tesis-n2082-Cortes

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Tesis de Posgrado
Estudio de la variación alozímicaEstudio de la variación alozímica
en el género Larreaen el género Larrea
Cortés, María Cristina
1987
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Biológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico
Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
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Cita tipo APA:
Cortés, María Cristina. (1987). Estudio de la variación alozímica en el género Larrea. Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2082_Cortes.pdf
Cita tipo Chicago:
Cortés, María Cristina. "Estudio de la variación alozímica en el género Larrea". Tesis de Doctor.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1987.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2082_Cortes.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2082_Cortes.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2082_Cortes.pdf
mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
ESTUDIO DE LA VARIACION ALOZIMICA EN EL GENERO LARREA
por
MARIA CRISTINA CORTES
DIRECTOR
Prof.Dr. JUAN HECTOR HUNZIKER
LUGAR DE TRABAJO
Laboratorio de Genética, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias
Exactas y ‘Naturales (UNBA) y Laboratorio de Genética, Unidad Integrada: Estación
Experimental Agropecuaria, INTA, Balcarce - Facultad de Ciencias Agrarias (UNMdP)
TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS
«2082­
gra
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi más profunda gratitud y mi más sincero reconocimieg
to al Profesor Dr. Juan H. Hunziker, Director de esta Tesis, quien me brindó la
oportunidad de realizar este trabajo de investigación a través de su contínua g
rientación, estimulante guia, permanente apoyo moral, valiosas sugerencias y leg
tura crítica del manuscrito, y por el gran caudal de conocimientos, ejemplo de
sabiduría, orden y rigurosidad que me transmitió durante estos años.
Deseo también agradecer profundamente al Profesor Dr. Américo 0. Men­
diburu, quien con toda generosidad me respaldó en momentosdifíciles y me brin­
dó su permanente apoyo, aliento y valiosos consejos, y a la Profesora Dra. Elsa
L. Camadro, porque con su bondad, conocimientos y continuas sugerencias me in­
centivo y apoyó permanentemente y me brindó su amistad.
Asimismoquisiera expresar mi agradecimiento a la Profesora Dra. Bea­
triz O. Saidman, quien con esmerada dedicación me inició en el aprendiZaje de
las técnicas de electroforesis y mebrindó valiosas sugerencias en varias eta­
pas de este trabajo.
Agradezco muyespecialmente a todos los investigadores que realizaron
las colecciones de las muestras de todos los materiales que se utilizaron para
la realización de este estudio.
Tambiénquisiera agradecer a todos aquellos compañeros de trabajo que
de una manera u otra me brindaron su apoyo durante los años de realización de
esta Tesis. En tal sentido deseo expresar mi gratitud a mis compañerosdel Labg
ratorio de Genética (Depto. Ciencias Biológicas) de la Facultad de Ciencias Exag
tas y Naturales (UNBA),así comoa todos los integrantes del Laboratorio de Ge­
nética y del Laboratorio de Calidad de la Unidad Integrada: Facultad de Ciencias
Agrarias (UNMdP)y Estación Experimental Agropecuaria, INTABalcarce, institucig
nes a las cuales debo todo mi agradecimiento por el invalorable apoyo recibido
durante estos años.
Agradezbo además a la Srta. Silvia C. Cífala por su esmerada colabora
ción en el mecanografiado de este trabajo.
Finalmente deseo destacar mi mayor reconocimiento al Consejo Nacional
de Investigaciones Cientificas y Técnicas, por brindarme la posibilidad y los
mediosnecesarios para desarrollar esta investigación a través de las becas
que me otorgara.
Esta trabajo pudo llevarse a cabo además gracias a1 apoyo del Conse­
jo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET),1a Secretaria
de Ciencia y Técnica (SECYT)y la Universidad de Buenos Aires (UNBA),a través
de los subsidios otorgados al Profesor Dr. Juan H. Hunziker, razón por la cual
quisiera expresar mi gratitud a las mencionadasinstituciones.
Mi
Pág.
l. Introducción...................................................... l
1.1. Electroforesisde isoenzimas................................. 5
1.1.1. Ventajas de 1a utiliZación de las isoenzimas en estudios
taxonómicos, de genética de poblaciones y evolutivos ....... 6
1.1.2. Limitaciones y/o desventajas de la utilización de las
isoenzimas en estudios taxonómicos, de genetica de pobla­
cionesy evolutivos........................................ lÜ
1.1.3. Precauciones que deben tomarse en un estudio donde se
empleala electroforesisde isoenzimas..................... ll
1.2.GéneroLarrea................................................ 13
1.3.Objetivosdeltrabajo ........................................ 21
2. Materialesy Métodos.............................................. 22
2.1.Materiales................................................... 22
2.1.1. Coleccióny conservacióndel material ...................... 24
2.1.2. Condicionesdegerminación................................. 25
2.2.Métodos...................................................... 25
2.2.1.Análisiselectroforético................................... 25
2.2.1.1. Elección de los sistemas isoenzimáticos analizados ....... 25
2.2.1.2. Númerode individuosestudiados .......................... 26
2.2.1.3.Estadiosanalizados...................................... 26
2.2.1.4. Condicionesde electroforesis ............................ 27
2.2.1.4.1. Preparaciónde los geles de poliacrilamida ............. 27
A.—Aminopeptidasa, glutamato oxaloacetato transaminasa y
superóxidodismutasa.......................................... 27
8.- Alcoholdehidrogenasay glutamatodehidrogenasa ............... 28
C.- 6-FosFogluconatodehidrogenasa................................ 28
2.2.1.4.2. Preparación de los geles de almidón(Esterasa) ......... 28
2.2.1.4.3.Preparaciónde la muestra.............................. 29
2.2.1.4.4. Siembradel materialen los geles ...................... 30
2.2.1.4.5.Corridaelectroforética................................ 30
2.2.1.4.6. Tamponesutilizados en las cubas electroforéticas ...... 31
A.—Aminopeptidasa, glutamato oxaloacetato transaminasa y
superóxidodismutasa.......................................... 31
Pág.
8.- Alcoholdehidrogenasay glutamatodehidrogenasa ............... 31
C.—6-FosFogluconatodehidrogenasa ........ . . ................ 31
D.- Esterasa .. . . . . ... . . . . . . . . . .... . . . . . ... .. . .. ............ 32
2.2.1.4.7. Reveladoy Fijaciónde los geles ....................... 32
A.—Alcoholdehidrogenasa ............. . . .. . . ..... .. .. .... 32
8.- Aminopeptidasa.................. .. . . ... . . . . . .... .. 32
C.- Esterasa ....................... .. . . .. .. . . .. . . . .. 33
D.—6-FosFogluconatodehidrogenasa ... . . .. ... ..... ......... 34
E.—Glutamatodehidrogenasa ....... .. . ... .. ... . ......... 34
F.—Glutamatooxaloacetato transaminasa . . . . ... ............ . . 35
G.—Superóxidodismutasa ............ ... . .. ....... .......... 35
2.2.1.4.8. Ac0ndicionamientode los geles ......................... 36
2.2.1.5.Análisisdelosgeles........................1........... 36
2.2.1.5.1. Determinaciónde los probables ¿99; y alelos ........... 36
2.2.1.5.2. Medidaspara Luantjficar la variabilidad genética . ... 38
2.2.1.5.3. Númerode clasiFicación y designación de las
isoehzimas . . . . . . . ... ... . . .. .... . . . . . . .... 4D
Resultados .. . . . . ... . . . . . ... ....... . . .. . . . .. . . .. 45
3.1. Glutamato oxaloacetato transaminasa (GDT=AAT)
E.C.2.6.1.1. ................................. ...... .. ... 45
3.1.1. Organosy/o estadios analizados ................¿.. . . . . ..... 453.1.2.SecciónBiFolium 45
3.1.2.1. Determinaciónde los probables ¿EEEy alelos ............. 51
3.1.3.SecciónLarrea............................................. 55
3.1.3.1. Determinaciónde los probables¿22; y alelos ............. 55
3.2. Alcohol dehidrogenasa (ADH)E.C. 1.1.1.1. .... . . . . ...... ... ‘91
3.2.1. Organosy/o estadios analiZados .... . . . . .... . .... ....... 91
3.2.2. SecciónBiFolium............ . .... . .......... .. .. ... 91
3.2.2.1. Determinaciónde los probables ¿EEEy alelos ....... ..... 93
3.2.3.SecciónLarrea............................................. 95
3.2.3.1. Determinaciónde los probables 1221Yalelos ............. 95
3.3. Aminopeptidasa(AMP)E.C.3.4.1.2. . .. .. .. 108
3.3.1. Organos Y/o estadios analizados . . .. . ... . .. . .. 108
3.3.2. SecciónBiFolium ........... . . . . . . ............ . .. . 108
3.3.2.1. Determinaciónde los probableslggi y alelos ............. llD
3.3.3. SecciónLarrea . . . . . ... . ... . . . . . ......... . ...... 113
ii.
3.3.3.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
3.4.
3.4.1. Organosy/o estadios analizados
3.4.2. Sección BiFolium
3.4.2.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
3.4.3.
3.4.3.1. Determinación de los probables ¿92; y alelos
3.5. 6-FosFogluconato dehidrogenasa (6-PGDH)E.C. 1.1.1.43.
3.5.1. Organosy/o estadios analizados
3.5.2. Sección BiFolium
3.5.2.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
3.5.3. Sección Larrea
3.5.3.1. Determinación de los probables ¿29; y alelos
3.6. Glutamato dehidrogenasa (GDH)E.C. 1.4.1.3.
3.6.1. Organos y/o estadios analiZados
3.6.2. Sección BiFolium
3.6.2.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
3.6.3. Sección Larrea
3.6.3.1. Determinaciónde los probables loci y alelos ...
3.7.
3.7.1. Organos y/o estadios analiZados
3.7.2. Sección BiFolium
3.7.2.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
3.7.3. Sección Larrea
3.7.3.1. Determinaciónde los probables loci y alelos
Esterasa (EST) 5.0. 3.1.1.
Sección Larrea
Superóxido dismutasa (SDD)E.C. 1.15.1.1.
3.8. CuantiFicación de la variabilidad genética e identidad
Discusión
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
4.8.
genética media entre especies y sus poblaciones
Glutamato oxaloacetato transaminasa
Alcohol dehidrogenasa
Aminopeptidasa......................
Esterasa
6-FoSfogluconato dehidrogenasa ..
Glutamatodehidrogenasa..............
Superóxido dismutasa
Cuantificación de la variabilidad genética
iii.
