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Facultad de Ciencias Sede Bogotá Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Nohora Angélica Vega Castro Edgar Antonio Reyes Montaño Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Bogotá, D. C., Colombia, mayo de 2020 Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Nohora Angélica Vega Castro Edgar Antonio Reyes Montaño © Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias © Nohora Angélica Vega Castro Edgar Antonio Reyes Montaño Primera edición, 2020 Edición Coordinación de publicaciones - Facultad de Ciencias coorpub_fcbog@unal.edu.co Corrección de estilo Nombre Apellido Diseño de la colección Leonardo Fernández Suárez Maqueta LaTex Camilo Cubides Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales Impreso y hecho en Bogotá, D. C., Colombia Contenido Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Capítulo uno Estructura primaria de proteínas 21 Requisitos para establecer la secuencia de una proteína . . . . . . . . . . . . . 24 Procesos de fragmentación de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 Métodos enzimáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Mapeo peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 Métodos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Fragmentación de la proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Secuenciación de los péptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Superposición de fragmentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 Fuentes de error en la determinación de la estructura primaria . . . . . . . 73 Limitaciones de la determinación de la estructura primaria a partir de la secuencia de adn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Capítulo dos Caracterización de proteínas por espectrometría de masas (ms) 81 Ionización en modo electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Ionización/desorción láser asistida por matriz (Maldi) . . . . . . . . . . . . . . . 92 Analizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Otros analizadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Analizador de trampa iónica (it) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Ciclotrón de resonancia de iones con transformada de Fourier (ft-icr) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Orbitrap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Determinación de la secuencia de proteínas por espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Fragmentación de la molécula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Determinación de la secuencia N-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Cuantificación de proteínas en estudios de proteómica . . . . . . . . . . . . . . 108 8 Utilidad de la espectrometría de masas como herramienta en el análisis de problemas relacionados con proteínas . . . . . . . . . . . . . 112 Identificación de nuevas variantes proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Evaluación del plegamiento de las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Capítulo tres Consecuencias de la determinación de la estructura primaria de proteínas 121 Proteínas que tienen la misma función y están en diferentes especies . 123 Proteínas que surgieron por la duplicación de un gen . . . . . . . . . . . . . . . . 125 Proteínas con diferente función y localización relacionadas evolutivamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Capítulo cuatro Estructura secundaria 131 Aspectos relevantes para la formación de estructuras secundarias . . . . 133 El enlace peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 Ángulos de torsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 Estructuras secundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 Hélice α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Estructura β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Propensiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 Giros β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 Estructuras supersecundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 Conformación de α-hélice, estructuras β y cadenas laterales . . . . . . . 145 Estabilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 Determinación experimental de la estructura secundaria . . . . . . . . . . . . 155 Dispersión óptica rotatoria (dor) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Comportamiento de macromoléculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Aplicaciones del dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Capítulo cinco Estructura terciaria 171 Determinación experimental de la estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . 175 Determinación de la estructura de proteínas por difracción de rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 9 Resonancia magnética nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 Microscopía crioelectrónica o criomicroscopía electrónica (Cryo-em) 192 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 Capítulo seis Glicoproteínas y carbohidratos 201 Diversidad estructural de los oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Biosíntesis de oligosacáridos en las glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Análisis estructural y funcional de glicanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 Análisis de la glicosilación en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 1. ¿La proteína es glicosilada? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 2. Caracterización de la glicosilación en la proteína intacta . . . . . . . . . 214 3. Caracterización de los oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 Análisis de la estructura del oligosacárido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 Métodos químicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 Métodos enzimáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 Métodos enzimáticos para elucidar estructura primaria de oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 Estudios de glicosilación, funciones biológicas y posibles aplicaciones 232 Patologías asociadas a glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 Capítulo siete Bioinformática estructural: aplicaciones del modelamiento estructural de proteínas 245 Predicción de estructura secundaria y terciaria de proteínas . . . . . . . . . 248 Métodos para predecir estructura secundaria de proteínas . . . . . . . . 249 Predicción de estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 Metodología sugerida para generar modelos estructurales . . . . . . . . 256 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 10 Lista de tablas Capítulo uno Tabla 1. Análisis de aminóacidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Tabla 2. Características de las carboxipeptidasas para determinación del C-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 Tabla 3. Datos de determinación de la secuencia con carboxipeptidasas y espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 Tabla 4. Endoenzimas para proteólisis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 Tabla 5. Endoenzimas recombinantes para proteólisis de proteínas . . . . . . . . . . . .52 Tabla 6. Electroforesis diagonal para determinación de diferentes aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Capítulo dos Tabla 1. Mecanismos de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 Tabla 2. Comparación de las masas moleculares determinadas para citocromos C por espectrometría de masas, ionización electrospray (ms-esi) . . . . . . . . . . .89 Tabla 3. Comparación de las dos técnicas de ionización para proteínas . . . . . . . . .95 Tabla 4. Comparación de los métodos de fragmentación para péptidos . . . . . . . .106 Capítulo cuatro Tabla 1. Longitud de los puentes de hidrógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146 Tabla 2. Valores de b0 y a0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161 Tabla 3. Características de las conformaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .167 Capítulo cinco Tabla 1. Desplazamiento químico en estructura al azar de los 20 aminoácidos proteicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .188 Tabla 2. Características principales de los métodos de preparación comunes de las grillas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .195 Capítulo seis Tabla 1. Bases de datos para glicómica y glicoproteómica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .204 Tabla 2. Métodos colorimétricos para cuantificación de carbohidratos . . . . . . . . .220 Tabla 3. Métodos analíticos para elucidar estructura de oligosacáridos . . . . . . . . .230 Capítulo siete Tabla 1. Parámetros de Chou-Fasman para establecer propensiones de cada uno de los aminoácidos a formar estructuras alfa (Pa), beta (Pb) o al azar (Pt). