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Analisis-estructural-proteinas-y-glicopoteinas

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Facultad de Ciencias 
Sede Bogotá
Introducción 
al análisis 
estructural de 
proteínas y 
glicoproteínas
Nohora Angélica Vega Castro
Edgar Antonio Reyes Montaño
Introducción al 
análisis estructural 
de proteínas y 
glicoproteínas
Bogotá, D. C., Colombia, mayo de 2020
Introducción al 
análisis estructural 
de proteínas y 
glicoproteínas
Nohora Angélica Vega Castro
Edgar Antonio Reyes Montaño
© Universidad Nacional de Colombia 
 Facultad de Ciencias
© Nohora Angélica Vega Castro
 Edgar Antonio Reyes Montaño
Primera edición, 2020
Edición
Coordinación de publicaciones - Facultad de Ciencias 
coorpub_fcbog@unal.edu.co
Corrección de estilo
Nombre Apellido
Diseño de la colección
Leonardo Fernández Suárez
Maqueta LaTex
Camilo Cubides
Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier 
medio sin la autorización escrita del titular de los derechos 
patrimoniales
Impreso y hecho en Bogotá, D. C., Colombia
Contenido
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Capítulo uno 
Estructura primaria de proteínas 21
Requisitos para establecer la secuencia de una proteína . . . . . . . . . . . . . 24
Procesos de fragmentación de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Métodos enzimáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Mapeo peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Métodos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Fragmentación de la proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Secuenciación de los péptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Superposición de fragmentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Fuentes de error en la determinación de la estructura primaria . . . . . . . 73
Limitaciones de la determinación de la estructura primaria a partir 
de la secuencia de adn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Capítulo dos
Caracterización de proteínas por 
espectrometría de masas (ms) 81
Ionización en modo electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Ionización/desorción láser asistida por matriz (Maldi) . . . . . . . . . . . . . . . 92
Analizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Otros analizadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Analizador de trampa iónica (it) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Ciclotrón de resonancia de iones con transformada de Fourier 
(ft-icr) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Orbitrap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Determinación de la secuencia de proteínas por espectrometría 
de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Fragmentación de la molécula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Determinación de la secuencia N-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
Cuantificación de proteínas en estudios de proteómica . . . . . . . . . . . . . . 108
8 
Utilidad de la espectrometría de masas como herramienta 
en el análisis de problemas relacionados con proteínas . . . . . . . . . . . . . 112
Identificación de nuevas variantes proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Evaluación del plegamiento de las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Capítulo tres 
Consecuencias de la determinación 
de la estructura primaria de proteínas 121
Proteínas que tienen la misma función y están en diferentes especies . 123
Proteínas que surgieron por la duplicación de un gen . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Proteínas con diferente función y localización relacionadas 
evolutivamente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Capítulo cuatro 
Estructura secundaria 131
Aspectos relevantes para la formación de estructuras secundarias . . . . 133
El enlace peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Ángulos de torsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Estructuras secundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
Hélice α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Estructura β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Propensiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Giros β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Estructuras supersecundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Conformación de α-hélice, estructuras β y cadenas laterales . . . . . . . 145
Estabilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Determinación experimental de la estructura secundaria . . . . . . . . . . . . 155
Dispersión óptica rotatoria (dor) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Comportamiento de macromoléculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Aplicaciones del dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Capítulo cinco
 Estructura terciaria 171
Determinación experimental de la estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . 175
Determinación de la estructura de proteínas por difracción 
de rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
9
Resonancia magnética nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
Microscopía crioelectrónica o criomicroscopía electrónica (Cryo-em) 192
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Capítulo seis
Glicoproteínas y carbohidratos 201
Diversidad estructural de los oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Biosíntesis de oligosacáridos en las glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Análisis estructural y funcional de glicanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
Análisis de la glicosilación en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
1. ¿La proteína es glicosilada? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
2. Caracterización de la glicosilación en la proteína intacta . . . . . . . . . 214
3. Caracterización de los oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
Análisis de la estructura del oligosacárido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Métodos químicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Métodos enzimáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Métodos enzimáticos para elucidar estructura primaria 
de oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
Estudios de glicosilación, funciones biológicas y posibles aplicaciones 232
Patologías asociadas a glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
Capítulo siete
Bioinformática estructural: aplicaciones del 
modelamiento estructural de proteínas 245
Predicción de estructura secundaria y terciaria de proteínas . . . . . . . . . 248
Métodos para predecir estructura secundaria de proteínas . . . . . . . . 249
Predicción de estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
Metodología sugerida para generar modelos estructurales . . . . . . . . 256
Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
10 
Lista de tablas
Capítulo uno 
Tabla 1. Análisis de aminóacidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Tabla 2. Características de las carboxipeptidasas para determinación 
del C-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Tabla 3. Datos de determinación de la secuencia con carboxipeptidasas 
y espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Tabla 4. Endoenzimas para proteólisis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
Tabla 5. Endoenzimas recombinantes para proteólisis de proteínas . . . . . . . . . . . .52
Tabla 6. Electroforesis diagonal para determinación de diferentes 
aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
Capítulo dos
Tabla 1. Mecanismos de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Tabla 2. Comparación de las masas moleculares determinadas para citocromos 
C por espectrometría de masas, ionización electrospray (ms-esi) . . . . . . . . . . .89
Tabla 3. Comparación de las dos técnicas de ionización para proteínas . . . . . . . . .95
Tabla 4. Comparación de los métodos de fragmentación para péptidos . . . . . . . .106
Capítulo cuatro 
Tabla 1. Longitud de los puentes de hidrógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146
Tabla 2. Valores de b0 y a0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161
Tabla 3. Características de las conformaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .167
Capítulo cinco
Tabla 1. Desplazamiento químico en estructura al azar de los 20 aminoácidos 
proteicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .188
Tabla 2. Características principales de los métodos de preparación comunes 
de las grillas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .195
Capítulo seis
Tabla 1. Bases de datos para glicómica y glicoproteómica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .204
Tabla 2. Métodos colorimétricos para cuantificación de carbohidratos . . . . . . . . .220
Tabla 3. Métodos analíticos para elucidar estructura de oligosacáridos . . . . . . . . .230
Capítulo siete
Tabla 1. Parámetros de Chou-Fasman para establecer propensiones de cada 
uno de los aminoácidos a formar estructuras alfa (Pa), beta (Pb) 
o al azar (Pt). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .251
Tabla 2. Lista de programas disponibles para predicción de estructura 
terciaria de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .261
11
Lista de figuras
Capítulo uno 
Figura 1. Métodos para establecer la presencia de subunidades de 
una proteína. A: cualitativos B: preparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Figura 2. Reducción de los puentes disulfuro (cistina) y alquilación 
en proteínas. A: reducción. B: alquilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Figura 3. Estudio de puentes disulfuro en proteínas. A: reacción de sulfitólisis. 