Pág.
113
138
138
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144
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158
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160
160
166
166
166
168
171
171
189
189
189
189
190
191
195
204
204
209
211
214
218
22D
221
223
4.8.1. L0
4.8.2. Es
especies y poblaciones
4.8.2.1.
4.8.2.2.
4.8.2.3.
4.8.3. Indices de similitud y distancia genética
ci diagnósticos
timación de la variabilidad genética en las diferentes
Porcentajede122;polimórficos(P) ......................
NÚMeromedio de alelos por ¿2222 y número efectivo de
aleldspor¿2225.........................................
Frecuencia media esperada de heterocigotas por ¿9229
4.8.4. Origen y antigüedad de E. tridentata en Américadel
No
Resumen
Bibliografía
rte OIOIIIOUOI.¡Oil-IIIIIIOUIIOI.IIOOOIIUÜOOIIOCDOIIII'...’
iv.
225
225
228
229
231
236
239
242
FIGURA
LOGJQOIUTDGJ
ll
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
INDICE DE FIGURAS
Pág.
Ubicación de los sitios de colección de las especies
......Ilíltltlo...¡...-IIIIICI...IIOIÍIIOUII'II.
Ubicación de los sitios de colección de las especies
norteamericanas........................................... 43/44
SISTEMA ISOENZIMATICÜ
GOT 58
. .. ... . .... . . . . . .. GÜT ........... ...... . 59
. .. .. .... . GOT .................. . 60
. .. ....... ........ . GÜT .....a.. .... . .... 61
....... . ..... . . . . . . .. GOT ......... . . ..... 62
.... . . .. . ... . .. . .. GOT ..................... 63
... ... .. ... . . . . . . .. ADH ..................... 96
... . . . . ...... ... .... ADH ..................... 97
.. ..... . ... ...... ADH ..................... 98
........................ ADH ......... .. . .. .. 99
100
101
no o 00.0.00... oInI I¡un ¡al o... I. no ¡no
o Io ono-nn o o. nod... a. ¡a o I ¡a II o...
catalana-Icoonaooo-oounv OIOOOOIDOIOOIOUCOJIDI
AMP .... 119
..... ... . ....... . AMP ..................,.. 120
... .. . ... ... ....... EST ..................... 145
..... ... .. ..... . EST ... ................. 147/148
..... .... . . .. ... EST ..................... 149
.... .... .. .. . 6-PGDH ....... .. ......... 162
... .... ... . .. EFPGDH ... .. ..... . ... . 163
... . . . . . . . . . . . . . . . .. GDH . . . . . . .............. 173
........................ GDH . .... . ..... ... 174
.. .. . . .................. GDH . ................. 175
.. .... . . . . . . . . . . . . . .. GDH .. .... . . ..... . 176
. .... . . . . . . . . . . . . . .. GDH . . . . . ... . ... ...... 177
. . . . . . ... . .... . . . . . .. GDH . . . . . . ............ . 178
... ... . . . . . ... . . . . . . .. SUD .. ..... .. . .. 192
TABLA
LDGJQCDU'IDLONH
(.0UDUUNNNNNNNNNNHHHHHHHHHH
DUNl-‘CJLDCDQCDLDDUNHO‘DGJQCDUT‘DUNl-‘D
INDICE DE TABLAS
SISTEMA ISOENZIMATICO
ID o o I o I l l I I I I ¡a
n n o 1 o a I I c.­
al... I o a a I ooo­
I n n I o o n a I n a ol.
o noo-0000.0000
¡II-occ...­
¡o I o o o.
colo. a I I a o o o I I­
III o o o I p a n­
o o ¡o o o u a a lo
o o o n n I n ccoo.
I lo no. o a
o o I a
III. I o u o o I ¡no o
o o o n u o 0-- . o
n o o. o o.
no I c I o ¡noo-ooo
o I han... o
a a o o n n o no... o.
o I o o I o ono-ou a
a ccoo-I... o
o ocn-¡.0
o o u o a o I o c u u o a no
a o a o u Isaac o
no... oont II. o
a o o c c I I n n a I al.
I a a a ¡coelho o
n a a o o u o ¡ono-c-n
o o... o
o o n u o o o I o a o a o su
n o o o o a o y o o o.
no I n s u cc. o o
o. I u I a n ¡no
o I o I I I u o o c a ¡lo
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
GOT
ADH
ADH
ADH
ADH
AOH
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
vii.
67
69
71
73
76
79
BO
82
TABLA
35
36
37
38
39
4D
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
55
56
57
58
59
60
61
Frecuencias alélicas en las diferentes poblaciones de las
especies de la sección BiFolium
Frecuencias alélicas en las poblaciones de L. nitida
(sección Larrea)
AMP
AMP
EST
.. EST
. EST
EST
EST
EST
.. EST
EST
EFPGDH ...
EFPGDH ......
.. GDH
. GDH
GDH
GDH
GDH
GDH
.. GDH
GDH
. GDH
. GDH
SDD
Frecuencia media esperada de heterocigotas por locus (Ñ),
porcentaje de loci polimórficos (P), númeromedio de alelos
por locus y promedio del númeroefectivo de alelos por locus
(Se) en poblaciones de especies de Larrea de la sección
BiFolium ...
Frecuencia media esperada de heterocigotas por locus (Ñ),
porcentaje de loci polimórFicos (P), númeromedio de alelos
por locus y promedio del númeroefectivo de alelos por locus
(He) en poblaciones de E. nítida (sección Larrea)
Viii.
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201
_ÜÏLÉ¡fiíïrïl
l. INTRODUCCION
El proceso de 1a evolución biológica consiste en cambios en las cons
tituciones genéticas de los organismos. Cada individuo experimenta a través de
su vida múltiples cambios en la morfología, Fisiología, comportamiento y otros
aspectos. Estos cambios carecen de permanencia, desaparecen con el individuo.
Noobstante,los cambios que tienen lugar en los materiales hereditarios pue­
den pasar de un individuo a sus descendientes y, por consiguiente son acumula­
tivos a lo largo de las generaciones (Ayala, 1980). Los grandes cambios evolu­
tivos que se producen a lo largo de la historia de 1a vida, así comola nota­
ble diversidad de los organismos vivos, son el resultado de cambios genéticos
acumulados.
El cambio evolutivo se produce en las poblaciones, no en los indivi­
duos. Desde el punto de vista evolutivo, el individuo es efímero; sólo la po­
blación es contínua, la continuidad deriva del mecanismode la herencia bioló­
gica. Los organismos individuales pueden cambiar Fenotípicamente a lo largo de
su vida, pero la constitución genética de una población puede cambiar de una
generación a otra, y así sucede por lo general.
Unade las principales dificultades para el estudio del proceso evo­
lutivo es la cuantificación de la variación genética oculta en las poblaciones
naturales. El desarrollo de métodosque permitieran analizar dicha variación a
nivel de ¿EEEindividuales debió esperar el desarrollo de la biología molecu­
lar.
Beadle y Tatum (1941), trabajando con Neurospora, propusieron la hi­
pótesis de que un gen codificaba una enzima. Actualmente dicha hipótesis está
bien establecida en la Formamodificada de que un cistrón codifica un p01ipép­
tido (Benzer, 1955; 1961). De este modo, se llegó a comprender el concepto más
ampliamente aceptado actualmente de la evolución biológica que propone que és­
ta consistiría en cambiosen la constitución genética de las poblaciones (Bob;
hansky, 1951), la cual, en la mayoria de los organismos está codificada en la
sustancia quimica llamada ácido de50xirribonucleico (ADN)(Avery gt al., 1944).
La prueba directa del ADNcomomaterial genético Fue obtenida por Hershey y
Chase en 1952.
Watson y Crick (1953a; b) propusieron que el ADNexiste como una mo­
lécula doblemente helicoidal constituida por dos cadenas complementarias de pg
linucleótidos. Este modelode la doble hélice aportó una explicación plausible
de las propiedades básicas del material hereditario: replicación binaria y trans
portador de la información genética. En 1958 Crick enunció 1a hipótesis de que
el ADNdetermina la secuencia de aminoácidos de un polipéptido y que dicha se­
cuencia establece la estructura tridimensional de la proteina. De ello se des­
prende que una secuencia lineal de nucleótidos (ADN)detennina una secuencia
específica de aminoácidos. Esto constituye uno de los mayores logros de la ge­
nética molecular: la "elaboración" o descifrado del código genético que esta­
blece la correspondencia entre los 64 tripletes de nucleótidos y los 20 amino­
ácidos (Crick gt al., 1961; Nirenberg y Matthei, 1961). Dadoque las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos serían colineales, un cambio mutacional en una
posición determinada de la secuencia de nucleótidos daría lugar a un cambio en
la correspondiente posición de la secuencia de aminoácidos.
Conocidala naturaleZa del material hereditario, numerosostrabajos,
principalmente los de Benzer (1955; 1959; 1961) Fueron dedicados a comprender
la naturaleZa del gen. Este seria una sección del ADNque contiene la informa­
ción para la síntesis de una proteína específica. La unidad Funcional que con­
tiene la información para la síntesis de un polipéptido correspondería al cis­
trón (Benzer, 1959; 1961).
Unavez determinada la naturaleza del gen y establecida la colineali
dad entre los nucleótidos del ADNy los aminoácidos de los polipéptidos, se i­
dearon métodosde análisis indirectos que permiten analizar la variación gené­
tica en las poblaciones y estimar las divergencias evolutivas entre diferentes
organismos a partir de las homologías entre sus genes.
.La cantidad de variación genética en una población es un parámetro
Fundamentalen los estudios evolutivos, dado que la variación genética determi
na el potencial evolutivo de las'poblaciones. Los polimorfismos genéticos son
Frecuentes en las poblaciones naturales, comose ha demostrado mediante estu­
dios de la variación morfológica, la selección artificial, las modificaciones
de la eficacia biológica y otros métodos (Lewontin, 1979).
Los eStudios de selección artificial y de la variabilidad genética 2
culta que modifica la eficacia biológica indican que la variabilidad génica es
un Fenómenomuydifundido. Si bien resulta muydifícil poder estimar en Forma
directa la variación de los genes individuales dentro de las poblaciones y las
homologíasentre los genes de los distintos organismos, el desarrollo de la ge
nética molecular ha hecho posible obtener una muestra aleatoria del genomay
detectar la variabilidad en lggi individuales. La información genética conteni
da en la secuencia de nucleótidos del ADNde los genes estructurales es tradu­
cida en una secuencia de aminoácidos que constituyen una cadena polipeptídica.