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251 Tabla 2. Lista de programas disponibles para predicción de estructura terciaria de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .261 11 Lista de figuras Capítulo uno Figura 1. Métodos para establecer la presencia de subunidades de una proteína. A: cualitativos B: preparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Figura 2. Reducción de los puentes disulfuro (cistina) y alquilación en proteínas. A: reducción. B: alquilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Figura 3. Estudio de puentes disulfuro en proteínas. A: reacción de sulfitólisis. B: alquilación con β-haloamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Figura 4. Detección de la glicosilación en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29 Figura 5. Determinación del porcentaje de glicosilación en glicoproteínas por sds-Page . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Figura 6. Detección de glicoformas por ms-esi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Figura 7. Deglicosilación enzimática de glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Figura 8. Oxidación perfórmica de cisteína y metionina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Figura 9. Curvas hipotéticas de la cinética de hidrólisis de los aminoácidos para una proteína en condiciones ácidas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Figura 10. Determinación de cisteína libre con el reactivo de Ellman . . . . . . . . . . .35 Figura 11. Determinación de triptófano por formación del complejo de Ruhemann . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35 Figura 12. Diagrama de purificación de aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Figura 13. Reacciones de derivatización de los aminoácidos. A: reacción con O-Ftalaldehído. B: reacción con fluroescamina. C: reacción con ninhidrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Figura 14. Perfil de elución de los aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37 Figura 15. Resultados del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis (lsbo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Figura 16. Reporte del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis (LSBo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39 Figura 17. Determinación del aminoácido N-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Figura 18. Determinación de la secuencia N-terminal por la degradación de Edman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 Figura 19. Determinación de la secuencia N-terminal con dabitc . . . . . . . . . . . . . . .44 Figura 20. Reacción de hidrazinólisis para la determinación del C-terminal . . . . . .48 Figura 21. Sitios de clivaje de una proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Figura 22. Ilustración esquemática de la fragmentación de un péptido con tripsina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51 Figura 23. Reacción de los grupos ε de la lisina con anhídridos carboxílicos . . . . .52 Figura 24. Mapa peptídico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .54 Figura 25. β-eliminación: modificación a nivel de Ser, Thr y Cys . . . . . . . . . . . . . . . .55 Figura 26. β-eliminación: modificación a nivel de cisteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Figura 27. Modificación a nivel de cisteína con cianuro de potasio (KCN) . . . . . . . .57 Figura 28. Modificación a nivel de cisteína con cianuro de potasio y el reactivo de Ellman (dntb) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58 12 Figura 29. Modificación a nivel de cisteína con el reactivo de Degani (2-Nitro-5-tiociano ácido benzoico) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Figura 30. Modificación a nivel de triptófano, método Patchkornich . . . . . . . . . . . .59 Figura 31. Modificación a nivel de metionina con BrCN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60 Figura 32. Modificación a nivel de serina con N, N’ carbonato disuccinimidilo (dsc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61 Figura 33. Ejemplo de superposición de los péptidos de una proteína hipotética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 Figura 34. Purificación de péptidos obtenidos en la hidrólisis de la lectina de Dioclea lehmanni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64 Figura 35. Superposición de fragmentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67 Figura 36. Secuencia de la lectina Canavalia marítima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Figura 37. Comparación de secuencias de tres lectinas relacionadas. . . . . . . . . . . .69 Figura 38. Electroforesis diagonal para determinación de la posición de los puentes disulfuro en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70 Figura 39. Representación de la electroforesis diagonal para la determinación de proteínas con puentes disulfuro intra e intercatenarios en proteómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72 Capítulo dos Figura 1. Componentes de un espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Figura 2. Ionización en modo electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .86 Figura 3. Configuración de un espectrómetro de masas básico para determinar peso molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87 Figura 4. Espectro de masas para la apomioglobulina (músculo de caballo) . . . . .88 Figura 5. Espectro de masas (esi-cuadrupolo) para la lectina de Salvia bogotensis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89 Figura 6. Determinación del peso molecular y de las glicoformas de la ribonucleasa A y B por espectrometría de masas en modo de ionización electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 Figura 7. Configuración de un espectrómetro de masas en tándem (ms/ms)-esi para determinar la secuencia de un péptido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Figura 8. Ionización/desorción láser asistida por matriz (Maldi) . . . . . . . . . . . . . . . .93 Figura 9. Esquema de un Analizador tof. A: geometría lineal. B: con reflectrón . .94 Figura 10. Fragmentación de un péptido-formación de iones . . . . . . . . . . . . . . . . . .99 Figura 11. Vía de fragmentación β de la molécula de proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 Figura 12. Diagrama para establecer secuencia de un tetrapéptido fragmentado en modo cid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101 Figura 13. Espectro de masas en modo cid del ion (M+H)+ (m/z = 1882.1) del péptido A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102 Figura 14. Espectro de masas para el péptido B y fragmentación vía C-terminal . .102 Figura 15. Espectro de masas para el péptido C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .104 Figura 16. Interacción de electrones (e-) con moléculas multiprotonadas . . . . . . . .104 Figura 17. Marcación del extremo N-terminal con dimetilo para análisis por espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .107 Figura 18. Estudio de proteómica cuantitativa usando espectrometría de masas 108 Figura 19. Marcación de cisteínas en una mezcla de proteínas con isótopos (método icat) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109 Figura 20. Etiquetado por digestión enzimática con tripsina en H2180 . . . . . . . . . . .110 Figura 21. Marcación isobárica (etiquetado itraq) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111 13 Figura 22. ms-esi para proteína plasmática transtiretina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113 Figura 23. ms-esi para el complejo avidina-biotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .116 Figura 24. ms-nano esi para el complejo homotetramérico Transtiretina . . . . . . . .117 Capítulo tres Figura 1. Árbol filogenético para el citocromo C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .124 Figura 2. Alineamiento de las secuencias de la proteína citocromo c . . . . . . . . . . .125 Figura 3. Árbol filogenético de la evolución por duplicación genética de la hemoglobina y la mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127 Figura 4. Crecimiento de la base de datos Uniprot KB/Swiss-prot desde 1990 hasta 2019 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .128 Capítulo cuatro Figura 1. Geometría del enlace peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .134 Figura 2. Ángulos diédricos y dipolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .134 Figura 3. Ángulos de torsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 Figura 4. Estructura en α hélices de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138 Figura 5. Representación de rueda helicoidal en una α hélice. . . . . . . . . . . . . . . . . .139 Figura 6. Red Helicoidal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .140 Figura 7. Comparación de las tres clases de hélices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .140 Figura 8. Hojas β antiparalelas en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .141 Figura 9. Representación de giros β en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .144 Figura 10. Interacción de las estructuras secundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146 Figura 11. Interacción entre α hélices formación del core hidrofóbico . . . . . . . . . . .149 Figura 12. Miohemeritrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149 Figura 13. Motivo jelly-roll Lectina de concanavalina A (Con A) . . . . . . . . . . . . . . . . .150 Figura 14. Estructuras de lectinas. A: estructura tridimensional de bryohealin resuelta con i-Tasser, flechas azules (hebras β). B: fucolectina proveniente de Anguilla anguilla O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151 Figura 15. Inmunoglobulina M. A: pdb 2RCJ Estructura de Inmunoglobulina M humana (IgM). B: estructura β sándwich que incluye topologíade llave griega . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152 Figura 16. Unidades β-α-b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152 Figura 17. Plegamiento Rossmann (α/β estructuras -hoja β abierta) . . . . . . . . . . . .153 Figura 18. Plegamiento barril tim. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .154 Figura 19. Plegamiento Rossmann en enzimas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Figura 20. pdb vgk Estructura cristalina del complejo mayor de histocompatiblidad de Tipo I, H-2Kd a 2.0 A resolución . . . . . . . . . . . . . . . . .155 Figura 21. Radiación electromagnética y luz polarizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .156 Figura 22. Componente eléctrico de luz polarizada y no polarizada . . . . . . . . . . . . .157 Figura 23. Dispersión óptica rotatoria (dor) y Dicroismo circular (dc). . . . . . . . . . .158 Figura 24. Curvas hipotéticas de dispersión óptica rotatoria dor . . . . . . . . . . . . . .158 Figura 25. Gráfica hipotética para la determinación de b0 y a0 para α hélice y estructuras desordenadas o random coil (rc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .160 Figura 26. Determinación del espectro por dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . .164 Figura 27. Espectro dc en la región uv-lejano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .166 Capítulo cinco Figura 1. Representación de un cristal y su celda unitaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .176 14 Figura 2. Sistemas cristalinos posibles en las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .177 Figura 3. Grupos espaciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .177 Figura 4. Incidencia de un haz sobre un plano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 Figura 5. Determinación de a, b y c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178 Figura 6. Determinación de la ecuación de Bragg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .179 Figura 7. Representaciones de vectores de dispersión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .182 Figura 8. Método geométrico para calcular la probabilidad de fase . . . . . . . . . . . . .183 Figura 9. Reemplazo isomorfo. Se han superpuesto dos fotografías de cristales triclínicos de lisozima. El punto izquierdo de cada pareja de puntos proviene del cristal de la lisozima nativa y el punto derecho corresponde al cristal después de la difusión de HgBr2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .184 Figura 10. Espectro Tocsy patrón para algunos aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .190 Figura 11. Conectividad Noesy y Tocsy en un dipéptido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .191 Figura 12. Ejemplo de diagrama de flujo para determinación de estructura por el método de partícula individual con microscopía electrónica (em) . . . .194 Capítulo seis Figura 1. Glicosilación en glicoproteínas de tipo N en mamíferos . . . . . . . . . . . . . .206 Figura 2. Glicosilación en glicoproteínas de tipo N en plantas e invertebrados . . .207 Figura 3. Glicosilación de tipo O en mucinas epiteliales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .208 Figura 4. O-Glicosilación en glicoproteínas de mamíferos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .209 Figura 5. O-Glicosilación en en plantas e invertebrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .210 Figura 6. Estrategia para realizar estudios de glicosilación en glicoproteínas . . . .215 Figura 7. Determinación del perfil de glicoproteínas citoplasmáticas en líneas celulares con microarreglos de lectinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .215 Figura 8. Deglicosilación enzimática para glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .216 Figura 9. Hidrólisis enzimática de glicanos en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . .218 Figura 10. Análisis cualitativo y cuantitativo de carbohidratos por electroforesis en geles de poliacrilamida y marcación con fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . .219 Figura 11. Patrones de fragmentación de monosacáridos por ionización de impacto electrónico (ei) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .221 Figura 12. Reacción de hidrazonólisis para liberar oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . .222 Figura 13. Reacción de marcación de los oligosacáridos con 2-AB (2-aminobenzamida) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .223 Figura 14. Cromatografía para purificación de oligosacáridos. A: Filtración en gel para separar por masa molecular. B: Intercambio aniónico de alta resolución (hplc) y marcación para detección por fluorescencia. . . . .224 Figura 15. Patrones de Fragmentación generados por espectrometría de masas en tándem (ms/ms) modo etd. A: patrones generados en péptidos. B: patrones generados en glicanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .226 Figura 16. Patrones de fragmentación generados por espectrometría de masas en tándem (ms/ms) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .227 Figura 17. Patrones de Fragmentación generados por espectrometría de masas en tándem (ms/ms) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .228 Figura 18. Determinación de la estructura de un glicano por digestión enzimática secuencial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .229 Figura 19. Determinación de la estructura de un glicano por digestión enzimática secuencial, utilizando un arreglo de enzimas con diferente especificidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .230 15 Figura 20. Diagrama general para estudios de glicómica, análisis estructural de los glicanos, y glicoproteómica, análisis de los glicopéptidos . . . . . . . . . . .231 Figura 21. Interacciones de los glicanos conjugados a proteínas y lípidos. Glicosilación de tipo N y O implicados en procesos celulares . . . . . . . . . . . . . .232 Capítulo siete Figura 1. Representación de estructuras secundarias de proteínas . . . . . . . . . . . . .249 Figura 2. Representación de la estructura de la red neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . .254 Figura 3. Metodología propuesta para la generación de modelos estructurales a partir de secuencia blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .257 Figura 4. Correspondencia aproximada entrer calidad del modelamiento, precisón, metodología usada y posibles aplicaciones de los modelos . . . . . .262 Introducción Las proteínas son polímeros lineales de α-aminoácidos que se organizan aleatoriamente para formar asociaciones estructuralmente diferentes, con diversas funciones biológicas. Los aminoácidos son compuestos orgánicos que se caracterizan por tener una estructura básica de un grupo carboxilo, unido a un grupo amino por medio de un carbono tetramérico (C α) que, además de unirse al grupo carboxilo y al grupo amino, se une a un hidróge- no a través de su tercer enlace y, a través de su cuarto enlace, a una cadena variable que da origen a la diversidad de α-aminoácidos que constituyen las proteínas. A pesar de que se conocen más de quinientos aminoácidos, solo son veinte los que se encuentran, mayoritariamente, en las proteínas y los que dan origen a la diversidad funcional y estructural de las mismas. Para que los aminoácidos se unan entre sí y puedan formar estructuras estables, se realiza un enlace covalente entre el grupo amino de un aminoácidoy el grupo carboxilo del siguiente, estableciéndose un enlace tipo amida que posee características especiales y se denomina enlace peptídico. Las proteínas se sintetizan constantemente y, para que eso ocurra, la información de su estructura se encuentra almacenada en una molécula completamente diferente, el adn. Para que se forme una proteína nueva, se requiere que se activen una serie de procesos que involucran varias es- tructuras celulares, y otros, más complejos: de copiado de información a partir de un gen (adn), la generación de una molécula mensajera que lleve la información desde el adn hasta el ribosoma (arn) y la lectura y traduc- ción de dicha información para que el mensaje que viene codificado en un lenguaje de cuatro componentes en el arn sea traducido en un lenguaje de veinte componentes en la proteína. Durante el proceso de transcrip- ción (copiado de la información del adn para formar arnm), se envía un mensaje que contiene toda la información almacenada en uno de los genes que conforman el genoma de un organismo. Este arnm llega al ribosoma de la célula y allí ocurre el proceso de lectura por tripletas de ese mensaje (codones), para formar la proteína con una alta fidelidad de acuerdo a lo contenido en el genoma del organismo. Los seres vivos están conformados por una gran variedad de