tesis-n2127-SopenadeKracoff

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar
Tesis de Posgrado
Biosíntesis del hemo : Estudio deBiosíntesis del hemo : Estudio de
propiedades de enzimaspropiedades de enzimas
relacionadas con este caminorelacionadas con este camino
metabólicometabólico
Sopena de Kracoff, Yolanda Elvira
1988
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Cita tipo APA:
Sopena de Kracoff, Yolanda Elvira. (1988). Biosíntesis del hemo : Estudio de propiedades de
enzimas relacionadas con este camino metabólico. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires.
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Sopena de Kracoff, Yolanda Elvira. "Biosíntesis del hemo : Estudio de propiedades de enzimas
relacionadas con este camino metabólico". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1988.
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mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
B I()S I N T E S IES D E L PIE M O EIS T U D I 0 D E
P R O P Ilï[)A D E S [)E E N Z IbíAÁS IIEÉL A C [C)N A D A S C O N
E SïïE CIAD4I N() MEÏFA¡B()L ICIO .
Y'OI,A N[)A EILV IIKA S OI’EIJA
Directora: Dra. Ana María Ferramola de Sancovích
21.22
¿J .2.
Tesis presentada para optar a1 título de
D()C)T OI! E N (II E N(ZI A S Q U ID4I C A S
1 9 8 8
A mi madre.
A Luis.
AGRADECIMIENTOS
A los Dres. ANA MARIA FERRAMOLA DE SANCOVICH y HORACIO
ALBERTOSANCOVICH,directora y consejero de estudios respec­
tivamente de este trabajo de Tesis, quienes me brindaron
toda su calidez para poder realizarlo, colaboraron fundamen­
talmente en su desarrollo y me ofrecieron sus importantes
sugerencias.
A1 Dr. MOISESGRINSTEINque con sus importantes conse­
jos y estimulo, mostró permanente interés.
A mis compañeros y ex-compañeros de laboratorio por su
disposición a ayudar, en especial a las Licenciadas BEATRIZM.
KARTOFELy LIDIA IÑIGO que colaboraron en la realización de
algunas experiencias fundamentales.
A 1a Sra. LILIA LESCANOpor su amable y permanente dig
posición y eficaz ayuda técnica.
A mis compañeros del grupo de las Porfirinas por su
amistad y constante apoyo durante todos estos años de tra­
bajo.
A los integrantes del laboratorio de Esteroides por su
buena predisposición a ayudar.
A la Sra. LILIANA INES VAZQUEZpor el trabajo dactilo­
gráfico.
A 1a Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la
Universidad de Buenos Aires por haberme dado el lugar de
trabajo.
INDICE
Abreviaturas
INTRODUCCION.
CAPITULO I: PORFIRINAS Y COMPUESTOS DERIVADOS . . . . . ..
- Porfirinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Metaloporfirinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Clorofilas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Corrinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
CAPITULO II: BIOSINTESIS DEL HEMO. . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Biosintesis de 6 ALA. . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . ..
_ Biosíntesis del Porfobilinógeno _. . . . O. _. _. . . _. . _..
- Biosintesis de Uroporfirinógeno III . . . . . . . . . . . . . ..
- Decarboxilación de Úroporfirinógeno . . . . . . . . . . . . . ..
- Conversión de Coproporfirinógeno III en protopor­
firínógeno IX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Formación de protoporfirina IX. . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Formación de Hemo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
CAPITULO III: REGULACION DEL CAMINO BIOSINTETICO DEL
O O O C I C I C O O O I O I 0 C i I O O O O I O O Ü I I l I O O I O l C 0 O O i I O O 0 O O O O
- Regulación primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
- Mecanismos de control adicionales . . . . . . . . . . . . . . . ..
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
MATERIALES Y METODOS.
- Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
P38°
kDNJLnH
11.
12.
16.
29.
36.
39.
41.
42.
45.
45.
51.
54.
74.
ORIGEN DE LAS FUENTES . . . . . . . . . . .._ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 74.
A) Hígado porcino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 74.
B) Hígado de pollos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 74.
C) Sangre de conejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 75.
SISTEMAS DE INCUBACION Y DETEBMINACION DE ACTIVIDADES
ENZIMATICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 76.
I) ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 76.
A) Fracciones provenientes de hígado de cerdo . . . . . . .. 76.
B) Homogenatos de higado de pollos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 77.
C) Hemolisado de sangre de conejos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 77.
Determinación colorimétrica del PBG. . . . . . . . . . . . . . . . .. 77.
II) PBG-asa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 79.
A) Homogenatos de higado de pollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 79.
B) Hemolisado de sangre de conejos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 81.
III) URO-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 81.
Preparación de uroporfirinógeno sustrato . . . . . . . . . . . .. 81.
A) Homogenato de higados de pollos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 82.
B) Hemolisado de sangre de conejos . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 83.
DETERMINACION DE PORFIRINAS LIBRES . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 84.