En una primera aproximación puede igualarse la variabilidad enzimática o pro­
teica con la variabilidad génica. Puede obtenerse una muestra aleatoria de pro
teinas respecto a su variabilidad determinada genéticamente; los genes que co­
difican dichas proteinas representan una muestra aleatoria del genoma.Pueden
estudiarse tantos genes con variabilidad comolggi invariables. Los cambios en
la secuencia de aminoácidos de una proteina implican la existencia de variabi­
lidad en el gen que la codifica.
En los últimos años han sido desarrolladas varias técnicas molecula­
res que permiten comparacionesdel material genético en distintas poblaciones.
Evidentemente, dos individuos presentarán mayor homología entre sus genes cuan
to más estrechamente relacionados se encuentren. Utilizando el concepto de co­
linealidad entre los nucleótidos y los aminoácidosde los polipéptidos, se pue
den estudiar las secuencias de estos últimos en distintos individuos de una mig
maespecie para analizar las diferencias nucleotídicas existentes entre ellos.
Este tipo de análisis de secuencias así comolas hibridaciones ig vigía (Hall
y Spiegelman, 1961) e i_n_¿ig (Pardue y Gall, 197o) de ácidos nucleicos (ADN—
ADNy ADN—ARN)extraídos de distintos individuos, técnicas inmunológicas y
de electroforesis de proteínas han permitido realizar importantes estudios en
el campode la genética de poblaciones, 1a evolución y la taxonomía, ya que pue
den utilizarse para cuantificar las homologíasa nivel molecular, tratando de
establecer las diferencias genéticas entre especies.
Con el surgimiento de las técnicas mencionadas se puso de manifiesto
la gran diversidad genética de las poblaciones. En los últimos años se ha acu­
mulado una gran cantidad de información que ha demostrado que entre el 30 y el
80%de todos los los; de los genes estructurales son polimórficos en las pobla
ciones naturales de la mayoría de los organismos, y que un individuo es hetero
cigótico en al menosentre el 5 y el 20%de sus genes estructurales. De este
modoha quedado invalidada la hipótesis clásica de Müller (1950) y Morton gt
al. (1956), según la cual, todos los individuos de una mismaespecie o raza sg
rían homocigotas para la mayoría de sus log; génicos para un alelo de tipo sal
vaje, y además cada uno de dichos individuos seria heterocigota para alelos de
letéreos raros que habrian surgido por mutación en un puñado de loci, del or­
den de un centenar entre decenas de miles de genes (Lewontin, 1979). Dichos a­
lelos raros tenderian a ser eliminados de la población o bien a ser mantenidos
en Frecuencias muybajas merced a la selección normaliZadora.
En directa oposición a la hipótesis de la teoría clásica de la estrug
tura poblacional, la hipótesis de la teoría equilibrada (Wallace, 1958) propo­
ne que los individuos de una especie, resultantes de la reproducción sexual en
poblaciones que presentan Fecundación cruzada, serian heterocigotas con respeE
to a casi todos sus logi, y sólo raramente un ¿2225 sería hOmocigota, excepto
en la descendencia de parientes muypróximos. Partede dicha variabilidad genÉ
tica seria generada por mutación, que produce generalmente mutantes deletéreos
a los que se contrapone la selección natural. Sin embargo, esta visión de la he
terocigosis implica ademásque 1a mayorparte de la variabilidad genética sería
mantenida por diversas Formasde selección equilibradora. Por otra parte, esta
hipótesis presenta serias diFicultades para explicar el hechode que, si los
polimorFismos se mantienen por FuerZas selectivas muyFuertes, una gran propor
ción de los individuos en las poblaciones estaria mal adaptada y constituiría
una carga genética muydiFicil de tolerar.
Para tratar de resolver este problema, varios autores (King y Jukes,
1969; Kimura, 1969; Kimura y Ühta, 1971; Kimura y Ohta, 1974; Nei, 1975; Kimu­
ra, 1979) han propuesto que los cambios mutacionales a nivel molecular y una
gran mayoría de los polimorFismosen las poblaciones naturales serían neutros
desde el punto de vista adaptativo, lo cual implica que su destino en las po­
blaciones biológicas estaría determinado principalmente por el aZar y, en con­
secuencia, las poblaciones podrían acumular cantidades muyimportantes de varia
bilidad genética. Desde el punto de vista de los neutralistas el polimorFismo
y la evolución molecular son dos FenómenosdiFerentes; el polimorFismo es sim­
plemente una Fase de la evolución molecular (Kimura, 1979).
Sin embargo, la idea de la neutralidad es rechaZada por las teorías
que consideran a la selección comoel único proceso que rige la evolución (Olé
sica y equilibrada). Los seleccionistas consideran que la mayorparte de la va
riación genética que se maniFiesta a nivel molecular es adaptativa. Por ello,
la ocurrencia de los polimorFismosproteicos en las poblaciones naturales pue­
de ser explicada por la acción de Fuerzas selectivas que los mantienen en un
equilibrio más o menosestable.
1.1. Electroforesis de isoenzimas
Una secuencia de aminoácidos de una proteína representa, con alto gra
do de precisión, una secuencia de bases nucleotidicas del ADNque la codifica,
reflejando asimismosustituciones o alteraciones que en ella hubieran ocurrido.
Los tipos y las cantidades de proteinas existentes en las células pueden ser va
liosas informaciones sobre la naturaleza de los mecanismosgenéticos que regulan
la expresión génica a nivel molecular.
Para lograr estimar las divergencias evolutivas entre diferentes orga
nismos sería necesario estudiar las homologías de sus genes, ya que es de supo­
ner que dos individuos estarán más estrechamente relacionados cuanto mayor homg
logia exista entre sus lggi. Debidoa la imposibilidad de realizar este tipo de
estudios, se han ideado otros métodos de análisis que, en forma indirecta permi
ten estudiar las divergencias existentes entre poblaciones y/o especies. Dado
que la expresión primaria de un gen es la formación de un polipéptido (Beadle y
Tatum, 1941; Benzer, 1955; 1961), el estudio de las enzimas daría una primera g
proximación al estudio del gen.
De todas las diferentes y variadas técnicas que permiten el análisis
de las proteínas, sean éstas enzimáticas o no, la electroforesis es la másver­
sátil, siendo de rápida y fácil aplicación en estudios que abordan el análisis
de la variación genética presente en los organismos vivos.
Básicamente, la técnica de electroforesis se basa en la migración di­
ferencial de las proteinas en un campoeléctrico, donde la velocidad de despla­
zamiento de las particulas dependede la carga eléctrica neta de su superficie
externa, y de su tamaño y forma.
Unprecursor de esta tecnica ha sido Tiselius (1937), al cual le suce
dieron muchosotros investigadores que mejoraron el método, desarrollando la e­
lectroforesis de zona en gel de almidón (Smithies, 1955; Smithies y Poulik, 1956;
Poulik, 1957) y en poliacrilamida (Raymondy Weintraub, 1959; Drnstein y Davis,
1959), utiliZando posteriormente métodosde coloración histoquímicos para locali
zar las zonas de actividad enzimática en el medio de soporte (Hunter y Markert,
1957; Whipple, 1964; Smith, 1968; Brewer gt al., 1969; Brewer y Sing, 197D; Chrag
bach y Rodbard, 1971).
Entre las técnicas de electroforesis, la de zona es la másutilizada
(Smithies, 1955), pues permite comparar, con seguridad, las muestras analizadas
en el mismogel, lo cual es extremadamente importante en análisis de poblacio
nes.
Combinandola electroforesis con métodosde tinción histhuimicos es
pacíficos es posible distinguir una enzimaentre cientos de ellas presentes en
un extracto de tejido. Asi Hunter y Markert (1957) desarrollaron la técnica del
zimogramapara identificar las diferentes bandas (enzimas) que aparecen en el
gel luego de la tinción histoquímica. De este modolos Fenotipos resultantes
son bandas de colorante que indican regiones de actividad enzimática o de con
centración proteinica para las que se ha propuesto la denominaciónde electro
morfos (King y Ohta, 1975). Su aplicación pronto condujo al importante descu­
brimiento de las isoenzimas o formas moleculares múltiples de enzimas (Markert
y Moller, 1959).
Originalmente el ténnino isoenzima Fue utilizado para describir todas
las Formas moleculares de una enzima, derivadas de un mismo organismo y con una
mismaespecificidad enzimática por lo que catalizan una mismareacción. Más tar
de se dio el nombrede aloenzimas a aquellas variantes isoenzimáticas especifi
cadas por alelos de un mismolocus (Prakash gt al., 1969).
La técnica de electroforesis de enzimas Fue introducida cuando Lewog
tin y Hubby(1966) y Harris (1966) intentaron sistemáticamente medir la varia­
ción génica en poblaciones naturales, seleccionando muestras de proteínas ele­
gidas al azar para encontrar las aloenzimas. De5de entonces, cada vez más gene
tistas de poblaciones y evolucionistas se han interesado por el significado big
lógico de la variación polimórfica en la estructura primaria de las proteínas
(Le Camgt g;., 1972; Lewontin, 1979; Markert, 1975; Nei, 1975). A medida que
se acumularonpruebas de la existencia casi universal de un amplio polimorfis­
moproteínico en las poblaciones naturales, los puntos de vista que consideran
su significado evolutivo pronto se polarizaron. Algunosinvestigadores creían
que 1a mayorparte de la variación molecular resultaría ser Fisiológicamente
significativa y, por consiguiente, estaría bajo control selectivo y sería impor
tante en la adaptación; pero otros la consideraron cono un "ruido" evolutivo,
sin efecto Fenotípico y, por lo tanto, selectivamente neutra.
1.1.1. Ventajas de la utiliZación de las isoenzimas en estudios taxonómicos,
de genética de poblaciones y evolutivos
Hubby y Lewontin (1966) y Lewontin y Hubby (1966) propusieron que el
estudio de las movilidades electroforéticas de las enzimas y proteinas permiti
ría profundizar en ciertos problemas evolutivos que, con las técnicas conven­
cionales de análisis genéticos, resultaban muydificiles.
El métodode análisis electroforético permite el reconocimiento y las
estimaciones directas de homocigotaspara diferentes alelos, así comode los hs
terocigotas, sin recurrir a experimentos genéticos. Generalmentecada alelo se
expresa, habiendo expresión de ambas cadenas polipeptídicas. Las aloenzimas cg
dificadas por alelos de un mismolocus, y las isoengimas, codificadas por dife
rentes lggi génicos, puedenser distinguidas por electroforesis siempre que pg
sean diferentes cargas eléctricas o diferentes tamañosmoleculares.
