tesis-n1874-Canziani

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Tesis de Posgrado
Mecanismo de acción del complejoMecanismo de acción del complejo
crotoxina de veneno de Crotaluscrotoxina de veneno de Crotalus
durissus terrificusdurissus terrificus
Canziani, Gabriela Alicia
1984
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Biológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
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Cita tipo APA:
Canziani, Gabriela Alicia. (1984). Mecanismo de acción del complejo crotoxina de veneno de
Crotalus durissus terrificus. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos
Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1874_Canziani.pdf
Cita tipo Chicago:
Canziani, Gabriela Alicia. "Mecanismo de acción del complejo crotoxina de veneno de Crotalus
durissus terrificus". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. 1984. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1874_Canziani.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar
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mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
MECANISMO DE ACCION DEL COMPLEJO CROTOXINA
DE VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS
VOLUMEN 1
Autor: LIC. GABRIELA ALICIA CANZIANI
Director de Tesis: DR. JUAN CARLOSVIDAL
Lugar de Trabajo: CONICET_ ¡DNEU
TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE DOCTOR EN
CIENCIAS BIOLOGICAS
A mi esposo y a mi hija.
A mis padres.
A mis hermanos.
Deseo expresar mi gratitud al Dr. Juan Carlos Vidal por haber sabido
transmitir su enfoque ágil y optimista de la investigación, por su siempre
buena disposición para las consultas y las discusiones, y por habermeense
ñado que es posible trabajar con ponzoñas sin envenenarse la vida.
A mi Consejero de Estudios, Dr. José Maria Gallardo, sin cuya ayuda
no hubiese podido alcanzar esta meta,
al Director del Instituto de Neurobiologia (CONICET),Dr. Juan Trame
zzani, quien confió en el resultado de nuestro proyecto de investigación y
nos apoyó incondicionalmente,
al CONICET,por haberme otorgado las becas de Iniciación y Perfeccig
namiento que hicieron posible la concreción del proyecto,
al Dr. Emilio Decima, profesor del School of Medecin, U.C.L.A.,quien
dedicó parte de su periodo sabático a introducimos en el complejo campo
de la fisiología de la unión neuromuscular,
a mis conpañeros de laboratorio Lic. Cristina Seki, HugoNisenbon y
Daniel Caso, por haber contribuido en amonio al trabajo de equipo,
a Marta Miranda y Gustavo Coutourier, inigualables guardianes de nues
tro equipo de cascabeles, cuya contribución fue esencial,
a Elvira Buonoy el equipo de dibujantes,
a Luis Millara y el equipo de fotografia, por su comprensión e inva­
lorable ayuda,
a las mecanógrafas Claudia Clemares, y muy eSpecialmente, Leticia
Scoccia, por la paciencia y dedicación c0n las que emprendieron la lectura
y transcripción de los manuscritos
y a todos aquellos que de una u otra manera colaboraron en la reali­
zación de esta tesis,
mi más profundo y sincero agradecimiento.
Gabriela Alicia Canziani.
Parte de los resultados presentados en esta tesis han sido
publicados según se indica a continuación:
Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1982. Accessibility of the
active site of crotoxin B in the crotoxin complex. Toxicon,
20 (5) : 809-822.
Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1983. The mechanism.of
inhibition of phospholipase activity of crotoxin B by
crotoxin A. Toxicon 21 (5) : 663-674.
Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1984. Crotoxin complex
dissociation promotedby acetylcholine. Acta Physiolocica
et Pharmacologyca Latino Americana (en prensa).
INDICE
INTRODUCCION
Antecedentes y objetivos de esta Tesis
de Doctorado. Estado previo a nuestros estudios
sobre el mecanismo de acción del
complejo crotozina
Carácter de nuestra contribución al problema
CAPITULO I
Materiales y Métodos - Generalidades
Identificación de las fracciones
Actividad biológica de las fracciones
Actividad enzimática de las fracciones
Inhibición de la actividad fosfolipasa A2
Experimentos de ligadura directa
CAPITULO II
Purificación de los componentes del camplejo
crotoxina
Purificación y fraccionamiento del complejo
crotozina. Identificación de las fracciones
purificadas. Rendimiento del método
Discusión
CAPITULO III
Acción biológica del complejo crotozina
Control de la preparación neurOmuscular
aislada
Efecto tóxico del complejo crotozina
Discusión
CAPITULO IV
Crotozina'B
n,.
Propiedades fisicas de la crotoxina B
Caracterización de la reacción catalizada
por crotozina B
Discusión e interpretación
CAPITULO V
Cinética de Za reacción catalizada por crotoxina
B. Influencia de la concentración del sustrato,
su estado fisico y el efecto del pH.
Actividad de Za crotoxina B sobre Zecitinas de
cadena corta
Efecto del pH sobre la hidrólisis de monómeros
Actividad de Za crotozina B sobre Zecitinas de
cadena larga
Efecto del pH sobre la hidrólisis de vesículas
Discusión
CAPITULO VI
Crotoxina A
Resultados
Discusión
CAPITULO VII
Actividad enzimática de la crotoxina B en eZ
complejo crotoxina
Actividad fosfolipásica del complejo crotoxina
con lecitinas monoméricas
Inactivación del complejo crotozina por
bromuro de p-bromofenacilo
Actividad fosfolipásica del complejo crotozina
sobre sustratos agregados
Efecto del pHsobre la actividad fosfolipásica
de complejo crotozina
Experimentos de ligadura directa del complejo
crotozina a micelas mixtas
Discusión
CAPITULOVIII
Disociación del complejo crotoxina en la
sinapsis de la unión neuromuscular
Resultados
Discusión
DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES
Modelo del mecanismo de acción del complejo
crotoxina
El modelo convencional
El modelo propuesto por el presente trabajo
Comparación del modelo convencional con
el propuesto
Abreviaturas
APENDICES
BIBLIOGRAFIA
200
203
209
211
213
225
226
234
238
239
240
241
257
INTRODUCCION
"Cnegó ven una ¿enpiente
que ¿e ¿ntenpglaba en gniego;"
Lew¿¿ Cannot!
Alicia en el paí¿
de Laó manauillaó
Desdelas civilizaciones más antiguas hasta nuestros dias las
serpientes han despertado las más variadas emociones. Para los
antiguos la serpiente encarnaba el espiritu de la tierra por su
naturaleza reptante y su capacidad de supervivencia. Comoen
las zonas desérticas se encontraban próximas a las fuentes de a
gua, se consideraban parte "de donde viene la vida humana y la
salud“. Para muchos pueblos fue dios y comienzo de todas las
cosmogonias, simbolo de fecundidad, salud, continuidad y eterni
dad (Leake, 1967; Boquet, 1979). Pero para los herederos de la
civilización occidental la serpiente es la encarnación del mal:
expulsada del Eden, condenada a_arrastrarse eternamente, produ­
ce el veneno comoesencia del mal que lleva adentro (Génesis).
Poca simpatía despiertan estos reptiles que nos provocan repul­
sión, incomodidad, temor y hasta pánico dependiendo de cuán cer
ca estén de nosotros, pero lo cierto es que las serpientes veng
nosas imponenrespeto. Por muchotiempo los naturalistas, en
la contemplación de la naturaleza, no prestaron muchaatención
a las serpientes, pero no pasarOn inadvertidas ,a AriStóteles.
El analizó su anatomia y reproducción, y lasdescribió en su
"Historia de los Animales"tratando de clasificar las criaturas
que se conocían 400 años antes de Cristo. Con el aporte de las
campañas de Alejandro Magnoéstas no debieron ser pocas y su e­
xotismo debió llamar la atención de los griegos. AunqueAnibal
de Cartago (247-183A.C.) no fue naturalista, tuvo éxito utili­
zando las serpientes comoarmas, pues tomó en cuenta las propig
dades de sus venenos sin hacer caso de la superstición o la mi­
tologia. Aterraba a los romanos lanzando hacia sus barcos vasi
jas de terracota repletas de serpientes venenosas de Africa del
Norte. Nikandros de Kolophon, poeta, gramático y médico, proba
blemente vinculado a1 Templode Esculapio, escribió en el siglo
<kB.AJLdos obrasgen versofde importancia mayor para 1a historia
natural: “Thériaca”, que trata de la ponzoña de los animales
venenosos, su acción y tratamientos de envenenamientos, y "Ale­
xispharmaca", sobre los venenos vegetales y minerales. Se sosf
pecha que la mayor parte de la información la obtuvo de los pa­
piros médicos egipcios que datan de 1600 años A.C. y que contig
nen descripciones de los tratamientos de mordeduras de una am­
plia variedad de animales. El resto de los conocimientos los
adquirió probablemente tomandonota de las tradiciones orales
propagadas entre los griegos a la vuelta de los soldados y médi
cos de Alejandro. Esto es lógico considerando que son pocas
las especies venenosas que hay en Grecia.
Los escritos de Nikandros tuvieron gran vigencia durante los pg
riodos greco-romano, medieval y aún el renacimiento. Fueron
traducidos al latin y‘publicados en Venecia en 1499. Luego el
texto griego con una traducción adosada apareció en Paris en
1549. Los eminentes hombres de ciencia que le sucedieron no hi
cieron más que copiar y clasificar la información de Nikandros,
y entre ellos podemosmencionar a Dioscorides del siglo primero
de nuestra era. Era médico de la corte de Nerón, clasificó los
principios curativos en una "Materia Médica" y alli incluyó los
tratamientos para mordedurasde serpientes¿ Plinio las considg
ró en su fantasiosa "Historia Natural" que escribió en el siglo
1 A.C. Sostenia que"entre todas las serpientes conocidas, el
basilisco era el más venenoso pues mataba con la miradaï Los
"bestiarios" de la Edad Media no fueron más que elaboraciones
imaginarias de sus trabajos, en donde se describian dragones,
serpientes monstruosas y reptiles horrendos. No contribuyeron
V
al conocimiento de las serpientes venenosas pero alimentaron el
folklore. Galeno (131-201 D.C.) adjuntó a la Historia Médica,
algunas notas referentes al tratamiento de mordeduras tomando
la información de los trabajos de Nikandros. De la mismamane­
ra se informaron todos aquellos que se refirieron al efect03rel
tratamiento de las mordeduras de animales venenosos (Celsus, A­
viaena). Andrómaco, también médico de la corte.de Nerón, fue en
cargado de preparar antídotos contra las mordeduras de serpien­
tes. Preparó lo que llamó Teriaca o Triaca que pasó a signifi­
car por extensión: remedio obtenido a partir del mismodaño, o
mal prevenido con prudencia. Ha sido usado hasta tiempos rela­
tivamente recientes y consistía en una mezcla compleja de carne
de serpiente o-hígado de serpiente, o bien de otros animales y
plantas según el origen de la enfermedad, que contenía opio.