B: alquilación con β-haloamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Figura 4. Detección de la glicosilación en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Figura 5. Determinación del porcentaje de glicosilación en glicoproteínas 
por sds-Page . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Figura 6. Detección de glicoformas por ms-esi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Figura 7. Deglicosilación enzimática de glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Figura 8. Oxidación perfórmica de cisteína y metionina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Figura 9. Curvas hipotéticas de la cinética de hidrólisis de los aminoácidos 
para una proteína en condiciones ácidas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Figura 10. Determinación de cisteína libre con el reactivo de Ellman . . . . . . . . . . .35
Figura 11. Determinación de triptófano por formación del complejo 
de Ruhemann . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Figura 12. Diagrama de purificación de aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Figura 13. Reacciones de derivatización de los aminoácidos. A: reacción 
con O-Ftalaldehído. B: reacción con fluroescamina. C: reacción 
con ninhidrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Figura 14. Perfil de elución de los aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Figura 15. Resultados del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia 
bogotensis (lsbo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Figura 16. Reporte del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia 
bogotensis (LSBo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Figura 17. Determinación del aminoácido N-terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Figura 18. Determinación de la secuencia N-terminal por la degradación 
de Edman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Figura 19. Determinación de la secuencia N-terminal con dabitc . . . . . . . . . . . . . . .44
Figura 20. Reacción de hidrazinólisis para la determinación del C-terminal . . . . . .48
Figura 21. Sitios de clivaje de una proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Figura 22. Ilustración esquemática de la fragmentación de un péptido con 
tripsina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
Figura 23. Reacción de los grupos ε de la lisina con anhídridos carboxílicos . . . . .52
Figura 24. Mapa peptídico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .54
Figura 25. β-eliminación: modificación a nivel de Ser, Thr y Cys . . . . . . . . . . . . . . . .55
Figura 26. β-eliminación: modificación a nivel de cisteína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Figura 27. Modificación a nivel de cisteína con cianuro de potasio (KCN) . . . . . . . .57
Figura 28. Modificación a nivel de cisteína con cianuro de potasio y el reactivo 
de Ellman (dntb) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58
12 
Figura 29. Modificación a nivel de cisteína con el reactivo de Degani 
(2-Nitro-5-tiociano ácido benzoico) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Figura 30. Modificación a nivel de triptófano, método Patchkornich . . . . . . . . . . . .59
Figura 31. Modificación a nivel de metionina con BrCN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
Figura 32. Modificación a nivel de serina con N, N’ carbonato disuccinimidilo 
(dsc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Figura 33. Ejemplo de superposición de los péptidos de una proteína 
hipotética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
Figura 34. Purificación de péptidos obtenidos en la hidrólisis de la lectina de 
Dioclea lehmanni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
Figura 35. Superposición de fragmentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67
Figura 36. Secuencia de la lectina Canavalia marítima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Figura 37. Comparación de secuencias de tres lectinas relacionadas. . . . . . . . . . . .69
Figura 38. Electroforesis diagonal para determinación de la posición de los 
puentes disulfuro en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
Figura 39. Representación de la electroforesis diagonal para la determinación 
de proteínas con puentes disulfuro intra e intercatenarios en 
proteómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Capítulo dos
Figura 1. Componentes de un espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84
Figura 2. Ionización en modo electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .86
Figura 3. Configuración de un espectrómetro de masas básico para determinar 
peso molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87
Figura 4. Espectro de masas para la apomioglobulina (músculo de caballo) . . . . .88
Figura 5. Espectro de masas (esi-cuadrupolo) para la lectina de Salvia 
bogotensis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89
Figura 6. Determinación del peso molecular y de las glicoformas de la 
ribonucleasa A y B por espectrometría de masas en modo de 
ionización electrospray (esi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90
Figura 7. Configuración de un espectrómetro de masas en tándem (ms/ms)-esi 
para determinar la secuencia de un péptido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91
Figura 8. Ionización/desorción láser asistida por matriz (Maldi) . . . . . . . . . . . . . . . .93
Figura 9. Esquema de un Analizador tof. A: geometría lineal. B: con reflectrón . .94
Figura 10. Fragmentación de un péptido-formación de iones . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
Figura 11. Vía de fragmentación β de la molécula de proteína . . . . . . . . . . . . . . . . . .100
Figura 12. Diagrama para establecer secuencia de un tetrapéptido 
fragmentado en modo cid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101
Figura 13. Espectro de masas en modo cid del ion (M+H)+ (m/z = 1882.1) del 
péptido A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .102
Figura 14. Espectro de masas para el péptido B y fragmentación vía C-terminal . .102
Figura 15. Espectro de masas para el péptido C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .104
Figura 16. Interacción de electrones (e-) con moléculas multiprotonadas . . . . . . . .104
Figura 17. Marcación del extremo N-terminal con dimetilo para análisis por 
espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .107
Figura 18. Estudio de proteómica cuantitativa usando espectrometría de masas 108
Figura 19. Marcación de cisteínas en una mezcla de proteínas con isótopos 
(método icat) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109
Figura 20. Etiquetado por digestión enzimática con tripsina en H2180 . . . . . . . . . . .110
Figura 21. Marcación isobárica (etiquetado itraq) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111
13
Figura 22. ms-esi para proteína plasmática transtiretina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113
Figura 23. ms-esi para el complejo avidina-biotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .116
Figura 24. ms-nano esi para el complejo homotetramérico Transtiretina . . . . . . . .117
Capítulo tres 
Figura 1. Árbol filogenético para el citocromo C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .124
Figura 2. Alineamiento de las secuencias de la proteína citocromo c . . . . . . . . . . .125
Figura 3. Árbol filogenético de la evolución por duplicación genética de la 
hemoglobina y la mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127
Figura 4. Crecimiento de la base de datos Uniprot KB/Swiss-prot desde 
1990 hasta 2019 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .128
Capítulo cuatro 
Figura 1. Geometría del enlace peptídico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .134
Figura 2. Ángulos diédricos y dipolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .134
Figura 3. Ángulos de torsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135
Figura 4. Estructura en α hélices de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138
Figura 5. Representación de rueda helicoidal en una α hélice. . . . . . . . . . . . . . . . . .139
Figura 6. Red Helicoidal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .140
Figura 7. Comparación de las tres clases de hélices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .140
Figura 8. Hojas β antiparalelas en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .141
Figura 9. Representación de giros β en proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .144
Figura 10. Interacción de las estructuras secundarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146
Figura 11. Interacción entre α hélices formación del core hidrofóbico . . . . . . . . . . .149
Figura 12. Miohemeritrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149
Figura 13. Motivo jelly-roll Lectina de concanavalina A (Con A) . . . . . . . . . . . . . . . . .150
Figura 14. Estructuras de lectinas. A: estructura tridimensional de bryohealin 
resuelta con i-Tasser, flechas azules (hebras β). B: fucolectina proveniente 
de Anguilla anguilla O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151
Figura 15. Inmunoglobulina M. A: pdb 2RCJ Estructura de Inmunoglobulina 
M humana (IgM). B: estructura β sándwich que incluye topologíade llave griega . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152
Figura 16. Unidades β-α-b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152
Figura 17. Plegamiento Rossmann (α/β estructuras -hoja β abierta) . . . . . . . . . . . .153
Figura 18. Plegamiento barril tim. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .154
Figura 19. Plegamiento Rossmann en enzimas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
Figura 20. pdb vgk Estructura cristalina del complejo mayor 
de histocompatiblidad de Tipo I, H-2Kd a 2.0 A resolución . . . . . . . . . . . . . . . . .155
Figura 21. Radiación electromagnética y luz polarizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .156
Figura 22. Componente eléctrico de luz polarizada y no polarizada . . . . . . . . . . . . .157
Figura 23. Dispersión óptica rotatoria (dor) y Dicroismo circular (dc). . . . . . . . . . .158
Figura 24. Curvas hipotéticas de dispersión óptica rotatoria dor . . . . . . . . . . . . . .158
Figura 25. Gráfica hipotética para la determinación de b0 y a0 para α hélice y 
estructuras desordenadas o random coil (rc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .160
Figura 26. Determinación del espectro por dicroísmo circular (dc) . . . . . . . . . . . . .164
Figura 27. Espectro dc en la región uv-lejano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .166
Capítulo cinco
Figura 1. Representación de un cristal y su celda unitaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .176
14 
Figura 2. Sistemas cristalinos posibles en las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .177
Figura 3. Grupos espaciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .177
Figura 4. Incidencia de un haz sobre un plano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178
Figura 5. Determinación de a, b y c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .178
Figura 6. Determinación de la ecuación de Bragg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .179
Figura 7. Representaciones de vectores de dispersión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .182
Figura 8. Método geométrico para calcular la probabilidad de fase . . . . . . . . . . . . .183
Figura 9. Reemplazo isomorfo. Se han superpuesto dos fotografías de cristales 
triclínicos de lisozima. El punto izquierdo de cada pareja de puntos proviene 
del cristal de la lisozima nativa y el punto derecho corresponde al cristal 
después de la difusión de HgBr2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .184
Figura 10. Espectro Tocsy patrón para algunos aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .190
Figura 11. Conectividad Noesy y Tocsy en un dipéptido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .191
Figura 12. Ejemplo de diagrama de flujo para determinación de estructura 
por el método de partícula individual con microscopía electrónica (em) . . . .194
Capítulo seis
Figura 1. Glicosilación en glicoproteínas de tipo N en mamíferos . . . . . . . . . . . . . .206
Figura 2. Glicosilación en glicoproteínas de tipo N en plantas e invertebrados . . .207
Figura 3. Glicosilación de tipo O en mucinas epiteliales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .208
Figura 4. O-Glicosilación en glicoproteínas de mamíferos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .209
Figura 5. O-Glicosilación en en plantas e invertebrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .210
Figura 6. Estrategia para realizar estudios de glicosilación en glicoproteínas . . . .215
Figura 7. Determinación del perfil de glicoproteínas citoplasmáticas en líneas 
celulares con microarreglos de lectinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .215
Figura 8. Deglicosilación enzimática para glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .216
Figura 9. Hidrólisis enzimática de glicanos en glicoproteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . .218
Figura 10. Análisis cualitativo y cuantitativo de carbohidratos por electroforesis 
en geles de poliacrilamida y marcación con fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . .219
Figura 11. Patrones de fragmentación de monosacáridos por ionización 
de impacto electrónico (ei) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .221
Figura 12. Reacción de hidrazonólisis para liberar oligosacáridos . . . . . . . . . . . . . .222
Figura 13. Reacción de marcación de los oligosacáridos con 2-AB 
(2-aminobenzamida) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .223
Figura 14. Cromatografía para purificación de oligosacáridos. A: Filtración 
en gel para separar por masa molecular. B: Intercambio aniónico 
de alta resolución (hplc) y marcación para detección por fluorescencia. . . . .224
Figura 15. Patrones de Fragmentación generados por espectrometría de 
masas en tándem (ms/ms) modo etd. A: patrones generados en péptidos. 