Las aloenzimas son 1a consecuencia bioquímica de la sustitución, de­
leción o adición de aminoácidos en los polipéptidos que forman la enzima. Dado
que 1a secuencia de aminoácidos de un polipéptido es colineal a la secuencia
de nucleótidos del gen estructural que la codifica, las aloenzimas pueden resul
tar de la mutación génica. De este modo,el análisis de la estructura proteica
utilizando electroforesis es, en una primera aproximación, un análisis del gen
(Gottlieb, 1977). Es precisamente esta simple relación entre las bandas de co­
lor enel gel y la secuencia de nucleótidos de los genes, lo que hace de la e­
lectroforesis de enzimasuna poderosa herramienta analítica para los estudios
taxonómicos.
Por lo dicho anteriormente, las diferencias de movilidad electroforÉ
tica pueden resultar de la sustitución de un único aminoácido (Ingram, 1957) lo
cual lleva a una modificación en la carga eléctrica de la molécula. Tambiénpue
den ser el resultado de mutaciones que causen cambios de aminoácidos sin impli
car cambios de carga, más aún cuando los aminoácidos cambiados tienen radicales
de tamaños bastante diferentes con propiedades diferentes, comoes el caso de
aminoácidos hidrófobos cambiados por hidrófilos o viceversa, y que pueden cau­
sar cambios en la estructura tridimensional de la molécula funcional. Esas a1­
teraciones en la estructura tridimensional de las moléculas puedenalterar la
relación de Stokes de las mismas y, consecuentemente (en geles de almidón o pg
liacrilamida) las movilidades electroforéticas puedenser diferentes, toda vez
que esos soportes, dependiendo de su concentración y de su "malla", puedan o­
frecer mayor o menor resistencia a la migración. ‘
Otro mecanismo ya mencionado, además de la mutación, que puede lle­
var a alteraciones de la carga eléctrica de 1a proteína, modificando la movili
dad electroforética de la misma, es el entrecruzamiento no homólogoque provo­
ca deleciones o duplicaciones intracistrónicas y consecuentementealteraciones
en la cadena polipeptídica correspondiente (Shaw, 1965).
El estudio de la movilidad electroforética de las proteínas o enzimas
permite analizar las diferencias fenotípicas causadaspor la sustitución aléli
ca en un único locus de cada individuo, así comotambién distinguir las sustitu
ciones alélicas en un locus dado de las sustituciones alélicas en otro locus.
Ademáspermite la investigación de muestras aleatorias del genoma, ya que las
proteínas son escogidas aleatoriamente en un organismo determinado (Hubbyy Lg
wontin, 1966).
Tambiéna través de la electroforesis es posible hacer estimaciones
de la proporción de loci que muestran variabilidad (loci polimórficos) en la
población y hacer estudios sistemáticos y evolutivos en diferentes taxones ba­
sados en el análisis de diferencias génicas individuales (Ayala, 1980).
E1 análisis a través de electroforesis pennite igualmente el estudio
de la similitud genética entre individuos de una especie o entre especies dis­
tintas. A través del estudio de órganos o tejidos diferentes, y del análisis a
lo largo del desarrollo ontogenético permite también estudiar la acción de los
genes reguladores en la diferenciación y ontogénesis (Scandalios y Espiritu,
1969; Quail y Scandalios, 1971; Chao y Scandalios, 1972; Scandalios gg al., 1972;
Hadacova, 1974; Cordeiro, 1974; Meyerhof y Haley, 1975; Scandalios, 1964; 1965;
1969; 1974; 1979; Torres y Hart, 1976; Scandalios y Baum, 1982).
Otra ventaja importante de esta tecnica, señalada por Marshall y Brown
(1975), es que los cambios mutacionales detectables son acompañadospor cambios
en el "estado de carga" de la proteína, lo cual lleVa a poder establecer una c2
rrelación entre la distancia mutacional (o evolutiva) entre dos alelos y la di­
ferencia entre las velocidades de migración en el gel de las proteinas que e­
llos codifican.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar si ha ocurrido varia
ción en las frecuencias alélicas a lo largo del tiempo de existencia de una es
pecie en particular (Berger, 1971; Dobzhanskyy Ayala, 1973), comoasí también
a lo largo de un gradiente geográfico y/o ambiental (Koehn y Rasmussen, 1967;
Koehn y Mitton, 1972; Allard gt al., 1972; Clegg y Allard, 1972; Hamrick y
Allard, 1972; Koehn gt al., 1980a; b; c; Rick y Tanksley, 1981). También per­
mite realizar discriminaciones taxonómicasentre diferentes especies (Selander
e; 21., 1971; Bosbach y Münster, 1981) y entre especies gemelas (Ayala gt al.,
1974a; b) y principalmente estudios de variabilidad genética (Burdongt al.,
1980; Vello Jaaska, 1981; Zera, 1981; Tabachnick y Howard, 1982).
La información básica obtenida en los análisis electroforéticos de
la variabilidad proteica consiste en las Frecuencias genotípicas o las frecueg
cias génicas de cada locus de una población detenninada. La aplicación de las
tecnicas electroforéticas al estudio de la genética de poblaciones ha resulta­
do ser sumamenteútil para detectar y analizar los polimorfismos bioquímicos,
virtualmente en cualquier organismo vivo (Lewontin, 1979). La caracterización
de cada una de las poblaciones naturales en términos de Frecuencias génicas o
genotípicas ha facilitado considerablemente los estudios de la variación gené­
tica en tiempo y en espacio.
Desde hace algunos años la técnica de electroforesis ha sido amplia­
mente usada para resolver problemas sistemáticos y evolutivos en animales (Bag
derson, 1965; Johnson y Selander, 1971; Lewontin, 1979). Más recientemente e­
sos estudios se han extendido al reino vegetal. De este modose ha comprobado
que la electroforesis de isoenzimas permite estudiar el grado de divergencia
genética entre poblaciones coespecíficas así cono entre especies de un mismo
género, un tema muyimportante pues provee evidencias de las consecuencias ge­
néticas y bioquímicas del proceso de la especiación (Gottlieb, 1977). Además,
el estudio de la variación isoenzimática ha sido de gran utilidad para el anali
sis de las relaciones evolutivas dentro de diferentes grupos de plantas (Gott­
lieb, 1971; 1977; 1982; Crawford, 1983), permitiendo además la cómparación de
la variación genética de plantas.poliploides y/o sus antecesores diploides
(Hart, 1969; 1970; Gottlieb, 1973a; b; Gottlieb y Pilz, 1976; Roose y Gottlieb,
1976; Rick gt gig, 1976; Crawford y Smith, 1982a; b; Hunziker y Schaal, 1983;
Cortés y Hunziker, 1985; Cortés y Hunziker, 1987a; b), así como para un grupo
bastante heterogéneo de otros estudios con propósitos especiales comoel análi
sis del flujo génico a través de barreras específicas (hibridación interespecá
fica) (Chu y Oka, 1970), el análisis demográfico (Schaal, 1975), el efecto de
los sistemas de reproducción sobre la cantidad y expresión de la variabilidad
genética (Allard, 1975), y la relación entre diversidad genética y especializa
ción edáfica (Babbel y Selander, 1974).
10.
1.1.2. Limitaciones yZodesventajas de la utilización de las isoenzimas en es­
tudios taxonómicos, de genética de poblaciones y evolutivos
A pesar de las grandes ventajas que presenta el método de análisis g
lectroforético, existen, sin embargo,algunas Fuentes de error inherentes a 1a
técnica que deben ser tenidas en cuenta cuando se hace un análisis de las iso­
enzimas, pues de lo contrario ciertos resultados pueden llevar a una subestima
ción de la pr0porción de polimorfisno en una población o a una sobrestimación
del grado de similitud genética entre poblaciones o especies.
La carga de una proteína sólo es alterada cuando uno de sus aminoáci­
dos es sustituido por otro de carga diferente. Comoes sabido, 16 de los 20 a­
minoácidos comunesposeen cadenas laterales no ionizables y son electroforéti—
camente neutros dentro de la gama de pH de los tampones que generalmente se u­
san en los estudios electroforéticos y sólo cuatro aminoácidos están cargados:
la arginina y la lisina, que son negativas (básicas) y el ácido aspártico y el
ácido glutámico que son positivos (ácidos). Es por ello que muchassustitucio­
nes de aminoácidos pueden ocurrir en una detenninada proteína sin manifestar g
na diferencia detectable en la carga neta (Hubbyy Lewontin, 1966). Basándose
en estos datos, Shaw (1955; 197o), Marshall y Brown (1975) y Lewontin (1979)
han estimado que sólo cerca del 25 al 27%de los casos de sustituciones de ami­
noácidos serían detectables por electroforesis. SegúnSelander (1980), solamen­
te el 70%de los cambios en los nucleótidos del ADNproducen cambios en la se­
cuencia de aminoácidos de una proteina debido a la redundanciadel código gené­
tico. Por ello, diferentes secuencias de bases nucleótídicas puedencodificar
un mismoaminoácido: mutaciones sinónimas (Nardi, 1978). Otra limitación del mg
todo es el númerofinito de movilidades de bandas distinguibles en el gel (Nar­
di, 1978).
Por otra parte, el hecho de que dos enzimas tengan la misma movilidad
electroforética no necesariamente implica que sean idénticas. En efecto, estu­
dios que han permitido detenninar las secuencias de aminoácidos de las proteínas
(Boyergt al., 1972), análisis mediante desnaturaliZación por calor de las mis­
mas (Bernstein gt al., 1973; Singh gt al., 1976) y cambios en las condiciones
de electroforesis (pHy concentración del gel) muestran diferencias en las ban­
das que antes eran reconocidas comoidénticas (Singh gt al., 1976; Coyne, 1976;
Johnson, 1976). Por lo tanto, pruebas bioquímicas adicionales son necesarias pg
ra determinar si aloenzimas con la mismamovilidad tienen la mismao diferente
ll.
secuencia de aminoácidos.
De este modola electroforesis, en general, provee una subestimación
de la cantidad de diferencias genéticas existentes entre las entidades que se
comparan.
Otro problema es que las evidencias electroforéticas no permiten una
cuantificación exacta acerca del númerode diferencias de aminoácidos (distan­
cia mutacional) que causan las diferencias en la movilidad de las isoenzimas
entre especies o poblaciones. Unadiferencia en la movilidad puede reflejar u­
na simple sustitución nucleotídica o numerosos cambios en la secuencia de nu­
cleótidos. Así, la electroforesis puede demostrar que dos taxones tienen dis­
tintas isoenzimas, pero no provee información acerca de la cantidad de difereg
cias.