Conel afán desmesuradode extraer los principios curativos de
las sustancias naturales, particularmente de aquellas que pro­
ducían el daño, las serpientes venenosas tuvieron que padecer
másde 20 siglos, desecaciones, pulverizaciones, incineraciones,
maceraciones en vinagre, vino y aceite, e infusiones, todas e­
llas muchopeores que la condena Divina... Fueron consumidas
erudas, cocidas, en elixires, en jarabes y píldoras, aplicadas
en forma de pomadas y unguentos, como emplastos y cataplasmas
(Phisalix, 1940). Detentoras de la Vida y de la muerte, pose­
ían propiedades milagrosas a los ojos de los hombres del 1500,
1600, e incluso del 1700.
El estudio de los venenos no despertó realmente interés hasta
el siglo XVIII. No es sorprendente, pues antes de la aparición
de las ciencias experimentales vinculadas a la composición de
la materia no había una distinción clara entre sustancia y prg
ceso, entre elemento y acción. Se habló de principio vital o
de flogisto. Los conceptós sobre la composición de la materia
no estaban definidos. Van Helmont asimilaba los venenos de ser
pientes ("Orthus Medicinae", 1648) a "espiritus irritados" que
"eran tan frios que coagulaban la sangre en las venas y deteni­
an la circulación" y a pesar de que Redi en 1664 escribia lo
que puede considerarse el primer trabajo metódico sobre venenos,
demostrando que el veneno era solamente efectivo cuando se in­
yectaba bajo la piel e inefectivo por via oral, Charas, segui­
dor de Van Helmont (1685),sostenia que las picaduras de serpien
tes eran peligrosas sólo cuando el animal estaba irritado. Pos
teriormente, con la observación de que la secreción de los col—;
millos de serpientes vivas o muertas era igualmente peligrosa,
Redi echaba por tierra las teorias flogisticas. Fontana (1767)
prosiguió estos estudios, tnató sistemáticamente problemas de
toxicologia y fue precursor en el estudio experimental del veng
no de las serpientes.
Durante algunos años no se registraron novedades en el tema, pg
ro la actitud de vincular fenómenos, de repetir experimentos y
de elaborar controles se multiplicó, comoen todas las discipli
nas de las ciencias. Hacia fines del siglo XVIII la quimica se
habia transformado en una ciencia experimental ywse habian sen­
tado las bases de la "quimica de las sustancias transformadas
por los seres vivientes", la bioquímica (Goethoy,1787)
En el siglo XIXla fisiología tomó cuerpo bajo la influencia de
Bernard y la medicina dejó atrás las rígidas estructuras impues
tas por Galeno. Las escalas de comparación de las que se dis­
puso y la definición de nuevos parámetros, permitió determinar
1a composición y la acción de venenos enteros o de fracciones.
.Deallí en adelante la investigación de estas secreciones ora­
les altamente especializadas progresó constantemente a la par
de las nuevas técnicas de investigación.
Unode los primeros fenómenos detectados, consecuencia de la
acción tóxica de los venenos ofídicos, fue la interferencia
con el proceso de coagulación (Goeffroy y Hunault, 1737; Fontg
na, 1787). Se intentó clasificar los venenos conocidos hasta
ese momentode acuerdo con sus propiedades coagulantes o anti­
coagulantes, pero la superficialidad de las observaciones sólo
llevó a profundas discrepancias entre los investigadores.
Physalix (1899) demostró actividad coagulante a dosis altas y
anticoagulante a dosis bajas en venenos de vipéridos. Martin
(1893) habia obtenido idénticos resultados con venenos de elá­
pidos de Australia, sin embargo, los venenos de crotálidos y
de la cobra de la India presentaron, en general, propiedades
anticoagulantes (Mitchell, 1860; Cunningham, 1895; Stephens
Myers, 1898; Rogers, 1904).
Noc (1904ïtsuponía que los venenos de acción coagulante con­
tienen factores que contribuyen a la formación de la trombina,
o que la trombina está presente en los venenos. Arthus (1912)
y Stawska (1910) observaron que los venenos de crotálidos ac­
tuaban como trombina y el veneno de vipérido llamado de Russell
acehnabala transformación de la protrombina en trombina.
Los venenos de muchos ofidios contienen enzimas que participan
en forma especifica en las tres reacciones primordiales que
provocan la coagulación: (1) la formación de autoprotrombina
C (Factor xa), (2) la formación de trombina, y (3) la forma­
ción de fibrona. Las fracciones purificadas han servido para
-dilucidar distintos pasos en el proceso-de coagulación y son
actualmente utilizadas comoreactivos en el análisis de protrom
bina, de autotrombina III, para la determinación de fibrinógeno,
para estudios moleculares de los mecanismos de coagulación y en
terapéutica(Seegers y Ouyang, 1979).
Hacia mediados del siglo XIX , Luis Bonaparte, sobrino de Napo­
león, naturalista y agudoobservador, fue el primero en asimi­
lar a fermentos digestivos un extracto de veneno de Viperaberus
en alcohol. Lo llamó'viperina"(Bonaparte, 1843).
La"crotalina',' semejante a la pepsinay a-laptialina fue extraída
por Mitchell (1860-1868), luego se aislaron la"nainahdel veneno
de cobra (Veaud Grand-Marais, 1867) y la"equidnasa¿de vipéridos
de acción semejante a la diastasa (Physalix, 1897). Se observó
la fuerte actividad proteolItica del veneno de crotálidos (No­
guchi, 1902; Noc, 1904) por oposición a la ligera proteólisis
que provocaban los venenos de elápidos. 'Se demostró la activi­
dad"lecitinasa"de los venenos de cobra y cascabel.
La naturaleza protéica de los componentes de veneno fue propues
ta por Pelder en 1878 y verificada por Reichert en 1883.
Por lo menos 26 enzimas diferentes han sido detectadas en veng
nos de serpientes hasta hoy. La mayoria son hidrolasas (ver
Tabla I).Doce familias de enzimas se encuentran en todos los vg
nenos, el resto se encuentra solamente en algunos grupos taxong
micos o en especies particulares. Las enzimas del mismotipo
distribuidas entre especies muyalejadas, comolas fosfolipasas
de cobras y de crotálidos, son antigénicamente distintas. Las
acetilcolinisterasas son caracteristicas de los venenosde elá­
pidos (Zeller, 1948), las endopeptidasas, arginina ester hidrg
lasas, las enzimas"thrombinlike? quininogenasa, y procoagulan­
tes están distribuidas predominantementeentre los vipéridos y
Tabla I : Enzimas identificadas en Zos venenos de ofidios E
Enzimasencontradas en todos los venenos estudiados:
Eosfolipasa A2 (3.1.1.4)
L-aminoácido oxidasa (1.4.3.2)
Fosfodiesterasa (3.1.4.1)
5'-nucleotidasa (3.1.3.5)
Deorxiribonucleasa (3.1.4.6)
Ribonucleasa (2.7.7.16)
Adenosinatrifosfatasa (3.6.1.8)
Hialuronidasa (4.2.99.1)
NAD-nucleosidasa (3.2.2.5)
Arilamidasa
Peptidasa
Ehzimascaracterísticas de venenosde crotálidos y vipéridos:
Ehdopeptidasa
Arginina este: hidrolasa(3.4.4.21)
Enzimatipo traïbina (thratbinelike)
Activadora del Factor x
Activadora de protmrbina
Ehzimasencontradas principalmente en venenos de elápidos:
Aoetilconesterasa (3.1.1.7)
Fosfolipasa B (3.1.1.5)
Glioerofosfatasa
Ehzimasencontradas al algunos venenos:
Glutánüco-pirúvico transaminasa (2.6.1.2)
Catalasa (1.1.1.1.6)
Amilasa (3.2.1.1)
B-Gluoosaminidasa
lactato deshidrogenasa (1.1.1.27)
Enzimatipo heparinasa
9- De S.Iwanaga y T.Suzuki (1979) Snake Venoms. Handbook of mcp.Pham.52.
crotálidos y no han sido aún detectadas en los venenos de elá­
pidos (Deutsch y Diniz,1955). La variabilidad cuantitativa y
cualitativa de las enzimas de venenos en función de la édad del
ofidio o de su nutrición (Jimenez Porras,l964;Bonilla y col.,1973)
muestra qué dificultades se presentan en estudios interespecifi
cos del contenido enzimático de los venenos, por 10 que tOdOa:
nálisis de este tipo seria inútil por si solo.
Las diferencias enzimáticas son responsables de una parte del
espectro de acción biológica de los venenos. Estos contienen o­
tras sustancias biológicamente activas entre neurotoxinas, fac­
tores de crecimiento, lIticos, hemorrágicos y de acción autofag
macológica. En 1884, De Lacerda observó el efecto hemolitico
del veneno de Lachesis sobre una suspensión de glóbulos rojos.
No fue el único veneno que poseía esta propiedad, y el fenómeno
perturbó a los investigadores durante poco menos de un siglo.
En primer lugar, el efecto hemolítico era insuficiente para ser
considerado letal (Rogers,1904; Lamby Hunter,1904; Cunningham,
1908; Condrea y col.,1969), y en segundo lugar, no se podia di­
lucidar el mecanismode acción hemolítica porque no se conocia
la estructura de la membranacelular. A partir de los años 60,
el avance en el conocimiento de la composición y función de las
membranasbiológicas, en particular la del glóbulo rojo, permi­
tió comprender la acción de los factores hemolfticos de los ve­
nenos. Inmediatamente, esos factores sirvieron a su vez como
herramientas, comopor ejemplo, para localizar fosfolïpidos en
las membranas(Zwaal y col.,1973; Singer,1974). Las fosfolipa­
sas A2 hemoliticas indirectas están presentes en venenos de vi­
péridos y crotálidos, los factores liticos directos en elápidos,
vipéridos y crotálidos,pero existen además otros factores en el'veng
no de cobra que son responsables de la activación especifica
del sistema del complementoque también lleva a la lisis celu
lar. El estudio de esta interacción surgió paralelamente con
el descubrimiento de las propiedades antisépticas de los sue­
ros. La historia de la dilucidación del complementoestá es­
trechamente ligada a los venenos de serpiente, ya que el fac­
tor de veneno de cobra CVF, fue una herramienta importante en
la disección del sistema. Las primeras observaciones que pro
porcionaron la clave de la existencia de mecanismoslatentes
en el suero para la destrucción celular datan de la segunda
mitad del siglo pasado (Mitchell, 1860; Stephens y Myers,1898;
Stephens, 1900).