proteínas que se pueden agrupar de acuerdo con sus características físicas, químicas, estructurales o funcionales. Teniendo en cuenta su función, las proteínas se pueden clasificar según el fenómeno biológico en el cual están involucradas. Hay proteínas que se encuentran catalizando la mayoría de las reacciones 18 metabólicas que ocurren en las células. Estas son conocidas como enzimas y presentan características como su especificidad, que las convierte en re- guladoras de los procesos en los que participan. Si se revisan los procesos de comunicación celular, se encontrará que en todos ellos hay proteínas involucradas. Ejemplos de estas proteínas son los receptores de hormonas y los receptores de neurotransmisores, los cuales interactúan con sus ligandos por complementariedad entre sus estructuras y desencadenan respuestas celulares. Muchos de estos ligandos (hormonas y neurotransmisores) son, a su vez, de naturaleza proteica. Las moléculas biológicas para transportar son, generalmente, proteínas, que se relacionan con cualquier tipo de transporte de moléculas. Entre los que se destacan el transporte de moléculas hidrofóbicas a través de medios acuosos como las lipoproteínas en la sangre y el transporte de sustancias a través del citoplasma por medio de una red de microtúbulos, como lo hace la kinesina. Así mismo, las proteínas pueden servir de transportadores a tra- vés de la membrana biológica ya sea participando en procesos redox, como en la membrana de la mitocondria, o como transportadoras de moléculas polares a través de la membrana, como ocurre en los canales iónicos. Al- gunas proteínas pueden cumplir también funciones de almacenamiento de sustancias nutritivas, como sucede en las etapas del desarrollo embrionario o con algunos iones vitales para el organismo. Otros procesos biológicos también son soportados por este tipo de molé- culas. La estructura y soporte de las células son dadas por una compleja red de naturaleza proteica que se denomina citoesqueleto, el cual constituye un armazón alrededor del que se organizan todos los componentes celulares, sirviendo como soporte para la realización de fenómenos indispensables para la viabilidad celular como el transporte intracelular o la división celular. En los tejidos de sostén (conjuntivo, óseo y cartilaginoso) de los vertebrados, las fibras de colágeno presentes en la matriz extracelular son las encargadas de conferir resistencia mecánica tanto a la tracción como a la compresión. La queratina (presente en cabello, plumas, uñas y cuernos), la fibroína de la seda de araña y la fibrina que segregan las plaquetas para formar los coágulos sanguíneos también son proteínas con función estructural. La defensa en los diferentes organismos también es un proceso realizado por proteínas. En las bacterias, las llamadas endonucleasas de restricción se encargan de identificar y destruir moléculas de adn que no se identifi- can como propias y, en los vertebrados superiores, las inmunoglobulinas reconocen moléculas extrañas y se unen a ellas para facilitar su destrucción, proceso del que se encargan las células del sistema inmunitario. El control de diferentes funciones vitales de las células se puede realizar a nivel gé- nico y, en este proceso, las proteínas regulan la expresión génica, es decir, se encargan de decidir en todo momento qué genes deben ser transcritos a arn y, por lo tanto, traducidos a proteína. 19 Independientemente del tipo de proteína que se esté considerando, para que esta sea funcional, debe tener una estructura tridimensional estable. Para llegar a esta estabilidad, las proteínas presentan tres (algunas cuatro) niveles estructurales que contribuyen para alcanzar esa estabilidad. La estructura primaria está determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados. La estructura secundaria corresponde al plegamiento que adoptan determinadas regiones de la cadena polipeptídica por el estable- cimiento de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico. Finalmente, la molécula proteica adopta un plegamiento tridi- mensional que constituye su estructura terciaria, concepto equiparable al de conformación absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria está determinada por la estructura primaria y es la responsable directa de sus propiedades biológicas. Las interacciones que estabilizan la estructura ter- ciaria pueden ser tanto de tipo covalente (puentes disulfuro) como de tipo no covalente (puentes de hidrógeno, fuerzas de polaridad, electrostáticas, hidrofóbicas, etc.). Algunas proteínas pueden tener un nivel estructural adicional cuando se asocian varias cadenas polipeptídicas (iguales o distin- tas) para formar una unidad funcional, y en ese caso se habla de estructura cuaternaria. Las interacciones que estabilizan la estructura cuaternaria son de tipo no covalente. Las proteínas se asocian entre sí o con otra clase de biomoléculas para formar asociaciones supramacromoleculares (microtúbulos, ribosomas, nu- cleosomas, virus, membranas, etc.). Las interacciones que estabilizan este nivel de estructura también son de tipo no covalente. Esta organización se diferencia de la cuaternaria debido a que la estequiometría de las estructuras formadas puede variar considerablemente. La pérdida de la estructura terciaria se denomina desnaturalización y va acompañada de la pérdida de funcionalidad. Sin embargo, con la des- naturalización no desaparece la estructura primaria, ya que se mantienen los enlaces peptídicos. En algunos casos la desnaturalización es reversible. Las proteínas se pueden estudiar en todos sus niveles estructurales por medio de diferentes técnicas experimentales. De acuerdo con lo anterior y teniendo en cuenta la importancia de estudiar las proteínas, en este docu- mento hablaremos sobre estructura de proteínas y algunos métodos básicos experimentales que se pueden emplear para su estudio. Capítulo uno Estructura primaria de proteínas Estructura primaria de proteínas • 23 La función de una proteína solo se puede entender si se conoce su estruc- tura tridimensional y para determinarla se debe conocer su secuencia de aminoácidos. Sanger [1] estableció la primera secuencia para la insulina bovina y a partir de este estudio se corroboró que las proteínas poseían una única estructura covalente. Desde entonces, se han establecido una gran cantidad de secuencias, las cuales han sido importantes para la formulación de los conceptos modernos de la bioquímica por varias razones, entre las que se destacan:1. La estructura primaria de una proteína es esencial para entender su mecanismo molecular de acción y es importante para establecer su estructura terciaria por difracción de rayos X o cryo-micros- copía electrónica. También se pueden obtener más fácilmente proteínas recombinantes, si se conoce con certeza la secuencia N-terminal y C-terminal. 2. Las comparaciones de las secuencias entre proteínas análogas del mismo individuo, de la misma especie y de especies relacionadas han dado información acerca de la función de una proteína y de las relaciones evolutivas entre las proteínas y los organismos que las producen. Estos análisis complementan los estudios taxonó- micos basados en comparaciones anatómicas. También, es posible hacer predicciones respecto a la estructura y función de la proteína. 3. La secuencia de una proteína tiene implicaciones clínicas impor- tantes, ya que algunas enfermedades se producen por mutacio- nes puntuales o por el cambio de un aminoácido por otro en la molécula. Muchos de estos estudios han llevado al desarrollo de métodos diagnósticos y, en algunos casos, el desarrollo de terapias. 4. Se puede hacer la predicción de la localización celular de la pro- teína en función de su secuencia N-terminal. 5. Permite hacer la determinación de la estructura y función de una proteína a través de diversos métodos computacionales y experimentales. La elucidación de la estructura primaria de la insulina bovina, la cual tiene cincuenta residuos de aminoácidos, fue el resultado del trabajo desa- rrollado por Sanger y colaboradores a lo largo de una década, en el que se emplearon grandes cantidades de proteína, del orden de gramos. Hoy en día los métodos y las técnicas para determinar la estructura primaria de las proteínas se han perfeccionado y automatizado, a tal punto que proteínas de un tamaño semejante se pueden secuenciar en unos pocos días, utilizando cantidades del orden de microgramos (mg) de proteína. Posteriormente, se hizo la secuenciación de la enzima β-galactosidasa, la cual tiene 1021 residuos de aminoácidos. Esto demostró que, de ahí en adelante, se podía determinar la secuencia de cualquier proteína. 24 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Para determinar la estructura primaria se debe realizar un proceso de frag- mentación de la proteína, la caracterización de sus fragmentos (péptidos) y la reconstrucción de su estructura original (por superposición de pépti- dos). Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede obtener por medio de: 1. Rupturas específicas, empleando métodos químicos y enzimáticos. Hoy en día, se han caracterizado nuevas proteasas bacteriales y de plantas. Además, se han obtenido enzimas recombinantes con una alta especificidad. 