También la determinación de homología entre las bandas se torna una
tarea dificil. SegúnFlorkin (1966), el análisis de las proteinas enzimáticas
por electroforesis sólo puede presuponer homologiacuando se trata de especies
estrechamente relacionadas.
A pesar de todo lo expuesto anteriormente, la electroforesis de enzi
mas asociada a métodos histoquímicos constituye una de las mejores herramien­
tas para estudios sobre la variación intra o interespecifica, así comopara pg
der probar diferentes hipótesis referidas a las divergencias genéticas surgi­
das entre las especies de un determinado grupo de organismos a lo largo de su
evolución.
1.1.3. Precauciones que deben tomarse en un estudio donde se emplea la electro­
foresis de isoenzimas
Dado que las enzimas participan activamente en el metabolismo de los
organismos, y que pueden variar de acuerdo a las funciones que desempeñan en
el mismo,al realizar estudios isoenzimáticos, dirigidos a resolver problemas
evolutivos y sistemáticos es muyimportante considerar las caracteristicas del
material y de las enzimasa analiZar para evitar distorsiones en los resulta­
dos obtenidos.
En cuanto al organismo que es analizado es necesario tomar en cuenta
la edad del individuo, los tejidos y órganos a ser analizados, así comoel am­
12.
biente en el cual el organismo se desarrolla, pues todos estos Factores pueden
causar alteraciones en los patrones isoenzimáticos (Hall, 1967; Scandalios,
1969; 1974; 1979; McCowne_t_g” 1959).
Para no obtener una sobre o subestimación de la variabilidad genéti­
ca en las poblaciones, también es necesario tener cierta precaución en la eleg
ción de los sistemas isoenzimáticos. Gillespie y Kojima (1968) y Kojima gt al.
(1970), han sugerido que el grado de polimorFismo en las enzimas varia según
la Función, siendo las isoenzimas implicadas en el metabolismo energético, que
metabolizan la glucosa (Grupo I), las que generalmente presentan menor polimor
Fismo cuando se las compara con las enzimas no especíFicas del metabolismo pe­
riFérico (Grupo II). Posteriormente, Johnson (1973a; 1979), estudiando en 9:2­
sophila la variación enzimática en términos de la utiliZación de los sustratos
internos Frente a los externos, encontró un mayor númerode alelos en los ¿992
que codiFican las enzimas del Grupo II. De este modo, Johnson (1973b; 1979) su
giere que las enzimas regulatorias implicadas en las etapas iniciales de las
rutas anabólicas, así comoen los puntos de ramiFicación de rutas, presentan
mayor polimorFismoque las no regulatorias, pues ellas están involucradas en
la adaptación del organismo al medio.
Gillespie y Langley (1974) y Johnson (1974) han deFinido las enzimas
del Grupo I como"caracteriZadas por un sustrato Fisiológico singular que gene
ralmente es generado y utilizado intracelularmente", y las enzimas del Grupo II
comoaquellas con "sustratos Fisiológicos múltiples que reFlejan diversidad am
biental". Aunquesu análisis sólo se limitó a las enzimas, estos autores olas;
Ficaron dentro del GrupoI a las proteínas estructurales, ribosómicas y regula
doras, junto con la mayorparte de las enzimas implicadas en la biosíntesis, el
metabolismointermedio, la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico. Ellos creen
que la proporción real de genes en el genomaque codiFican las enzimas del Gru­
po II es pequeña y está desproporcionadamente representada en los estudios de
variación proteica.
El hecho de que las enzimas, conFormesus características Funcionales,
puedan presentar diFerentes grados de variación, sugiere que el problema de es­
timar la variación total del genomaimplica descubrir la proporción de los; que
están, de alguna manera, restringidos en cuanto a la variabilidad genética que
pueden tolerar.
Sobre la base de lo expuesto, cuando se emprende un estudio de varia
13.
bilidad genética a través de electroforesis, es necesario utilizar diferentes
sistemas isoenzimáticos que cubran en gran medida el espectro metabólico.
Tambiénes necesario considerar el tamaño de la muestra a estudiar.
Dado que existe un gran polimorfismo en las poblaciones, tanto en animales co­
mo en plantas (Shannon, 1968; Selander gt a;., 1971; Gottlieb, 1977; Hamrick,
1979) en un análisis de isoenzimas para estudiar las variaciones interespecífi
cas se requeriría un muestreo que abarque tanto cuanto sea posible la variabi­
lidad existente dentro de cada especie, con el fin de lograr una buena estima­
ción de las diferencias intereSpecíficas. Noobstante, se ha mostrado que en
general las poblaciones coespecificas son extremadamentesimilares genéticameg
te (Clegg y Allard, 1972; Gottlieb, 1973a; 1974a; Babbel y Selander, 1974; Rick
y Fobes, 1975; Levy y Levin, 1975; Gottlieb y Pilz, 1976; Roose y Gottlieb,
1976). Esto sugiere que las evidencias electroforéticas de unas pocas poblacig
nes muyfrecuentemente constituyen una muestra adecuada de la especie en estu­
dio (Gottlieb, 1977). Evidentemente, existen discrepancias con respecto al nú­
mero de poblaciones que es necesario utilizar para obtener una muestra repre­
sentativa de la especie. En este aspecto es necesario tener en cuenta el tipo
de fecundación de la especie en cuestión (Gottlieb, 19Bla). En las especies dog
de existe autofecundación, varios autores han sugerido que generalmente se re­
quiere muestrear un mayor número de poblaciones —encomparación con las espe­
cies de fecundación cruzada- si se desea obtener un análisis más confiable de
la variabilidad genética de la especie en estudio (Nevogt al., 1979; Crawford
y Wilson, 1977; 1979). Además, si no se tiene información previa sobre los pa­
trones de variación de una especie, Marshall y Brown (1975) recomiendan el mues
treo en más poblaciones con menos individuos por población más bien que mues­
trear intensivamente sólo algunas poblaciones particulares; más aún si la espe
cie en cuestión está compuesta por poblaciones donde existe la autofecundación
(Browny Moran, 1981) ya que éstas tienden a mostrar mayor diferenciación geo­
gráfica y/o microgeográfica que las poblaciones de fecundación crUZada (Brown,
19'78; Brown y Munday, 1982).
1.2. Género Larrea
El género Larrea (Cav.) tiene gran importancia biogeográfica porque
sus representantes cubren extensas regiones áridas y semiáridas deArgentina,
Chile, Bolivia, Perú, México y sudoeste de Estados Unidos, constituyendo un ig
teresante caso de distribución anfitropical disyunta.
14.
Este género pertenece a la Familia de las Zygophyllaceae, subFamilia
Zygophylloideae, y está compuestopor cinco especies, de las cuales cuatro son
sudamericanas (E. ameghinoi Speg., E. nitida Cav., E. divaricata Cav. y E. Eg­
neiFolia Cav.) y una única especie es norteamericana (E. tridentata (DC.) Cov.).
Dichas especies-se incluyen en dos secciones: sección Larrea, con hojas multi­
Folioladas y Flores pequeñas y sección BiFolium, con Flores más grandes y ho­
jas biFolioladas (Palacios y Hunziker, 1972). La primera de estas secciones a­
grupa a las especies diploides (x = 13; 2n = 26) E. nítida, que es un arbusto
que crece en el oeste y sur de Argentina (Salta a Chubut) y Chile (C0quimbo, fi
concagua y Santiago), y L. ameghinoi, que es una caméFita leñosa, que crece en
la Patagonia Argentina (desde Neuquénhasta Santa Cruz). La sección BiFolium
está constituida por el tetraploide (2n = 52) E. cuneiFolia, que es otra de las
especies arbustivas de la región del Montede Argentina, que tiene una amplia
distribución, principalmente en la parte oeste de la Argentina (desde Salta a
Chubut), E. divaricata y E. tridentata. Estas dos últimas especies han desarrg
llado agresivos mecanismosde proliferación y dominio territorial, Formandoeï
tensas y "exclusivas" comunidades en las que es poco Frecuente encontrar sim­
biosis precisas con otros elementos bióticos (CamposLópez gt al., 1979). 527
¿rea divaricata es diploide (2n = 26) y es el arbusto dominante en la región
semidesértica central denominadaMonte en Argentina, donde su área de distribu
ción es contínua. Tambiéncrece al otro lado de la cordillera de los Andes, en
Chile (Atacama, Aconcagua) y en regiones aisladas de Bolivia (Tarija) y Perú
(Chuquibamba,Aplao). Un taxón vicario, L. tridentata, es el arbusto dominante
en los desiertos comparables de América del Norte. Este taxón norteamericano
consta de tres razas que corresponden a tres grados de ploidia: diploide (2n =
26) (desierto de Chihuahua), tetraploide (2h = 52) (desierto de Sonora) y hexg
ploide (2n = 78) (desierto de Mohave) (Yang, 1967; 1968; 1970; Yang y Lowe,
1968; Barbour, 1969). Yangha sugerido que la raza tetraploide del desierto de
Sonora habria surgido por hibridación entre el diploide del desierto de Chihua
hua y un diploide muysimilar al sudamericano (E. divaricata) con la subsecueg
te poliploidiZación; el hexaploide del desierto de Mohavehabria derivado por
autopoliploidización de triploides naturales surgidos por hibridación entre los
tetraploides del desierto de Sonora y los diploides del desierto de Chihuahua.
Todas las especies presentan Fecundación cruzada, pero Simpsongt El.
(1977) han encontrado diFerencias en cuanto a la cantidad relativa de autocom­
patibilidad y/o autoFecundaciónFacultativa que presentan las diFerentes espe­
cies del género Larrea, comolo indican las distintas morFologias Florales de
15.
cada una de ellas. Dichos autores han demostrado que todas las especies son ag
tocompatibles, pero que E. tridentata (tetraploide), L. cuneiFolia y E. giga­
ricata exhiben una serie creciente de sus niveles de autopolinización natural.
Aunquesegún Simpsongt al. (1977) E. tridentata cerca de Tucson presenta un
porcentaje relativamente bajo de autopolinización, Raven (1963) ha sugerido,
sobre la base del trabajo de Twisselmann(1956), que la raza tetraploide del
desierto de Colorado es autocompatible y normalmenteproduce abundante canti­
dad de semillas por autoFecundación.