DETERMINACION DE PORFIRINAS CON METIL ESTERES . . . . . .. 85.
- Formaciónde los metil ésteres de las porfirinas... 85.
- Cromatografía de los metil ésteres . . . . . . . . . . . . . . . .. 85.
DETERMINACION DE PROTEINAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 87.
METODOS ESTADISTICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 87.
PURIFICACION DE ALA-D DE HIGADO PORCINO . . . . . . . . . . . . .. 88.
ENSAYOS CON ALA-D DE HIGADO PORCINO . . . . . . . . . . . . . . . . .. 88.
Tratamiento con Urea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 88.
Reversión del efecto causado por urea . . . . . . . . . . . . . . .. 88.
Electroforesis en geles de poliacrilamida . . . . . . . . . . .. 89.
A) En condiciones desnaturalizantes . . . . . . . . . . . . . . . . .. 89.
B) En condiciones nativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 90.
Efecto de compuestos sobre la actividad de ALA-D..... 90.
A) Efecto de sales de Zn++, Pb++, Fe H, Cd++ y Mg++. 9o.
B) Efecto de piruvato y levulinato . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 91.
C) Efecto de fosfatos de piridoxal y piridoxamina.... 91.Efecto de inhibidores de grupos tiólicos en ALA-D.... 91.
Determinación de grupos sulfhidrilos . . . . . . . . . . . . . . . .. 92.
Efecto de inhibidores en la unión enzima-sustrato.... 93.
A) Levulinato y piruvato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 94.
B) Fosfato de piridoxal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..- . . . . . .. 94.
Medición de la radioactividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 95.
C) Reversión y estabilización del complejo ALA-D-PPy. 95.
Estudio de aminoácidos esenciales del sitio activo
de ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 96.
A) Reacciones de fotooxidación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 96.
B) Reacción con Dietilpirocarbonato . . . . . . . . . . . . . . . . .. 97.
ENSAYOS CON SANGRE DE CONEJOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 98.
Tratamiento de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 98.
Determinación de indices hematológicos . . . . . . . . . . . . . .. 98.
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 100.
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
1) PURIFICACION Y PROPIEDADES DE ALA-D DE HIGADO POR­
CINO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 103.
Purificmfión de ALA-Dde higado porcino . . . . . . . . . . . . . .. 104.
1er Paso. Preparación del homogenato . . . . . . . . . . . . . .. 104.
2do Paso. Centrifugación a 11.000 xg . . . . . . . . . . . . . .. 104.
3er Paso. Tratamiento por calor . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 104.
4to. Paso. Fraccionamiento con sulfato de amonio.... 105.
5to. Paso. Tratamiento con gel de fosfato tricálcico 105.
6to. Paso. Cromatografía por columnas de exclusión.. 106.
a) Sephadex G-200 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 106.
b) Sephacryl 8-300 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 106.
- Determinación del pH óptimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 108.
de incubación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 112.
- Efecto de la atmósfera de incubación y protectores
de -SH sobre ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 113.
- Velocidad de reacción en función del tiempo de
incubación . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 118.
r Velocidad de reacción en función de 1a concentra­
ción de enzima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 119.
- Efecto de la temperatura de incubación sobre la
actividad de ALA-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 119.
- Dependencia de la concentración de sustrato . . . . . .. 122.
- Efecto de urea sobre ALA-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 122.
- Reversión de la inhibición causada por urea....... 124.
- Determinación del PM de ALA-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 124.
1) Sephadex G-100 . . . . ., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 127.
2) Sephadex G-200 . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 127.
3) Cromatografía en presencia de ¡3mercaptoetanol... 128.
4) Cromatografía en presencia de urea..., . . . . . . . . . .. 132.
Variación de la actividad de ALA-Dcon el buffer
5) Recromatografía en Sephadex G-lOO. . . . . . . . . . . . . . .. 135.
6) Sephacryl 8-300 . . . . . . . . . . . . . ... . . . . ... . . . . . . . . . . .. 137.
7) Determinación del PMde ALA-Dpor electroforesis. 137.
Efecto del agregado de EDTAsobre 1a actividad
enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 139.
Acción de iones metálicos sobre la actividad de
ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 139.
Determinación de parámetros cinéticos de ALA-Den
presencia de iones metálicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 142.
Acción de inhibidores tiólicos sobre ALA-D. . . . . . . . .. 143.
Determinación de grupos -SH de ALA-D. . . . . . . . . . . . . . .. 146.
Acción intramonomérica de grupos -SH de ALA-D. . . . . .. 150.
Determinación de parámetros cinéticos de ALA-Den
presencia de levulinato y piruvato . . . . . . . . . . . . . . . . .. 152.
Efecto del levulinato y piruvato en la unión enzima­
sustrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 152.
Fotooxidacíón mediada por Rosa de Bengala . . . . . . . . . .. 155.
Fotooxidacíón mediada por Azul de Metileno . . . . . . . . .. 158.