B: patrones generados en glicanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .226
Figura 16. Patrones de fragmentación generados por espectrometría 
de masas en tándem (ms/ms) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .227
Figura 17. Patrones de Fragmentación generados por espectrometría de masas en 
tándem (ms/ms) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .228
Figura 18. Determinación de la estructura de un glicano por digestión 
enzimática secuencial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .229
Figura 19. Determinación de la estructura de un glicano por digestión 
enzimática secuencial, utilizando un arreglo de enzimas con diferente 
especificidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .230
15
Figura 20. Diagrama general para estudios de glicómica, análisis estructural 
de los glicanos, y glicoproteómica, análisis de los glicopéptidos . . . . . . . . . . .231
Figura 21. Interacciones de los glicanos conjugados a proteínas y lípidos. 
Glicosilación de tipo N y O implicados en procesos celulares . . . . . . . . . . . . . .232
Capítulo siete
Figura 1. Representación de estructuras secundarias de proteínas . . . . . . . . . . . . .249
Figura 2. Representación de la estructura de la red neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . .254
Figura 3. Metodología propuesta para la generación de modelos estructurales 
a partir de secuencia blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .257
Figura 4. Correspondencia aproximada entrer calidad del modelamiento, 
precisón, metodología usada y posibles aplicaciones de los modelos . . . . . .262
Introducción
Las proteínas son polímeros lineales de α-aminoácidos que se organizan 
aleatoriamente para formar asociaciones estructuralmente diferentes, con 
diversas funciones biológicas. Los aminoácidos son compuestos orgánicos 
que se caracterizan por tener una estructura básica de un grupo carboxilo, 
unido a un grupo amino por medio de un carbono tetramérico (C α) que, 
además de unirse al grupo carboxilo y al grupo amino, se une a un hidróge-
no a través de su tercer enlace y, a través de su cuarto enlace, a una cadena 
variable que da origen a la diversidad de α-aminoácidos que constituyen las 
proteínas. A pesar de que se conocen más de quinientos aminoácidos, solo 
son veinte los que se encuentran, mayoritariamente, en las proteínas y los 
que dan origen a la diversidad funcional y estructural de las mismas. Para 
que los aminoácidos se unan entre sí y puedan formar estructuras estables, 
se realiza un enlace covalente entre el grupo amino de un aminoácidoy 
el grupo carboxilo del siguiente, estableciéndose un enlace tipo amida que 
posee características especiales y se denomina enlace peptídico.
Las proteínas se sintetizan constantemente y, para que eso ocurra, la 
información de su estructura se encuentra almacenada en una molécula 
completamente diferente, el adn. Para que se forme una proteína nueva, 
se requiere que se activen una serie de procesos que involucran varias es-
tructuras celulares, y otros, más complejos: de copiado de información a 
partir de un gen (adn), la generación de una molécula mensajera que lleve 
la información desde el adn hasta el ribosoma (arn) y la lectura y traduc-
ción de dicha información para que el mensaje que viene codificado en un 
lenguaje de cuatro componentes en el arn sea traducido en un lenguaje 
de veinte componentes en la proteína. Durante el proceso de transcrip-
ción (copiado de la información del adn para formar arnm), se envía un 
mensaje que contiene toda la información almacenada en uno de los genes 
que conforman el genoma de un organismo. Este arnm llega al ribosoma 
de la célula y allí ocurre el proceso de lectura por tripletas de ese mensaje 
(codones), para formar la proteína con una alta fidelidad de acuerdo a lo 
contenido en el genoma del organismo. 
Los seres vivos están conformados por una gran variedad de proteínas 
que se pueden agrupar de acuerdo con sus características físicas, químicas, 
estructurales o funcionales. Teniendo en cuenta su función, las proteínas se 
pueden clasificar según el fenómeno biológico en el cual están involucradas. 
Hay proteínas que se encuentran catalizando la mayoría de las reacciones 
18 
metabólicas que ocurren en las células. Estas son conocidas como enzimas 
y presentan características como su especificidad, que las convierte en re-
guladoras de los procesos en los que participan. Si se revisan los procesos 
de comunicación celular, se encontrará que en todos ellos hay proteínas 
involucradas. Ejemplos de estas proteínas son los receptores de hormonas y 
los receptores de neurotransmisores, los cuales interactúan con sus ligandos 
por complementariedad entre sus estructuras y desencadenan respuestas 
celulares. Muchos de estos ligandos (hormonas y neurotransmisores) son, 
a su vez, de naturaleza proteica.
Las moléculas biológicas para transportar son, generalmente, proteínas, 
que se relacionan con cualquier tipo de transporte de moléculas. Entre los 
que se destacan el transporte de moléculas hidrofóbicas a través de medios 
acuosos como las lipoproteínas en la sangre y el transporte de sustancias a 
través del citoplasma por medio de una red de microtúbulos, como lo hace 
la kinesina. Así mismo, las proteínas pueden servir de transportadores a tra-
vés de la membrana biológica ya sea participando en procesos redox, como 
en la membrana de la mitocondria, o como transportadoras de moléculas 
polares a través de la membrana, como ocurre en los canales iónicos. Al-
gunas proteínas pueden cumplir también funciones de almacenamiento de 
sustancias nutritivas, como sucede en las etapas del desarrollo embrionario 
o con algunos iones vitales para el organismo.
Otros procesos biológicos también son soportados por este tipo de molé-
culas. La estructura y soporte de las células son dadas por una compleja red 
de naturaleza proteica que se denomina citoesqueleto, el cual constituye un 
armazón alrededor del que se organizan todos los componentes celulares, 
sirviendo como soporte para la realización de fenómenos indispensables 
para la viabilidad celular como el transporte intracelular o la división celular. 
En los tejidos de sostén (conjuntivo, óseo y cartilaginoso) de los vertebrados, 
las fibras de colágeno presentes en la matriz extracelular son las encargadas 
de conferir resistencia mecánica tanto a la tracción como a la compresión. 
La queratina (presente en cabello, plumas, uñas y cuernos), la fibroína de la 
seda de araña y la fibrina que segregan las plaquetas para formar los coágulos 
sanguíneos también son proteínas con función estructural.
La defensa en los diferentes organismos también es un proceso realizado 
por proteínas. En las bacterias, las llamadas endonucleasas de restricción 
se encargan de identificar y destruir moléculas de adn que no se identifi-
can como propias y, en los vertebrados superiores, las inmunoglobulinas 
reconocen moléculas extrañas y se unen a ellas para facilitar su destrucción, 
proceso del que se encargan las células del sistema inmunitario. El control 
de diferentes funciones vitales de las células se puede realizar a nivel gé-
nico y, en este proceso, las proteínas regulan la expresión génica, es decir, 
se encargan de decidir en todo momento qué genes deben ser transcritos 
a arn y, por lo tanto, traducidos a proteína. 
19
Independientemente del tipo de proteína que se esté considerando, para 
que esta sea funcional, debe tener una estructura tridimensional estable. Para 
llegar a esta estabilidad, las proteínas presentan tres (algunas cuatro) niveles 
estructurales que contribuyen para alcanzar esa estabilidad. La estructura 
primaria está determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena 
proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que 
están enlazados. La estructura secundaria corresponde al plegamiento que 
adoptan determinadas regiones de la cadena polipeptídica por el estable-
cimiento de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace 
peptídico. Finalmente, la molécula proteica adopta un plegamiento tridi-
mensional que constituye su estructura terciaria, concepto equiparable al 
de conformación absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria está 
determinada por la estructura primaria y es la responsable directa de sus 
propiedades biológicas. Las interacciones que estabilizan la estructura ter-
ciaria pueden ser tanto de tipo covalente (puentes disulfuro) como de tipo 
no covalente (puentes de hidrógeno, fuerzas de polaridad, electrostáticas, 
hidrofóbicas, etc.). Algunas proteínas pueden tener un nivel estructural 
adicional cuando se asocian varias cadenas polipeptídicas (iguales o distin-
tas) para formar una unidad funcional, y en ese caso se habla de estructura 
cuaternaria. Las interacciones que estabilizan la estructura cuaternaria son 
de tipo no covalente.
Las proteínas se asocian entre sí o con otra clase de biomoléculas para 
formar asociaciones supramacromoleculares (microtúbulos, ribosomas, nu-
cleosomas, virus, membranas, etc.). Las interacciones que estabilizan este 
nivel de estructura también son de tipo no covalente. Esta organización se 
diferencia de la cuaternaria debido a que la estequiometría de las estructuras 
formadas puede variar considerablemente.
La pérdida de la estructura terciaria se denomina desnaturalización y 
va acompañada de la pérdida de funcionalidad. Sin embargo, con la des-
naturalización no desaparece la estructura primaria, ya que se mantienen 
los enlaces peptídicos. En algunos casos la desnaturalización es reversible. 