El veneno de cobra, aunque posee propiedades hemolItiCas defi
nidas, es letal por su acción neurotóxica. La neurotoxicidad
de los venenos fue estudiada en el siglo XIXcon el surgimien
to de las ciencias fisiológicas. La acción paralizante de mu
chos venenos era semejante a la del curare, descripta por Ber
nard (1850). Se observó la parálisis de los miembrosy el
paro respiratorio en animales inyectados con venenos de e15
pidos, y se demostró que el efecto era periférico, a nivel de
las terminales motoras, y prácticamente irreversible (Bruntos
y Freyer, 1874; Ragotzi, 1890). Sin embargo no se descartó u
na posible acción central. No se han descripto neurotoxinas
que actúen atravesando la "barrera" hematoencefálica. Sin em
bargo se purificaron dos categorias de neurotoxinas periféri­
cas: de acción posináptica o a-toxinas y de acción presinápti
ca o fl-toxinas. La a-bungarotoxina (a-BGT) (Changeaux,1970),
una de las a-toxinas más conocidas, interactúa tan especifica
mente con los receptores de acetilcolina, que su ligadura a g
10
na proteína es suficiente para clasificar a esta última entre
los receptores nicotinicos (Changeauxy ool..1970)151descubri­
miento de las neurotoxinas posinápticas significó un avance
considerable en la investigación de la estructura y función
del receptor nicotínico que, independientemente, hubiera sido
más lenta. La a-BGTy/o la a-toxina de cobra han sido utili­
zadas para dosar receptores nicotinicos in-vitro y para puri
ficar receptores por medio de columnas de afinidad. Han per­
mitido estudiar cambios conformacionales y cinética de inter­
acción receptor-neurotransmisor, síntesis y metabolismodelos
receptores in vivo, evaluar el peso molecular del receptor y
han contribuido al entendimiento del rol de los receptores en
enfermedades tales comola miastenia gravis.
Conpocas excepciones, los venenos no han podido clasificarse
como"neurotóxicos", "paralizantes", "de shock", "hemorragi­
cos" o "hemotóxicos" debido a la multiplicidad de efectos prg
ducidos por sus variados componentes (Boquet, 1979). Aún la
supuesta predominancia de uno de estos efectos depende de va­
rios factores tales comola dosis, la vía de inoculación, y
la especie inoculada (Vidal, 1976). Sin embargo, los venenos
de las Elapidae, cobras, mambas,bungaros, y de las Hydrophi­
939, serpientes de mar, son fuertemente neurotóxicas, provo­
cando la muerte por parálisis respiratoria. Por otro lado,
los venenos de Viperidae y Crotolidae, comolas serpientes de
cascabel norteamericanas y las yararás sudamericanas (Gén.
Bothrops) son conocidos comoproductores de shock, hemorragias
locales y sistémicas, y necrosis, que llevan a la destrucción
extensiva de téiidos. Los crotálidos producen el veneno más
complejo entre los ofidios (tabla II) constituido por un mayor
Tabla II : Componentesdialisables y no dialisables de los ve­
nenos de elápidos, vipéridosy crotálidosg (Mebs,
196 9) .
mg de Veneno mg no dialisable %dialisado
El idos:
Naja naja 100 65 35
Naja naja atra 80 20 75
Naja nigmlcollis 100 61 39
Naja haje 40 15 62
Naja nivea 100 60 40
Hemachatus haemachatus 50 22 56
Ophiophagus hannah 100 55 45
Deondroaspis angusticeps 70 29 59
Bungarus fasciatus 100 66 34
Pvendechis coZZettii 100 62 38
Vi idos:
Vipera russeZZii 100 87 13
Bitis gabonica 40 38 5
Crotálidos:
CrotaZus atroz 100 90 10
Crotalus durissus termificus 100 87 13
Bothrops jararaca 100 83 17
E Los venenos disueltos en agua destilada (100 n‘gen 5 ml) fueron dialisadas en
oelofán contra 10 veces su volumen de agua a 4°C. Se realizaron 2 cambios a
las 24 y 48 horas. Luegoel residuo de dialisis y el dialisado fueron liofi­
lizados separadamente y se evaluó sus contenidos en proteína.
12
númerode proteínas distintas, de mayor peso molecular y un
espectro de acción farmacológica y bioquímica más amplio. La
mayorparte de estas proteinas está provista de actividad en­
zimática, predominantementeproteolitica y lipásica.
No conviene perder de vista la finalidad del veneno de los o­
fidios en la Naturaleza. Aunque muchos componentes han sido
de muchautilidad para la investigación fundamental, para la
serpiente la función del veneno es procurar alimento, inmovi­
lizando a la presa rápidamente y, probablemente, colaborando
en la digestión. La muerte de la presa resulta del efecto si
nérgico de todos los componentes, que muchas veces actúan po­
tenciándose. La efectividad de los venenos es consecuencia
de su complejidad pues contienen más de una substancia para
alterar rápidamente procesos vitales tales comola transmisión
nerviosa y neuromuscular, la actividad cardíaca, la circula­
ción sanguínea, y la permeabilidad y estructura de las membrg
nas. Las proteinas enzimáticas y no enzimáticas son comunes
a todos los venenos y se encuentran en mayor proporción, acom
pañados de péptidos, aminas, áéidos nucléidos, pigmentos, li­
pidos, carbohidratos y sales inorgánicas de iones metálicos
que muchas veces son cofactores. Las proteinas son los compg
nentes más importantes funcionalmente, por lo que no es sor­
prendente que constituyan la mayor parte del veneno.
Lineo definió el orden de las serpientes en 1758. Se trataba
de un conjunto heterogéneo en el cabian lagartijas, basilis­
cos e iguanas (Wagler, 1830). Dumeril y Bibron (1854) clasi­
ficaron las serpientes de acuerdo con la característica más
conspicua para el hombre: el aparato bucal de inoculación y la
13
presencia o ausencia de glándulas productoras de veneno. Las
serpientes conocidas comovenenosas pertenecen principalmente
a cuatro familias: hidrófidos, elápidos, vipéridos y crotáli­
dos (Klemmer,1963; Ohsaka,1979). Muchas veces la distinción
entre serpientes inocuas y venenosas es equivocada, porque se
entiende que la diferencia depende de la presencia o de la au­
sencia de glándulas productoras de veneno. Por el contrario,
esta clasificación depende exclusivamente de la habilidad de
cada clase para inyectar el veneno (Fonseca,1949). Varias es­
pecies de culebras, consideradas no venenosas, producen un ve­
neno que puede extraerse, pero cuyo estudio careció de interés
por la preponderancia que han ejercido los venenos que son ef;
cazmente inyectados y que, por lo tanto, son de suma importan­
cia para el hombre. Se le ha acordado status taxonómico a la
clasificación de las serpientes de acuerdo a su aparato bucal.
Asi es como, según el aparato bucal, las serpientes llamadas
venenosaspuedenclasificarse en Proteroglifas y Solenoglifas,
cuyos colmillos están situados anteriormente en el premaxilar
superior. En los proteroglifos (Fam.hidrófidos y elápidos),
los colmillos fijos son fuertemente acanalados y bastante más
grandes que el resto de la dentadura (Fig.l). El veneno de
las glándulas es inoculado por medio de esos canales. Las so­
lenoglifas (Fam.Crotálidos y Vipéridos) tienen colmillos tubu
lares, generalmente con fusión completa de la canaleta y no
presentan dientes fijos en los maxilares. Los maxilares son
móviles, de tal manera que los colmillos que normalmente repo­
san replegados sobre el paladar, pueden ser erectos por la a­
pertura de la boca que provoca una rotación en bisagra de la
articulación del hueso lacrimal con la maxila. Cuandolos col
V
®
AGUFAh
OPBTOGLWA
Fig.l Esquemageneralizado de 1a trans­
formación evolutiva
de los ofidíos, con
cular en el aparato
sombreada: posición
de veneno.
de la dentición
atención partí­
ínoculador. Zona
de las glándulas
15
millos han penetrado la presa son llevados violentamente hacia
atrás por Contracción muscular y se introducenmás'profundamente.
Este movimiento puede acompañarse por la inyección de veneno.
El proceso completo dura un tercio de segundo y puede decirse
que la inoculación se produce por "picadura" en el sentido es­
tricto.
Las serpientes llamadas no venenosas son las aglifas (Fam. Co­
lubridae y Boidae) que carecen de colmillos inoculadores, y
las opistoglifas (Fam. Colubridae) cuyos colmillos acanalados
están ubicados en posición posterior. En los elápidos, hidró­
fidos y colúbridos, los colmillos más cortos y fijos hacen que
la serpiente deba permanecer en contacto con la presa durante
más tiempo.
Existen otras caracteristicas de importancia en la clasifica­
ción de las serpientes, comoforma y peculiaridades de los he­
mipenes, número y forma de las escamas, color y forma de la ca
beza y los ojos, órganos térmicos como, por ejemplo, los órga­
nos sensibles al calor, característicos de los crotálidos y
boideos, que le permiten "visualizar" el espacio en términos
de diferencias de temperatura (Gallardo,1977; Newmany Hart­
line:1982). Sin embargono se ha llegado aún a una clasificación
universalmente aceptada.
La cascabel sudamericanaCrotalus durissus terrificus pertene­
ce a la familia de los crotálidos o subfamilia de los crotáli­
dos según distintos autores (Gallardo,1977) que agrupan a los
crotálidos entre los vipéridos. Está representada por cinco
géneros ampliamente distribuidos en América del Norte, Central
y Sur, y por dos géneros en Europa y ASia. La cascabel es so­
.1enoglifa. El veneno que produce difiere del de todos los crg
tálidos conocidos por ser fundamentalmente neurotóxico, porque no
provoca necrosis en el sitio de picadura y por no observarse hemg
rragias generalizadas en los animales inoculados.
