en 50 µl de agua estéril y fue guardado a -20°C hasta su uso. 22 5.8 VERIFICACIÓN DE LA CLONACIÓN Y MARCOS DE LECTURA 5.8.1 Análisis con enzimas de restricción. Para verificar la presencia de insertos en el vector pET24a(+) se realizó una doble digestión con las enzimas NdeI y XhoI, y para verificar que la clonación fue positiva para los dos insertos; Pv200L-1 y Pv200L-3, se realizó digestión con las enzimas de restricción PvuII y VspI . Se utilizaron 3U de cada enzima de restricción en un volumen final de 20 µl de reacción. A la mezcla de la reacción se adicionaron 2 µl de buffer D 10X (Promega) y 0.2 µl BSA-acetilada, dejando reaccionar durante 3 horas a 37°C. El producto de digestión se sometió a un análisis electroforético en gel de agarosa al 1.2%. 5.8.2 PCR. Para verificar la identidad de los fragmentos clonados, se realizó PCR sobre los plásmidos recombinantes que contenían Pv200L-1 y Pv200L-3, con oligonucleótidos específicos para cada fragmento. Las condiciones de la amplificación fueron las descritas anteriormente y los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.2%. 5.8.3 Secuenciación. Para verificar el marco de lectura y la ligación de los insertos Pv200L-1 y Pv200L-3 en el plásmido pET24a(+), se realizó la secuenciación en el equipo ABI Prims 3100 – Avant (Applied biosystem, Foster City, CA) usando el kit BigDye Terminador v3.1 y se utilizó el oligo cebador T7. 23 5.9 EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS Pv200L-1 y Pv200L-3 5.9.1 Expresión proteica a pequeña escala Para expresar las proteínas Pv200L-1 y Pv200L-3 a pequeña escala, se sembró 1 UFC de E. Coli BL21 (DE3) pLysS conteniendo pET24a(+) recombinante con cada uno de los fragmentos en 12.5 ml de medio LB suplementado con kanamicina (50 µg/ml) y se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación de 250 rpm. Posteriormente se sembraron 300 µl de cultivo de la noche anterior en 25 ml de medio LB suplementado con kanamicina (50 µg/ml) y se incubó a 37°C, 250 rpm durante 3 horas hasta que alcanzó una densidad óptica (OD) entre 0,6-1,0. Una vez alcanzado este valor, se tomaron 2 ml de medio bacteriano y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El pellet bacteriano se resuspendió en 150 µl de buffer laemmli 2X. Esta preparación sirvió como control no inducido. Para inducir la expresión de Pv200L-3 se usó IPTG (isopropil β-Đ-1- thiogalactopyranoside) a una concentración final de 1 mM. Esta mezcla se incubó a 37 C con agitación de 250 rpm durante 3 horas. Después de este tiempo se realizaron las lecturas de absorbancia y se procedió a procesar las muestras como se indicó anteriormente. Estas muestras fueron guardadas a -20°C hasta que se evaluaron por SDS-PAGE e inmunoblot. 5.9.2 Gel de Acrilamida Todas las muestras fueron analizadas por electroforesis en acrilamida (SDS-PAGE). Las condiciones de corrido estándar para ello fueron las siguientes: Concentración de acrilamida 15% y la corrida se realizó a 80V/cm durante 20 min y a 100V/cm durante 2,5 24 hrs. De cada muestra se sembraron 5 µl y se incubaron a 56ºC durante 10 min. Finalmente se realizó una tinción con Azul de Coomassie y se observaron las proteínas expresadas en E. coli, incluidas la Pv200L-1 y Pv200L-3. Como control positivo se utilizó la proteína EcPv200L (proteína estudiada previamente). 5.9.3 Inmunoblot Para verificar que la expresión proteica de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 fuera positiva se realizó un análisis por inmunoblot utilizando anticuerpos dirigidos contra las colas de histidinas, proporcionadas por el plásmido pET24a(+) y anticuerpos específicos para la EcPv200L obtenidos a partir de monos Aotus inmunizados con la proteína EcPv200L. Las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE y la electrotransferencia se realizó en una membrana de PVDF con un voltaje de 30V durante 18 horas. Como control positivo se utilizó la proteína EcPv200L. Para realizar la prueba de Inmunoblot se utilizaron 50 ml de la solución de bloqueo (TBS 1x/Tween 20/BSA) durante 2 hrs. Posteriormente la membrana se lavó con 50 ml de la solución de lavado (Tween 20/TBS 1x) durante 5 min. Luego se incubó durante 1 hora con anticuerpos anti-His de ratón y con sueros de monos Aotus inmunizados con la proteína EcPv200L diluido en solución de anticuerpo (TBS1x/Tween 20/BSA) en una proporción de 1:3000 y 1:2000 respectivamente. Transcurrido ese tiempo, nuevamente se lavó la membrana durante 3-8 min en la solución de lavado y se incubó con anti-ratón IgG (1:20.000) y anti-human (1:10.000) respectivamente, diluido en solución de anticuerpo. La membrana se lavó nuevamente durante 3-8 min. Por último se reveló conuna pastilla de 25 substrato (BCIP/NBT Sigma Phast) diluida en 10 ml de agua tipo I, hasta que se observaron las bandas esperadas. 