Las proteínas se pueden estudiar en todos sus niveles estructurales por 
medio de diferentes técnicas experimentales. De acuerdo con lo anterior y 
teniendo en cuenta la importancia de estudiar las proteínas, en este docu-
mento hablaremos sobre estructura de proteínas y algunos métodos básicos 
experimentales que se pueden emplear para su estudio. 
Capítulo uno 
Estructura primaria 
de proteínas
Estructura primaria de proteínas • 23
La función de una proteína solo se puede entender si se conoce su estruc-
tura tridimensional y para determinarla se debe conocer su secuencia de 
aminoácidos. Sanger [1] estableció la primera secuencia para la insulina 
bovina y a partir de este estudio se corroboró que las proteínas poseían una 
única estructura covalente. Desde entonces, se han establecido una gran 
cantidad de secuencias, las cuales han sido importantes para la formulación 
de los conceptos modernos de la bioquímica por varias razones, entre las 
que se destacan:1. La estructura primaria de una proteína es esencial para entender 
su mecanismo molecular de acción y es importante para establecer 
su estructura terciaria por difracción de rayos X o cryo-micros-
copía electrónica. También se pueden obtener más fácilmente 
proteínas recombinantes, si se conoce con certeza la secuencia 
N-terminal y C-terminal. 
2. Las comparaciones de las secuencias entre proteínas análogas del 
mismo individuo, de la misma especie y de especies relacionadas 
han dado información acerca de la función de una proteína y de 
las relaciones evolutivas entre las proteínas y los organismos que 
las producen. Estos análisis complementan los estudios taxonó-
micos basados en comparaciones anatómicas. También, es posible 
hacer predicciones respecto a la estructura y función de la proteína.
3. La secuencia de una proteína tiene implicaciones clínicas impor-
tantes, ya que algunas enfermedades se producen por mutacio-
nes puntuales o por el cambio de un aminoácido por otro en la 
molécula. Muchos de estos estudios han llevado al desarrollo de 
métodos diagnósticos y, en algunos casos, el desarrollo de terapias. 
4. Se puede hacer la predicción de la localización celular de la pro-
teína en función de su secuencia N-terminal. 
5. Permite hacer la determinación de la estructura y función de 
una proteína a través de diversos métodos computacionales y 
experimentales.
La elucidación de la estructura primaria de la insulina bovina, la cual 
tiene cincuenta residuos de aminoácidos, fue el resultado del trabajo desa-
rrollado por Sanger y colaboradores a lo largo de una década, en el que se 
emplearon grandes cantidades de proteína, del orden de gramos. Hoy en 
día los métodos y las técnicas para determinar la estructura primaria de las 
proteínas se han perfeccionado y automatizado, a tal punto que proteínas de 
un tamaño semejante se pueden secuenciar en unos pocos días, utilizando 
cantidades del orden de microgramos (mg) de proteína. Posteriormente, 
se hizo la secuenciación de la enzima β-galactosidasa, la cual tiene 1021 
residuos de aminoácidos. Esto demostró que, de ahí en adelante, se podía 
determinar la secuencia de cualquier proteína. 
24 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
Para determinar la estructura primaria se debe realizar un proceso de frag-
mentación de la proteína, la caracterización de sus fragmentos (péptidos) 
y la reconstrucción de su estructura original (por superposición de pépti-
dos). Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede 
obtener por medio de:
1. Rupturas específicas, empleando métodos químicos y enzimáticos. 
Hoy en día, se han caracterizado nuevas proteasas bacteriales y 
de plantas. Además, se han obtenido enzimas recombinantes con 
una alta especificidad. 
2. Métodos de detección a partir de pequeñas cantidades de proteína.
3. La secuenciación automática que, al compararla con la secuen-
ciación manual, garantiza la reducción de los tiempos de análisis. 
4. La secuenciación de péptidos por espectrometría de masas, que 
ha reducido, de manera considerable, la obtención de la secuen-
cia de los péptidos derivados de una proteína y ha aumentado, 
considerablemente, el número de secuencias reportadas.
Requisitos para establecer la 
secuencia primaria de una proteína
Cuando se van a realizar estudios enfocados en la determinación de la 
estructura primaria, la proteína debe cumplir con unos requisitos para de-
terminar la secuencia. Aunque las técnicas para alcanzar estos resultados 
han tenido grandes avances, se debe establecer una estrategia que permita, 
al final del proceso, obtener secuencias que sean lo más exactas posibles, 
de esta forma se pueden iniciar estudios enfocados en estructura terciaria 
y función de proteínas. 
La selección de la proteína de interés depende del objetivo de la in-
vestigación, de la fuente biológica de la cual será aislada (virus, bacterias, 
órganos o semillas, entre otros) y, por supuesto, de la cantidad de proteína 
disponible. Sin embargo, si la secuencia tiene como objetivo desarrollar 
una nueva metodología para secuenciación, se emplean proteínas con se-
cuencias establecidas. 
Los principales requisitos para establecer la secuencia de una proteína son:
1. Pureza de la proteína: debe ser mayor al 97 %, de tal forma que las impu-
rezas no afecten la cantidad de los péptidos de interés. Si el estudio ha sido 
diseñado para obtener una secuencia completa, la pureza debe ser mayor 
al 98 %. Por otra parte, la preparación de proteína debe ser homogénea y 
se debe garantizar que solo hay una entidad molecular. Se hacen controles 
Estructura primaria de proteínas • 25
previos que incluyan una evaluación por electroforesis y la determinación 
del punto isoeléctrico y de la secuencia N-terminal. Sin embargo, con estas 
técnicas algunas heterogeneidades no son detectadas y aparecen durante 
el análisis, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos con carga eléctrica 
idéntica, isoleucina y valina, y algunas modificaciones postraduccionales 
como acetilaciones, metilaciones, etc. 
2. Cantidad de proteína: depende de la cantidad de datos que se desean ob-
tener y del método de secuenciación (para un análisis completo se necesitan 
cantidades del orden de miligramos). Las pérdidas de proteína durante los 
procedimientos analíticos se dan por la absorción de péptidos a los sopor-
tes cromatográficos. Los procesos de fragmentación que no son del cien 
por ciento (100 %) y las malas estrategias de secuenciación incrementan su 
cantidad durante el análisis. 
3. Evaluación de la exactitud de la estructura primaria: se debe hacer la 
identificación de secuencias idénticas de péptidos en más de un digerido 
(fragmentos obtenidos por métodos enzimáticos y químicos) y, si es posible, 
un análisis de aminoácidos. Si existen datos de secuencias de proteínas cer-
canas o similares, solo se requieren experimentos con un solo digerido, por 
ejemplo, con tripsina. En cambio, si la proteína no ha sido estudiada ni se 
conoce nada acerca de las proteínas cercanas, se requiere una producción 
continua de proteína pura y una minuciosa caracterización de los péptidos.
4. Tratamientos previos: son necesarios para realizar una digestión más 
completa de la proteína, ya que el microambiente en el que están los resi-
duos puede impedir el ataque proteolítico. Al final del tratamiento, se debe 
obtener un material altamente soluble. Para tal fin, se emplean agentes 
desnaturalizantes químicos y físicos. En presencia de agentes desnaturali-
zantes físicos, como la temperatura, se hace un calentamiento previo de la 
proteína a pH ácidos o alcalinos, de esta forma se pueden emplear agentes 
proteolíticos como la tripsina o el bromuro de cianógeno (BrCN). Con 
agentes desnaturalizantes químicos, por lo general, se emplea docecil sul-
fato de sodio (sds) al 1 %, con o sin calentamiento, y se diluye al 0.1 % para 
realizar una posterior fragmentación de la proteína con proteasas. 
Otros tratamientos incluyen modificaciones químicas, entre las que se 
encuentra la reducción de los puentes disulfuro y la adición de urea junto con 
dodecil sulfato de sodio (sds) al 0.1 %. Es importante tener en cuenta, que no 
todos los agentes desnaturalizantes son removidos para llevar a cabo la diges-
tión enzimática y, por lo tanto, no deben afectar la actividad de las proteasas. 
La reducción de los puentes disulfuro puede llevar a la formación de 
agregados de alto peso molecular, los cuales no se pueden solubilizar, ni 
siquiera empleando condiciones drásticas de reducción, aunque, cuando 
26 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
el producto es soluble en medio ácido, se puede fragmentar con bromuro 
de cianógeno (BrCN) y pepsina. 