El envenenamiento por mordedura de la cascabel sudamericana provg
ca esencialmente parálisis fláccida y lleva a la muerte por deteg
ción de los movimientos respiratorios (Houssay y Pavé,l922). Se­
gún la distribución geográfica de esta especie, se pueden o no ob
servar espasmosy convulsiones asociadas al efecto paralizante
del veneno. Los Crotalus distribuidos en el territorio argentino
y en algunas regiones de Brasil producen un veneno que provoca es
pasmos musculares y convulsiones tónicas que desembocanen la hi­
potonïa musculary la parálisis respiratoria (Barrio y Vital Bra­
zi1,l949; Vital Brazil y col.,1966).. El componenteneurotóxico
potente ha sido llamado crotoxina (Slotta y Fraenkel-Conrat,1938)
y se ha demostrado repetidamente que produce los efectos tóxicos
más conspicuos del veneno entero (Vital Brazil,1966; Chang,1979;
Breithaupt,1976). La crotoxina constituye un 65%del peso seco
del veneno, seguida por 1a crotamina, que representa el 30 %y
es responsable de los espasmos y convulsiones (Moussatché y col.,
1956; Cheymol,1971) que preceden la acción paralizante de la org
toxina. Su ausencia en algunos crótalos explica las di­
ferencias que se observan en el síndrome de envenamiento
(Barrio y Vital Brazil, 1949). La toxicidad de 1a crotoxi
na depende de la especie siendo en orden de efectividad
más tóxica para el pollo que para el ratón y que para
la rata (Habermany Breithaupt, 1978). Para el hombre, las do­
sis efectivas son semejantes a las que provocan el síndrome ca­
racterístico en el ratón (Vidal y col.,comunicación personal).Enaves,la crotoxina es diez veces-vés potente que la toxina botulínica, y en ma
17
míferos parece revertir la acción de esta última, compitiendo
por los sitios de ligadura (Chang, 1979)aunque posee un quin­
to de la potencia tóxica de la toxina botulínica.
La crotoxina fue aislada por primera vez por Slotta y Fraenkel­
Conrat en 1938 por precipitación isoeléctrica a pH 4.7-4.8 y
y fue cristalizada en acetato de piridina a pH 4.4. Esta frag
ción del venenopresentaba actividad fosfolipasa(singer y
Fraenkel-Conrat, 1950). Estudios de ultracentrifugación (Gra­
len y Svedberg; 1938) y electroforesis libre de Tiselius (Li
y Fraenkel-Conrat, 1942) habian indicado que se trataba de una
proteina homogénea. La crotoxina fue considerada durante tres
décadas comouna proteína pura y figuró en textos de enzimolo­
gía comouna de las primeras enzimas cristalizadas. Esta enzi
ma fue calificada de neurotóxica (DL50 i.v. 0,1 ug/g) y res­
ponsable de la letalidad del veneno (DL500,2 pg/g). Hasta la
década del 50, los principales grupos de investigación intenta
ron generalizar el mecanismode acción de los venenos, atribu­
yendo los efectos tóxicos a la actividad fosfolipasa A2, ya
que se la medía en prácticamente todos los venenos neurotóxi­
cos y fracciones hemorrágicas. Habermann y Newmann(1955) en­
tre tanto, lograron separar dos componentesde la crotoxina
por electroforesis en papel, utilizando crotoxina purificada
por cristalización. Unode los componentesestaba provisto de
actividad enzimática mayorque la de la substancia inicial,y el
otro componente, desprovisto de actividad enzimática que llama
ron crotactina era altamente.tóxico (DL500,04 ug/g). Singer
y Fraenkel-Conrat (1958) obtuvieron dos dinitrofenil péptidos
que se diferenciaban Por SU solubilidad Y comPOSi’
ción en aminoácidos. Paralelamente, las fracciones neurotóxi­
18
cas de los venenos de diferentes especies de gala fueron puri­
ficadas y se encontraron neurotoxinas carentes de actividad en
zimática, lo que hizo bascular las teorias de relación activi­
dad enzimática-toxicidad a tal punto que a fines de los años
50 se descartaba la participación de la PA2en la toxicidad de
los venenos. Másrecientemente, el análisis de las fracciones
neurotóxicas mejor purificadas y de homogeneidadcomprobada,
ha demostradoque no es posible realizar una clasificación tan
radical puesto que hay tanto PA2tóxicas y atóxicas, comopro­
teinas no enzimáticas tóxicas y atóxicas.
La crotoxina fue finalmente resuelta aados componentesmayores,
de\condicione's drásticas de pHy fuerza iónica (Rubsameny 001,1970;
Hendony Fraenkel-Conrat, 1971): una fosfolipasa A2 básica, tg
xica"per se? llamada crotoxina B por ser el componentebásico
del complejo, y una proteina ácida, no enzimática, llamada crg
toxina A por ser el componente ácido. La crotoxina B y la crg
toxina A forman espontáneamente un complejo no covalente fuer­
temente unido, a pHneutro, aún a partir de soluciones dilui­
das (Canziani y col., 1982) que presenta propiedades idénticas
a las de la crotoxina nativa. Rübsamen(1971) encontró que en
el complejo reformado, la proteina ácida inhibe la actividad
enzimática de la fosfolipasa A2 y potencia, al mismotiempo,
su toxicidad diez a quince veces, por lo que llamó a la prote­
ína crotapotin.
19
Antecedentes y objetivos de esta Tesis de Doctorado.
Estado previo a nuestros estudios sobre el mecanismodel com­
plejo crotoxina.
Luegodel aislamiento de la crotoxina por Slotta y Fraenkel­
Conrat (1938), el conocimiento avanzó notablemente al obtener
se la separación de subunidades, demostrándose que se trata
de entidades químicas estructural y funcionalmentedistintas:
la fosfolipasa A2básica (crotoxina B) y la crotoxina A, áci
da y carente de actividad enzimática y de toxicidad. Asi pu
do demostrarse que (a) el agente farmacológico crucial del
complejo es la crotoxina B , ya que es capaz de reproducir tg
dos los efectos farmacodinámicos del complejo, si bien se re­
quieren dosis muyelevadas y (b) la actividad enzimática es g
sencial para la toxicidad (Rübsameny col, 1971: Hendon y
Frankel-Conrat, 1971). El segundo avance importante fue la
observación de que,.a partir de las subunidades A y B sepa­
radas se formaba espontáneamente un complejo en el que se reg
tauraban sus propiedades fisicoquimicas y enzimáticas, así c9
mola elevada toxicidad del complejo crotoxina nativo (Brei­
thaupt y col, 1974).
El tercero consistió en la demostración de su modode acción
a nivel de la unión neuromuscular, lo que permitió clasificar
la comouna fosfolipasa que actúa esencialmente a nivel pre­
sináptico (Vital Brazi1.y col.,1966,1973; Breithaupt,1976;Chang
yLee,l977; Hawgood.y5mith11977).
Sin embargo quedaban demasiadas preguntas sin respuesta, es­
20
pecialmente, la paradoja de que toda la acción enzimática y
tóxica residiera en la subunidad B, a pesar de Lo cual la
crotoxina A es necesaria para la expresión completa de la
toxicidad. Las evidencias farmacológicas acumuladas hasta
la actualidad no han permitido aVanzar en eltconocimiento
del mecanismode acción de la crotoxina más allá de los efeg
tos netos que produce. Esto es el resultado de aplicar un
sistema,en el que los parámetros son múltiples, interconec­
tados y, en consecuencia incontrolables todos a la vez CO­
moresulta ser la transmisión nerviosa,donde intervienenzla
naturaleza de la membranapresináptica, el mecanismode libg
ración de acetilcolina, con todas sus etapas dependientes del
balance iónico Na+ - K+ y del movimiento de Ca2+ , las re­
servas de acetilcolina, su movilización. Conese tipo de
metodologiaes imposible construir hipótesis plausibles so­
bre preguntas claves tales comosi el complejo crotoxina de
be disociarse para ejercer su efecto y si la crotoxina A es
sólo un transportador de la subunidad activa o un verdade­
ro potenciador en el sitio de acción.
Dosobservaciones bioquímicas contradictorias permitieron
generar una explicación plausible del? mecanismode acción
de la crotoxina. (a) Jeng, Hendon y Fraenkel - Conrat (1978)
empleandoeritrocitos y crotoxina doblemente marcada obser­
varon que sólo se ligaba la subunidad B. Además, empleando
un inhibidor dirigido a sitio activo de las fosfolipasas A2
demostraron que la subunidad B no se inactiva cuando se en­
cuentra en el complejo crotoxina, por lo que concluyeron que
el sitio activo de la fosfolipasa está “ocluído en el complg
21
jo (Jeng y Fraenkel-Conrat, 1978), (b) Hendon y Tu (1979) de­
mostraron que el complejo crotoxina unido en forma covalente
por un reactivo bifuncional era carente de toxicidadsn bien
presentaba una actividad fosfolipasa idéntica a la del complg
jo crotoxina nativo.
Sobre esas bases se generó el concepto de "acompañante" (Cha­
peron), según el cual la crotoxina A es un transportador far­
macocinético de la fosfolipasa A2básica, que actúa impidien­
do la ligadura de la enzima (y su ulterior inactivación) a si
tios de baja afinidad, mediante la oclusión del sitio activo
de la enzima. Los sitios de acción biológica, presumiblemente
receptores a nivel de la membranapresináptica (Habermanny
Breithaupt,1976; Mebs,l980; Changy col.,1980) poseerïan una
afinidad por la crotoxina B aún mayor de la que posee la crotg
xina A. De manera que el complejo crotoxina actuaria como un
depósito circulante de crotoxina B debido a que la afinidad de
la subunidad A por la enzima es mayor que la de los "sitios i­
nespecificos" y menorque la del"receptor". La validez de las
pruebas que apoyan el modelo vigente es objetable:
(a) La suposición de que'la crotoxina A impide la interacción
de la crotoxina B con sitios inespecIficos mediante
la oclusión del sitio activo sugiere que tal sitio no
seria accesible para una interfase "inespecifica" como
la de las lipoproteinas de yema de huevo. Esto está
en contradicción con las evidencias experimentales que
demuestran que el complejo crotoxina exhibe una actividad
fosfolipásica de 50% de la que presenta la fosfoli­pasa A2 básica pura. Más aún, si las subunidades A y
(b)
(C)
22
B se unen covalentemente, la actividad del complejo re­
sultante es igual a 1a que presenta el complejo nativo
(Hendon y Tu, 1979) y no menor, como podría esperarse
si la subunidadA ocluyera el sitio activo de la crotoxi
na B.
La supuesta oclhsión del sitio activo de la fosfolipasa
por la subunidad A se basa en a observación de due un ig
hibidor dirigido al sitio activo de las fosfolipasas A2
(el bromuro de p-bromofenacilo) inactiva la crotrxina B
pura, mientras que no se observa inactivación si la enzi­
ma se encuentra en forma de complejo con crotoxina A.
Sin embargo, no se han realizado estudios sobre la reacti
vidad del sitio activo de la enzima en el complejo croto­
xina empleandoel sustrato, que es el mejor reactivo para
estudiar las propiedades del sitio activo de una enzima.
En algunas preparaciones la actividad de crotoxina B pu­
ra decae con el tiempo, lo que no sucede con el complejo
crotoxina. Se ha sugerido (Chang y Su, 1978, 1981) que
en ausencia de CAla crotoxina B aislada podria "degradar
se" e inactivarse perdiendo sus propiedades tóxicas y en­
zimáticas, tanto en solución fisiológica comoen presencia
de tejido muscular.