La morfología y menor tamaño de las Flores de las dos especies multi
Folioladas, juntamente con el hecho de que su Floración es más temprana (en la
época en que hay menos insectos) indicarian que E. nitida y E. ameghinoi pre­
sentan mayor porcentaje de autoFecundación que las especies de la sección BiFg
lium (Simpsongt al., 1977).
Las especies del género Larrea han sido usadas por el hombre en di­
versas Formas con propósitos diferentes. La investigación de sus componentes
quimicos muestra que Larrea es muyrica en productos naturales. Tiene numero­
sos compuestos Fenólicos (incluyendo especialmente los Flavonoides y el ácido
nordihidroguaiarético —NDGA-),aceites volátiles, ceras, saponinas y esteroi­
des (Mabrygt al., 1977). Unode sus compuestos Fenólicos, el ácido nordihidrg
guaiarético (NDGA),extraído de las hojas y tallos, tiene múltiples aplicacio­
nes y de este modole otorga a la planta importancia económica. Dicho compues­
to está presente en todas las especies y sus híbridos (Ruth, 1946; 1947; Miz—.
rahi, 1967; Mabrygt al., 1977). El NDGAtiene aplicación comoantioxidante en
alimentos y productos Farmacéuticos, lubricantes, hule y diversos metales (Hi9
gins y Black, 1944; Lundberggt al., 1944; Matill et al., 1944; Stull gt al.,
1948a; b; Dassow y Stansby, 1949; Krukovsky gt al., 1949; Tappel y Marr, 1954;
Oliveto, 1972), ademásde propiedades Fungicidas (Epstein et al., 1967; Olive­
to, 1972) e inhibidoras de tumores (Burk y Woods, 1963; von Ardenne gt al.,
1969; Smart gt al., 1969; Oliveto, 1972). Larrea también puede usarse comoFo­
rraje si se elimina la resina (Duisberg, 1952; Abiusso, 1962; 1971) y ha sido
utiliZada por los indígenas norte y sudamericanos para muchospropósitos medi­
cinales, principalmente preparando una infusión de las hojas (Jiu, 1966; Hart­
well, 1971). Un Factor importante en la explotación de Larrea es el hecho de
que cubre extensas áreas del orden de miles de kilómetros cuadrados con una a­
bundancia del 90% o aún mayor (Timmermann, 1977).
16.
Las especies multifolioladas de la sección Larrea (E. nitida y E. g­
meghinoi) son más mesofíticas y microtérmicas que las xeróFitas extremas de la
sección BiFolium. Larrea nitida es ocnsiderada comoun taxón que representa el
tipo más primitivo de Larrea. Larrea ameghinoi, con su menor número de Folíolos
y hábito de crecimiento postrado, está adaptada obviamente al clima Frío y ven
toso de la Patagonia. Por lo dicho, y ya que la mayoria de los géneros en las
Zygophyllaceaepresentan especies multiFolioladas, y las especies biFolioladas
más raras parecen representar una tendencia reduccional del área Foliar en res
puesta a la aridez (Hunzikergt al., 1977), el grupo multiFoliolado parece ser
el másprimitivo. Las tres especies integrantes de la sección Bifolium (E. gif
varicata, E. tridentata y E. cuneiFolia) probablenente representan una adapta­
ción a la aridez por la reducción en el númerode foliolos conjuntamente con g
tras adaptaciones morfológicas y Fisiológicas. En E. cuneiFolia la hoja está
básicamente reducida a una simple lámina emarginada, debido a la extrema Fusión
de sus foliolos. Másaún, esta especie ha adquirido la extraordinaria capaci­
dad de orientar sus hojas de manera tal que la mayoría de sus epiFilos miren
hacia el este de modotal que al mediodia sus hojas reciben los Fuertes rayos
solares de manera tangencial (Hunziker et al., 1972). Estarmbilidad es una a­
daptación que le permite a E. cuneiFolia ser una xeróFita más extrema que L.
divaricata. En realidad, E. cuneiFolia puede estar presente en sitios más se­
cos que E. divaricata (Morello, 1955; Ragonese, 1951). Por ello, la especie te
traploide L. cuneifolia posiblemente represente el taxón más avanzado y xerofi
ticamente más especializado del género Larrea (Hunziker gt al., 1977).
Hunziker g _a_l.(1969; 19'78) han señalado la existencia de hibrida­
ción natural entre las Cuatro especies sudamericanas del género en estudio. El
análisis citogenétioo de los híbridos ha indicado que E. ameghinoi y E. nitida
estarían estrechamente relacionadas y poseerían pocas diferencias en cuanto a
la estructura general de sus cromosomas.La afinidad de las especies dentro de
cada sección está basada en estudios morfológicos, citogenéticos, cromatográfi
cos y de electroforesis de proteínas. El par multiFoliolado (sección Larrea)
estátan estrechamente relacionado que el híbrido entre ambostaxones muestra
Formaciónregular de bivalentes y es completamenteFértil (Hunziker et al.,
1972; 1973; Hunziker gt al., 1977; Yanget al., 1977). La hibridación entre es
tas dos especies es un Fenómenocomúnen la Patagonia Argentina. Ambostaxones
podrian ser considerados comosemiespecies parcialmente simpátricas (Hunziker
gt al., 1977) y comoconstituyentes de un syngameon(Grant, 1971).
17.
Las especies sudamericanas del grupo bifoliolado, E. divaricata y E.
cuneifolia, también están tan estrechamente relacionadas en un grado tal que
la evidencia citogenética de su híbrido interespecifico indica que E. divari­
Eata poseería un genomio en comúncon E. ouneifolia y, en consecuencia, esta­
ria estrechamente relacionada con uno de sus progenitores diploides o habria
sido uno de ellos (Hunziker gt al., 1972; 1973). La estrecha relación entre es
tas dos especies bifolioladas ya ha sido señalada por Cozzo (1948) sobre la ba
se de la anatomía leñosa. La presencia del genomio de E. divaricata en E. 927
neifolia indicaría que el genomiode E. divaricata es muyantiguo en América
del Sur (Hunziker, 1975). Por otro lado, este antiguo genomio sudamericano es
homólogoal genomiode E. tridentata, comolo demuestra el análisis del híbri­
do entre ambas especies diploides, que presenta una meiosis regular (Hunziker
EE 21., 1977; Yanggt al., 1977). Sin embargo, dichos híbridos son semiestéri­
les con respecto a la Fertilidad del polen y la semilla. La esterilidad podría
ser génica o cromosómica o ambas.
Comoya ha sido señalado por Yang gt al. (1977) la relación entre E.
divaricata de América del Sur y E. tridentata de América del Norte ha sido un
tema de controversia por algún tiempo. Algunos autores se han inclinado a con­
siderarlas comorazas diferentes o subespecies de una simple especie anfitropi
cal.
Los estudios de electroforesis de proteinas seminales (Hunziker gt
al., 1972; 1973; 1977) y de patrones de compuestos fenólicos (Hunziker gt al.,
1972; 1973; Mabry gt El., 1977) han mostrado que cada una de las cuatro espe­
cies sudamericanas presenta un patrón característico. En cambio, dichos estu­
dios demuestran que existen muypocas diferencias entre las especies diploides
L. divaricata y E. tridentata. Los estudios de Yanggt al. (1977) han revelado
la presencia de una barrera reproductiva parcial en los híbridos entre ambas
entidades, la cual los hace semiestériles. Yaque el desarrollo de una barrera
reproductiva eficiente entre ellas no ha sido completado, biológicamente, estos
taxones caerían dentro de una categoría intermedia entre especie y subespecie,
y podrían ser considerados comosemiespecies alopátricas. Esta categoria se a­
plica a los taxones a10pátricos que no han alcanzado a completar su aislamien­
to reproductivo y se encuentran en estadios intermedios de divergencia (Grant,
1963; 1971). Ambasentidades están todavía muy estrebhamente relacionadas como
lo indican su morfología, la homologia de sus proteínas, los patrones cromato­
gráficos de compuestos fenólicos, el comportamiento cromosómicoregular en los
18.
híbridos y el intercambio génico parcial aún posible entre ellas a través de
un híbrido semiestéril. Por ello, ambostaxones también podrían ser considera
dos como integrando una superespecie (Mayr, 1942; 1963; 1970; Grant, 1963).
Por otra parte, comoya ha sido señalado por Hunziker gt al. (1977),
tratar de esclarecer la relación existente entre los tres citotipos norteameri
canos de E. tridentata es importante. La ausencia de diferencias bioquímicas
en los patrones electroForéticos y cromatográFicos (Hunziker gt al., 1972;1973;
.1977; Mabryet al., 1977) así comolas semejanzas morFológicas, Fisiológicas y
anatómiCasentre las razas diploide, tetraploide y hexaploide de E. tridentata,
en América del Norte, provee una Fuerte evidencia a Favor de la ocurrencia de
autopoliploidía interracial, ya que no se ha observado incremento de las Frac­
ciones proteicas o»de los compuestos Fenólicos así cono tampocodiferenciación
morfológica abrupta con el incremento del nivel de ploidía (Palacios y Hunzi­
ker, 1972; Hunziker gt É¿., 1973; Hunziker gt g;., 1977).
Con respecto al posible origen geográFico del género Larrea, se han
esb02ado varias hipótesis (Barbour, 1969; Hunziker gt al., 1972; Turner, 1972;
Porter, 1974; Hunziker, 1975; Hunziker gg g¿., 1977). Johnston (1940) ya había
propuesto un probable origen sudamericano para el género. Esta teoría Fue lueT
go apoyada por los estudios realiZados por Hunziker gt al. (1972; 1973), Hunzi
ker (1975), Hunziker gt 3;. (1977) y Wells y Hunziker (1977). Axelrod (1950)
ha señalado que la actual existencia de tipos australes, tales comoLarrea en
Américadel Norte, puede ser explicada por migración transtropical hacia Fines
del Cenozoico. La dispersión a larga distancia a través de los trópicos puede
haber ocurrido a través de una serie intermedia de hábitats semiáridos apropia
dos que sirvieron como"estaciones" (Raven, 1963), una situación que podría ha
ber surgido comoel resultado de la expansión de los climas áridos en el mundo
hacia el Final del Terciario o a comienzos del Cuaternario (Axelrod, 1970; Por
ter, 1974).
Sobre la base de las semejanzas entre las especies del desierto de
Chihuahua y E. divaricata de Argentina, Barbour (1969) ha Postulado que la dis
tribución disyunta de Larrea se habría originado por la evolución de los tipos
de Chihuahua y Argentina a partir de un tipo transtropical comúnque se habría
extinguido.