En términos generales, las modificaciones previas a la fragmentación 
pueden alterar la selectividad del agente proteolítico. Algunas de ellas son 
las acetilaciones, la producción de sulfoderivados y la carbamilacióndel 
grupo ε-amino de la lisina, en este último caso se ve afectada la actividad 
de la tripsina. También el uso de la urea puede producir cianato y modi-
ficar algunos grupos en un amplio rango de pH. Otras modificaciones se 
evidencian al usar los anhídridos carboxílicos (succínico, maleico, etc.), que 
pueden ser empleados en estudios de disociación de multímeros y funcio-
nalidad. La oxidación de los aminoácidos aromáticos y la acilación de los 
grupos ε-amino restringen, en el último caso, la hidrólisis de la proteína 
por proteasas como la tripsina. 
5. Caracterización parcial de la proteína: es muy importante ya que nos 
permite proponer una buena estrategia de secuenciación. El proceso previo 
de purificación debe arrojar un producto de óptima calidad y, por lo tanto, 
permitir la evaluación de parámetros moleculares como: 
5.1. El peso molecular de la proteína nativa, el cual se debe determinar 
mínimo por tres métodos analíticos o, de una forma más exacta, por es-
pectrometría de masas con ionización electrospray (ms-esi). Este parámetro 
permite hacer un estimado del número de los aminoácidos que se van a 
secuenciar. La presencia de proteínas conjugadas da como resultado un 
peso molecular menor de la parte proteica y, por lo tanto, del número de 
aminoácidos que se van a determinar. 
5.2. Si las proteínas son multiméricas, se deben caracterizar los monóme-
ros constituyentes. Cuando se emplean diferentes métodos, la sensibilidad 
de las proteínas difiere y, por lo tanto, se deben establecer las condiciones 
de disociación para el análisis individual de cada subunidad. Por medio de 
métodos analíticos, se puede evaluar el número de subunidades que tiene 
la proteína, cómo son químicamente entre sí (idénticas o no idénticas) y 
cómo interactúan las cadenas polipeptídicas (covalentemente o no covalen-
temente). La suma del peso molecular de las subunidades debe ser igual al 
peso molecular de la proteína nativa. En la figura 1, se observa un resumen 
de las técnicas para determinar si las proteínas son multiméricas. 
La reducción de los puentes disulfuro varía en susceptibilidad hacia los 
agentes reductores. Para el proceso de reducción se deben establecer las 
condiciones para cada proteína, como concentración del reductor, tiempo, 
pH y temperatura. Comúnmente se emplean agentes reductores como 
β-mercaptoetanol y ditiotreitol (reactivo de cleland). La alquilación se rea-
liza para evitar la recombinación de los puentes disulfuro y evitar que se 
Estructura primaria de proteínas • 27
formen agregados. Para ello, se emplean agentes alquilantes como el ácido 
iodoacético y la iodoacetamida (figura 2). Otros agentes alquilantes incluyen 
el uso de la vinilpiridina, β-haloamina o la etilenimina, en este último caso 
se obtiene un derivado catiónico S-(2-aminoetil-cisteina) (figura 3B) con 
propiedades similares a la lisina, una ventaja, ya que se hace la introducción 
de sitios específicos de clivaje enzimático, para la tripsina [2]. 
A
CUALITATIVOS
ELECTROFORESIS
EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
Y REDUCTORAS.
PUNTO ISOELÉCTRICO EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTES.
B PREPARATIVOS
FILTRACIÓN EN GEL
ELECTROFORESIS PREPARATIVA
La resolución del método entre dos proteínas es de 23 kDa.
Se puede realizar en condiciones desnaturalizantes
La resolución del método entre dos proteínas es de 
Se puede realizar en condiciones desnaturalizantes
1 kDa.
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA (hplc)
Figura 1. Métodos para establecer la presencia de subunidades de una proteína. A: 
cualitativos B: preparativos 
OH CH2 CH2 CH2 CH2S S OHCH2
CH2
SH
SH
C
HS
CH 2
CH 2
OH
AC C N
CH2 O
S
S
CH2
C C
O
OH
OH
SH
CH
CH
SH
CH
2
CH
2
1
1
OH
HCS OH
S
CH2
CH2
HC
2
2
+
B
CH2
S
C
C O
NH2
CH2
S
C
C O
O
HI
I C
H 2
CO
O
I CH
2 CONH 2
CH2
CH2
SH
SH
C
1
2
Figura 2. Reducción de los puentes disulfuro (cistina) y alquilación en proteínas. A: 
reducción. B: alquilación
28 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
S-aminoetilcisteina
B
A
Cismercaptido
R1 S S SO2R 3
2 R1(2) S 1 R2(1) S SO3
1
SO32 R1(2)S 1 SO3
22Cu 2 2Cu 1S
S
H
NH
CH CH2 CH2 CH2BrSH NH3
haloamina
C O
NH
CH CH2 CH2 NH3
C O
CH2
Br
Figura 3. Estudio de puentes disulfuro en proteínas. A: reacción de sulfitólisis. B: 
alquilación con β-haloamina
Fuente: [3, p. 38].
La sulfitólisis introduce un grupo sulfo para mejorar la solubilidad de 
la proteína o del péptido. Con esta reacción no hay oxidación del triptó-
fano ni de la metionina, como ocurre cuando se hace la iodoacetilación. 
En condiciones muy básicas y desnaturalizantes los puentes disulfuro son 
heterolíticamente clevados y la formación del producto es favorecida por 
exceso de reactivo (figura 3A). Para la secuenciación de una proteína mul-
timérica, la separación de subunidades iguales no es necesaria, pero sí la 
disociación del polipéptido en las condiciones establecidas (unión covalente 
o no covalente), con el fin de que los puntos de corte de los agentes pro-
teolíticos sean más accesibles. 
La separación de subunidades diferentes es necesaria, al igual que su 
análisis individual, para realizar estudios de secuenciación. 
5.3. Determinación de la secuencia N-terminal que, para la proteína nativa 
y para las subunidades, solo se va debe encontrar una secuencia en cada 
caso. Esto garantiza que en el material de partida hay solo una entidad 
molecular y que este es homogéneo. Algunas veces, esta secuencia puede 
Estructura primaria de proteínas • 29
estar bloqueada por modificaciones postraduccionales o manipulación de 
la proteína; sin embargo, se debe hacer una revisión minuciosa de los re-
sultados antes de llegar a estas conclusiones. 
5.4. En el caso de proteínas conjugadas, se deben hacer ensayos para evaluar 
cómo es la interacción de la proteína con grupos de diferente naturaleza, 
como carbohidratos, lípidos, grupos heme, etc., y removerlos sin afectar 
la proteína, por ejemplo, la remoción de carbohidratos en glicoproteínas. 
La detección de glicoproteínas se puede hacer por métodos cualitativos 
que van a variar en la sensibilidad. Los métodos se basan en la oxidación 
de los carbohidratos y la formación de un complejo coloreado. Un método 
que se emplea es la oxidación de los carbohidratos con metaperiodato de 
sodio para formar aldehídos vecinales y, posteriormente, formar un deri-
vado, por ejemplo, con hidrazina biotinilada. Al final, la detección se hace 
con el sistema de estreptavidina peroxidasa [4]. Existen otros métodos que 
tienen diferente sensibilidad como la tinción shiff o el uso de anticuerpos 
antiperoxidasa dirigidos contra glicoproteínas de origen vegetal (figura 4). 
A
Oxidación
Biotinilación
Aldehídos vecinales
Aldehídos-Biotina
Detección de carbohidratos
SDS-Page Tinción Reacción enzimática
Figura 4. Detección de la glicosilación en glicoproteínas 
30 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
Una vez se ha hecho la detección de la glicosilación, se debe hacer la 
cuantificación de los carbohidratos en la proteína. Usualmente se hace em-
pleando el método de Dubois et al. [5], el cual se basa en la deshidratación 
del carbohidrato con ácido sulfúrico concentrado y posterior formación de 
un complejo amarillo con fenol al 5 % que absorbe la luz a 450 nm. Con 
ayuda de una curva de calibración, empleando glucosa como patrón y la 
proteína pura cuantificada, se puede hacer la determinación con base en 
la diferencia del peso:
% = (mg carbohidrato en la muestra/mg proteína total) × 100
Sin embargo, si el porcentaje de carbohidratos es inferior al 5 % no es 
necesario removerlo para realizar los estudios de secuencia. 
Empleando técnicas como sds-Page, se puede determinar el porcentaje 
(%) de uniones N-glicosídicas y O-glicosídicas. A partir de la diferencia en 
la movilidad electroforética ((∆kDa), figura 5) y el uso de enzimas especi-
ficas para la hidrólisis de cada unión glicosídica (figura 7), es posible esta-
blecerel porcentaje de glicosilación y, a su vez, realizar comparaciones con 
estructuras de oligosacáridos ya establecidas, teniendo en cuenta que esta 
modificación postraduccional es conservada. Tambíen se puede determinar 
el porcentaje total de glicosilación, haciendo una hidrólisis química total 
para remover todas las cadenas de oligosacáridos (figura 5).