De manera que la potenciación de la toxicidad de CBen el
complejo crotoxina se deberia a estabilización de su con­
formación activa por la formación del complejo con croto­
es sorprendente teniendoxina A . Esta interpretación
(d)
23
en cuenta la inusual resistencia de la crotoxina B (así
comode otras fosfolipasas A2) frente a tratamientos f;
sicos drásticos (pH, temperatura) o agentes desnaturali
zantes (Breithaupt, 1976a). La aparente inactivación bien
puede resultar de las dificultades en la manipulación. En
efecto, la crotoxina B (no el complejo crotoxina) se ad”
sorbe fuertemente al material de vidrio (Habermanny Brei
thaupt, 1978) y a la. matriz de los geles usados comunmen
te para cromatografía (Rübsamenny 001.1971).
La necesidad de postular la existencia de "sitios de al­
ta afinidad" o "receptores" en la membranapresináptica
1980, Chang y col.(Habermanny Breithaupt, 1978; Mebs,
1980) que compitan con la crotoxina A es una complica­
ción adicional que oscurece el panorama en lugar de aclg
rarlo. Se desconocenlos detalles estructurales a nivel
molecular de la membrana presinápticaJ en la ¡que po­
drían existir áreas con una arquitectura molecular tal
que las propiedades fisicoquimicas la hicieran efectiva
para ligar la crotoxina B con mayor afinidad que otras.
Sin embargo, tales receptores no han sido caracterizados
o aislados y difícilmente se podria emplear ese argumen
to para explicar el efecto miotóxico (post sináptico) que
se observa solamente cuando se aplican concentraciones al
tas de complejo crotoxina a preparación neuromuscular:
aislada (Breithaupt,1976b; Hawgoody Smith,1977).
24
Carácter de nuestra contribución al problema.
Ante este estado de cosas se procedió al aislamiento y purifi
cación hasta homogeneidad de las subunidades A y B del complg
jo crotoxina asi comola caracterización de sus propiedades
desde el punto de vista enzimático y tóxico. A continuación
se ensayó la reformación del complejo crotoxina a partir de
subunidades A y B aisladas y se compararon las propiedades del
complejo reconstruido con las del complejo crotoxina nativo.
La disponibilidad de preparaciones purificadas de crotoxina A
B y complejo crotoxina reconstituïdohizo posible revisar las
consideraciones básicas en que se apmülel modelo propuesto.
(1) En primer lugar se expkxóla accesibilidad y eficiencia
funcional del sitio activo de la fosfolipasa A2en el complg
jo crotoxina en comparación con las propiedades que presenta
en la crotoxina B aislada empleando soluciones monoméricas
de lecitinas de cadena corta obtenidas por síntesis química.
Se demostró que el sitio activo de la fosfolipasa A2 Aen. el
complejo crotoxina es libremente accesible y cataliticamente
eficiente. La falta de reactividad de la enzima en el complg
jo con el reactivo bromuro de p-bromofenacilo debe renfinrpq;
tarse en términos de los requerimientos específicos del reag
tivo más que comoresultado de la oclusión del sitio activo.
(2) Si el sitio activo de la crotoxina B en el complejo cro­
toxina es libremente accesible al sustrato (monomérico) y oa
talíticamente funcional, la inhibición de la actividad fosfg
lipásica de la crotoxina B, propiedad caracteristica de la
25
crotoxina A, se observa únicamente cuando el sustrato se en­
cuentra agregado, pero no con sustrato monomérico. Las ev;
dencias experimentales obtenidas sugieren que la crotoxina B
presenta un "sitio" funcional y topográficamente distinto del
sitio activo responsable del "anclado" de la enzima a interfg
ses fosfolïpidos-agua. La interacción de este "sitio" con in
terfases es aparentemente un prerrequisito para la "activa
ción interfacial" de la enzima. La inhibición de la activi­
dad fosfolipásica de la crotoxina B por crotoxina A se debe­
ria a que al formarse el complejo crotoxina, la subunidad A
bloquea la exposición de este "sitio" de la crotoxina B impi­
diendo así el anclado de la enzima a la interfase y, en consg
cuencia, la activación interfacial de la enzima.
(3) Si bien esta interpretación explica por qué el complejo
crotoxina debe disociarse a nivel de la membranablanco que­
dando la crotoxina B unida a la membrana, queda como incógni­
ta qué condición caracteristica de la membranapresináptica
en la unión neuromuscular es capaz de promover la disociación
del complejo. La acetilcolina, que se encuentra permanente­
mente en la proximidad de la membrana presináptica es un
agente disociante efectivo a las concentraciones en que se
encuentra normalmenteen el espacio intersináptico.
El gradiente de concentración de acetilcolina existente en g
se espacio y resultante de los procesos de liberación y re­
captación a nivel de la membranapresináptica y el de hidró­
lisis por la acetilcolinestarasa a nivel de la membranapost­
sináptica (Chang Lee, 1977) así comoel efecto miotóxico ob­
26
servado cuando se aplica crotoxina a preparaciones neuromuscu­
lares aisladas en concentraciones altas (Breithaupt,1976; Haw­
good y Smith,1977) apoyan el rol de la acetilcolina en la deter
minación del blanco de la crotoxina.
Sobre estas bases experimentales se propone un módelo minimopa
ra la acción del complejo crotoxina, que si bien puede no ser
la única explicación plausible, tiene la ventaja de estar fun­
damentado sólo en datos experimentales demostrados.
Al respecto, es pertinente considerar que la validez de un mode
lo, comorepresentación simplificada que explique el comporta­
miento del sistema real, depende del número de parámetros que
el modelo requiere. Cuanto mayor sea el número de entidades
incluidas en el modelo, mayor será el número de parámetros re­
queridos. Si la evidencia experimental disponible a partir del
sistema real es limitada, confusa o contradictoria, un modelo
con un número grande de parámetros tiene poco valor, ya que el
ajuste de los parámetros a los datos experimentales es un procg
so extremadamente ambiguo. Este es un punto crucial en el dise
ño de modelos físicos para sistemas biológicos, no siempre teni
do en cuenta.
CAPITULO I
"La ¿cience deó pnojetó conóióte
a pneuen¿n Le¿ diáfiicufitéó de ¿'execution".
La Rochefioucauid
Réáiex¿onó, ¿entenceó
et maximeb monaieó
l) Veneno:
2
V
MATERIALES Y METODOS
Generalidades
El veneno fue extraído de especimenes sanos de
Crótalus durissus terrificgg mantenidosen cautiverio en
nuestro laboratorio.en cajas individuales - a 28°C-.
Los ofidios son alimentados con un ratón (25-28 g) por se­
mana. En estas condiciones se obtienen sobrevidas en cau­
Las extracciones de veneno setiverio mayores de 2 años.
efectúan cada 20 dias. El veneno, colectado en placas de
Petri mantenidas sobre hielo se centrífuga a 16000 g duran
te 20 min.a 4°C y el sobrenadante, cuidadosamente separado,
se liofilizay se mantiene en recipientes herméticos a
-60°C.
Materiales de fraccionamiento: Los tamices moleculares
Sephadex G-lOO Sephadex G-75 (S.F.); Sephadex G-25 (fine
grade) de Pharmacia Ltd.,Uppsa1a, Suecia, se prepararon de
acuerdo cdn las indicaciones de los fabricantes. Los in­
tercambiadores de iones DEAE-Sephadex A-SO y CM-Sephadex
C-50 (Pharmacia) se lavaron de acuerdo con la técnica des­
crita por Himmelhochy Peterson (1966).
Para la separación y purificación de fosfolípidos se emplg
aron óxido de aluminio (E.Merck, Darmstadt) y ácido silici
co (Mallinckrodt). El análisis de fosfolípidos se efectuó
P0r cromatografía en la capa delgada sobre placas de Silica
Gel (TLC-LKSV-Whatman). Los cromatogramas se desarrolla­
ron con cloroformo-metanol-agua (65:35:4, en volumen) y
3)
28
las manchas se revelaron con vapores de 12,0 bien por car­
bonización (30 min a 150°C) luego de haber sido tratadas
con un aerosol conteniendo formaldehído-SO4H2(3:97 en volu
men).
Otros reactivos y.métodos analíticos: Todos los reactivos
empleados fueron de calidad analítica. La albúmina de sue
ro bovino (BSA), el bromuro de p-bromofenacilo (pBPB), el
ácido iodoacético (cristalizado de una solución de etanol
segúnVidal y col.(l972)), la fosforilcolina (sal de cal­
cio) y acetilcolina se obtuvieron en Sigma Chemical Co.
(St. Lewis,Mo.,U.S.A.). El suero antiorotálico (Serie INM,
1976) fue proporcionado por el Instituto Nacional de Micro
biología "Dr. Carlos G. Malbrán". Los marcadores de peso
molecular empleados para calibrar las columnas de Sephadex
y en electroforesis en gel de poliacrilamida se obtuvieron
de MannResearch Laboratories (Richmond,Ca.,U.S.A.).
'Debido a la propiedad de la fosfolipasa A2 básica de que­
dar fuertemente absorbida al material de vidrio, las frac­
ciones se colectaron en tubos plásticos (Polystor) en to­
das las etapas de purificación. La concentración de protg
Inas en las fracciones eluidas se siguió espectrofotométri
camente a 280 nm. Las fracciones correspondientes a cada
pico se combinaron y se evaluó su contenido en proteína
por el método de Lowryy col.(l951) para el cálculo del
rendimiento del método. Luego se concentraron por filtra­
ción bajo nitrógeno en una celda Amicon(AmiconCo., Bloom­
ington, Ma.,U.S.A.) de 60 ml provista de membranaDiaflo
4)
'ron determinados según el método de Chen y col.
29
UM-OSó UM-lO. Sin embargo, por la razón mencionada más
arriba las fracciones conteniendo fosfolipasa A2básica
debieron ser concentradas en CM-Sephadexequilibrada con
0.1M, formiato de amonio a pH 3.5 (baja fuerza iónica) pg
ra la retención de toda la proteina que fue luego eluida
en bloque por un fuerte incremento de la fuerza iónica
(3Mformiato de amonio a pH 3.5). El pico de fosfolipasa
A2basica concentrada de esta manera fue dializado en ce­
lofán (Fisher Scientific Co.,Pittsburg, Pa.,U.S.A.) cut­
off PM12.000 La diálisis en celofán es el método
que permite la mayorrecuperación de fosfolipasa básica.
La desalinización en columna de Sephadex G-25 es inapro­
piada para la fosfolipasa.básica, pero fue el métodouti­
lizado para desalinizar otras fracciones. Cuandofue ne­
cesario evaluar el contenido en proteinas de soluciones
muydiluidas se utilizó el método de Esen (1978) que em­
plea el azul de Coomass.eR-250 (pro análisis) como colg
rante específico.