5.10 EXPRESIÓN A MEDIANA ESCALA 5.10.1 Inducción de la Expresión Para la inducción de la expresión de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 se siguieron las recomendaciones descritas en el manual The QIAexpressionistTM de Qiagen (Valencia, CA) y el procedimiento operativo estándar (POE) ML-01-POE-002 “Inducción de expresión y extracción de proteína recombinante EcPv200L”, del Instituto de Inmunología del Valle. Inicialmente se inoculó 1 UFC recombinante de cada fragmento en 12.5 ml de medio líquido LB suplementado con Kanamicina (50 µg/ml) y se incubó durante 16 horas a 250 rpm. Transcurrido ese tiempo se adicionaron 5 ml de precultivo a 250 ml de medio LB líquido y se incubó a 37°C y 250 rpm hasta alcanzar una densidad óptica de OD630 de 0.6. Luego se adicionó IPTG, obteniendo una concentración final de 1 mM y se incubó bajo las mismas condiciones durante 3 horas más. 5.10.2 Aislamiento de las proteínas Para realizar el aislamiento de las proteínas se centrifugaron a 10000 rpm durante 10 minutos a 4°C los 250 ml de cultivo bacteriano que fueron inducidos con IPTG. Posteriormente se descartó el sobrenadante y se adicionó 6 ml de buffer A (Fosfato monosódico 100mM, Tris base 10mM, Gu-HCl 6M, Imidazol 10mM) y 6 ml de buffer B 26 (Fosfato monosódico 100mM, Tris base 10mM, Urea 8M, Imidazol 10mM) y se incubó durante 1 hora agitando fuertemente cada 15 minutos. Luego se realizó 5 ciclos de criofractura que consistió en congelar en nitrógeno líquido y descongelar en agua a 42- 45°C. Terminados los ciclos de criofractura se adcionó nuevamente los mismos buffer A y B en las mismas cantidades anteriores y se centrifugó a 10000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Finalmente se recuperó el sobrenadante y se filtró secuencialmente por membrana de 0,45 y 0,22 μm. El material quedó listo para su respectiva purificación. 5.10.3 Purificación y Cuantificación La purificación de las proteínas Pv200L-1 y Pv200L-3 se realizó por cromatografía de afinidad con ión inmovilizado (Niquel) (IMAC), de acuerdo al procedimiento operativo estándar (POE) QM-04-POE-006 del instituto de Inmunología del Valle. Para ello se prepararon columnas con resina de Ni – NTA y se dejaron reposar durante 12 horas a 4°C. Transcurrido ese tiempo se lavaron con 5 volúmenes de agua tipo I y se equilibraron con 5 volúmenes de buffer A (NaH2PO4 y Tris – HCl, pH 8.0) durante 1 hora. Luego el sobrenadante que se obtuvo en la extracción, se pasó por los conductos de la fase móvil de la columna y seguidamente se lavó con 5 volúmenes de Buffer B (NaH2PO4, Tris – HCl e inmidazol, pH 6.3). Las proteínas de interés fueron eluidas en 2 volúmenes (10 ml) de buffer C (NaH2PO4, Tris – HCl e inmidazol, pH 8.0) y se colectaron en tubos Falcon de 15 ml. Estas proteínas se cuantificaron por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay) y se analizaron por SDS-PAGE e inmunoblot como se describió anteriormente. 27 5.11 DETERMINACIÓN DE ANTIGENICIDAD Las proteínas recombinantes Pv200L-1 y Pv200L-3, junto con la Pv200L-2 producida anteriormente (Echeverry 2009), se usaron para determinar el nivel de reconocimiento por anticuerpos presentes en sueros de individuos de áreas endémicas de Colombia y Brasil infectados con P. vivax. 5.11.1 Sueros Se usaron 55 sueros de pacientes de área endémica de Colombia y 48 sueros de área endémica de Brasil. Los sueros de Colombia, inicialmente fueron recolectados para el proyecto “Identificación de la actividad bloqueadora de la transmisión (TBA) en un área endémica para malaria por P. vivax en Colombia (Estudio A1)”, ejecutado por el Instituto de Inmunología de la Universidad del Valle (IDIV); revisado y aprobado por el comité Institucional de revisión de Ética Humana de la Facultad de Salud de la Universidad del Valle, el día 15 de abril del 2005; acta No. 060 del 2005. 