 
a b
c d
kDa
a. SDS - Page proteína glicosilada.
c. Tinción especifica glicoproteína.
b. SDS - Page proteína deglicosilada.
d. Tinción especifica proteína deglicosilada.
Figura 5. Determinación del porcentaje de glicosilación en glicoproteínas por sds-
Page
Estructura primaria de proteínas • 31
Una determinación cuantitativa exacta se puede realizar usando es-
pectrometría de masas con ionización electrospray (ms-es), que consiste 
en determinar el peso molecular de la glicoproteína antes y después de la 
remoción del oligosacárido. Con este método, también es posible hacer la 
detección de glicoformas porque la diferencia de peso molecular entre ellas 
es muy pequeña, pero las propiedades físicas y químicas de la proteína son 
iguales (figura 6). 
La remoción de carbohidratos se puede realizar de manera no selectiva, 
con una hidrólisis química suave, con ácido clorhídrico (HCl) 0.01 M a 
100 °C durante 3 horas (un ácido más concentrado puede romper los enlaces 
peptídicos). Una vez terminada la hidrólisis se puede hacer la eliminación 
de los monosacáridos por medio de filtración en gel, ultrafiltración o diáli-
sis. Una hidrólisis química selectiva para eliminar O-glicosídicos se puede 
realizar con ácido sulfónico trifluorometano (tmsf) [6]. 
Los métodos de deglicosilación selectivos incluyen la hidrólisis enzimá-
tica con enzimas para remover la N y O glicolisación (figura 7). Antes del 
tratamiento enzimático, es importante realizar una desnaturalización previa 
de la glicoproteína para asegurar la accesibilidad de la proteasa y evitar la 
modificación del oligosacárido. 
En el caso de proteínas conjugadas a lípidos, los cuales no están asociados 
covalentemente a las proteínas, se pueden realizar procesos de extracción 
diferencial con solventes (Etanol: éter); un ejemplo del proceso es la deli-
pidación de proteínas de alta densidad del suero. 
Para proteínas que tienen cofactores, si ellos están unidos covalente-
mente, su remoción no debe alterar el enlace peptídico, por ejemplo, el 
13500 14000 14500 15000 15500 16000
0
100
Proteína A
Proteína B14896.9 (14895.5)
15058.8
Diferentes glicoformas
(GlcNAc) 2 Man 5
X X X X
15384.3
15223.8
15545.4
Man 6
Man 9
Man 7
Man 8
Ab
so
rb
an
ci
a 
re
la
ti
va
Figura 6. Detección de glicoformas por ms-esi
32 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
grupo heme del citocromo c se puede eliminar con una solución de áci-
do perfórmico (95 %). Si no están unidos covalentemente su remoción se 
hace en condiciones desnaturalizantes, a pH ácido y con el uso de agentes 
acomplejantes como edta y egta. Finalmente, se eliminan por medio de 
filtración en gel, ultrafiltración o diálisis, entre otros.
5.5. El análisis de aminoácidos permite planear una mejor estrategia de 
secuenciación y hacer un balance de masa entre la proteína intacta y los 
fragmentos derivados de la digestión enzimática o química. Si la masa to-
tal es mayor que la de los péptidos aislados, hay pérdidas de los péptidos 
durante el proceso de purificación. Si la masa total es menor que la de los 
péptidos aislados, probablemente, se hizo un reconteo de péptidos con la 
misma secuencia. Para hacer un buen análisis de aminoácidos, se deben 
realizar diferentes hidrólisis que no alteren las cadenas laterales de estos. 
Algunos aminoácidos no estándar pueden ser pasados por alto durante el 
análisis por hidrólisis, por ejemplo, la fosfoserina y el γ-carboxiglutámico, 
en los que el grupo fosfato y carboxilo pueden ser perdidos, lo que da como 
resultado serina y glutámico, respectivamente. Otros, como ε-metil lisina 
y 3-metil histidina, no son detectados por los métodos cromatográficos 
convencionales y se pueden presentar electroforesis anormales de péptidos 
y proteínas que indican su presencia.
El método de hidrólisis general de las proteínas se hace con HCl 6M, a 
100 0C, durante 24 horas, en ausencia de oxígeno y de metales. Con este 
tratamiento la metionina y cisteína no se pueden cuantificar y, por lo tanto, 
antes de la hidrólisis, se deben obtener como derivados metioninsulfona 
y ácido cisteico, respectivamente (figura 8). Se debe tener en cuenta que, 
con el tratamiento, la tirosina se puede clorar, por lo que, algunas veces, 
se introduce fenol para inhibir el daño. La serina y treonina son lábiles al 
1. PNGase F ( de Flavobacterium meningosepticum): hidroliza los enlaces N- glicosídicos
R-Asp GlcNAc........ 
de manosa y glicanos de tipo N-híbridos.
3. Endo GalNAc-Ser/Thra ( de Streptococcus pneumoniae )
2.Endoglicosidasa H (endo H) ( de Streptomices plicatus): hidroliza los enlaces N- glicosídicos
R-Asp-GlcNAc 
-1-3GalNAc ser/Thr
Figura 7. Deglicosilación enzimática de glicoproteínas
Fuente: [7, p. 344].
Estructura primaria de proteínas • 33
tratamiento; por esto, se debe hacer un análisis cinético de la liberación y 
velocidad de destrucción de estos aminoácidos. Aminoácidos como alanina, 
valina e isoleucina forman enlaces peptídicos que son muy resistentes a la 
hidrólisis, en estos casos se deben extender los tiempos de hidrólisis hasta 
las 72 horas (figura 9). Los demás aminoácidos se determinan a las 24 ho-
ras de hidrólisis, excepto el triptófano, el cual se destruye completamente. 
Aminoácidos como la glutamina y la asparagina se convierten en los 
ácidos glutámico y aspártico, respectivamente. De modo que, después de 
la hidrólisis ácida, solo puede cuantificarse la mezcla de la amida y el ácido 
como Asx (Asp +Asn) y Glx (Glu+Gln). Para la determinación de triptófa-
no se han hecho varias modificaciones del método de hidrólisis para evitar 
su cloración y destrucción, algunas de ellas incluyen tratamiento con ácido 
P-toluen sulfónico 3N o hidrólisis básica con Ba (OH)2 (saturado) 4N. 
Se debe hacer una hidrólisis de la proteína luego de su tratamiento con 
ácido perfórmico del 90-95 % (H2O2 + ácido fórmico) en medio desnatura-
lizante, para cuantificar la cisteína como ácido cisteico y la metionina como 
metioninsulfona. Estos derivados son estables en condiciones de hidrólisis 
ácida y básica pero, en el último caso, el BrCN (bromuro de cianógeno) 
no hidroliza el enlace en el que hay metionina, si se fuera a fragmentar la 
proteína con este reactivo. Se resalta que, con este tratamiento, también 
hay destrucción del triptófano y los aminoácidos polares se oxidan. 
NH-CHCH CH SCH2 2 3 + HCOOH NH-CHCH CH SCH
O
2 2 3
O
metioninsulfona
NH-CHC
O
CH 2
S
S
CH 2
-NH-CH-C-
O
+HCOOH
NH-CHC
O
CH 2
CH 2
-NH-CH-C-
O
SO
3
SO 3
ácido cisteíco
Figura 8. Oxidación perfórmica de cisteína y metionina
34 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
Para complementar el análisis de aminoácidos se puede realizar una 
determinación de cisteína y cistina. De esta forma, se puede deducir si los 
residuos de ácido cisteico que fueron determinados en el análisis de ami-
noácidos están en forma libre o formando puentes disulfuro. Con el reac-
tivo de Ellman [2,8], se mide la cantidad de nitobenzoato (ntb) liberado 
durante la reacción del ditiobis -2 ácidonitrobenzoico (dntb) con un grupo 
tiol (figura 10). La hidrólisis de la proteína empleando otros ácidos como 
sulfúrico (H2SO4) o nítrico (HnO3) traen como consecuencia una fuerte 
deshidratación, destrucción y nitración de la tirosina, por lo tanto, no son 
recomendables. Por otra parte, la hidrólisis básica provoca la descomposi-
ción de cisteína, serina, treonina y arginina. Además, desamina y racemiza, 
parcialmente, los demás aminoácidos. 
Para determinar la cantidad de triptófano se realiza una digestión enzi-
mática con pronasa o proteinasaK y se hace una condensación con P-di-
metilbenzaldehído (paba) en medio ácido y, posteriormente, una oxidación 
con nitrito de sodio (NaNO2). La absorbancia del complejo se puede leer 
a 596 nm y se determina la cantidad empleando una curva de calibración 
(figura 11) [9]. 
El contenido de aminoácidos en un hidrolizado puede determinarse 
cuantitativamente con un analizador de aminoácidos automatizado. Este 
equipo separa los aminoácidos sobre una columna de intercambio iónico, 
usando como base la técnica que fue desarrollada por Hirs y colaborado-
res [10, 11] (figura 12). Para la detección de los aminoácidos, se pueden 
m
m
o
l 
aa
24 48 72 h
Los demás aminoácidos se pueden cuantificar a las 24 horas de hidrólisis. La cisteína y la metionina
se cuantifican como metionisulfona y ácido cisteíco respectivamente.