Los contenidos de P de las soluciones de fosfolípido fue­
(1956) m9
dificado por Rouser y Fleischer (1954) con una sensibili­
dad hasta el décimo de microgramo de fósforo.
LIEidos: La fosfatidilcolina de yema de huevo se preparó
por cromatografía en óxido de aluminio y ácido silicico,
de acuerdo con el procedimiento de Ansell y Hawthorne
(1964). Su composición en ácidos grasos fue determinada
por cromatografía gas-líquido de los ésteres metílicos.
30
Las lecitinas 1,2-dihexanoil-[PC(6:0)]; 1,2-diheptanoil­
[PC(7:0)]; 1,2-dioctanoil-[PC(8:O)] y 1,2-dimiristoil-[PC
(1420)]—sn-glicero-3-fosforilcolina se prepararon por sín­
tesis química por el método de Cubero Robles y Van den Bergh
(1969) o se adquirieron en Avanti Polar Lipids Inc., Birmig­
ham,U.S.A. Las 2,3-diheptanoil[D-PC(7:0)] y 2,3-didecanoil
[D-PC(10:0)]-sn-glicero-l-fosforilcolina fueron enviadas
por el Prof,Dr. G.A. De Haas (Universidad-del Estado, Utrecht,
Holanda); la pureza de las muestras fue ensayada por cromatg
grafía de capa delgada. La miristoil lisolecitina (l-mirig
toil-sn-glicero-3-fosforilcolina) fue preparadapor hidróli­
sis enzimática de PC(14:0) usando fosfolipasa A2_purificada
de veneno de Bothrops neuwiedii, de acuerdo con el método
descrito por Vidal y Stoppani (1971). El ácido graso libre
y la miristoil lisolecitina se separaron por cromatografía
en ácido silicico (Vidal y col.,1978).
La concentración micelar crítica de cada una de las lecitinas
de cadena corta fue evaluada por el corrimiento de la máxima
absorbancia de la Rhodamina 6G (British Drug Houses Ltd.,
England) ocasionado por su incorporación en la interfase de
las micelas que se forman al incrementar la concentración de
fosfolípido (Bonseny col.,1972) Fig.I-1. Los valores obte­
nidos fueron: 10 mmpara PC(6:0), 1,6 mmpara PC(7:0) y 0,19
mmpara PC (8:0). La c.m.c. de PC(14:0) es de 6 x 10-7 M
(Vidal y col.,1978) y la de las micelas mixtas de D-PC(10:0)
y liso PC(14:0) de 7 x 10-5 M.
31
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Fig.I-1: Determinaciónde la concentración micelar crítica (c.m.c.) de
PC (7:0) por espectrofotometría diferencial. El cambiode pen
diente observado en el gráfico (0-0) por incremento en la con­
centración de licitina es indicación de la formación de agrega
dos debido al corrimiento en la absorbancia máximade la Rhodg
mina 6Gal incorporarse a micelas (inserto).
Log [PC(7:0)] en función de la absorbancia permite obtener dos
rectas (A——-A)que extrapoladas se interceptan en el punto co­
rrespondiente al valor de la c.m.c. en las abscisas. 0,2 mg/ml
Rhodamina 6G.
Las muestras de dihexanoil [PC(6:0)], diheptanoil [PC(7:0)]
dioctanoil [PC(8:0)]lecitinas y miristoil lisolecitina se
conservaron en etanol absoluto a -20°C.
Las muestras de D-didecanoillecitina [D-PC(10:0)] Y dimi­
ristoil lecitina [PC(14:0)] se conservaron en C14Ca -20°C
y la de lecitina de yema de huevo en hexano a -20°C.
Las suspensiones acuosas de las lecitinas de cadena corta
PC(6:0), D ó L-PC(7:0) y PC(8:0) se prepararon a partir de
muestras en medio orgánico que se desecaron bajo nitrógeno
y se suspendieron en un volumen apropiado de agua para ob­
32
tener una concentración final de 15-20 veces la concentra­
ción micelar crítica correspondiente.
Se obtuvieron soluciones micelares claras con PC(6:0) y PC
(7:0) a temperatura ambiente, mientras que la solución a­
cuosa de PC(8:0) fue necesario mantenerla a 40°C para evi­
tar la separación en dos fases.
Las micelas mixtas de D-PC(10:0)y miristoil lisolecitina
(relación molar 1:1) fueron preparadas mezclando los fos­
folípidos disueltos,a concentraciones apropiadas, en sol­
ventes orgánicos que fueron luego evaporados. E1 residuo
secofue resuspendido en agua a una concentración de apro­
ximadamente 50 veces la c.m.c. La solución micelar clara
se mantuvo a 25°C. Las vesículas unilaminares de PC(14:0)
fueron preparadas por dispersión de fosfolípido seco en
0,15 MNaCl con ayuda de un vortex (concentracion final
3.0 mm), y sonicación de la suspensión en hielo con un de­
sintegrador ultrasónico MSE(Measuring and Scientific E­
quipment, Ltd.,London) a 20 KHz. Luego de 20 minutos de
sonicación en hielo la temperatura fue elevada a 25°C has­
ta finalizar el tratamiento (tiempo total: aproximadamen­
te 40 minutos o hasta clarificación de la solución cuando
aparece el efecto óptico de Tyndall). Las vesículas así
obtenidasfueron incubadas durante 60 minutos a 42°C para
su anillado (Lawaczecky col.,1976%. Las vesículas uni­
laminares fueron separadas de las multilaminares por cen­
trifugación según el método de Barenholz y col(1977) o por
cromatografía en Sepharosa 4B (Ver figura I-Zh.
33
A\3OO
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0,5 — 1’
0.6’ 034 '­
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g: 0,3 — 7
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7/ ao ¡oo 120 MO [Pi] ug/ ml '
Fig.I-2: Separación de vesículas unilaminares. A.Cromatografía en Sepng
rosa 4B-CL (110 x 2,3 cm) equilibrada con ClNa 0,15 M, Tris-HCl
25 mMpH 7,4. Flujo 2 m1.Cm_.hr'l. B.Corre1acíón entre Abs300
y contenido de P lipídico considerando únicamente tubos que es­
tán sobre la recta (zona grisada de A).
Identificación de Zas fracciones
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida: La separación
electroforética de las distintas fracciones se llenó a cg
bo sobre la base del método descrito por Laemmli (1970)
con acrilamida 15%como gel de corrida y 3% en el gel de
concentración, conteniendo 0.1%(P/V) de dodecilsulfato de
sodio en amortiguador de Tris-ClH 0.125 M, pH 6.8. Las
muestras (5-20 mgde proteina) se corrieron durante 2-3
horas con una corriente aplicada de 3 mA/gel. Los geles
2
V
3)
34
se lavaron y fijaron durante 48 horas en ácido tricloroacg
tico 10% (P/V), luego en ácido acético 7% (V/V) y finalmen
te en una mezcla de isopropanol-ácido acético-agua (2,5:
1,0:6,5 en vol.) y el exceso de dodecilsulfato de sodio
fue eliminado de los geles por iontoforesis (30 mAdurante
3 hs., Fairbanks y col.,1971). Finalmente fueron teñidos
con Amido-Schwartzy decolorados por iontoforesis.
Innmunoelectroforesis: Se llevó a cabo sobre portaobjetos
con una base de agar 0.5%(P/V) cubiertos con una capa con­
teniendo 1,5 g de agar en 100 ml de amortiguados de ácido
dietilbarbitúrico-dietilbarbiturato de sodio pH8.6, con
una fuerza iónica de 0.05. Las muestras (2-4 Pg de prote­
ïna) se corrieron durante 90 min. con una corriente aplica
da de 5 mA/portaobjeto. Se separó el gel de la cavidad
central, que fue cargada con suero anticrotálico, y se per
mitió la difusión de los componentes durante 48 horas. Los
portaobjetos se lavaron con solución ClNa 0.15 My agua bi
destilada durante 72 horas.
Finalmente, los portaobjetos fueron secados a 37°C, teñidos
con solución de Amido-Schwartz y decolorados en solución
de metanol-ácido acético-agua (4,5:1,0:4,5 V/V).
Determinación de peso molecular: El peso molecular de las
fracciones purificadas se determinó por dos procedimientos,
a saber:
(a) Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS), tal comose ha descrito
(b)
35
más arriba, de acuerdo con el método de Laemmli (1970).
Se determinó la mobilidad de cada banda y se comparó
la mobilidad de las fracciones con los marcadores de
peso molecular conocido (Ver figura I-3)
Cromatografía en tamices moleculares (Sephadex G-lOO):
El gel previamente hidratado se empaquetó en una colum
na de 100 x 1.2 cm adaptada para flujo ascendente. La
columna se equilibró con la solución amortiguadora a­
propiada a 4°C. Las muestras se sembraron a través de
una jeringa (250Au) provista de una llave de tres VI­
La elución se llevó a cabo a una velocidad de flu
-1
as.
jo de 1,2 ml.cm-2.h ajustada mediante una bomba pe­
ristáltica Gilson MinipulsZ (Francia) y se colectaron
fracciones de 0,5 ml en un colector LKB2070 Ultrorac
II (Suecia). El volumen de la fracción excluida (V0)
se determinó como el volumen de elución de Blue-Dedzan
2000 que fue medido en el eluido espectrofotométrica­
mente a 620 mm. Los volúmenes de elución de los dis­
tintos marcadores (Ve) fueron determinados de acuerdo
con el procedimiento de Andrews (1964,1965) y se deter
minaron los valores de Kav “Kav = Ve - Vo)/(Ve - Vo)]
para cada marcador. Los valores de Kav se representa­
ron gráficamente en función del log. del p.m. y se ob­
tuvo una recta, cuyos parámetros coinciden con los des
critos previamente por Determann(1969).(Fig.I-3).
36
)
Ve-Vo Vt-Vo PP NU Il ////& N
kav(
I
I l I I
4p m2 m4 k6 «e ao 12
Log. peso molecular
Fig.I-3: Determinación de pesos moleculares por filtración en .gel de S_g
phadex (G-100). Los marcadores utilizados son: (1) Sero albú­
mina bovina, dímero; (2) sero albúmina bovina, monómero; (3) 2
voalbümina; (4) quinotripsirógeno A; (5) Complejo crotoxina; '
(6) mioglobina; (7) citocromo c. ­
4) Fluorescencia intrínseca: La fluorescencia intrínseca de
la crotoxina y de sus componentes fue medida luego de ex­
citar las muestras con una longitud de onda inCidente de
290 nm.y registrando su espectro de emisión entre 300 y
600 nmcon un espectrofluorometro automático Aminco Bow­
man (American Instrument Co.) a 20°C. Los espectros de
emisión fueron registrados en un Tohshin Electron (Japón)
sincronizado con el espectrofluorómetro.