5.11.2 ELISAs Para determinar el reconocimiento de anticuerpos contra cada uno de los fragmentos en sueros de individuos de área endémica infectados con P. vivax y en sueros de monos Aotus inmunizados previamente con la proteína completa Pv200L se realizaron ELISAs de acuerdo al POE Procedimiento SE-01-POE-001 del Instituto de Inmunología del Valle (IDIV), y se preparó el antígeno de acuerdo al IOE Instructivo para preparación del 28 antígeno para ELISA SE-01-IOE-001, del IDIV. Se incubaron placas de 96 pozos durante toda la noche con los antígenos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 disueltos en PBS 1X por separado. Una vez terminada la incubación se procedió a bloquear las placas con solución de bloqueo (PBS1x, Tween 20 0.05%, leche 5%) durante 2h, luego fueron lavadas con PBS1x/ Tween 20 0.05% y se adicionaron sueros problemas diluidos 1:200 en solución de anticuerpos (PBS1x, Tween 20 0.05%, leche 2.5%). Nuevamente fueron lavadas e incubadas con el conjugado anti-human marcado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en solución de anticuerpos. Las muestras fueron reveladas con el sustrato para-nitrofenil fosfato (p-NPP) (Sigma, St. Louis, MO) durante 45min y analizadas en un Espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm (MRX dynex). 6. RESULTADOS 6.1 Amplificación de los fragmentos Pv200L-1 Y Pv200L-3 mediante PCR convencional Para la amplificación de cada uno de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3, se utilizaron los oligonucleótidos descritos anteriormente en la metodología. Los productos de PCR que se obtuvieron se corrieron en gel de agarosa al 1,2% y se observaron las bandas esperadas correspondientes a los pesos moleculares; 392 pb y 389 pb para el fragmento Pv200L-1 y Pv200L-3 respectivamente (Figura 6). Los pesos moleculares se analizaron con el fotodocumentador GBox y el software GenSnap. 29 Figura 6. Análisis de de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 amplificados por PCR en geles de agarosa. Pv200L-1 (carriles 2 y 3) y Pv200L-3 (carriles 5 y 6); Marcador de peso (carril 1); controles de la reacción (carriles 4, 7 y 8) (Echeverry 2009). 6.2 CLONACIÓN Y ANALISIS DE LOS FRAGMENTOS 6.2.1 Clonación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en pcDNA3.1/V5-His-TOPO La ligación de cada uno de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en pcDNA3.1/V5-His- TOPO fue positiva. Al realizar la transformación en bacterias E. coli con este producto de ligación, se obtuvieron en promedio 20 unidades formadoras de colonia (UFC), de las cuales se seleccionó una UFC para la extracción de ADN plasmídico recombinante y se analizó mediante la digestión con enzimas de restricción (Echeverry 2009). 30 Tabla 2. Fragmentos esperados al digerir con enzimas de restricción (PvuII y BamHI) los plásmidos recombinantes con cada uno de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3. Muestras Fragmentos esperados Enzimas PvuII + BamHI PvuII BamHI pcDNA3.1 + Subfragmento EcPv200L-1 207pb 627pb 1071pb 1097pb 2912pb 627pb 1071pb 1097pb 3119pb 5615pb pcDNA3.1 + Subfragmento EcPv200L-3 832pb 1071pb 1097pb 2911pb 1071pb 1097pb 3354pb 5912pb Figura 7. Análisis de restricción con enzimas PvuII y BamHI en Pv200L-1 y Pv200L-3 en gel de agarosa al 1.2%. PvuII y BamHI con Pv200L-1(carril 1), Pv200L-3 (carril 2); PvuII con Pv200L-1(carril 4), Pv200L-3 (carril 5); BamHI con Pv200L-1(carril 7), Pv200L-3 (carril 8), Marcador de peso (carriles 3 y 6) (Echeverry 2009). Una vez confirmada la clonación de cada uno de los fragmentos en el plásmido pcDNA3.1, se procedió a realizar PCR (Figura 8) para comprobar la identidad de los fragmentos. 31 Figura 8. Amplificación de cada uno de los fragmentos en pcDNA3.1 con aligonucleótidos específicos. A. Amplificación del fragmento Pv200L-1. Oligonucleótidos fragmento 1 (carril1), Oligonucleótidos Fragmento 3 (carril 4). B. Amplificación del fragmento Pv200L-3. Oligonucleótidos fragmento 3 (carril 7), Oligonucleótidos fragmento 1 (carril 5). Controles negativos (carriles 2 y 8). Marcador de peso (Carriles 3 y 6). (Echeverry 2009). La amplificación se realizó con oligonucleótidos específicos para cada fragmento, encontrándose que ninguno de los clones recombinantes estaba contaminado. Entre los controles negativos que se realizaron, se hizo PCR con oligonucleótidos cruzados en cada uno de los fragmentos. Posteriormente se realizó secuenciación, la cual confirmó la presencia del fragmento correspondiente en el marco de lectura adecuado (Anexo 4) 6.3 Purificación de insertos y vectores Tanto el plásmido pcDNA3.1 recombinante conteniendo cada uno de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 como el plásmido pET24a(+) fueron tratados con las enzimas de restricción NdeI y XhoI. Esto se realizó con el fin de liberar el inserto del vector pcDNA3.1 y con