Extrapolación a tiempo cero para
cuantificar serina y treonina.
Extrapolación a las 72 h para
cuantificar leucina, valina, isoleucina.
m
m
ol
 a
a
24 48 72 h
Figura 9. Curvas hipotéticas de la cinética de hidrólisis de los aminoácidos para 
una proteína en condiciones ácidas
Estructura primaria de proteínas • 35
preparar derivados antes o después del paso por la columna de separación. 
Los derivados se pueden formar con fluroescamina, ninhidrina, fenilisotio-
cianato (pitc), fenil tiocarbamil (ptc), O-Phataldehído (Opa), este último no 
reacciona con prolina y, por lo tanto, se debe hacer una oxidación previa 
con cloramina T (figura 13).
RS R S S NO2
2COpH 8.0
2
O N2 S
O C
S
CO2
NO2
NTB
S
CO2
NO2
DTNB
Figura 10. Determinación de cisteína libre con el reactivo de Ellman
Fuente: [2, p. 157].
COO
CH C H
H C O
N NH
2
3
3 2
N(CH )
HO
N
O
C
C
H
OH
3 2
N(CH )
gComplejo Ruheman =596 nm
N
O
C
(CH )N 3 2
N
C
(CH )N 3 2
Na
NO
2
H 42SO[ [
Figura 11. Determinación de triptófano por formación del complejo de Ruhemann
36 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
Figura 12. Diagrama de purificación de aminoácidos 
Fuente: [11, p. 674].
A
CH
O
CH
O
HS
3
CH2 CH2 OH NH CH COO
R
OH-CH -CH -S2 2
CH COO
R
N
B
O
O
O
O
H N CH
R
3
COO
COOH
C
RNOH
O
C
O
C
C
C
OH
OH
O
2 H N3 CH
COO
R
R C H
O
CO2 O
C
O
C
O
C
O
C
C N C
2 O3H
Figura 13. Reacciones de derivatización de los aminoácidos. A: reacción con 
O-Ftalaldehído. B: reacción con fluroescamina. C: reacción con ninhidrina
Los aminoácidos se identifican de acuerdo con su volumen de elución 
o tiempo de retención y se hace su cuantificación de acuerdo con su inten-
sidad fluorescente o por el área bajo la curva (figura 14). Los métodos de 
detección tienen una alta sensibilidad y se pueden detectar cantidades del 
orden de un picomol de cada aminoácido. Los datos son reportados, en 
un aminograma, como porcentaje de cada aminoácido en la proteína (g aa 
Estructura primaria de proteínas • 37
/100 g de proteína). Para obtener los datos, es importante una cuantifica-
ción exacta de la solución de proteína, por ejemplo, por micro-Kjeldahl o 
algún método colorimétrico exacto o por el coeficiente de extinción de la 
proteína si se conoce. 
El resultado final del análisis de aminoácidos se describe como residuos 
de cada aminoácido o molécula. Para alcanzar estos datos, se debe tener 
en cuenta la masa molecular de cada aminoácido sin una molécula de agua. 
Para no reportar Glx y Asx como una mezcla, se puede hacer un tratamiento 
previo a la proteína para determinar las amidas como aminas en el análisis. 
Por otra parte, es posible hacer una aproximación al punto isoeléctrico de 
la proteína de acuerdo con el contenido de aminoácidos básicos y ácidos. 
En el siguiente ejemplo, se presenta el reporte del análisis de aminoácidos 
para la lectina de Salvia bogotensis (LSBo) (figura 15) con y sin oxidación 
perfórmica. En los datos se observa lo siguiente: 
• Algunos aminoácidos disminuyen su contenido luego del proceso 
de oxidación perfórmica. 
• Luego de la oxidación perfórmica aparece el ácido cisteico, lo que 
indica la presencia de cisteína en la proteína. 
D
E
S G
H
R
T
A
P
N
H
3
5 10 15 Minutos
Y
V
M F
I L K
Figura 14. Perfil de elución de los aminoácidos, detección a 254 nm-Derivados 
aminoácidos-ptc (Feniltiocarbamilados). Se observa la elución de los aminoácidos 
ácidos; luego, de los polares e hidrofóbicos y, al final, de la lisina
Fuente: [12, p. 48].
38 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
• El cálculo de los residuos de aminoácidos se realiza con los datos 
que fueron determinados sin oxidación perfórmica, excepto para 
la cisteína y metionina. 
• La metionina es un aminoácido que es escaso en proteínas de 
plantas. En el ejemplo, la proteína es aislada de semillas y, en este 
caso, no aparece. Por lo tanto, se confirma su ausencia luego del 
tratamiento de oxidación. 
• No aparece el contenido de triptófano porque, en los dos casos, la 
hidrólisis lo destruye completamente. Por lo tanto, se debe com-
plementar el análisis haciendo su determinación por el método 
colorimétrico o por técnicas cromatográficas [13]. 
Aa LSBo LSBo**
ASX 5,79 6,661
4,1184,248THR
SER
GLU
GLY
ALA
1/2 CYs
VAL
MET
ILE
17,118
17,669
17,146
8,483
0
3,156
0
2,373
0
14,583
22,632
24,159
6,895
1,223
3,437
2,738
LEU
TYR
PHE
HIS
LYS
ARG
PRO
TRP
SUMA
3,7
2,456
1,939
1,655
8,846
1,382
4,039
ND
100,0 100,0
ND
3,244
1,092
0,982
1,015
2,395
1296
3531
LSBo:Lectina de Salvia bogotensis
Masa molecular: 38702 Da
16 % carbohidratos
ND: no determinado
LSBo**: con oxidación perfórmica
Figura 15. Resultados del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia 
bogotensis (LSBo) 
Fuente: [14, p. 352].
Estructura primaria de proteínas • 39
Para calcular los residuos de aminoácidos por molécula se debe realizar 
el cálculo por cadena polipeptídica, si la proteína es multimérica. Poste-
riormente, corregir el porcentaje de aminoácidos dado que el reporte no 
incluye cisteína y triptófano, según el ejemplo propuesto, entonces: 
1 00-(1.22+5.1) = 93.677
(%) real = porcentaje de cada aminoácido × 0.93677
Si la proteína es conjugada se debe calcular la masa total, sin el contenido 
de carbohidratos, en este caso es del 16 %: 
38 702 × 0.16 = 6192.32 g
38 702 - 6192.32 = 32 510 g
Lectina de Salvia bogotensis (LsBo)
Aa Aa/ 100gproteína
Aa 
residuos/mol. Integral
1
Asx 5,42 15,3 15
Thr 3,98 12,8 13
Ser
Glx
Gly
Ala
Val
Met
Cys
lle
Leu
Tyr
Phe
His
Lys
Arg
Pro
Trp3
2
2
16,03 59,8 60
16,55 41,7 42
16,06 91,5 92
7,94 36,3 36
2,95 9,7 10
0,2 0 0
1,22 3,9 4
2,22 6,4 6
3,46 9,9 10
2,30 4,6 5
1,81
1,55
8,28
1,29
3,7
5,1
3,7
4,0
21,0
2,7
12,7
8,9
4
4
21
3
13
9
Cálculos con PM = 38702 con 16% carbohidratos
(1) Residuos / cadena polipeptidiza
(2) Determinado como met SO y CySO
(3) Determinado espectrofotometricamente
2 3
Figura 16. Reporte del análisis de aminoácidos para la lectina de Salvia bogotensis 
(LSBo)
Fuente: [14, p. 352].
40 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
El número de residuos de cada aminoácido se debe calcular con el por-
centaje obtenido en condiciones de hidrólisis normales, es decir sin oxida-
ción perfórmica, para el caso de la mezcla de ácido aspártico y asparagina 
(Asx) tendremos: 
(32.510 × 5.42) /100 = 1762.04/115.089 = 15.31 residuos
y se debe reportar como un número entero, es decir 15 residuos de la 
mezcla Asx. Se hace el cálculo para los demás aminoácidos y se completa 
la tabla adjunta para dar el reporte final (figura 16). 
Tabla 1. Análisis de aminóacidos 
AA AA (g) Residuos 
AA
N.º Residuos AA Totales 
AA(g)
Asx 1762.04 15.31 15 1726.3
Ʃ=PM
Para deducir el número de puentes disulfuro debemos tener en cuenta 
el porcentaje determinado. Así, si tenemos cuatro residuos, habrán, pro-
bablemente, dos puentes disulfuro. Finalmente, se deben tabular los datos 
y sumar los gramos de cada uno de los aminoácidos que nos darán la masa 
molecular de la proteína. Teniendo en cuenta la caracterización molecular 
de laproteína de estudio, con el reactivo de Ellman se puede evaluar si 
las cisteínas están libres. Los resultados arrojados de las electroforesis bajo 
condiciones reductoras y no reductoras, permiten establecer si los puentes 
disulfuro son intracatenarios o intercatenarios. Los datos finales se deben 
reportar como residuos de cada aminoácido por molécula y de esta forma 
se pueden hacer comparaciones con proteínas que estén relacionadas. 