Por otro lado, Porter (1974), siguiendo a Turner (1972), sugiere un
origen norteamericano del género Larrea con la subsecuente dispersión a Améri
19.
ca del Sur. Wells y sus colaboradores, sin embargo, consideran que la presente
distribución del género en América del Norte sería de muyreciente origen (Wells
y Berger, 1967; Wells, 1969; Wells y Hunziker, 1977). De acuerdo a estos auto­
res y a las distintas líneas de evidencia anteriormente expuestas, se ha pro­
puesto que E. tridentata se habria originado a partir de poblaciones de E. g;­
varicata transportadas a larga distancia por aves migratorias (Hunzikeret al.,
1977; Wells y Hunziker, 1977).
Si la especie xeroFitica E. divaricata ha sido capaz de seguir una
ruta hipotéticamente contínua a través de los trópicos durante un período de
clima muyseco, entonces una disyunoión anFitropical muchomayor de los géneros
de las Zygophyllaceae sería de esperar (Wells y Hunziker, 1977).
Entre los posibles agentes de dispersión en este transporte a larga
distancia desde Sud a Norteamérica, se ha citado entre otros, el "ohorlo dora­
do" (Pluvialis dominica), conocido por sus vuelos a larga distancia sin inte­
rrupciones durante su migración anual intercontinental entre Américadel Sur y
del Norte (Hunziker gg É¿., 1977; Wells y Hunziker, 1977).
Raven y Axelrod (1974) han enumerado las razones que permiten suponer
que Larrea y otros taxones disyuntos de las Floras de Norte y Sudamérica se han
dispersado por transporte a larga distancia: 1.- constituyen sólo una pequeña
parte de sus respectivas Floras; 2.- los animales asociados con los taxones dis
yuntos son casi totalmente diferentes y 3.- son principalmente autocompatibles.
Existen áreas xéricas en los trópicos y éstas sólo habrían alcanzado su máxima
extensión en las Fases más secas del Plioceno medio y Cuaternario (Raven y Axel
rod, 1974). El escaso registro Fósil no provee evidencias a favor de un corre­
dor árido durante el Terciario (Graham, 1972), pero es necesario un muestreo
más completo a lo largo del oeste de los continentes (Raven y Axelrod, 1974).
Además,con anterioridad al Pleistoceno las áreas áridas de amboscontinentes
eran más pequeñas y aún más separadas de lo que están actualmente.
Las faunas de abejas de Norte y Sudamérica sugieren ausencia históri
ca de disperSión directa entre ambas (Hurd, 1972) y no se conoce ninguna abeja
con área similar a la de Larrea (Raven y Axelrod, 1974).De haber existido un
corredor conectando ambas regiones y migración directa se encontrarían hoy ma­
yores similitudes entre las Floras y los animales habrian migrado con las plan
tas. Según Raven y Axelrod (1975) es probable que Larrea haya llegado a Améri­
ca del Norte por transporte a larga distancia en los últimos varios millones de
20.
años. En consecuencia el concepto de un "matorral transtrópico" de Barbour
(1969), del cual podrían resultar las actuales áreas de Larrea, entre otras,
no está apoyado actualmente por evidencia alguna (Raven y Axelrod, 1974).
La evidencia paleobotánica es incompleta respecto a cuando se habría
producido el establecimiento y coloniZación de Larrea en América del Norte. Pg
do haber arribado al sur de Méxicoantes o después de la transición del Pleis­
toceno al Holoceno, pero existen evidencias importantes, de que la amplia dom;
nancia de Larrea en el sudoeste de América del Norte no se llevó a cabo antes
del Holooeno (Wells y Hunziker, 1977).
Por todo lo expuesto resulta interesante el estudio de las relacio­
nes genéticas entre las especies del género Larrea.
21.
1.3. OBJETIVOS DEL TRABAJO
Conel objeto de evaluar la divergencia genética entre las diferen­
tes especies del género Larrea y especialmente entre E. divaricata y E. triden­
tata, contribuir al esclarecimiento del origen, antigüedad y diferenciación de
E. tridentata en Américadel Norte y comparar la variación genética existente
en los taxones de diferente nivel de ploidía, en el presente estudio se ha ana
lizado la variación aloenzimática de siete sistemas isoenzimáticos: glutamato
oxaloacetato transaminasa (GÜT=AAT),alcohol dehidrogenasa (ADH), aminopeptida
sa (AMP),esterasas (EST), 6-fosfogluconato dehidrogenasa (6-PGDH),glutamato
dehidrogenasa (GDH)y superóxido dismutasa (SUD)en diferentes poblaciones de
especies pertenecientes a las dos secciones del género Larrea:
Sección Larrea: L. nítida (2n=2x=26) de Argentina
Sección Bifolium: E. divaricata (2n=2x=26)de Argentina
Il" cuneifolia (2n=4x=52) de Argentina
II­ tridentata (2n=2x=25 y 2n=4x=52) de Estados Unidos
En cada una de ellas se ha analiZado el número y la frecuencia de los
alelos de cada ¿9225, el grado de polimorfismo en las poblaciones, los niveles
de heterocigosis, la correlación de la variabilidad genética presentada con la
amplitud ecológica de cada entidad, las diferencias y/o similitudes existentes
entre las especies y/o sus poblaciones, cuantificadas mediante la estimación
de las distancias e identidades genéticas. En base a los resultados obtenidos
se discute el grado de diferenciación y variabilidad genética de dichas espe­
cies y sus respectivas poblaciones. Ademásse ha tratado de determinar la pre
sencia de marcadores aloenzimáticos propios de cada especie y/o población, que
permitan establecer diferencias entre ellas o entre sus respectivas poblaciones.
Asimismo se ha comparado también el grado de polimorfismo de cada sistema isoeg
zimático en Larrea con aquéllos hallados por otros autores en otros organismos,
tratando de aportar infonmación que permita ampliar el conocimiento que se tie
ne sobre la relación entre el grado de polimorfismo que presentan las enzimas
según su función especifica y la estrategia adaptativa de las especies. Además,
se discute el posible origen del género Larrea y la antigüedad de E. tridentata
en Américadel Norte sobre la base de los resultados obtenidos en el presente
estudio así comopor otros autores, evaluando la divergencia genética entre las
diferentes especies y especialmente entre E. divaricata y E. tridentata.
22.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1. MATERIALES
Se detallan a continuación la procedencia, las iniciales del colec­
tor de la muestra, el númerode herbario, la cantidad de individuos de los cua
les se recogió semilla, la cantidad de individuos estudiados y los sistemas i­
soenzimáticos analizados en cada una de las poblaciones de las diferentes espe
cies consideradas en el presente estudio. En las Figuras l y 2 se indican los
sitios de colección de los materiales.
Los ejemplares de herbario de las poblaciones argentinas han sido de
positados en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (BAFC),
con excepción de los ejemplares correspondientes a E. nitida procedente de la
provincia de Chubut, que Fueron depositados en el herbario del Centro Nacional
Patagónico, Puerto Madryn, Chubut; en tanto que los ejemplares de las poblacig
nes norteamericanas han sido depositados en el Instituto Danwinion (SI) y en
el Missouri Botanical Garden (Mo).
E. divaricata (Argentina)
.- provincia de Santiago del Estero, Departamento La Banda, dique Los Quiro­
ga, ca. 200 m.s.m.; col. 8.0.8. N08: 15 individuos. 727 semillas: ADH­
AMP - EST — 6-PGDH — GDH - GOT — SUD.
. provincia de La Rioja, Departamento General Belgrano, El Cisco, 9 km al S
de Olta, i 570 m.s.m.; col.'J.H.H. N°9783:5 individuos. 479 semillas.
ADH — AMP - EST - GOT — SÜD.
.—provincia de Mendoza, Departamento Las Heras, entre Punta de Vacas y Arrg
yo Picheuta, 1980 m.s.m.; col. J.H.H. N°9B72zlD individuos. 246 semillas.
GDT — soo}
.— provincia de Mendoza, Departamento Tunuyán, entre Manzano Histórico y Tu­
nuyán, 1300 m.s.m.; col. J.H.H., A.F.W. y N.G.G. N°11298: 24 individuos.
656 semillas. ADH — AMP — EST — 6-PGDH — GDH — GOT — SUD.
. provincia de La Pampa, Departamento Caleu-Caleu, ruta 22, km 619, 43 km
al E de Río Colorado, i 75 m.s.m.; col. J.H.H. N°9886: 25 individuos. 612
23!
semillas. ADH — AMP — EST — GDH - GOT — SOO.
.—provincia de Río Negro, Departamento Avellaneda, ruta 22, 115 km al D de
Río Colorado, 25 km al E de Choele Choel, i 150 m.s.m.; col. J.H.H. N°
9883: 25 individuOs. 569 semillas. ADH— AMP— EST — GDH - GOT - SOD.
E. tridentata (Estados Unidos)
Diploide
. estado de Arizona, CampVerde, a 1.6 km de Monte2uma Monument; col. J.H.
H. N°10019: 25 individuos. 689 semillas. ADH- AMP— EST — 6-PGDH —GDH
— GOT — SOD.
.— estado de'Arizona, Mountain View, ca. 40 km al SE de Tucson; col. T.W.Y.
s/N°: 25 individuos. 749 semillas. ADH— AMP— EST — EFPGDH - GDH - GOT ­
SOD.
. estado de NewMexico, entre Elkins y Pecos River, 10.5 km al E de Pecos
River; col. J.H.H. N°1ODle 25 individuos. 767 semillas. ADH- AMP- EST
— 8-PGDH - GDH — GOT — SOD.
Tetraploide
.—estado de Arizona, Bellevue, 759 m.s.m., Tucson; col. T.W.Y. s/N°: 25 in­
dividuos. 321 semillas. 6-PGDH- GDT—SDD.
.- estado de Arizona, 32° 15' latitud, 111° 13' 4" longitud, 24 kmal D de
Tucson, Awra Valley, al W de Saguaro National Monument; cole T.W.Y. SNMW
#- 5: SD individuos. 1043 semillas. ADH — AMP — EST — 6-PGDH — GDH — GDT
— SOD.
E. cuneifolia (Argentina)
.- provincia de Mendoza, Departamento Capital, entre Mendozay Canota; col.
J.H.H., A.F.W. y N.G.G. s/N°: 25 individuos. 1165 semillas. ADH- AMP—
EST — 6-PGDH — GDH — GOT — SOD.