2. Métodos de detección a partir de pequeñas cantidades de proteína. 3. La secuenciación automática que, al compararla con la secuen- ciación manual, garantiza la reducción de los tiempos de análisis. 4. La secuenciación de péptidos por espectrometría de masas, que ha reducido, de manera considerable, la obtención de la secuen- cia de los péptidos derivados de una proteína y ha aumentado, considerablemente, el número de secuencias reportadas. Requisitos para establecer la secuencia primaria de una proteína Cuando se van a realizar estudios enfocados en la determinación de la estructura primaria, la proteína debe cumplir con unos requisitos para de- terminar la secuencia. Aunque las técnicas para alcanzar estos resultados han tenido grandes avances, se debe establecer una estrategia que permita, al final del proceso, obtener secuencias que sean lo más exactas posibles, de esta forma se pueden iniciar estudios enfocados en estructura terciaria y función de proteínas. La selección de la proteína de interés depende del objetivo de la in- vestigación, de la fuente biológica de la cual será aislada (virus, bacterias, órganos o semillas, entre otros) y, por supuesto, de la cantidad de proteína disponible. Sin embargo, si la secuencia tiene como objetivo desarrollar una nueva metodología para secuenciación, se emplean proteínas con se- cuencias establecidas. Los principales requisitos para establecer la secuencia de una proteína son: 1. Pureza de la proteína: debe ser mayor al 97 %, de tal forma que las impu- rezas no afecten la cantidad de los péptidos de interés. Si el estudio ha sido diseñado para obtener una secuencia completa, la pureza debe ser mayor al 98 %. Por otra parte, la preparación de proteína debe ser homogénea y se debe garantizar que solo hay una entidad molecular. Se hacen controles Estructura primaria de proteínas • 25 previos que incluyan una evaluación por electroforesis y la determinación del punto isoeléctrico y de la secuencia N-terminal. Sin embargo, con estas técnicas algunas heterogeneidades no son detectadas y aparecen durante el análisis, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos con carga eléctrica idéntica, isoleucina y valina, y algunas modificaciones postraduccionales como acetilaciones, metilaciones, etc. 2. Cantidad de proteína: depende de la cantidad de datos que se desean ob- tener y del método de secuenciación (para un análisis completo se necesitan cantidades del orden de miligramos). Las pérdidas de proteína durante los procedimientos analíticos se dan por la absorción de péptidos a los sopor- tes cromatográficos. Los procesos de fragmentación que no son del cien por ciento (100 %) y las malas estrategias de secuenciación incrementan su cantidad durante el análisis. 3. Evaluación de la exactitud de la estructura primaria: se debe hacer la identificación de secuencias idénticas de péptidos en más de un digerido (fragmentos obtenidos por métodos enzimáticos y químicos) y, si es posible, un análisis de aminoácidos. Si existen datos de secuencias de proteínas cer- canas o similares, solo se requieren experimentos con un solo digerido, por ejemplo, con tripsina. En cambio, si la proteína no ha sido estudiada ni se conoce nada acerca de las proteínas cercanas, se requiere una producción continua de proteína pura y una minuciosa caracterización de los péptidos. 4. Tratamientos previos: son necesarios para realizar una digestión más completa de la proteína, ya que el microambiente en el que están los resi- duos puede impedir el ataque proteolítico. Al final del tratamiento, se debe obtener un material altamente soluble. Para tal fin, se emplean agentes desnaturalizantes químicos y físicos. En presencia de agentes desnaturali- zantes físicos, como la temperatura, se hace un calentamiento previo de la proteína a pH ácidos o alcalinos, de esta forma se pueden emplear agentes proteolíticos como la tripsina o el bromuro de cianógeno (BrCN). Con agentes desnaturalizantes químicos, por lo general, se emplea docecil sul- fato de sodio (sds) al 1 %, con o sin calentamiento, y se diluye al 0.1 % para realizar una posterior fragmentación de la proteína con proteasas. Otros tratamientos incluyen modificaciones químicas, entre las que se encuentra la reducción de los puentes disulfuro y la adición de urea junto con dodecil sulfato de sodio (sds) al 0.1 %. Es importante tener en cuenta, que no todos los agentes desnaturalizantes son removidos para llevar a cabo la diges- tión enzimática y, por lo tanto, no deben afectar la actividad de las proteasas. La reducción de los puentes disulfuro puede llevar a la formación de agregados de alto peso molecular, los cuales no se pueden solubilizar, ni siquiera empleando condiciones drásticas de reducción, aunque, cuando 26 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas el producto es soluble en medio ácido, se puede fragmentar con bromuro de cianógeno (BrCN) y pepsina. En términos generales, las modificaciones previas a la fragmentación pueden alterar la selectividad del agente proteolítico. Algunas de ellas son las acetilaciones, la producción de sulfoderivados y la carbamilacióndel grupo ε-amino de la lisina, en este último caso se ve afectada la actividad de la tripsina. También el uso de la urea puede producir cianato y modi- ficar algunos grupos en un amplio rango de pH. Otras modificaciones se evidencian al usar los anhídridos carboxílicos (succínico, maleico, etc.), que pueden ser empleados en estudios de disociación de multímeros y funcio- nalidad. La oxidación de los aminoácidos aromáticos y la acilación de los grupos ε-amino restringen, en el último caso, la hidrólisis de la proteína por proteasas como la tripsina. 5. Caracterización parcial de la proteína: es muy importante ya que nos permite proponer una buena estrategia de secuenciación. El proceso previo de purificación debe arrojar un producto de óptima calidad y, por lo tanto, permitir la evaluación de parámetros moleculares como: 5.1. El peso molecular de la proteína nativa, el cual se debe determinar mínimo por tres métodos analíticos o, de una forma más exacta, por es- pectrometría de masas con ionización electrospray (ms-esi). Este parámetro permite hacer un estimado del número de los aminoácidos que se van a secuenciar. La presencia de proteínas conjugadas da como resultado un peso molecular menor de la parte proteica y, por lo tanto, del número de aminoácidos que se van a determinar. 5.2. Si las proteínas son multiméricas, se deben caracterizar los monóme- ros constituyentes. Cuando se emplean diferentes métodos, la sensibilidad de las proteínas difiere y, por lo tanto, se deben establecer las condiciones de disociación para el análisis individual de cada subunidad. Por medio de métodos analíticos, se puede evaluar el número de subunidades que tiene la proteína, cómo son químicamente entre sí (idénticas o no idénticas) y cómo interactúan las cadenas polipeptídicas (covalentemente o no covalen- temente). La suma del peso molecular de las subunidades debe ser igual al peso molecular de la proteína nativa. En la figura 1, se observa un resumen de las técnicas para determinar si las proteínas son multiméricas. La reducción de los puentes disulfuro varía en susceptibilidad hacia los agentes reductores. Para el proceso de reducción se deben establecer las condiciones para cada proteína, como concentración del reductor, tiempo, pH y temperatura. Comúnmente se emplean agentes reductores como β-mercaptoetanol y ditiotreitol (reactivo de cleland). La alquilación se rea- liza para evitar la recombinación de los puentes disulfuro y evitar que se Estructura primaria de proteínas • 27 formen agregados. Para ello, se emplean agentes alquilantes como el ácido iodoacético y la iodoacetamida (figura 2). Otros agentes alquilantes incluyen el uso de la vinilpiridina, β-haloamina o la etilenimina, en este último caso se obtiene un derivado catiónico S-(2-aminoetil-cisteina) (figura 3B) con propiedades similares a la lisina, una ventaja, ya que se hace la introducción de sitios específicos de clivaje enzimático, para la tripsina [2]. A CUALITATIVOS ELECTROFORESIS EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES Y REDUCTORAS. PUNTO ISOELÉCTRICO EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES. B PREPARATIVOS FILTRACIÓN EN GEL ELECTROFORESIS PREPARATIVA La resolución del método entre dos proteínas es de 23 kDa. Se puede realizar en condiciones desnaturalizantes La resolución del método entre dos proteínas es de Se puede realizar en condiciones desnaturalizantes 1 kDa. CROMATOGRAFÍA LIQUIDA (hplc) Figura 1. Métodos para establecer la presencia de subunidades de una proteína. A: cualitativos B: preparativos OH CH2 CH2 CH2 CH2S S OHCH2 CH2 SH SH C HS CH 2 CH 2 OH AC C N CH2 O S S CH2 C C O OH OH SH CH CH SH CH 2 CH 2 1 1 OH HCS OH S CH2 CH2 HC 2 2 + B CH2 S C C O NH2 CH2 S C C O O HI I C H 2 CO O I CH 2 CONH 2 CH2 CH2 SH SH C 1 2 Figura 2. Reducción de los puentes disulfuro (cistina) y alquilación en proteínas. A: reducción. B: alquilación 28 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas S-aminoetilcisteina B A Cismercaptido R1 S S SO2R 3 2 R1(2) S 1 R2(1) S SO3 1 SO32 R1(2)S 1 SO3 22Cu 2 2Cu 1S S H NH CH CH2 CH2 CH2BrSH NH3 haloamina C O NH CH CH2 CH2 NH3 C O CH2 Br Figura 3. Estudio de puentes disulfuro en proteínas. A: reacción de sulfitólisis. B: alquilación con β-haloamina Fuente: [3, p. 38]. La sulfitólisis introduce un grupo sulfo para mejorar la solubilidad de la proteína o del péptido. Con esta reacción no hay oxidación del triptó- fano ni de la metionina, como ocurre cuando se hace la iodoacetilación. En condiciones muy básicas y desnaturalizantes los puentes disulfuro son heterolíticamente clevados y la formación del producto es favorecida por exceso de reactivo (figura 3A). Para la secuenciación de una proteína mul- timérica, la separación de subunidades iguales no es necesaria, pero sí la disociación del polipéptido en las condiciones establecidas (unión covalente o no covalente), con el fin de que los puntos de corte de los agentes pro- teolíticos sean más accesibles. La separación de subunidades diferentes es necesaria, al igual que su análisis individual, para realizar estudios de secuenciación. 