extremos cohesivos que permitan la respectiva ligación. La purificación de los 32 fragmentos y el plásmido pET24a(+) se realizó a partir de gel de agarosa al 1%. (Figuras 9 y 10). Figura 9. Fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 generados por digestión con enzimas de restricción NdeI y XhoI y extraídos a partir de gel de agarosa. fragmento Pv200L-1 (carriles 2-4), fragmento Pv200L-3 (carriles 5-7), MP (carril 1). Figura 10. Plásmido pET24a(+) digerido con enzimas de restricción NdeI y XhoI y extraído a partir de gel de agarosa. pET24a(+) sin extraer (carril 2), espacio donde se extrajo pET24a(+) digerido (carriles 3 y 4). MP (carril 1). Después de realizada la extracción y purificación se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa la presencia tanto de los fragmentos como del vector con los pesos moleculares esperados (Figura 11). MP M MP M Pv200L-1 Pv200L-3 33 Figura 11. Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-3 y pET24a(+) en gel de agarosa al 1.2%. Pv200L-1 y Pv200L-3 (carriles 2 y 3), pET24a(+) (carriles 4 y 5). 6.4 Clonación de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en el vector pET-24a(+) Después de la purificación, cada uno de los fragmentos fueron ligados en el vector pET24a(+) (vector de expresión en procariotas). Realizada la ligación se transformaron bacterias E. coli BL21 (DE3) pLysS químicamente competentes mediante choque térmico y se obtuvieron un promedio de 20 UFC de cada uno de los clonos recombinantes, de las cuales se seleccionaron 4 UFC y se realizó la extracción de ADN plasmídico por miniprep (Fig. 12) y finalmente se analizó por RFLP (Fig. 13 y 14) y PCR (Fig. 15). 34 Figura 12. ADN plasmídico recombinante de pET24a(+) + Pv200L-1 y pET24a(+) + Pv200L-3 en gel de agarosa al 1%. pET24a(+) + Pv200L-1 (carriles 2 y 3), pET24a(+) + Pv200L-3 (carriles 4 y 5), MP (carril 1). Para verificar que la ligación fue positiva, se realizó digestión con enzimas de restricción NdeI y XhoI, las cuales cortan en los extremos de cada fragmento haciendo que se liberen del plásmido pET24a(+) y se observen en el gel con los pesos moleculares a los cuales corresponden (Figura 13). Figura 13. : Producto de la doble digestión con enzimas de restricción NdeI y XhoI en Pv200L-1 y Pv200L-3 en gel de agarosa al 1.2%. Pv200L-1 (carril 2), Pv200L-3 (carril 3), pET24a(+) sin inserto (carril 4), control negativo (carril 5), MP (carril 1). 35 Para comprobar que cada clon contuviera cada uno de los fragmentos, y de esta manera asegurar que los insertos son diferentes entre sí, se realizó digestión con enzimas de restricción (PvuII y VspI) y se analizó en gel de agarosa al 1,2% (figura 14). Tabla 3. Fragmentos esperados al digerir con enzimas de restricción PvuII y VspI. Muestras Fragmentos esperados Enzimas PvuII VspI pET24a(+) + Subfragmento EcPv200L-1 2928pb 1595pb 999pb 93pb ------------- pET24a(+) + Subfragmento EcPv200L-3 4523pb 999pb 93pb 2758pb 1428pb 1185pb 189pb 59pb Figura 14. Producto de digestión con enzimas de restricción PvuII y VspI en Pv200L-1 y Pv200L-3 en gel de agarosa al 1.2%. Digestión con PvuII en Pv200L-1, Pv200L-3 y pET24a(+) sin inserto (carriles 2, 3 y 4 respectivamente); digestión con VspI en Pv200L-3 36 y pET24a(+) sin inserto (carriles 5 y 6 respectivamente); Control negativo (carril 7); MP (carril 1). Ya confirmada la ligación mediante RFLPs, se procedió a realizar PCR para identificar posibles contaminaciones. Ninguno de los fragmentos amplificados presentó contaminación, puesto que solo se observó las bandas de pesos moleculares 392 y 389 pb correspondientes a los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 respectivamente (figura 15). oFinalmente se realizó secuenciación, lo cual confirmó definitivamente la presencia de cada uno de los fragmentos en el plásmido pET24a(+) en el marco de lectura adecuado (Anexo 4). Figura 15. Amplificación por PCR de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en gel de agarosa al 1.2%. Pv200L-1 (carriles 2 y 3) y Pv200L-3 (carriles 5 y 6); Controles negativos (carriles 4 y 7); MP (carril 1). 