Efecto de Dietilpirocarbonato sobre 1a actividad de
ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 162.
Efecto de los fosfatos de piridoxal y de piridoxami­
na sobre 1a actividad de ALA-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 165.
2) ENZIMAS SOLUBLES HEPATICAS DE LA BIOSINTESIS DEL
HEMO EN EL DESARROLLO ONTOGENICO DEL POLLO . . . . . . . . .. 171.
Establecimiento de las condiciones de medición de
la actividad enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 171.
Actividad de ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 173.
Actividad de PBG-asa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 176.
Actividad de URO-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 179.
3) ANEMIAS EXPERIMENTALES EN CONEJOS Y su INFLUENCIA
EN LA BIOSINTESIS DEL HEMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 186.
Inducción del estado anémico. . . . . . . . . . . . . . . . ..:..... 186.
1) Actividad de ALA-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 195.
a) En conejos tratados con fenilhidracina . . . . . .. 195.
b) En conejos sometidos a sangría . . . . . . . . . . . . . .. 198.
2) Actividad de PBG-asa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L 199.
a) En anemias por fenilhidracina . . . . . . . . . . . . . . . .. 199.
b) En animales sometidos a sangría . . . . . . . . . . . . . .. 199.
3) Actividad de URO-D...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 200.
a) En conejos tratados con fenilhidracina . . . . . . .. 200.
b) En conejos sometidos a sangrías . . . . . . . . . . . . . .. 200.
Proporcionalidad de las cantidades de las enzimas... 201.
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 203.
DISCUSION.
PURIFICACION DE ALA-D DE HIGADO PORCINO . . . . . . . . . . . .. 205.
PROPIEDADES DE ALA-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 207.
ENZIMAS SOLUBLES HEPATICAS DE LA BIOSINTESIS DEL
HEMO EN EL DESARROLLO ONTOGENICO DEL POLLO . . . . . . . . .. 225.
ANEMIAS EXPERIMENTALES EN CONEJOS Y SU INFLUENCIA EN
LA BIOSINTESIS DEL HEMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 233.
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 242.
aa
6 ALA
ALA-D
ALA-S
AM
/5 SH
CDNA
Copro'genasa
Óopro'geno
DEPC
dimetil POPOP
DTT
DTNB
EDTA
FQ
GR
GSH
HACO
Hb
Hepta'geno
Hexa'geno
Ht
ABREVIATURAS.
-CH2COOH.
aminoácido.
ácido ó aminolevúlico.
ácido 5 aminolevúlíco dehídrasa.
ácido 6 aminolevúlico sintetasa.
azul de metíleno.
[3 mercaptoetanol .
DNAcopia.
coproporfirínógeno oxidasa.
coproporfirinógeno.
dietilpirocarbonato.
1,4p-bis(2-(4metil-5 feníl oxazol)benceno.
ditiotreítol.
5-5'-ditíobis-(2-ácido nitrobenzoico).
etilendíamínotetra acetato.
ferroquelatasa.
glóbulo rojo.
glutation reducido.
ácido acético.
hemoglobina.
heptaporfírinógeno, porfirinógeno hepumar­
boxílico.
hexaporfirinógeno, porfirínógeno hexacar­
boxílico.
hematocríto.
IAm
Me
PBG
PBG-asa
PBG-D
PCMB
penta'geno
proto'geno
proto'geno ox
PPO
PPy
RB
ret
SDS
TCA
TNB
Trís
Uro
Uro-CoS
Uro-D
Uro'geno
Iodoacetamida.
-CH3
porfobilínógeno.
porfobilinogenasa:complejo PBG-D-Uro-CoS.
porfobílínógeno Deamínasa, Uro'geno I sin­
tetasa.
p-cloromercuribenzoato.
pentaporfírinógeno, porfirinógeno pentacag
boxílico.
protoporfirinógeno, porfirinógeno dicar­
boxílico.
protoporfirinógeno oxídasa.
2,5 difeníloxazol.
fosfato de piridoxal.
Rosa de Bengala.
reticulocitos.
dodecil sulfato de sodio.
ácido tricloroacético.
5 mercapto-Z-ácído nitrobenzoíco.
tri(hidroximetil)amino metano.
uroporfirina, porfírina octacarboxílica.
Uro'geno III CoS, Isomerasa.
Uro'geno Decarboxílasa, porfirinógeno car­
boxílíasa.
uroporfirinógeno, porfírínógeno octacar­
boxílíco.
-CH=CH2
INTRODUCCION.
CAPITULO I: PORFIRINAS Y COMPUESTOS DERIVADOS.
Las porfirínas y metaloporfirinas se encuentran amplia
mente distribuidas en la Naturaleza, interviniendo en reac­
ciones de oxidación biológica y transporte de oxigeno.
En virtud de su estructura anular y de su capacidad
de formar ligandos con metales, las porfirínas pueden acomple
jar hierro, magnesio, etc. encontrándose asi compuestos con
roles biológicos esenciales comoel hemo(Fe-protoporfirina
IX), clorofilas (Mg-porfirínas) y vitamina B12 (Co-porfirí­
na).