5.3. Determinación de la secuencia N-terminal que, para la proteína nativa y para las subunidades, solo se va debe encontrar una secuencia en cada caso. Esto garantiza que en el material de partida hay solo una entidad molecular y que este es homogéneo. Algunas veces, esta secuencia puede Estructura primaria de proteínas • 29 estar bloqueada por modificaciones postraduccionales o manipulación de la proteína; sin embargo, se debe hacer una revisión minuciosa de los re- sultados antes de llegar a estas conclusiones. 5.4. En el caso de proteínas conjugadas, se deben hacer ensayos para evaluar cómo es la interacción de la proteína con grupos de diferente naturaleza, como carbohidratos, lípidos, grupos heme, etc., y removerlos sin afectar la proteína, por ejemplo, la remoción de carbohidratos en glicoproteínas. La detección de glicoproteínas se puede hacer por métodos cualitativos que van a variar en la sensibilidad. Los métodos se basan en la oxidación de los carbohidratos y la formación de un complejo coloreado. Un método que se emplea es la oxidación de los carbohidratos con metaperiodato de sodio para formar aldehídos vecinales y, posteriormente, formar un deri- vado, por ejemplo, con hidrazina biotinilada. Al final, la detección se hace con el sistema de estreptavidina peroxidasa [4]. Existen otros métodos que tienen diferente sensibilidad como la tinción shiff o el uso de anticuerpos antiperoxidasa dirigidos contra glicoproteínas de origen vegetal (figura 4). A Oxidación Biotinilación Aldehídos vecinales Aldehídos-Biotina Detección de carbohidratos SDS-Page Tinción Reacción enzimática Figura 4. Detección de la glicosilación en glicoproteínas 30 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Una vez se ha hecho la detección de la glicosilación, se debe hacer la cuantificación de los carbohidratos en la proteína. Usualmente se hace em- pleando el método de Dubois et al. [5], el cual se basa en la deshidratación del carbohidrato con ácido sulfúrico concentrado y posterior formación de un complejo amarillo con fenol al 5 % que absorbe la luz a 450 nm. Con ayuda de una curva de calibración, empleando glucosa como patrón y la proteína pura cuantificada, se puede hacer la determinación con base en la diferencia del peso: % = (mg carbohidrato en la muestra/mg proteína total) × 100 Sin embargo, si el porcentaje de carbohidratos es inferior al 5 % no es necesario removerlo para realizar los estudios de secuencia. Empleando técnicas como sds-Page, se puede determinar el porcentaje (%) de uniones N-glicosídicas y O-glicosídicas. A partir de la diferencia en la movilidad electroforética ((∆kDa), figura 5) y el uso de enzimas especi- ficas para la hidrólisis de cada unión glicosídica (figura 7), es posible esta- blecerel porcentaje de glicosilación y, a su vez, realizar comparaciones con estructuras de oligosacáridos ya establecidas, teniendo en cuenta que esta modificación postraduccional es conservada. Tambíen se puede determinar el porcentaje total de glicosilación, haciendo una hidrólisis química total para remover todas las cadenas de oligosacáridos (figura 5). a b c d kDa a. SDS - Page proteína glicosilada. c. Tinción especifica glicoproteína. b. SDS - Page proteína deglicosilada. d. Tinción especifica proteína deglicosilada. Figura 5. Determinación del porcentaje de glicosilación en glicoproteínas por sds- Page Estructura primaria de proteínas • 31 Una determinación cuantitativa exacta se puede realizar usando es- pectrometría de masas con ionización electrospray (ms-es), que consiste en determinar el peso molecular de la glicoproteína antes y después de la remoción del oligosacárido. Con este método, también es posible hacer la detección de glicoformas porque la diferencia de peso molecular entre ellas es muy pequeña, pero las propiedades físicas y químicas de la proteína son iguales (figura 6). La remoción de carbohidratos se puede realizar de manera no selectiva, con una hidrólisis química suave, con ácido clorhídrico (HCl) 0.01 M a 100 °C durante 3 horas (un ácido más concentrado puede romper los enlaces peptídicos). Una vez terminada la hidrólisis se puede hacer la eliminación de los monosacáridos por medio de filtración en gel, ultrafiltración o diáli- sis. Una hidrólisis química selectiva para eliminar O-glicosídicos se puede realizar con ácido sulfónico trifluorometano (tmsf) [6]. Los métodos de deglicosilación selectivos incluyen la hidrólisis enzimá- tica con enzimas para remover la N y O glicolisación (figura 7). Antes del tratamiento enzimático, es importante realizar una desnaturalización previa de la glicoproteína para asegurar la accesibilidad de la proteasa y evitar la modificación del oligosacárido. En el caso de proteínas conjugadas a lípidos, los cuales no están asociados covalentemente a las proteínas, se pueden realizar procesos de extracción diferencial con solventes (Etanol: éter); un ejemplo del proceso es la deli- pidación de proteínas de alta densidad del suero. Para proteínas que tienen cofactores, si ellos están unidos covalente- mente, su remoción no debe alterar el enlace peptídico, por ejemplo, el 13500 14000 14500 15000 15500 16000 0 100 Proteína A Proteína B14896.9 (14895.5) 15058.8 Diferentes glicoformas (GlcNAc) 2 Man 5 X X X X 15384.3 15223.8 15545.4 Man 6 Man 9 Man 7 Man 8 Ab so rb an ci a re la ti va Figura 6. Detección de glicoformas por ms-esi 32 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas grupo heme del citocromo c se puede eliminar con una solución de áci- do perfórmico (95 %). Si no están unidos covalentemente su remoción se hace en condiciones desnaturalizantes, a pH ácido y con el uso de agentes acomplejantes como edta y egta. Finalmente, se eliminan por medio de filtración en gel, ultrafiltración o diálisis, entre otros. 5.5. El análisis de aminoácidos permite planear una mejor estrategia de secuenciación y hacer un balance de masa entre la proteína intacta y los fragmentos derivados de la digestión enzimática o química. Si la masa to- tal es mayor que la de los péptidos aislados, hay pérdidas de los péptidos durante el proceso de purificación. Si la masa total es menor que la de los péptidos aislados, probablemente, se hizo un reconteo de péptidos con la misma secuencia. Para hacer un buen análisis de aminoácidos, se deben realizar diferentes hidrólisis que no alteren las cadenas laterales de estos. Algunos aminoácidos no estándar pueden ser pasados por alto durante el análisis por hidrólisis, por ejemplo, la fosfoserina y el γ-carboxiglutámico, en los que el grupo fosfato y carboxilo pueden ser perdidos, lo que da como resultado serina y glutámico, respectivamente. Otros, como ε-metil lisina y 3-metil histidina, no son detectados por los métodos cromatográficos convencionales y se pueden presentar electroforesis anormales de péptidos y proteínas que indican su presencia. El método de hidrólisis general de las proteínas se hace con HCl 6M, a 100 0C, durante 24 horas, en ausencia de oxígeno y de metales. Con este tratamiento la metionina y cisteína no se pueden cuantificar y, por lo tanto, antes de la hidrólisis, se deben obtener como derivados metioninsulfona y ácido cisteico, respectivamente (figura 8). Se debe tener en cuenta que, con el tratamiento, la tirosina se puede clorar, por lo que, algunas veces, se introduce fenol para inhibir el daño. La serina y treonina son lábiles al 1. PNGase F ( de Flavobacterium meningosepticum): hidroliza los enlaces N- glicosídicos R-Asp GlcNAc........ de manosa y glicanos de tipo N-híbridos. 