6.5 EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS Pv200L-1 y Pv200L-3 6.5.1 Expresión proteica a pequeña escala Para expresar las proteínas Pv200L-1 y Pv200L-3 a pequeña escala, se utilizó bacterias E. coli BL21sin inducir e inducidas con IPTG 1 mM durante 3 horas. Para ello se realizó mini preparaciones de bacterias las cuales fueron tratadas con DTT 10 mM y 150 µl de buffer laemmli 2X. Posteriormente se analizó por SDS-PAGE (Figura 16) 37 Figura 16. Expresión de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 en E. coli BL21 (DE3) LysS. Con inducción por IPTG: Pv200L-1 y Pv200L-3 (carriles 7 y 8); pET24a(+) sin inserto (carril 9); BL21 sin plásmido (carril 10). Sin inducción (Carriles 2, 3, 4 y 5); Control positivo EcPv200L (carril 6); Marcador de peso (carril 1). Mediante el análisis por SDS-PAGE se observó la expresión de los fragmentos proteicos. Sin embargo fue necesario verificar su expresión mediante inmunoblot usando anticuerpos dirigidos contra las colas de histidinas que se encontraban en los extremos de cada fragmento (figura 17). Figura 17. Análisis de los fragmentos proteicos; Pv200L-1 y Pv200L-3 por la técnica de inmunoblot. Con inducción por IPTG: Pv200L-1 y Pv200L-3 (carriles 7 y 8); pET24a(+) sin inserto (carril 9); BL21 sin plásmido (carril 10). Sin inducción (Carriles 2, 3, 4 y 5); Control positivo EcPv200L (carril 6); Marcador de peso (carril 1). 38 En este ensayo se evidenció la presencia de cada uno de los fragmentos expresados como proteínas recombinantes. Las colas de histidina de éstas proteínas fueron reconocidas por anticuerpos anti-HIS, lo cual permitió observar las bandas esperadas de peso molecular entre 10-20 kDa como se muestra en la figura 17. 6.6 Expresión y purificación de los Fragmentos proteicos a mediana escala Una vez confirmada la expresión de cada uno de los fragmentos, se procedió a expresar a mediana escala y purificarlos para realizar estudios de antigenicidad. La inducción de la expresión con IPTG 1mM se realizó con 250 ml de medio LB sin antibiótico y 5 ml de precultivo bacteriano con cada uno de los fragmentos. La extracción y purificación proteica se realizó como se explica en la metodología y se analizó por SDS-PAGE (Figuras 18 y 19). Figura 18. Fragmento Pv200L-1purificado por IMAC y analizado por SDS-PAGE. Proteínas expresadas en E. coli que pasaron por la columna de níquel (carril 2); fragmento Pv200L-1 (carriles 4 y 5). 39 Figura 19. Fragmento Pv200L-1purificado por IMAC y analizado por SDS-PAGE. Proteínas expresadas en E. coli que pasaron por la columna de níquel (carriles 3 y 4); fragmento Pv200L-3 (carriles 2 y 6). 6.7 Cuantificación del producto Antes de realizar los ensayosde antigenicidad se cuantificó la proteína por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay). Para determinar la concentración de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3, los resultados de absorbancia a 595 nm se interpolaron a una curva de calibración utilizando una proteína estándar, BSA (albúmina sérica bovina), cuya concentración era conocida (Figura 20). Figura 20. Curva de calibración y ecuación de la recta obtenidas para determinar las concentraciones de de los fragmentos proteicos Pv200L-1 y Pv200L-3. 40 Las concentraciones de las proteínas Pv200L-1 y Pv200L-3 fueron de 0.4628 y 0.2344 mg/ml respectivamente. La cantidad total de proteína para cada uno de los fragmentos en su orden fue de 2.808 mg y 1.406 mg. 6.8 DETERMINACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD Una vez teniendo las proteínas purificadas y cuantificadas se procedió a realizar ELISAs para determinar la antigenicidad de cada uno de los fragmentos, utilizando sueros de individuos infectados con P.vivax de áreas endémicas de Colombia y Brasil (figuras 21 y 22). 6.8.1 Reconocimiento de los tres fragmentos por sueros de individuos de área endémica de Colombia Figura 21. Reconocimiento de los Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 por sueros de individuos de área endémica en Colombia. Dilución 1:200. 41 Cada una de las proteínas Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 fueron reconocidas por 94,5%, 85,45% y 98,1% respectivamente por sueros de individuos de área endémica de Colombia. Es decir, casi la totalidad de los sueros respondieron positivamente con cada uno de los fragmentos proteicos. Sin embargo, se evidenció que hubo una mayor respuesta de anticuerpos tipo IgG contra el fragmento Pv200L-1 con respecto a los otros dos fragmentos. 6.8.2 Reconocimiento de los tres fragmentos por sueros de individuos de área endémica de Brasil Figura 22. Reconocimiento de los Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 por sueros de individuos de área endémica en Brasil. Dilución 1:200. En el caso de Brasil, los fragmentos proteicos Pv200L-1 y Pv200L-3 fueron reconocidos por el 100% de los sueros, mientras que el fragmento Pv200L-2 fue reconocido por el 70% del total de los sueros. Como en el caso de Colombia, los sueros de Brasil presentaron una mayor respuesta de anticuerpos tipo IgG contra el fragmento Pv200L-1determinada por las densidades ópticas (OD) con respecto a los otros dos fragmentos. 