El hemoes la mitad prostética de una gran variedad
de hemoproteinas: hemoglobina, mioglobina, citocromos, trip
tofano pirrolasa, catalasa, etc. con importantes funciones
de oxidación y las clorofilas son esenciales para la utili­
zación de la energia solar en el proceso de fotosíntesis en
plantas y bacterias.
Porfirinas.
La estructura de estos compuestos derivan del núcleo
de porfina que consiste en cuatro anillos pirrólicos uni­
dos por puentes metenos, formando un macrociclo plano y ri
gido (Fig. 1). En las posiciones 1 a 8 puede contener cadg
nas laterales que determinanlas caracteristicas fisico-qui
micas de la porfirína en cuestión. Los cuatro anillos pirré
licos se designan A, B, C y D y los puentes metenos d, /3,
‘ó'yá
PORFIRINA PORFIRII‘DGEN.)
FIGURA 1. ESTRUCTURAS DE PORFIRINAS Y PORFIRINOGENOS.
E1 intermediario biológico real no es el compuesto
altamente conjugado porfirina sino su derivado hexahidro­
porfirina, el porfirinógeno, con los cuatro puentes mete­
nos reducidos (Fíg. 1). Se caracterizan por ser compuestos
incoloros no conjugados, sin fluorescencia a la luz ultra­
violeta. Son moléculas no planas que se oxidan espontánea­
mente a las correspondientes porfirinas, las cuales si
presentan las características mencionadas.
En 1a Figura 2 se muestran las estructuras de las
principales porfirinas y porfirínógenos de interés bioló­
gico.
Para 1a uroporfirina y 1a coproporfirina pueden en­
contrarse cuatro isómeros posibles (I, II, III y IV) se­
gún las posiciones relativas de los dos sustituyentes,
en los carbonos ¡9 del pirrol (Fig. 3).
CHÍ{HÏCUOH
|H2 (¡HZ
coou con”
UrOporí¡rinógeno lll
Prot0poríirinógcno 1X Proloporíirina IX
FIGURA 2. ESTRUCTURA DE LOS PRINCIPALES PORFIRINOGENOS Y PORFIRINAS.
FIGURA 3. ESTRUCTURA DE LOS ISOMEROS DE LAS PORFIRINAS.
En 1a Naturaleza solo se han hallado los ísómeros
I y III pero los primeros son productos de síntesis anor­
mal en el camino metabólico de las porfirinas. La proto­
porfirina de la hemoglobinay las otras hemoproteínas tie­
nen comoestructura básica a la porfirina isómero tipo III.
Podrian existir teóricamente 15 ísómeros de la protopor­
firina que fueron nominadospor Fischer et al (1925),del
I al XV. Solamente la designada como isómero IX ha sido
identificada comofisiológica, siendo por definición ísó­
mero tipo III.
Meta10porfirinas.
Las porfirinas se combinan fácilmente con metales,
formando parte de la estructura de compuestos de gran impor
tancia biológica.
Los complejos de hierro se conocen con el nombre de
hemos, especificándose la naturaleza de 1a porfirina con
un prefijo adecuado, como por ejemplo mesohemo. E1 más co­
nocido es el protohemoo hierroprotoporfirina, en el cual
el metal puede estar en cualquier estado de oxidación. En
1a práctica se utiliza el término hemoy hematina para re­
ferirse a1 protohemoferroso y férrico, respectivamente.
El hemo, grupo prostático de la hemoglobina, se oxida
rápidamente en contacto con el aire, a hematina o hemina
(cloruro de protoporfirina férrica) si hay iones cloruros
presentes. Este cloruro, que es estable y es 1a forma usual
en 1a cual se aísla el grupo prostático de la hemoglobina,
es el más utilizado en estudios bioquímicos.
El hemopresenta una estructura planar, ubicándose
el hierro en un mismoplano con la protoporfirina (Fig. 4).
El metal puede unirse por coordinación con dos iones, ubi­
cados arriba y abajo del anillo dando los hemocromos o hemo
cromógenos. Entre las sustancias que pueden formarlos se en
cuentran el peróxido de hidrógeno, monóxido de carbono, oxí
geno, iones cianuro y bases nitrogenadas como la piridina
y el amonio.
CH2 ïH,
CHz CH2
COOH coou
FIGURA 4 ESTRUCTURA DEL HEMO.
En la hemoglobina de mamíferos, responsable del
transporte del oxigeno desde los pulmoneshasta los tejidos
y del C02 en forma inversa, se determinaron 4 moles de hemo
por mol de hemoglobina. Cada uno de los 4 átomos de hierro
de la hemoglobina puede tomar un mol de 0xigeno,dando lugar
a la oxihemoglobina. En ambas formas, con oxigeno o libre de
él, el hierro se encuentra en estado ferroso. Si el átomo
de hierro se oxida a la forma férrica, el compuesto resul­
tante, la metahemoglobína, es incapaz de transportar oxige­
no.