5) Determinación de la toxicidad: La toxicidad de las frac­
37
ciones purificadas fue comprobadaen ratón por vía intrapg
ritoneal. El cálculo de la DL (dosis letal media o do­50
sis a la que el 50%de la población es sensible) es un'mé­
todo aproximativo que permite comparar valores numéricos,
y hablar de potencia tóxica de una sustancia, comopor e­
jemplo de la crotoxina o de sus componentes. Sin embargo
la DL50es independiente del tiempo de sobrevida de la po­
blación. El método de Litchfield y Wilcoxon (1949) permi­
tió determinar rápidamente las dosis medias efectivas con
limites de confianza (P = 0.05) dados por el test de X2,
utilizando métodos gráficos simples. El número de dosis
empleadas fue cinco (a intervalos de 10 unidades en el ran
go de toxicidad del veneno entero de Crotalus durissus te­
rrificus) y se inyectó a 6 ratones por dosis.
Actividad biológica de Zas fracciones
Preparaciones neuromusculares: Los preparados de nervio
frénico-diafragma de ratón fueron aislados comodescripto
por Bulbring (1949) y montados en una cámara de acrilico
(Fig.I-4A). El material de la cámara fue elegido en razón
de la fuerte absorción de la fosfolipasa A2 al vidrio. El
diafragma fue sumergido en una solución Ringer-Krebs de
composición: (mM)NaCl 118, KCl 4,8, NaHCO325, CaC122,5,
glucosa 11,2; a temperatura ambiente, ventilada con 95%
02-5% C02.
El pH de la solución fue de 7.4. El nervio frénico, sepa
38
A. han“. al d-lnlo "un unen-a.- nocul-lo
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Fig.I-4A: Cámarade incubación para preparados de ciático-sartorio de ba­
trac1o .
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Fig.I-4B: Cámarade incubación para preparados de frénico-diafragma de
ratón.
2
V
39
rado del diafragma por un film de vaselina, fue montado en
un compartimento húmedoen contacto-con electrodos de est;
mulo y de registro como se muestra en la figura 4 A. De
la mismaforma, los preparados de “ciático-sartorio de sa­
po fueron montados en una cámara construida especialmente
(Fig.4 B) y el músculo fue sumergido en una solución Rin­
ger para batracios de composición (mM):NaCl 112, KCl 3.2,
CaCl 2.0, Tris 0,2, de pH 7.2 a 25°C y con2.7, Na HPO2 2 4
ventilación de 95%02-5% C02. La contracción del músculo
fue provocada por estimulo directo o indirecto con pulsos
rectangulares supramaximales de 0,5 a 2,0 volt y 20-30
msec de duración (indirecto) o de 10-30 V durante 0,1 msec
(directo). Se registró la tensión isométrica del músculo
por medio de un transductor fuerza-desplazamiento Grass
modelo FT03C acoplado a un poligrafo SAN-EI (Japón) Surgi
cal Monitor Type 5508. Se controló el estado del nervio
y del músculo registrando sus respectivos potenciales de
acción con un sistema de amplificación conectado a un os­
ciloscopio Beckman.
El sistema experimental descrito permitió comparar el e­
fectoneurotóxico de la crotoxina y de sus componentes pu
rificados al de drogas de acción semejante comoel curare
'y la galamina.
Preparados para microscopía óptica y electrónica: El e­
fecto neurotóxico de las fracciones fue estudiado en el
tejido blanco. Se eligio el diafragma de ratón por su fé
cil disección y localización de los botones presinápticos.
40
La zona rica en terminales nerviosas fue localizada por me­
dio de 1a coloración específica de Karnovsky (1964) que po­
ne en evidencia la acetilcolioresterasa del espacio sinápti
co. El tejido ligeramente*fijado en formaldehído 2%en a­
mortiguador fosfato, pH 7.6, fue incubado en presencia de
un sustrato de la acetilcolinesterasa, la acetilcolina cuyo
producto de hidrólisis es coloreado en presencia de sulfato
de cobre y ferricianuro de potasio a pH 6.0. La distribu­
ción de botones presinápticos aparece claramente en la figu
ra I-5.Los diafragmas incubados en ausencia del sustrato de
acetilcolinesterasa no resultaron coloreados.
Se procesó la región de botones terminales para microscopía
electrónica de la siguiente forma: se fijó el tejido por in
mersión en glutaraldehido 1%en amortiguador Millonig a pH
7.4 durante 60 minutos, los fragmentos fueron postfijados
en Oso4 1%en Millonig , luego deshidratados en una bateria
de alcoholes, coloreados"in toto"con acetato de uranilo 2.5
%y embebidos en Epon 812. Fueron cortados para el micros­
copio electrónico en un ultramicrótomo LKB(Suecia) y monta
dos en grillas cubiertas con Parlodion (Fischer). Los cor­
tes ultrafinos con color de interferencia plateado a blanco
fueron contrastado con acetato de uranilo 1%y citrato de
plomo (Reynolds, 1963) y observados en un microscopio Jeol
JEM100C transmision electron microscope.
Tres grupos de 9 ratones fueron inyectados por via intrape­
ritoneal con 10 veces las DL50de crotoxina inativa, croto­
xina B y crotoxina reconstituída respectivamente, y fueron
sacrificados a distintos tiempos luego de aparecer los pri­
* Entiéndase no más de dos horas.
41
meros sintomas de bloqueo respiratorio (taquipnea, disnea­
y apnea). ‘Enalgunos especimenes se realizó la disección
luego de 1a muerte por asfixia.
Fig.I-5: Distribución de botones presinápticos en diafragma de ratón .
puestos en evidencia con el método de Karnovskypara la acetil
colinesterasa localizada en el espacio sináptico.
\
P Actividad Enzimática.de las fracciones
1) Actividad proteolítica: Fue medidautilizando caseína co­
mo sustrato según el método de Kunitz (1947) modificado
por Wagnery Prescott (1966).
2) Actividad-fosfodiesterasa: Fue medida por el método de Sul
kowskiy col.(1963) utilizando bis-(p-nitrofenil fosfato)2
V
V
42
comosustrato.
Actividad tamesterasa: Fue determinada por eh método es­
pectrofotométrico descrito por Hummel(1959) y demostrado
por Seki y col.(1980).
Actividad fosfolipasa A: La crotoxina presenta actividad
fosfolipasa A2 y el componenteresponsable de la neurotoxi
cidad de la crotoxina es una fosfolipasa A2, de modoque
esta actividad enzimática fue determinada utilizando dis­
tintos métodoscon el propósito de caracterizar a la crotg
xina y comparar la acción biológica con sus propiedades en
zimáticas.
a) Métodotitrimétrico: Descripto por Vidal y col.(1977),
este método fue utilizado para las medidas de rutina de
actividad fosfolipasa A2. Consiste en la titulación de
ácidos grasos liberados de una emulsión de yema de huevo
(25 i pmol P.m1'1 , ClNa 0,2 M; C12Ca 5,0 mM; volumen fi­
nal: 9 ml) equilibrada a 10°C en un autotitulador Radio­
meter TTT2 equipado con una autobureta ABU12 como dis­
pensador de OHNa0,1 N. El pH de la mezcla se ajusta a
8,0 y se registra el consumode álcali requerido para man
tener el pH durante 5 minutos. A tiempo cero se adiciona
la solución de enzima en ClNa 0,15 My se registra el con
sumo de álcali para mantener el pH en 8,0 durante 3 min.
Una unidad de actividad se define comoel consumo (libera
ción) de 1 quuiv. de álcali (acido graso) por min. en
las condiciones experimentales mencionadas. La actividad
especifica se calcula comonúmero de unidades por mg de
proteína.
b) Métodoturbidimétrico:
C
V
43
(Marinetti, 1965) Se preparó el
medio de reacción de 0,5 a 0,8 ml de una suspensión de
yema de huevo (0.32 i 0,03 umol p. ml’l) en 0,15 M ClNa
ajustada a pH 6.8 y equilibrada a 30°C en una cubeta de
espectrqfotómetro. ‘Se agregó 200 ul de muestra de acti
vidad desconocida. El cambio de absorbancia (925 nm)
de la mezcla se comparó con el de un control (al cual
se le agregó 200 ul de solución 0,15 MClNa) que fue a­
justado a una absorbancia (925 nm) de 0,600 en un espeg
trofotómetro Gilford 250. Unaunidad de actividad está
definida comola cantidad de enzima que produce una dig
minución de 0¡001 unidades de absorbancia por minuto.
Método semicuantitativo de la coagulación de 1a yema
de huevo: (Habermann y Neuman, 1954) A 2 m1 de una sus­
pensión de yema de huevo al 45% (V/V) (95 i 3 umol P.
ml-l) en 0,2 ClNa, 20 mMc1 c1, 1 mMEDTA y 5 mMamorti2
guador Tris-HCl, pH 8.0 a 37°C se agregó 200 ul de mueg
tra de actividad desconocida en 0,15 MClNa. Se incubó
la muestra a 37°C con agitación durante 30,60 o 90 ming
tos. Se midió el tiempo de coagulación de la yema de
huevo de las muestras llevadas a 100°C en un baño María
en ebullición. Unaunidad de actividad está definida
como la cantidad de enzima que aumenta en 1 minuto el
tiempo de coagulación del control. Los controles mues­
tran invariablemente un tiempo de coagulación de 90 Í
10 seg.
d) Análisis cualitativo y cuantitativo de los productos de
e)
44
reacción: Cuandola actividad fosfolipasa A2 debió ser
medida en medios fuertemente amortiguados se Signió el
CUISOde la hidrólisis en forma discontinua con alicuo­
tas de 1 ml de reacción (10 mMClZCa, 50 mMamortigua­
dor, a 30°C) conteniendo 40 ul de la muestra de activi­
dad desconocida en 0,15 MClNa. A distintos tiempos se
detuvo la reacción con 0,1 ml de EDTA0,3 M y se suspen
dió la alícuota en 10 ml de etanol absoluto. Las mues­
tras fueron evaporadas en un evaporador Buchi (Suiza)
termostatizado, suspendidas en benceno, secadas bajo ni
trógeno y retomadas en 200 ul de etanol absoluto. Ali­
cuotas de 20 a 50 ul de esta suspensión fueron sembra­
das en capa delgada de silica gel y resueltas en cloro­
formo-metanol-agua (65:35:4 V/V). Las manchas de leci­
tina y lisclecitina fueron reveladas y los Rx compara­
dos con patrones cromatografiados simultáneamente. Se
raspó cada mancha y se midió su contenido en fósforo.