3. Endo GalNAc-Ser/Thra ( de Streptococcus pneumoniae ) 2.Endoglicosidasa H (endo H) ( de Streptomices plicatus): hidroliza los enlaces N- glicosídicos R-Asp-GlcNAc -1-3GalNAc ser/Thr Figura 7. Deglicosilación enzimática de glicoproteínas Fuente: [7, p. 344]. Estructura primaria de proteínas • 33 tratamiento; por esto, se debe hacer un análisis cinético de la liberación y velocidad de destrucción de estos aminoácidos. Aminoácidos como alanina, valina e isoleucina forman enlaces peptídicos que son muy resistentes a la hidrólisis, en estos casos se deben extender los tiempos de hidrólisis hasta las 72 horas (figura 9). Los demás aminoácidos se determinan a las 24 ho- ras de hidrólisis, excepto el triptófano, el cual se destruye completamente. Aminoácidos como la glutamina y la asparagina se convierten en los ácidos glutámico y aspártico, respectivamente. De modo que, después de la hidrólisis ácida, solo puede cuantificarse la mezcla de la amida y el ácido como Asx (Asp +Asn) y Glx (Glu+Gln). Para la determinación de triptófa- no se han hecho varias modificaciones del método de hidrólisis para evitar su cloración y destrucción, algunas de ellas incluyen tratamiento con ácido P-toluen sulfónico 3N o hidrólisis básica con Ba (OH)2 (saturado) 4N. Se debe hacer una hidrólisis de la proteína luego de su tratamiento con ácido perfórmico del 90-95 % (H2O2 + ácido fórmico) en medio desnatura- lizante, para cuantificar la cisteína como ácido cisteico y la metionina como metioninsulfona. Estos derivados son estables en condiciones de hidrólisis ácida y básica pero, en el último caso, el BrCN (bromuro de cianógeno) no hidroliza el enlace en el que hay metionina, si se fuera a fragmentar la proteína con este reactivo. Se resalta que, con este tratamiento, también hay destrucción del triptófano y los aminoácidos polares se oxidan. NH-CHCH CH SCH2 2 3 + HCOOH NH-CHCH CH SCH O 2 2 3 O metioninsulfona NH-CHC O CH 2 S S CH 2 -NH-CH-C- O +HCOOH NH-CHC O CH 2 CH 2 -NH-CH-C- O SO 3 SO 3 ácido cisteíco Figura 8. Oxidación perfórmica de cisteína y metionina 34 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Para complementar el análisis de aminoácidos se puede realizar una determinación de cisteína y cistina. De esta forma, se puede deducir si los residuos de ácido cisteico que fueron determinados en el análisis de ami- noácidos están en forma libre o formando puentes disulfuro. Con el reac- tivo de Ellman [2,8], se mide la cantidad de nitobenzoato (ntb) liberado durante la reacción del ditiobis -2 ácidonitrobenzoico (dntb) con un grupo tiol (figura 10). La hidrólisis de la proteína empleando otros ácidos como sulfúrico (H2SO4) o nítrico (HnO3) traen como consecuencia una fuerte deshidratación, destrucción y nitración de la tirosina, por lo tanto, no son recomendables. Por otra parte, la hidrólisis básica provoca la descomposi- ción de cisteína, serina, treonina y arginina. Además, desamina y racemiza, parcialmente, los demás aminoácidos. Para determinar la cantidad de triptófano se realiza una digestión enzi- mática con pronasa o proteinasaK y se hace una condensación con P-di- metilbenzaldehído (paba) en medio ácido y, posteriormente, una oxidación con nitrito de sodio (NaNO2). La absorbancia del complejo se puede leer a 596 nm y se determina la cantidad empleando una curva de calibración (figura 11) [9]. El contenido de aminoácidos en un hidrolizado puede determinarse cuantitativamente con un analizador de aminoácidos automatizado. Este equipo separa los aminoácidos sobre una columna de intercambio iónico, usando como base la técnica que fue desarrollada por Hirs y colaborado- res [10, 11] (figura 12). Para la detección de los aminoácidos, se pueden m m o l aa 24 48 72 h Los demás aminoácidos se pueden cuantificar a las 24 horas de hidrólisis. La cisteína y la metionina se cuantifican como metionisulfona y ácido cisteíco respectivamente. Extrapolación a tiempo cero para cuantificar serina y treonina. Extrapolación a las 72 h para cuantificar leucina, valina, isoleucina. m m ol a a 24 48 72 h Figura 9. Curvas hipotéticas de la cinética de hidrólisis de los aminoácidos para una proteína en condiciones ácidas Estructura primaria de proteínas • 35 preparar derivados antes o después del paso por la columna de separación. Los derivados se pueden formar con fluroescamina, ninhidrina, fenilisotio- cianato (pitc), fenil tiocarbamil (ptc), O-Phataldehído (Opa), este último no reacciona con prolina y, por lo tanto, se debe hacer una oxidación previa con cloramina T (figura 13). RS R S S NO2 2COpH 8.0 2 O N2 S O C S CO2 NO2 NTB S CO2 NO2 DTNB Figura 10. Determinación de cisteína libre con el reactivo de Ellman Fuente: [2, p. 157]. COO CH C H H C O N NH 2 3 3 2 N(CH ) HO N O C C H OH 3 2 N(CH ) gComplejo Ruheman =596 nm N O C (CH )N 3 2 N C (CH )N 3 2 Na NO 2 H 42SO[ [ Figura 11. Determinación de triptófano por formación del complejo de Ruhemann 36 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas Figura 12. Diagrama de purificación de aminoácidos Fuente: [11, p. 674]. A CH O CH O HS 3 CH2 CH2 OH NH CH COO R OH-CH -CH -S2 2 CH COO R N B O O O O H N CH R 3 COO COOH C RNOH O C O C C C OH OH O 2 H N3 CH COO R R C H O CO2 O C O C O C O C C N C 2 O3H Figura 13. Reacciones de derivatización de los aminoácidos. A: reacción con O-Ftalaldehído. B: reacción con fluroescamina. C: reacción con ninhidrina Los aminoácidos se identifican de acuerdo con su volumen de elución o tiempo de retención y se hace su cuantificación de acuerdo con su inten- sidad fluorescente o por el área bajo la curva (figura 14). Los métodos de detección tienen una alta sensibilidad y se pueden detectar cantidades del orden de un picomol de cada aminoácido. Los datos son reportados, en un aminograma, como porcentaje de cada aminoácido en la proteína (g aa Estructura primaria de proteínas • 37 /100 g de proteína). Para obtener los datos, es importante una cuantifica- ción exacta de la solución de proteína, por ejemplo, por micro-Kjeldahl o algún método colorimétrico exacto o por el coeficiente de extinción de la proteína si se conoce. El resultado final del análisis de aminoácidos se describe como residuos de cada aminoácido o molécula. Para alcanzar estos datos, se debe tener en cuenta la masa molecular de cada aminoácido sin una molécula de agua. Para no reportar Glx y Asx como una mezcla, se puede hacer un tratamiento previo a la proteína para determinar las amidas como aminas en el análisis. Por otra parte, es posible hacer una aproximación al punto isoeléctrico de la proteína de acuerdo con el contenido de aminoácidos básicos y ácidos. En el siguiente ejemplo, se presenta el reporte del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis (LSBo) (figura 15) con y sin oxidación perfórmica. En los datos se observa lo siguiente: • Algunos aminoácidos disminuyen su contenido luego del proceso de oxidación perfórmica. • Luego de la oxidación perfórmica aparece el ácido cisteico, lo que indica la presencia de cisteína en la proteína. D E S G H R T A P N H 3 5 10 15 Minutos Y V M F I L K Figura 14. Perfil de elución de los aminoácidos, detección a 254 nm-Derivados aminoácidos-ptc (Feniltiocarbamilados). Se observa la elución de los aminoácidos ácidos; luego, de los polares e hidrofóbicos y, al final, de la lisina Fuente: [12, p. 48]. 38 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas • El cálculo de los residuos de aminoácidos se realiza con los datos que fueron determinados sin oxidación perfórmica, excepto para la cisteína y metionina. • La metionina es un aminoácido que es escaso en proteínas de plantas. En el ejemplo, la proteína es aislada de semillas y, en este caso, no aparece. Por lo tanto, se confirma su ausencia luego del tratamiento de oxidación. • No aparece el contenido de triptófano porque, en los dos casos, la hidrólisis lo destruye completamente. Por lo tanto, se debe com- plementar el análisis haciendo su determinación por el método colorimétrico o por técnicas cromatográficas [13]. Aa LSBo LSBo** ASX 5,79 6,661 4,1184,248THR SER GLU GLY ALA 1/2 CYs VAL MET ILE 17,118 17,669 17,146 8,483 0 3,156 0 2,373 0 14,583 22,632 24,159 6,895 1,223 3,437 2,738 LEU TYR PHE HIS LYS ARG PRO TRP SUMA 3,7 2,456 1,939 1,655 8,846 1,382 4,039 ND 100,0 100,0 ND 3,244 1,092 0,982 1,015 2,395 1296 3531 LSBo:Lectina de Salvia bogotensis Masa molecular: 38702 Da 16 % carbohidratos ND: no determinado LSBo**: con oxidación perfórmica Figura 15. Resultados del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis (LSBo) Fuente: [14, p. 352]. Estructura primaria de proteínas • 39 Para calcular los residuos de aminoácidos por molécula se debe realizar el cálculo por cadena polipeptídica, si la proteína es multimérica. Poste- riormente, corregir el porcentaje de aminoácidos dado que el reporte no incluye cisteína y triptófano, según el ejemplo propuesto, entonces: 1 00-(1.22+5.1) = 93.677 (%) real = porcentaje de cada aminoácido × 0.93677 Si la proteína es conjugada se debe calcular la masa total, sin el contenido de carbohidratos, en este caso es del 16 %: 38 702 × 0.16 = 6192.32 g 38 702 - 6192.32 = 32 510 g Lectina de Salvia bogotensis (LsBo) Aa Aa/ 100gproteína Aa residuos/mol. Integral 1 Asx 5,42 15,3 15 Thr 3,98 12,8 13 Ser Glx Gly Ala Val Met Cys lle Leu Tyr Phe His Lys Arg Pro Trp3 2 2 16,03 59,8 60 16,55 41,7 42 16,06 91,5 92 7,94 36,3 36 2,95 9,7 10 0,2 0 0 1,22 3,9 4 2,22 6,4 6 3,46 9,9 10 2,30 4,6 5 1,81 1,55 8,28 1,29 3,7 5,1 3,7 4,0 21,0 2,7 12,7 8,9 4 4 21 3 13 9 Cálculos con PM = 38702 con 16% carbohidratos (1) Residuos / cadena polipeptidiza (2) Determinado como met SO y CySO (3) Determinado espectrofotometricamente 2 3 Figura 16. Reporte del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis (LSBo) Fuente: [14, p. 352]. 