En los citocromos, el transporte de electrones y/o
hidrógeno se cumple en virtud de un cambio reversible de
valencia de su hierro hémico.
Clorofilas.
Las clorofílas difieren en su estructura de los hemos
en que son complejos de magnesio, tienen el anillo D (ve­
getales)o D y B (bacterias) totalmente reducidos, y un ani­
llo ciclopentanona adicional (E) formado por ciclación de
la cadena lateral ácido propiónico en C-6 con el meteno 5
Ademásla cadena lateral propiónica en C47está esterifica­
da con un alcohol isoprenoide de cadena larga, generalmente
fitol (Fig. 5).
Clorofila a R1=CH=CH2
¡(2.1343
CIoroHla b R1: CH=CH2
E
H -——E=0
tu:2 E Bactcrloclorofila R1: CD-EH3
(|Z=0 ¿[J R2: CH3 y cl anillo B
(l) cua redUcldo como el D
FIGURA 5. ESTRUCTURA DE LAS CLOROFILAS.
En 1a naturaleza existen diferentes tipos de clorofi
las. Las más conocidas son la a, b y la bacterioclorofila,
que difieren entre si en los sustituyentes de los carbonos
externos de los anillos pirrólicos.
Teniendoen cuenta las similitudes estructurales del
hemoy la clorofila, era dable esperar que sus biosintesis
siguieran caminos comunes. Esto fue confirmado por Granick
(1948, a y b) sobre mutantes de Chlorella que no producían
clorofila pero acumulaban protoporfirina IX o Mg-protopor­
firina IX. Ademásse demostró que la protoporfirina IX se
sintetiza en el cloroplasto de la planta por el mismocami
no biosintético que el protohemo en la célula animal (Gra­
nick, 1954).
La protoporfirina IX es el último miembro común a los
caminos biosintéticos del protohemoy 1a clorofila, a partir
del cual, la inserción de hierro lleva a 1a formación de prg
tohemo y 1a de magnesio a 1a de Mg-protoporfirína IX, el prg
cursor de 1a clorofila.
Corrinas.
E1 grupo de la vitamina B12 conocido también como co­
balaminas o corrinas, comprende un gran número de compues­
tos con el núcleo tetrapirrólico quelado con un átomo de cg
balto. Estos compuestos se encuentran además combinados con
cianuro, frecuentemente comoderivados de cianocobalaminas
con diferentes sustituyentes.
La forma coenzima de 1a vitamina B12 posee el grupo
ciano reemplazado por un residuo adenosil (Fig. 6).
Los anillos corrinicos derivan de los mismosprecur­
sores que las porfirinas, separándose los caminos a nivel
de uroporfirinógeno III.
10.
“¿N-[IC-HzC-IIZC H LÍH3 CHa -Cll2—CU—NHZ
“zw-0042€ H
H3C cn+2—cn¿,-co-NH2
HáN-OC-HZC ¿“3
H' CH
CD H C H C C CH3 H CH —CH -CO-NH
l — 2 — 2 H3 2 2 2
hlíH
H c-cn
3 \ _ u
U\ /0 /N\C/C\C/CH3
/IP\ HC ¡1 eo o \N/ N7 \cu
FIGURA 6. ESTRUCTURA DE LA VITAMINA B12.
11.CAPITULO II: BIOSINTESIS DEL HEMO.
La capacidad de sintetizar hemo es común a todas las
células aeróbicas de animales, plantas y bacterias. Cada
paso de la biosintesis del hemoes el resultado de la acción
de una o más enzimas que pueden tener localización citoplag
mática o mitocondrial, como se esquematiza en la Fig. 7.
fi W
GLICINA ALA-S ALA-D
+ ___.> ¿ALA___)PBG
PBG
SUCCINIL CoA l DEAMINASA
HIDROXIMETIL
HEMO BILANO
++ .
Fe FERROQUE URO GENO III
COSINTETASALATASA.
WCLOROFILAS CORRÉNAS
PROTOPORFIRINA 1x " IÏRO'GENO III
o PROTO'GENO 'ox URO'GENO
2
COPRO ' GENASA DECARBOXILASA
PROTO'GENO(——— COPRO'GENOIII
IX o
.2
\ mitocondria J citoplasma
EIGURA 7. ESOUEMA DEL CAMINO BIOSINTETICO DEL HEMO.