42 El test de Kruskal-Wallis se utilizó para obtener una confirmación estadística de las diferencias detectadas en la intensidad del reconocimiento de los tres fragmentos por los sueros. En los sueros de Colombia se encontró que habían diferencias significativas entre los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 (H=20.84659, p<0.0000). La prueba de comparaciones múltiples, sugirió que Pv200L-1 se diferencia significativamente de los demás fragmentos (p<0.017), mientras que Pv200L-2 y Pv200L-3 no se diferencian entre sí (p=0.23). En la figura 23 se muestra un diagrama de caja donde se comparan las medianas de la respuesta de los sueros contra cada uno de los fragmentos. Figura 23. Fragmentos que reaccionaron con sueros de Colombia representados en diagramas de caja. Para los sueros de Brasil, utilizando el mismo test (Kruskal-Wallis), también se encontró que habían diferencias significativas entre los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 (H=61.97829, p<0.0000). La prueba de comparaciones múltiples, también sugirió que que Pv200L-1 se diferencia significativamente de los demás fragmentos (p<0.0000), mientras que Pv200L-2 y Pv200L-3 no se diferencian entre sí (p=0.114003). En la figura 24 se 43 muestra un diagrama de caja donde se comparan las medianas de la respuesta de los sueros contra cada uno de los fragmentos. Figura 24. Fragmentos que reaccionaron con sueros de Brasil representados en diagramas de caja. Por otro lado, mediante el test de Mann-Whitney se compararon cada uno de los fragmentos entre los dos países (Colombia y Brasil). Para los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-2 no se encontraron diferencias significativas entre los dos países (Z=-1.71557, p=0.086241) y (Z=1.831267, p=0.067062), mientras que el fragmento Pv200L-3 mostró que habían diferencias significativas (Z=2.386598, p=0.017006). En las figuras 25, 26 y 27 se muestran diagramas de cajas donde se observan las diferencias de la respuesta de cada uno de los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 respectivamente frente a sueros de Colombia y Brasil. 44 Figura 25. Fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 que reaccionaron con sueros de Colombia y Brasil. Después de determinar que el fragmento proteico Pv200L-1 presentara diferencias significativas frente a los otros dos fragmentos, evidenciando así una mayor respuesta frente a sueros de área endémica tanto de Colombia como de Brasil, se decidió realizar titulaciones para determinar hasta donde podría ser reconocido este fragmento. En la tabla 4 se muestra el porcentaje de los sueros a diferentes diluciones que reaccionaron con el fragmento proteico Pv200L-1. 45 Tabla 4. Títulos de anticuerpos contra Pv200L-1 con sueros de Colombia y Brasil Dilución Sueros positivos Colombia Sueros positivos Brasil 1:200-1:1600 45.5% 60.8% 1:3200-1:25600 43.6% 34.78% 1:102000-1:204000 -------- 4.3% 1:51000-1:400000 10.9% ------- 7. DISCUSIÓN Este estudio se enfocó básicamente en determinar y comparar la antigenicidad de tres fragmentos de la región N-terminal de la proteína MSP-1 de P. vivax. Esta región denominada Pv200L ha mostrado alta antigenicidad determinada por los niveles de anticuerpos IgG contra la proteína recombinante rPv200L en individuos de área endémica para la malaria (Valderrama et al., 2005). Al realizar pruebas de antigenicidad para los tres fragmentos, se evidenció una clara respuesta de anticuerpos IgG presentes en sueros de individuos de áreas endémicas de Colombia y Brasil. Los tres fragmentos correspondientes a la subunidad Pv200L de la proteína MSP-1 de P. vivax difieren entre sí. El fragmento Pv200L-1 presenta una secuencia conservada entre las especies de Plasmodium, Pv200L-2 presenta una secuencia variable o polimórfica y Pv200L-3 presenta una secuencia semi-consevada. Esta variación se ve reflejada en el fenotipo antigénico y puede ser atribuida a la variación en el gen msp-1, que podría resultar de la recombinación intragénica (Miller et al., 1993) o por selección inmune ( Hughes 1992). Al analizar la respuesta de los sueros tanto de Colombia como de Brasil con cada 46 uno de los tres fragmentos se observó que estos fragmentos proteicos fueron reconocidos por el 94,5%, 