.—provincia de La Rioja, Departamento Capital, cerca del aeropuerto y Río
de la Hodadera; col. J.H.H. N°9723: 25 individuos. 1290 semillas. ADH—
24.
AMP — EST — 6-PGDH — GDH — GOT — SÜD.
E. nitida (Argentina)
.—provincia de Salta, Departamento Cachi, entre Payogasta y arroyo Quipón,
2330 m.s.m.; col. J.H.H. y N.G.G. N°ll399: 8 individuos. 47D semillas.
ADH — AMP - EST — 6-PGDH — GDH - GÜT — SOD.
. provincia de MendDZa,Departamento Las Heras, a 48 km de la ciudad de Men
doza, a 5 kmde Villavicencio, 1310 m.s.m.; col. A.L.F. s/N°: 27 indivi­
duos. 527 semillas. ADH — AMP - EST — 6-PGDH — GDH — GOT - SÜD.
. provincia de Mendoza, Departamento Tunuyán, entre Manzano Histórico y Tu­
nuyán, 1300 m.s.m.; col. J.H.H., A.W.F. y N.G.G. N° 11297: 23 individuos.
556 semillas. ADH — AMP — EST - 6-PGDH — GDH - GOT - SÜD.
.- provincia de Neuquén, Departamento Confluencia; col. M.P. s/N°: 25 indivi
duos. 307 semillas. ADH — EST — 6-PGDH — GDH — GOT - SÜD.
.— provincia de Chubut, Departamento Biedma, a 15 km al N de Puerto Madryn,
a 30 m de la ruta nacional N°3; col. M.P.I. s/N°: 31 individuos. 639 se­
millas. ADH — AMP — EST — 6-PGDH— GDH — GOT — SUD.
Abreviaturas empleadas:
J.H.H.: ProF.Dr. Juan H. Hunziker; T.W.Y.: ProF.Dr. Tien W. Yang; 8.0.8.: Prof.
Dra. Beatriz D. Saidman; A.F.W.: Lic. Arturo F. WulFF; N.G.G.: Lic. Norma G. Ga
liano; M.P.I.: Ing.Agr. María P. Irisarri; M.P.: Ing.Agr. MónicaPoverene; A.L.
F.: Ing.Agr. Adriana López Frasca.
2.1.1. Colección y conservación del material
Se coleccionaron al azar semillas de 1a cantidad antes indicada de ar
bustos diferentes, escogidos también al azar de cada una de las poblaciones men
cionadas.
-De cada arbusto se coleccionaron los esquizocarpos (con sus respecti­
vos mericarpios) y en muchoscasos con la mayoría de los mericarpios ya separa­
dos. Al momentode coleccionarlos, ellos Fueron colocados en sobres de papel sE
parados e identificados según cada arbusto madre. En todos los casos, una vez
25.
ingreSados al laboratorio, se los guardaba en frío (heladera) a 4°C, en Fras­
cos de vidrio cerrados que contenían sílica gel. Esta conservación de los Fru­
tos en frío evita la pérdida de viabilidad de las semillas por varios años.
2.1.2. Condiciones de germinación
Unavez separados los mericarpios de los esquizocarpos correspondieg
tes, cada semilla Fue desprovista de su respectivo pericarpio utilizando una
pinza de punta muyFina. Las semillas Fueron puestas a genninar ig vitro o se
las volvía a guardar en los sobres de papel identificados por planta madre, a
4°C en Frascos de vidrio con sílica gel.
Las semillas Fueron puestas a germinar a una temperatura de 23°C y
en completa oscuridad (Barbour, 1968) en cajas de Petri previamente esteriliza
das, que contenían una Fina capa de algodón embebida en agua, sobre la cual se
colocaba un papel de Filtro WhatmannN° l de 9 cm de diámetro.
2.2. METODOS
2.2.1. Análisis electroForético
2.2.1.1. Elección de los sisteman inonnzimúticon analizados
Los sistemas isoenzimáticos escogidos para el presente estudio fueron:
alcohol dehidrogenasa, aminopeptidasa, esterasa, glutamato dehidrogenasa, gluta
mato oxaloacetato transaminasa, 6-Fosfogluconato dehidrogenasa y superóxido dis
mutasa.
Para lograr las óptimas condiciones experimentales para cada uno de
los sistemas antes mencionados, la elección de cada uno de los tampones utili­
zados en las cubas electroforéticas, así comolos empleadospara la preparación
de los geles y/o el homogenatodel órgano en estudio, se realizó mediante el
método de prueba y error. De este modose emplearon gran diversidad de condicig
nes para cada sistema tratando de lograr una buena resolución de las bandas.
Tambiénse utilizaron diferentes sistemas de revelado para las distintas isoeg
zimas y se emplearon diferentes tamaños de poro del gel y/o preincubaciones pg
ra tratar de obtener mayornitidez de las zonas de actividad, al lograr mayor
poder de separación al cambiar Iu concentración del tamiz molecular y/o al cam
26.
biar el pHdel sistema de revelado. De esta manera se descartaron todos aque­
llos métodos que dieron cono resultado la ausencia de bandas o una muymala o
escasa resolución de las mismas.
Comoconsecuencia de todas las pruebas realizadas no se analizaron o
tros cuatro sistemas isoenzimáticos que habian sido también considerados al ela
borar el plan de investigación; ellos Fueron: malato dehidrogenasa, peroxidasa,
FosFatasas ácida y alcalina. El primero de ellos no se analizó por ser excesi­
vamente diFícil conseguir Fijar el pHóptimo de la solución de revelado, el se
gundo por obtenerse bandas en momentosmuybreves del desarrollo de las plántu
las y aún en esos casos con muyescasa resolución y los dos últimos por obtener
se bandas demasiado diFusas en todas las condiciones en que Fueron probadas.
Todas las pruebas experimentales para la elección de las diFerentes
condiciones Fueron realizadas utilizando el extracto de L. divaricata proceden
te de Río Negro (Argentina) como testigo, obteniéndose el mismopoder de reso­
lución de las bandas para las demás especies, con la única excepción de E. gi­
Eigg para el sistema de las esterasas, donde las bandas siempre se coloreaban
más tenuemente.
2.2.1.2. Númerode individuos estudiados
Se analizó un total de 11633individuos para estudiar los siete sis­
temas isoenzimáticos según se detalla a continuación:
1459 individuos para alcohol dehidrogenasa (ADH)
1804 individuos para aminopeptidasa (AMP)
1330 individuos para esterasa'(EST)
1441 individuos para glutamato dehidrogenasa (GDH)
3347 individuos para glutamato oxaloacetato transaminasa (GOT=AAT)
1010 individuos para 6-FosFogluconato dehidrogenasa (6-PGDH)
1242 individuos para superóxido dismutasa (SUD)
2.2.1.3. Estadios analizados
En todas las especies y sus respectivas poblaciones se estudiaron se
millas de 3 y 5 días después de iniciada la germinación y raices, hipooótilos
y ootiledones de plántulas de diFerentes edades.
27.
En el caso del sistema correspondiente a glutamato oxaloacetato tran
saminasa se analizaron también epicótilos y hojas adultas: lero., 2do. y aer.
par.
Debido a que para diferentes sistemas isoenzimáticos era necesario u
tilizar distintos tamponesy/o diferentes estadios, un mismoindividuo no pudo
ser usado para más de un sistema isoenzimático.
2.2.1.4. Condicionesde electroforesis
Se empleó1a técnica de electroforesis horizontal en geles de polia­
crilamida y almidón.
2.2.1.4.1. Preparación de los geles de poliacrilamida
Se utilizaron geles de poliacrilamida de diferentes concentraciones
(5%, 7%y 9%) según cada sistema isoenzimático y/o las distintas pruebas reali
zadas.
Dichos geles fueron preparados de la siguiente manera:
Tampón............................................ 105m1
Cyanogum41 .................................¿..... 5.35g (5%)ó
7.35 g (7%) ó
9.35 g (9%)
Diamina de N,N,N',N' tetrametiletileho (TEMED) .... 0.14 ml_
Persulfatode amonio(Ap) ..........¿.............. 0.10 g
Los tampones empleados para la preparación de los geles variaron se­
gún los diferentes sistemas isoenzimáticos analiZados, comose describe a con­
tinuación:
A.- Aminopeptidasal glutamato oxalqgcetato transaminasa X sugeróxido dismu­
tasa
Tampones A y B (Scandalios, 1969), pH 8.3 (0.2 M), en una proporción
lA:98.
TampónA: borato de litio pH 8.3:
hidróxidode litio ....................... 1.200g
ácidobórico(anhidro) ................... 11.890g
28.
aguadestilada .......................... 1000m1
TampónB: tris citrato pH 8.3:
tris (hidroximetil) aminometano (TRIZMA). 6.200 g
ácidocítrico ........................... 1.600g
aguadestilada .......................... 1000ml
8.- Alcohol dehidrogenasa y glutamato dehidrogengág
Tampóntris-citrico pH 7 (Shaw y Prasad, 1969):
tris (hidroximetil) aminometano(TRIZMA).......... 16.350 g
ácidocítrico ..................................... 9.040g
aguadestilada .................................... 1000m1
Se diluyen 66.7 ml del tampón en 1000 ml de agua destilada (Shaw y
Prasad, 1969).
C.—6-FosFogluconato dehidrogenasa
Tampóndehidrogenasa pH 9 (Schaal y Anderson, 1974):
tris (hidroximetil) aminometano(TRIZMA).......... 10.540 g
¡ICO-IOUIOI-O'IlOIC-OUIOOIOOODÜIOIO...
ácido etilendiamino tetracético (EDTA)............ 0.410 g
aguadestilada.................................... 1000ml
Para hacer el gel, la solución correspondiente se volcó en una cubeta
de vidrio con dimensiones internas de 15 cm de ancho x 17 cm de largo y 0.2 cm
de espesor. Asi se producía la polimerización en aproximadamente 30 minutos y
en ausencia de aire, lo cual se logra colocando una placa de vidrio sobre la
cubeta. Luego el gel se transfería a una heladera a 4°C, donde se lo mantenía
durante dos horas comomínimoantes de ser usado para la corrida electroforéti
Ca.
2.2.1.4.2. Preparación de los geles de almidón
Se emplearon geles de almidón únicamente para el sistema isoenzimáti
co correspondiente a las esterasas. Se utilizaron geles de almidón al 13%que
Fueron preparados de la siguiente manera:
29.
Tampóntris citrato pH 7.4 en dilución 1:9
(Shawy Prasad,1969) ..............................