E1 camino biosintético del hemocomienza a partir de
la unión en la mitocondria de los precursores glicina y
Succinil CoA,proveniente del ciclo de los ácidos tricarbo­
xilicos, para formar el ácido 8 aminolevúlico (á ALA). El
paso siguiente es 1a condensación citoplasmática de dos mg
léculas de 5 ALApara formar el monopirrol porfobilinógeno
(PBG). Posteriormente cuatro de estos monopirroles se unen
dando origen al uroporfirinógeno III (URO'genoIII), primer
intermediario tetrapirrólico. A través de una serie de des­
carboxilaciones secuenciales de las cadenas laterales, éste
se transforma en coproporfirinógeno III (Copro'geno III),e1
cual sigue descarboxilándose en el compartimiento mitocon­
drial para dar el protoporfirinógeno IX (proto'geno IX).Por
medio de una oxidación enzimática se obtiene 1a protofiri­
na IX, en la cual se inserta posteriormente el Fe++ dando
orígen al hemo.
La elucidación de la secuencia de reacciones involu­
cradas ha sido el resultado de extensos e importantes tra­
bajos realizados con marcadores isotópicos en varios labora
torios (Cookson y Rimington, 1953; Neuberger y Scott, 1953;
Shemin y Russel, 1953; Granick y Bogorad, 1953; Rimington
y Krol, 1955).
A continuación se describirán cada una de las etapas
de la biosíntesis del hemoa partir de moléculas simples
comoglicina y succinato.
Biosintesis de 6 ALA.
El primer precursor de la biosintesis del hemoes el
ó ALA,formado por condensación de glicina y Succinil
CoA, en una reacción catalizada por la enzima 6 aminolevú­
13.
lico sintetasa (ALA-S)(Succinil CoA-glicina C-succinil
transferasa (decarboxilante)EC 2.3.1.37).
Esta enzima ha sido encontrada desde bacterias, in­
cluso las fotosíntéticas, (Kikuchi et al., 1958; Tait, 1973)
hasta mitocondrias animales (Gibson et a1., 1958;andeflumdt
et al, 1969; Scotto et a1., 1983). En sistemas de orígen ve
getal fue detectada por primera vez por Wider de Xifra et
a1., en 1971.
La condensación de Glicina y Succinil CoArequiere fos
fato de piridoxal (PPy). Este, unido a 1a enzima, forma una
base de Schiff con la glicina, la cual se hace más reactiva
al establecerse un carbanión capaz de reaccionar con el Suc­
cinil CoA.Luego por descarboxilación del grupo carboxilo
de la glicina se obtiene el ó ALA(Gibson et a1., 1958;
Kíkuchi et a1., 1958; Scholnick et al 1972b; Akhtar et a1.,
1976).
El succinil CoAutilizado en esta reacción, estaría
provisto por la acción de la Succinil CoA-sintetasa sobre
succinato y CoAen presencia de nucleosidotrifosfatos e io­
nes Mg++(Kikuchi et a1., 1958; McKayet a1., 1969). También
puede formarse a partir de «i-cetoglutarato por acción de
la d.-cetoglutarato deshidrogenasa (Laver et a1., 1958;
Gibson et a1., 1958) o a partir de Metilmalonil CoAcon
intervención de la metilmalonil isomerasa y CoB12(Nakao &
Takaku, 1968; Cavender, 1971).
La enzima ALA-Sha sido purificada de mitocondrias a­
nimales (Kaplan, 1971; Whiting & Granick, 1976; Ades & Harpe,
14.
1981; Wattanabe et al., 1984), de Rhodopseudomonasspheroi­
des (Lascelles, 1975) y de citosol de higado de rata como
precursor inmaduro (Scholnik et al., 1969, 1972a y b;hmnudü_
et al., 1980).
Tambiénse encontró que las plantas y algas, incluyen­
do cíanofitas procaríotas, son capaces de formar 6 ALApor
otra ruta, partiendo de glutamato, vía un camino de 5 car­
bonos (Beale et al., 1975; Avissar, 1980; Oh-Hamaet al.,
1982; Porra et al., 1983) Euglena gracilis posee ambos cami­
nos: los tetrapirroles de los plástidos son sintetizados ex­
clusivamente a partir de Glutamato y los de mitocondria, in­
cluido hemoa, a partir de glicina (WeinStein & Beale, 1983).
En el alga roja Cyanidíumcaldarium se utiliza solamente la
vía del glutamato (Weinstein & Beale, 1984) y lo mismo se
comprobó en maiz (Zea mays) (Schneegurt & Beale, 1986).
Hansido descriptas una gran cantidad de sustancias,
de variadas estructuras químicas, capaces de provocar un in­
cremento importante en la actividad de ALA-S(Granick, 1966,
Marver et al. 1966a, Tomita et al., 1974, Kikuchi & Hayashi,
1981). Trabajando con pacientes que presentaban un tipo de
porfiria hepática conocida comoporfiria aguda intermitente,
Tschudy et al (1965), encontraron un marcado incremento en
1a actividad de esta enzima.
Granick (1966) y posteriormente Scholnik et a1 (1969)
demostraron que ALA-Ses una enzima inducible y que, al me­
nos en el higado, está sujeta a represión e inhibición por
15.
hemo. La inducción de ALA-Simplica una sintesis de novo de
1a molécula proteica (Whiting & Elliot, 1972). La formación
del primer precursor 5 ALAes decisivo para la biosíntesis
del hemo, ya que ALA-Slimita la velocidad de la secuencia
de reacciones posteriores (Granick, 1966; Marver et a1.,
1966 b). A ella se le asigna el rol regulatorio primario del
camino (Sassa & Granick, 1970; Granick & Sassa, 1971; Marver
et a1., 1968).