Se han desarrollado otras técnicas para cuantificar aminoácidos como la 
cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa o empleando otros 
soportes. También se han empleado electroforesis capilar, cromatografía de 
gases y cromatografía líquida acoplada a un detector de masas. La mayoría 
de estas técnicas requiere que los aminoácidos sean derivatizados para hacer 
su detección u obtener derivados volátiles para hacer el análisis por gases. 
También se ha trabajado en la marcación de aminoácidos usando isóto-
pos como 13C o etiquetado con 10-metil-acridona-2-sulfonilo (d0-masc) 
y d3-masc deuterado, con el objetivo de mejorar la detección de algunos 
aminoácidos por masas. Sin embargo, con estas técnicas solo se cuantifican 
unos pocos aminoácidos. Por otra parte, se continúa haciendo el método 
de hidrólisis convencional acompañado de una digestión adicional asistida 
con microondas durante treinta minutos. Aminoácidos como el triptófano 
y la cisteína se pierden durante este proceso [15, 16].
Estructura primaria de proteínas • 41
5.6. La determinación del aminoácido (aa)-N terminal se basa en la re-
acción específica de algunos compuestos orgánicos con los grupos α-amino 
del aminoácido del extremo N-terminal para formar un derivado que se 
puede identificar fácilmente, ya que la cadena lateral se conserva, a dife-
rencia de la reacción convencional con ninhidrina, en la que no es posible 
identificar el aminoácido. Algunos métodos se resumen a continuación: 
5.6.1. Dinitroflurobenceno (dnfb): reacciona con el grupo α-amino del 
aminoácido del extremo N-terminal, para formar un dinitrofenil-derivado 
(dnp) del aminoácido (figura 17 A). La hidrólisis se hace en medio ácido y los 
demás aminoácidos de la cadena polipeptídica quedan como aminoácidos 
libres. La reacción no se realiza si el N-terminal está bloqueado. La detec-
ción del derivado se puede hacer por cromatografía en capa delgada (tlc) o 
su separación, por cromatografía de intercambio iónico, entre otros métodos. 
5.6.2. Cloruro de dansilo (dns-cl) (1-dimetilamino naftaleno 5 sulfonil-
cloruro) (figura 17 B): es un método más sensible (1-5 ng) que el derivado 
obtenido con dnfb, rápido y simple, pero algunos derivados son lábiles 
como la prolina. Por cromatografía en capa delgada (tlc), algunos derivados 
son de difícil resolución, por ejemplo, arginina, histidina y ácido cisteico; 
sin embargo, se pueden emplear métodos cromatográficos para hacer la 
separación e identificación. También se puede obtener un dipéptido como 
N-terminal, debido a que los enlaces peptídicos son más resistentes cuando 
hay residuos hidrofóbicos. El cloruro de dansilo reacciona con las aminas 
primarias (entre ellos el grupo ε-amino de la lisina), dando como resultado 
A
O2N F H2 NCHCO
R
NHCHCO
R
HCO
(-HF)
3
NO2
O2N H2NCHCO
R
NHCHCO
R
H O3
NO2
Polipéptido acoplado
Mezcla de aminoácidos
O2N HNCHCO
R
N
RNO2
H2 3H CHCO2
B H
2
3C CH3
N
NH CHCONHCHCO....
R1 R2
pH 9.5 - 10
H3C CH3
N
2SO NHCHCONHCHCO....
R1 T 4
J
105°C, 18h
H3C CH3
N
Mezcla de aminoácidos
2SO NHCHCO H2
R1
Derivado
Figura 17. Determinación del aminoácido N-terminal. A: con 2, 4 
dinitrofluorobenceno (dnfb) B: con cloruro de dansilo 
Fuente: Capítulo 23. [17, p. 204].
42 • Introducción al análisis estructural de proteínas y glicoproteínas
polipéptidos dansilados que posteriormente por hidrólisis ácida libera el 
aminoácido N-terminal dansilado y una mezcla de los demás aminoácidos. 
El derivado exhibe una intensa fluorescencia amarilla que puede identificarse 
por cromatografía con cantidades del orden de picomoles [17]. 
La determinación de la secuencia N-terminal se lleva a cabo con el méto-
do más común, denominado la degradación de Edman, el cual es realizado 
con fenil isotiocianato (pitc) que reacciona con los grupos α-amino del ami-
noácido N-terminal de las proteínas. La reacción se realiza en condiciones 
básicas suaves para formar el fenil tiocarbamilo (ptc) y, posteriormente, 
se hace una hidrólisis suave con ácido trifluroacético anhidro y se separa 
el derivado llamado feniltiazolina y el péptido (proteína), el cual tendrá 
un residuo menos de aminoácido. El derivado de feniltiazolina se extrae 
en medio orgánico y, por tratamiento con tfa al 20 %, se convierte en un 
derivado más estable, feniltiohidantoina (ptH) (figura 18 A). Este aminoá-
cido-ptH puede identificarse por comparación con estándares conocidos, 
R1
N C S NH2 CH C NH CH C
R 2
O
pH 9.5
Piridina
PITC
NH C NH CH C NH CH C
R2
O
S
O(1)
R1
C NH CH C
TFA anhidro
C
NH
C S
H
R1
CH C
O
NH S
C
NHNH
CHNH3
R2
C
Polipéptido/Péptido
(2)
Feniltiazolina
(3)
OH
R1
CH C
O
N
C
S
NH
TFA 20%
3
Feniltiohidantoina - PTH
R1
CH
C O
N
NH
SC
Péptido
Proteína
Extracción
Feniltiazolina
Obtención conversión
Feniltiazolina Feniltiohidantoina-PTH
4
PITC
Hidrólisis Acople
Lavado
5 6 7
3 1
2
A
B
Identificación
HPLC
Figura 18. Determinación de la secuencia N-terminal por la degradación de Edman
Fuente: Capítulo 26. [18, p. 245, 246].
Estructura primaria de proteínas • 43
empleando cromatografía en capa delgada (tlc) o cromatografía liquida 
de alta eficiencia (Hplc), entre otros. Una de las diferencias más claras con 
respecto a las determinaciones del aminoácido N-terminal antes citadas es 
que permite determinar la secuencia de, por lo menos, veinte aminoácidos 
por medio de ciclos repetidos en los que se identifica el ptH liberado (figura 
18 B). Hoy en día, esta técnica se ha automatizado y, por lo tanto, se ahorra 
tiempo y muestra. 
Con técnicas automatizadas, la repetición de este método puede utilizarse 
para determinar la secuencia de hasta cincuenta aminoácidos, comenzan-
do desde el extremo N-terminal. Por lo tanto, si se desea secuenciar una 
proteína, se hace la secuenciación de cada uno de los péptidos aislados de 
la fragmentación de la proteína. 
Algunas de las características de la degradación de Edman se resumen 
a continuación: 
• Presenta una alta eficiencia de la remoción del aminoácido del 
extremo N-terminal.
• Es un método automático o manual, los dos se diferencian en el 
número de ciclos/día.
• Se presentan pocas pérdidas del péptido (proteína) por cada ciclo, 
si es una técnica automatizada. 
• Se puede realizar el análisis en forma sólida si la proteína está 
muy pura. 
• Puede detectar aminoácidos naturales, pero no funciona bien con 
aminoácidos modificados. 
• Si el N-terminal está bloqueado, no se da la reacción. 
• Se pueden secuenciar entre diez y treinta aminoácidos, depen-
diendo de la secuencia y de la cantidad de material.
• No permite estudiar modificaciones postraduccionales.
• El porcentaje de eficiencia de la reacción es del 15 %.
• La serina y la treonina se deshidratan y, algunas veces, se produ-
cen reacciones laterales.
• Los ciclos se pueden demorar entre treinta minutos y una hora, 
si es un método automatizado.
El método fue optimizado gracias a la propuesta de Matsudaira [19], 
trabajando con cantidades muy pequeñas de proteína. La transferencia de 
la proteína se hace sobre una membrana de polivinildifluoruro (pvdf), la 
cual es inerte y no interfiere en el proceso. También se debe evitar el uso de 
solventes que bloqueen el N-terminal durante la transferencia, por ejemplo, 
el ácido acético. Se pueden procesar bandas de 10 picomoles para el aná-
lisis y si es posible entre 40-60 pmoles, obtenidos de varias transferencias. 
La determinación con dabitc (4-N, N-dimetilazobenceno-4´isotiocianato) 
es otro método que se emplea

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