85,45% y 98,1% respectivamente por sueros de área endémica de Colombia. Para el caso de Brasil, Pv200L-1 y Pv200L-3 fueron reconocidos por el 100% de los sueros, mientras que el fragmento Pv200L-2 fue reconocido por el 70% del total de los sueros. Como se mencionó anteriormente, en estudios previos se mostró una alta antigenicidad de la sub-unidad completa Pv200L determinada por los niveles de anticuerpos IgG contra esa proteína recombinante (Valderrama et al., 2005). Así como la proteína Pv200L completa fue reconocida por anticuerpos IgGs presentes en sueros de individuos infectados con P. vivax, se encontró que cada uno de los fragmentos correspondientes a esa proteína también respondieron frente a sueros de individuos de área endémica infectados con P. vivax. Se debe tener en cuenta que los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-3 presentando secuencias conservada y semi-conservada respectivamente reaccionaron positivamente con casi la totalidad los sueros, mientras que el fragmento Pv200L-2 que presenta una secuencia polimórfica, reaccionó con un porcentaje más bajo. Esto evidencia que las regiones polimórficas o variables le confieren al parásito en ciertamedida la capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero (Jiménez et al., 2005), mientras que las regiones conservadas pueden ser reconocidas por anticuerpos generados en diferentes poblaciones, y de esta manera las vacunas creadas contra la malaria a partir de estas secuencias pueden ser más efectivas. Por otro lado, cabe resaltar que en estudios previos (Echeverry 2009), se demostró que el fragmento Pv200L-2 fue reconocido por el 87.6% de los sueros de área endémica de Colombia, porcentaje muy similar al encontrado actualmente (85.45%), dato que confirma 47 que el estudio realizado es reproducible y por lo tanto se puede aplicar para el análisis de antigenicidad para cada uno de los tres fragmentos. De acuerdo al análisis estadístico realizado mediante el test de Kruskal-Wallis se demostró que para el caso de Colombia habían diferencias significativas entre los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 (H=20.84659, p<0.0000). Sin embargo la prueba de comparaciones múltiples, sugirió que Pv200L-1 se diferencia significativamente de los demás fragmentos (p<0.017), mientras que Pv200L-2 y Pv200L-3 no se diferencian entre sí (p=0.23). De acuerdo a estos datos estadísticos y a la figura 23, donde se comparan las medianas de la respuesta humoral de cada uno de los fragmentos, se puede considerar que el fragmento Pv200L-1 presenta una mayor antigenicidad determinada por los altos niveles de anticuerpos IgG contra ese fragmento, los cuales ocurren naturalmente en individuos de área endémica e infectados con malaria. Para el caso de los fragmentos Pv200L-2 y Pv200L-3, aunque respondieron positivamente frente a los sueros de área endémica de Colombia, la capacidad antigénica es menor comparada con la del fragmento Pv200L-1 (Figura 21). Para el caso de Brasil, también se encontraron diferencias significativas entre los fragmentos Pv200L-1, Pv200L-2 y Pv200L-3 (H=61.97829, p<0.0000). La prueba de comparaciones múltiples, también sugirió que Pv200L-1 se diferencia significativamente de los demás fragmentos (p<0.0000), mientras que Pv200L-2 y Pv200L-3 no se diferencian entre sí (p=0.114003). Igual que en Colombia, estos datos muestran que el fragmento Pv200L-1 presenta una mayor antigenicidad, comparada con la antigenicidad de los fragmentos Pv200L-2 y Pv200L-3 (Figura 22). 48 Por otro lado, mediante el test de Mann-Whitney se encontró que los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-2 no presentaron diferencias significativas entre Colombia y Brasil (Z=-1.71557, p=0.086241) y (Z=1.831267, p=0.067062), mientras que el fragmento Pv200L-3 mostró que habían diferencias significativas (Z=2.386598, p=0.017006) (Figura 24). Teniendo en cuenta que tanto Colombia como Brasil presentan condiciones climáticas similares, las cuales han permitido la proliferación de la malaria ocasionada principalmente por P. vivax para las dos regiones, se esperaba que las respuestas de sueros de pacientes infectados con esta especie en los dos países fuera similar cuando se exponen a antígenos como los que se analizaron en este estudio. Efectivamente como se mencionó anteriormente, no se presentaron diferencias significativas de antigenicidad de los fragmentos Pv200L-1 y Pv200L-2 analizados con sueros tanto de Colombia como de Brasil. Esto evidencia