Ha sido demostrado que la actividad de ALA-Sen higado
de rata fetal es aproximadamente 10 veces mayor que la de
adultos, lo que reviste particular interés desde el punto de
vista fisiológico y regulatorio (Woods,. 1974). La actividad
lentamente decae a los valores de 1a rata adulta pocos días
después del nacimiento. Durante el periodo fetal 1a enzima
no es inducible por drogas y es refractaria a la represión
por hemo. Woods & Murthy (1975) postularon que la ALA-S fetal
es funcionalmente activa y similar a la adulta pero que su
regulación es distinta, lo que podria ser explicado en tér­
minos de diferencias en la función mitocondrial en ambas e­
tapas del desarrollo.
Yamamotoet al (1985) han obtenido clones cDNAque con
tienen secuencias codificadoras de ALA-Sde embriones de
pollo y Maguire et al (1986) han aislado el gen completo de
ALA-Sde higado de pollo. Este es de 6,9 kilobases de largo
y contiene 10 exones; los exones 4 a 10 codificarian para
la enzima activa, mientras que los tres primeros lo harian
para el precursor citosólico de PMmayor y para la secuencia
16.
necesaria para el transporte a mitocondrias.
Biosintesis delgporfobilinóggno.
El <5ALAformado en la mitocondría pasa a citoplasma
donde por medio de la enzima citosólica ó aminolevúlico­
dehidrasa (ALA-D)(PBG-sintetasa, 5-aminolevúlico hidrola­
sa) (E.C. 4.2.1.24), dos moléculas formando base de Schiff
con la enzima, son condensadas asimétricamente con libera­
ción de H20 y obtención del monopirrol, porfobilinógeno
(PBG).
Comose ilustra en la Figura 8 una molécula de 6 ALA
integra el lado propiónico (P) del PBGinterviniendo el N
en el anillo pirrólico mientras que la otra molécula de ¿ALA
da la cadena acética (A), manteniendo libre su grupo amino.
COOH COOH
l
ïuz COOH (P) GHZ COOH (A)
CH2 CIH2 CÏZ CIH2 + 2 H20
c=o c H2 c — c
Í l // \\
CHZ (l;=o HC c\I
NH2 CH2 \ N / CH
l H
NHZ NH2
ALA PBG
FIGURA 8. BIOSINTESIS DEL PORFOBILINOGENO.
Esta enzima se ha detectado en tejidos animales y ve­
getales cuyo metabolismo sea al menos en parte aeróbico. Se
ha purificado y caracterizado de diversas fuentes: bacterias
17.
(Nandi et a1., 1968; Yamasaki & Moriyama, 1971; Van Heyningen
& Shemin, 1971: Nandi & Shemin, 1973) levaduras (de Barreiro,
1967) vegetales (Shetty & Miller, 1969; Tigier et a1., 1970)
ratón (Coleman, 1966; Doyle & Schímke, 1969; Doyle, 1971) ra­
ta (Tomioet a1., 1968), bovino (Batlle et a1., 1967; Wilson
et al, 1972; Gurba et a1., 1972; Cheh & Neilands, 1973; Wu
et a1., 1974; Gurne et a1., 1977; Hasnain et a1., 1985) gui­
nea pigs (Weissberg & Voytek, 1974) y humano (Anderson &
Desnick, 1979; Despaux et a1., 1979; Bustos et a1., 1980;
Gibbs et a1., 1985 b).
Ha sido asignado una región cromosómica para el gen
estructural de ALA-Dhumana (Eiberg et a1., 1983; Wanget al.
1985) y el cDNAque 1a codifica, clonado y parcialmente se­
cuenciado (Wetmuret al, 1986).'
El peso molecular de ALA-Dnativa ha sido estimado
para la mayoria de las fuentes en 280.000 daltons (Cheh &
Neilands, 1973; Wuet a1., 1974; Shemin, 1976) y la determi­
nación electroforética en presencia de SDSy pSH en geles de
poliacrilamida indicó que la enzima es homomultimera, confor
mada por 8 subunidades de PM35.000 daltons (Wuet a1., 1974;
Tsukamoto et a1., 1975). En ratón, la enzima sería un hexá­
mero con subunidades de 40.000 daltons y PMtotal 250.000
daltons (Doyle, 1971). En espinaca Liedgens et al. (1983)
informan 6 subunidades de 50.000 daltons cada una (hexámero
de 320.000). Wuet al. (1974) observaron por microscopía e­
lectrónica que la enzima cristalizada de hígado bovino se
estructura en 4 lóbulos colocados en las cuatro esquinas de
o
18.
un cuadrado. Al ser 8 las subunidades, estos 4 lóbulos se
agrupan con otros 4 dirigiéndose cada uno hacia los vérti­
ces de un cubo observando una simetria dihédrica D4. Solo
4 de las 8 subunidades reaccionarian con el sustrato, cada
una formando una base de Schiff con una molécula de 6 ALA
(Shemin, 1975). (Figura 9).