40 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas El número de residuos de cada aminoácido se debe calcular con el por- centaje obtenido en condiciones de hidrólisis normales, es decir sin oxida- ción perfórmica, para el caso de la mezcla de ácido aspártico y asparagina (Asx) tendremos: (32.510 × 5.42) /100 = 1762.04/115.089 = 15.31 residuos y se debe reportar como un número entero, es decir 15 residuos de la mezcla Asx. Se hace el cálculo para los demás aminoácidos y se completa la tabla adjunta para dar el reporte final (figura 16). Tabla 1. Análisis de aminóacidos AA AA (g) Residuos AA N.º Residuos AA Totales AA(g) Asx 1762.04 15.31 15 1726.3 Ʃ=PM Para deducir el número de puentes disulfuro debemos tener en cuenta el porcentaje determinado. Así, si tenemos cuatro residuos, habrán, pro- bablemente, dos puentes disulfuro. Finalmente, se deben tabular los datos y sumar los gramos de cada uno de los aminoácidos que nos darán la masa molecular de la proteína. Teniendo en cuenta la caracterización molecular de laproteína de estudio, con el reactivo de Ellman se puede evaluar si las cisteínas están libres. Los resultados arrojados de las electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras, permiten establecer si los puentes disulfuro son intracatenarios o intercatenarios. Los datos finales se deben reportar como residuos de cada aminoácido por molécula y de esta forma se pueden hacer comparaciones con proteínas que estén relacionadas. Se han desarrollado otras técnicas para cuantificar aminoácidos como la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa o empleando otros soportes. También se han empleado electroforesis capilar, cromatografía de gases y cromatografía líquida acoplada a un detector de masas. La mayoría de estas técnicas requiere que los aminoácidos sean derivatizados para hacer su detección u obtener derivados volátiles para hacer el análisis por gases. También se ha trabajado en la marcación de aminoácidos usando isóto- pos como 13C o etiquetado con 10-metil-acridona-2-sulfonilo (d0-masc) y d3-masc deuterado, con el objetivo de mejorar la detección de algunos aminoácidos por masas. Sin embargo, con estas técnicas solo se cuantifican unos pocos aminoácidos. Por otra parte, se continúa haciendo el método de hidrólisis convencional acompañado de una digestión adicional asistida con microondas durante treinta minutos. Aminoácidos como el triptófano y la cisteína se pierden durante este proceso [15, 16]. Estructura primaria de proteínas • 41 5.6. La determinación del aminoácido (aa)-N terminal se basa en la re- acción específica de algunos compuestos orgánicos con los grupos α-amino del aminoácido del extremo N-terminal para formar un derivado que se puede identificar fácilmente, ya que la cadena lateral se conserva, a dife- rencia de la reacción convencional con ninhidrina, en la que no es posible identificar el aminoácido. Algunos métodos se resumen a continuación: 5.6.1. Dinitroflurobenceno (dnfb): reacciona con el grupo α-amino del aminoácido del extremo N-terminal, para formar un dinitrofenil-derivado (dnp) del aminoácido (figura 17 A). La hidrólisis se hace en medio ácido y los demás aminoácidos de la cadena polipeptídica quedan como aminoácidos libres. La reacción no se realiza si el N-terminal está bloqueado. La detec- ción del derivado se puede hacer por cromatografía en capa delgada (tlc) o su separación, por cromatografía de intercambio iónico, entre otros métodos. 5.6.2. Cloruro de dansilo (dns-cl) (1-dimetilamino naftaleno 5 sulfonil- cloruro) (figura 17 B): es un método más sensible (1-5 ng) que el derivado obtenido con dnfb, rápido y simple, pero algunos derivados son lábiles como la prolina. Por cromatografía en capa delgada (tlc), algunos derivados son de difícil resolución, por ejemplo, arginina, histidina y ácido cisteico; sin embargo, se pueden emplear métodos cromatográficos para hacer la separación e identificación. También se puede obtener un dipéptido como N-terminal, debido a que los enlaces peptídicos son más resistentes cuando hay residuos hidrofóbicos. El cloruro de dansilo reacciona con las aminas primarias (entre ellos el grupo ε-amino de la lisina), dando como resultado A O2N F H2 NCHCO R NHCHCO R HCO (-HF) 3 NO2 O2N H2NCHCO R NHCHCO R H O3 NO2 Polipéptido acoplado Mezcla de aminoácidos O2N HNCHCO R N RNO2 H2 3H CHCO2 B H 2 3C CH3 N NH CHCONHCHCO.... R1 R2 pH 9.5 - 10 H3C CH3 N 2SO NHCHCONHCHCO.... R1 T 4 J 105°C, 18h H3C CH3 N Mezcla de aminoácidos 2SO NHCHCO H2 R1 Derivado Figura 17. Determinación del aminoácido N-terminal. A: con 2, 4 dinitrofluorobenceno (dnfb) B: con cloruro de dansilo Fuente: Capítulo 23. [17, p. 204]. 42 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas polipéptidos dansilados que posteriormente por hidrólisis ácida libera el aminoácido N-terminal dansilado y una mezcla de los demás aminoácidos. El derivado exhibe una intensa fluorescencia amarilla que puede identificarse por cromatografía con cantidades del orden de picomoles [17]. La determinación de la secuencia N-terminal se lleva a cabo con el méto- do más común, denominado la degradación de Edman, el cual es realizado con fenil isotiocianato (pitc) que reacciona con los grupos α-amino del ami- noácido N-terminal de las proteínas. La reacción se realiza en condiciones básicas suaves para formar el fenil tiocarbamilo (ptc) y, posteriormente, se hace una hidrólisis suave con ácido trifluroacético anhidro y se separa el derivado llamado feniltiazolina y el péptido (proteína), el cual tendrá un residuo menos de aminoácido. El derivado de feniltiazolina se extrae en medio orgánico y, por tratamiento con tfa al 20 %, se convierte en un derivado más estable, feniltiohidantoina (ptH) (figura 18 A). Este aminoá- cido-ptH puede identificarse por comparación con estándares conocidos, R1 N C S NH2 CH C NH CH C R 2 O pH 9.5 Piridina PITC NH C NH CH C NH CH C R2 O S O(1) R1 C NH CH C TFA anhidro C NH C S H R1 CH C O NH S C NHNH CHNH3 R2 C Polipéptido/Péptido (2) Feniltiazolina (3) OH R1 CH C O N C S NH TFA 20% 3 Feniltiohidantoina - PTH R1 CH C O N NH SC Péptido Proteína Extracción Feniltiazolina Obtención conversión Feniltiazolina Feniltiohidantoina-PTH 4 PITC Hidrólisis Acople Lavado 5 6 7 3 1 2 A B Identificación HPLC Figura 18. Determinación de la secuencia N-terminal por la degradación de Edman Fuente: Capítulo 26. [18, p. 245, 246]. Estructura primaria de proteínas • 43 empleando cromatografía en capa delgada (tlc) o cromatografía liquida de alta eficiencia (Hplc), entre otros. Una de las diferencias más claras con respecto a las determinaciones del aminoácido N-terminal antes citadas es que permite determinar la secuencia de, por lo menos, veinte aminoácidos por medio de ciclos repetidos en los que se identifica el ptH liberado (figura 18 B). Hoy en día, esta técnica se ha automatizado y, por lo tanto, se ahorra tiempo y muestra. Con técnicas automatizadas, la repetición de este método puede utilizarse para determinar la secuencia de hasta cincuenta aminoácidos, comenzan- do desde el extremo N-terminal. Por lo tanto, si se desea secuenciar una proteína, se hace la secuenciación de cada uno de los péptidos aislados de la fragmentación de la proteína. Algunas de las características de la degradación de Edman se resumen a continuación: • Presenta una alta eficiencia de la remoción del aminoácido del extremo N-terminal. • Es un método automático o manual, los dos se diferencian en el número de ciclos/día. • Se presentan pocas pérdidas del péptido (proteína) por cada ciclo, si es una técnica automatizada. • Se puede realizar el análisis en forma sólida si la proteína está muy pura. • Puede detectar aminoácidos naturales, pero no funciona bien con aminoácidos modificados. • Si el N-terminal está bloqueado, no se da la reacción. • Se pueden secuenciar entre diez y treinta aminoácidos, depen- diendo de la secuencia y de la cantidad de material. • No permite estudiar modificaciones postraduccionales. • El porcentaje de eficiencia de la reacción es del 15 %. • La serina y la treonina se deshidratan y, algunas veces, se produ- cen reacciones laterales. • Los ciclos se pueden demorar entre treinta minutos y una hora, si es un método automatizado. El método fue optimizado gracias a la propuesta de Matsudaira [19], trabajando con cantidades muy pequeñas de proteína. La transferencia de la proteína se hace sobre una membrana de polivinildifluoruro (pvdf), la cual es inerte y no interfiere en el proceso. También se debe evitar el uso de solventes que bloqueen el N-terminal durante la transferencia, por ejemplo, el ácido acético. Se pueden procesar bandas de 10 picomoles para el aná- lisis y si es posible entre 40-60 pmoles, obtenidos de varias transferencias. La determinación con dabitc (4-N, N-dimetilazobenceno-4´isotiocianato) es otro método que se emplea
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