que los anticuerpos IgG presentes en estos sueros se han generado por la infección de parásitos que presentan antígenos, como son Pv200L-1 y Pv200L-2 con posibles epítopes B conservados para las dos poblaciones. Cabe resaltar que aunque el fragmento Pv200L-2 es polimórfico, sí se conservan regiones que pueden ser reconocidas por anticuerpos generados en diferentes países tras la infección por P. vivax. Las diferencias de antigenicidad encontradas para el fragmento Pv200L-3 con los sueros de Colombia y Brasil, podría ser atribuida a que a pesar de que es un fragmento semi- conservado presenta una región altamente variable y por lo tanto el reconocimiento de anticuerpos IgG presentes en estos sueros difiere entre un país y otro. 49 El nivel antigénico de las proteínas del parásito y las diferencias de esa antigenicidad encontradas en diferentes localidades pueden ser determinantes para que sean consideradas como candidatos a vacunas contra la malaria. Como es el caso, en este estudio, mediante análisis estadísticos y mediante titulaciones con diluciones hasta 1:400.000, se mostró que el fragmento proteico Pv200L-1 presenta un alto nivel antigénico tanto en Colombia como en Brasil y por lo tanto puede ser considerado como candidato a vacuna contra la malaria. 50 8. CONCLUSIONES Los tres fragmentos mostraron ser antigénicos, los cuales fueron reconocidos por sueros de áreas endémicas tanto de Colombia como de Brasil El fragmento Pv200L-1 presentó mayor antigenicidad en los dos países, y por lo tanto puede ser considerado como uno de los candidatos más promisorios a vacuna contra la malaria. El alto nivel de reconocimiento de sueros de individuos infectados con P. vivax de área endémica hacia los tres fragmentos, sugiere que existen epítopes B que se conservan en las dos poblaciones (Colombia y Brasil). Para el fragmento Pv200L-3 se encontraron diferencias en la intensidad de reconocimiento entre Colombia y Brasil, sugiriendo que este, al presentar una región altamente polimórfica puede responder de manera diferente entre un país y otro. La intensidad de reconocimiento de Pv200L-2 por sueros de Colombia y Brasil incluidos en este estudio no mostró diferencias significativas, indicando que la variabilidad documentada para esta región no tuvo mayor efecto en la antigenicidad entre las dos poblaciones. 51 9. PERSPECTIVAS Teniendo en cuenta que los tres fragmentos (Pv200L-1 ,Pv200L-2 y Pv200L-3), mostraron ser antigénicos, determinado por el reconocimiento de anticuerpos IgG generados en individuos infectados con P. vivax, es importante realizar estudios de inmunogenicidad en animales de experimentación para determinar si estos fragmentos confieren protección contra la infeccion por P.vivax o si es necesario mantener como candidato el fragmento más extenso Pv200L. 52 BIBLIOGRAFÍA BLACKMAN, M. J., HEIDRICH, H. G., DONACHIE, S., McBRIDE, J. S. & HOLDER, A. A. 1990. A Single Fragment of a Malaria Merozoite Surface Protein Remains on the Parasite During Red Cell Invasion and Is the Target of Invasion-inhibiting Antibodies. J Exp Med 172: 379-82. CARMONA- FONSECA, J., ÁLVAREZ, G. & BLAIR, S. 2006. Malaria por Plasmodium vivax: curación del ataque agudo con tres dosis diferentes de primaquina y dosis fija de cloroquina. Antioquia, Colombia, 2003-2004. Biomédica 26: 353-65. DEL PORTILLO, H. A., LONGACRE, S., KHOURI, E. & DAVID, P. H. 1991. Prymary structure of the merozoite surface antigen 1 of Plasmodium vivax reveals sequences conserved between different Plasmodium species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4030– 4034. ECHEVERRY, D. M. 2009. Antigenicidad de la región variable de la subunidad recombinante EcPv200L de la MSP-1 de Plasmodium vivax. Tesis de pregrado. Popayán- Colombia, Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias. 76p. FERREIRA, M., NUNEZ, M. & WUNDERLICH, G. 2004. Antigenic Diversity and Immune Evasion by Malaria parasites. Clinical and diagnostic laboratory inmunology. Minireviews. 11(6) : 987-995. FIGTREE, M., PASAY, C., SLADE, R., CHENG, Q., CLOONAN, N., WALKER, J. & SAUL, A. 2000. Plasmodium vivax synonymous substitution frequencies, evolution and population structure deduced from diversity in AMA 1 and MSP 1 genes. Molecular and Bichemical Parasitology 108: 53-66. GALINSKI, M. R. & BARNWELL J. W. 2008. Plasmodium vivax: who cares?. Malaria Jurnal. Review 7. GOMES, A., DE PAULA, M., DUARTE, A., LIMA, M., MALAFRONTES, R., MUCCI,
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