Se determinó la hidrólisis relativa de lecitina en cada
tiempo. Los controles de composición similar fueron in
cubados en ausencia de enzima o en presencia de 30 mM
EDTAagregada en el tiempo cero. Los resultados negati
vos de amboscontroles permitieron (1) descartar la hi­
drólisis espontánea del sustrato y (2) la actividad en­
zimática posterior a la activación de la fpsfolipasa A2
por el gel de separación de los productos de hidrólisis
(ver Goerke y col.,1971).
Método espectrofotométrico: El uso del sustrato monomg
rico (ver Apéndice A) genera problemas en la titulación
45
de productos de hidrólisis por la sensibilidad inadecua
da del métodotitrimétrico que restringe la reproducibi
lidad de resultados debido a las bajas concentraciones
de sustrato utilizadas. Por otro lado la alta absor­
ción de la fosfolipasa A2básica a las superficies de
vidrio del electrodo y del recipiente de incubación, y
su posible activación en las interfases del vidrio y de
las burbujas de aire producidas durante la agitación,
reducen aún más la seguridad de una buena determinación.
Por esta razón se utilizó el métodoespectrofotométrico
de medida continua de los productos de hidrólisis des­
cripto por Wells (1972) que tiene la ventaja de reducir
las superficies inertes y no requiere agitación.
La muestra de la cubeta de cuarzo de 1 ml fue preparada
me2clando la enzima y CaCl2 a concentraciones apropia­
das y el indicador Azul de Bromotimol 0.5 mMenOHNa20
mM,el pH se ajustó a 8.0 con hidróxido de sodio 20 mM.
El blanco fue preparado con los mismos elementos salvo
el cofactor Ca++. Las medidas fueron registradas de un
espectrofotómetro Gilson 250 a 475 nm (absorbencia mini
ma de la forma básica del indicador). Después de lle­
var el registrador a cero absorbencia se agregó rápida­
mente elsustrato a las dos cubetas. Se mezcló bien y
se conectó el registrador a una velocidad de l cm/lO seg.
Un cambio de absorbencia de 0.01/10 seg. corresponde a
0.05 equiv. de ácido graso liberado por minuto. La ve­
locidad de hidrólisis es lineal Con la concentración de la
enzima y no se observan cambios de absorbancia en ausen
f
V
46
cia de la enzima o en presencia de sustratos no hidro­
lizables (lecitinas de la serie D).
Método de la titulación de hidroxamatos: De Browny
Bowles (1966) modificado por Augustyn y Elliott (1969)
fue puesto a punto para evaluar 1a cinética de nidróli
sis de sustrato monoméricoren:función del pH (verCinéti
cas.fie hidrólisis,Cap.V.y VII).Los métodostitrimétrico
y espectrbfotométrico no admiten variaciones de pH, pero
el método de titulación de hidroxamatos permitió eva­
luar la hidrólisis de sustratos homogéneosentre pH 4.0
y 10.0 comose describe a continuación:
A una alícuota de 280 ul de la mezcla de reacción —1
(fosfolípido, enzima y C12Ca)se agregó, a distintos
tiempos, 400 ul de etanol absoluto y 200 pl de solu­
ción I preparada en el día mezclando l volúmen de 3.5
N NaOHy 1 volúmen de solución de 20 g de clorhidrato
Se dejó incu­de hidroxilamina en 220 ml de metanol.
bar la mezcla durante 30 min., por lo menos, a tempe­
ratura ambiente, para que la reacción fuera completa
(formación de los hidroxamatos). Luego, se acidificó
la preparación con 120 ul de 3.3 N HCl y se agregó
100 ul de solución II que contiene 1 volúmen de solu­
ción de 100 g de cloruro férico (FeIIICl3) en 100 ml
de HCl 1.2 N y 9 volúmenes de etanol absoluto, lo que
resultó en la coloración de las alícuotas, de volúmen
final 1.1 ml, y cuya absorbencia fue determinada a
525 nm. Una curva standard de absorbencia en función
de la concentración mMde fosfolipido proporcionó el
47
coeficiente de extinción nME = 0.32 .
La concentración de hidroxamatos formados en la reac­
ción con clorhidrato de hidroxilamina básico es el re­
flejo de la actividad hidrolítica de la fosfolipasa A2:
fosfolipasa A2fosfatidilcolina —————————————a.lisofosfatidilcolina
+ ácido graso
2 acil hidroxamatos 1 acil hidroxamato
+ _ +glicerüfosforfl colina gliceerosforfl.colina
Cuandola hidrólisis de fosfoleido en el medio de re­
acción es completa la concentración de hidroxamatos fo;
mados es 50%de 1a concentración inicial de hidroxama­
tOS .
48
Inhibición de la actividad fosfolipasa A2
Se utilizaron inhibidores enzimáticos tales comoagentes
reductores y alquilantes (ver Capitulo II). Se observó que
el sitio activo de la enzimaes especificamente sensible a
bromocetonas apolares comoel bromuro de P;bromofenacilo,
mientras que .10 es .menoa por bromoacetonas polares como
"¿1 ácido iodoacético. El bromuro de p-bromofenacilo modifi
ca de manerairreversible un residuo histidina del sitio ag
tivo de las fosfolipasas A2 (Volwerky col., 1974). De acuer
do con el protocolo experimental utilizado se incubó la enzi
ma en presencia del inhibidor a una concentración ligeramen­
te superior a la de su solubilidad en medio acuoso que es de
10’4 M, y en relación molar enzima a .inhibidor de 1:65. En
dichas condiciones la concentración del reactivo disuelto se
mantiene constante y la reacción obedece una cinética de pri
mer orden. La constante de velocidad de inactivación de
pseudo primer orden (k') fue calculada a partir de gráficos
semilog de acuerdo con la relación:
[CB]
2,303 log o
t [CBt]
(1)
donde [CEO] es la actividad enzimática inicial y [CBt] es
la actividad residual luego de t minutos. Cuando [CBt]=
1/2 [CBC], t = tl/2 (es decir, el tiempo medio de inactié
vación) y la ecuación (1) se reduce a k' =[2,303/tl/2]logz=
= 0.693/t1/2 .
49
Se obtuvieron idénticas velocidades de inactivación a con
centraciones de pBPB entre 5 y 500 veces la concentración
molar de enzima, lo que confirma que la velocidad de inactiva
ción de las fosfolipasas A2 depende solamente de la concentra
ción de inhibidor disuelto.
Conel objeto de determinar las velocidades de inactiva­
ción de la fosfolipasa A2 básica y del complejo crotoxina en
distintas condiciones (por ejemplo, presencia o ausencia de
sustrato y cofactor) y en función de pH se empleó amortigug
dor Tris-maleato 0.1M, pH 5,0-7,5, ClNa 0.1M. Experimentos
control demostraron que no hay efecto de pH sobre la solubili
dad de pBPB. Las velocidades de inactivación fueron determi
nadas evaluando la actividad enzimática residual de aliomfiïs
prelevadas a distintos intervalos de tiempo. La reacción
de inactivación fue detenida, en todos los puntos, por la adi
ción de formiato de amonio pH 3,0, ClNa 0.1M . En el caso
del complejo crotoxina estas condiciones favorecieron la disg
ciación total del complejo y la evaluación de la actividad
fosfolipasa real. Los experimentos fueron realizados a 3012°C.
Experimentos de ligadura directa
La interacción de la fosfolipasa A2básica pura y en el
complejo con el sustrato fue medida utilizando la técnica de
filtración en gel de aephadex en condiciones de equilibrio
(Hummaly Dreyer, 1962). Se empleó como ligando el análogo
no hidrolizable del sustrato D - diheptanoil hxitfiutD-PC(7:0)
50
en solución monomérica, con el que se equilibró una columna
de Sephadex G-7S (14 x 1,2 cm) amortiguada a pH 8,0 , utili
zando 50 mr1 Tris-HCl. Una muestra conteniendo 10.2 /¿moles
de complejo crotoxina a pH 8.0 fue sembrada en la colum­
na y se determinó el perfil de eiución de la muestra en
relación con la concentración de lipido por evaluación del
contenido de proteina y de P de la fracción.
No se pudo realizar experimentos de ligadura en equili­
brio en presencia de la fosfolipasa A2 básica por su fue;
te tendencia a interactuar con los geles de separación (Brei
thaupt, l976a).
Se emplearon micelas mixtas de D- didecanoillecitina ,
D-PC(10:00) y L-ldniristoil lecitina en relación molar 1:1
para evaluar la interacción del complejo crotoxina y de la en
zima interfases lipido-agua. Muestras de la enzima y del com
plejo crotoxina fueron incubadas con micelas durante 60 minu­
tos y fueron luego cromatografiadas en una columna de Sepha­
dex - G 75 equilibrada a. pH 8.0 ó 10.0.
Las fracciones eluïdas fueron analizadas y se determinó
el contenido de proteina (Esen, 1978) de P lipidico (Rouser
y Fleischer, 1967) y la actividad enzimática de cada una.
CAPITULO II
"Pnactica en iaó caóaó pequeñaó, pon
el aman del cielo, y ¿uego pnocede
a ¿datan Laó gnandeó."
Epictetuó
D¿¿cunóo¿ IV.¿
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PURIFICACION DE LOS COMPONENTES DEL COMPLEJO CROTOXINA
La serpiente de cascabel sudamericana, Crotalus durisus terri­
figgs, produce un veneno fuertemente neurotóxico a diferencia
de otras especies de crotálidos. Su picadura provoca hipoto­
nía muscular y parálisis flácida que podrían hacer pensar en
los efectos de los venenos de elápidos que poseen neurotoxi­
nas postsinápticas que bloquean el receptor de acetilcolina.
El agente neurotóxico del veneno de C.d. terrificus responsg
ble de estos efectos posee actividad fosfolipasa A2. Muchas
de las toxinas más potentes aisladas de los venenos de ofidios
son fosfolipasas A2 o están constituidas por fosfolipasas A2
asociadas a polipéptidos de peso molecular ligeramente menor
o similar. Estas toxinas son generalmente de acción neurotó­
xica, miotóxica y/o citotóxica. La crotoxina es el agente neu
rotóxico de este veneno del cual constituye un 60-65%del peso
seco y es un complejo no covalente formado por dos tipos de
fosfolipasa A (una ácida, pHi 4,7 y una básica, pHi 9,6)(Horst
y col., 1972; Breithaupt y col., 1975) y una proteína ácida
(pHi 3,7) no enzimática (Horst y col., 1972). La fosfolipasa
A2 básica