UU
FIGURA 9. MODELO DE ESTRUCTURA CUATERNARIA DE ALA-D.
Trabajando con ALA-Ddekúgado bovino, hemos postulado
que la estructura minimanecesaria para la actividad es un
dimero funcional formado por 2 clases de subunidades que
posiblemente, teniendo similar composición juegan un rol di
ferente en la sintesis del PBG(Batlle et al., 1978).
Una caracteristica casi común a todas las ALA-Des su
sensibilidad al oxigeno, asociada a residuos de cisteina al
tamente reactivos requeridos para actividad y estabilidad
(Tsukamoto et al., 1979; Barnard et al., 1977; Seehra & Jor­
dan, 1981) necesitando un compuestocomocisteina,ditiotreitol
19.
(DTT), P mercaptoetanol (/35H) o glutation reducido para
expresar al máximola actividad enzimática (Granick y Mauze­
rall, 1958a; Coleman, 1966; Batlle et a1., 1967; Nandi & Way
good, 1967; Nandi et a1., 1968; Ho & Lascelles, 1971). Por
lo tanto, inhibidores de grupos -SH como iodoacetamida,p­
cloromercuriobenzoato, ditiobisnitrobenzoico, N-etilmaleimi
da, tienen el efecto de disminuir notoriamente su capacidad
catalítica (Batlle et a1., 1967; Coleman, 1966; Barnard et
a1., 1977). Algunas enzimas purificadas de plantas superio­
res parecen diferir ya que no resultan esenciales los grupos
-SHpara la actividad, siendo insensibles a iodoacetamida
como comprobaron Liedgens et a1. (1983) en ALA-Dde espinaca.
Por análisis de aa totales de ALA-Dpurificada de hí­
gado vacuno por diversos autores (Shemin, 1976; Tsukamoto et
a1., 1979; Kreutzer et a1., 1977) se calcularon entre 7 y 9
grupos -SH por subunidad de PM35.000. En base a estudios en
enzima de higado de vaca y de callos de soya (Batlle et a1.,
1967; Ferramola et a1., 1972) concernientes a la reactivi­
dad de los grupos -SH con DTNBse los clasificó según su vg
locidad de reacción, deducíendo que habría grupos responsa­
bles en mantener la actividad enzimática y otros que serían
desenmascarados al desplegar 1a enzima con urea 8M. Gibbs &
Jordan (1981) informaron que serían 32 los grupos tiólicos
reactivos por octámero o sea 4 por subunidad en la enzima
aislada de hígado de vaca.
Tsukamotoet al. (1979) titulan 8 grupos reactivos por
subunidad: 2 grupos -SH muy cercanos reaccionan dentro del
20.
1er. minuto (tipo I), luego son modificados 3 tioles dentro
de la 1ra. hora (tipo II) y por traumúenu) con SDSse libe­
ran 3 grupos extras (tipo III). Seehra et al. (1981) encon­
traron una diferencia significativa en la reactividad de los
-SH del grupo I clasificados por Tsukamoto, lo que los lleva
a postular un grado de asimetría en la molécula octamérica.
La actividad enzimática depende de estos restos sulfhi
drílicos vecinos de tipo I en estado reducido, ya que la oxi
dación de los mismosconduce a una inactivación total.
La presencia de Zn disminuye la velocidad de reacción
de los tioles del tipo I, en tanto que la oxidación de los
mismos produce una liberación del metal que forma parte de
la estructura proteica del ALA-Dde higado vacuno (Tsukamoto
et a1., 1979; Seehra et a1., 1981; Gibbs et a1., 1985 a).
Dependiendo del origen, ALA-Dpuede o no requerir
complejar un ión metálico para su actividad máxima (Ho &
Lascelles, 1971; Abdulla et a1., 1976; Wilson et a1., 1972).
Cuando lo contiene generalmente es Zn o Cu (Gurba et a1.,
1972; Cheh & Neilands, 1973; Tsukamoto et a1., 1975) pero
puede ser Mg (Leidgens et a1., 1983) o K (Nandi & Shemin,
1968 , Nandi et a1., 1968).
El EDTAy la 1-10 fenantrolina, quelantes de Zn, inhi
ben reversiblemente la enzima aislada de mamíferos, reacti­
vándose completamente por agregado de Zn++ ó Cd++ o parcial
mente con Co++ y Mn++. En cambio otros iones fueron inefi­
caces: Ni++, Fe++, Fe+++ Cu+, Cu++, Mg++, Ca++ y Cr3+ (Cheh
& Neilands, 1973).
El ALA-Dpurificada de higado bovino pierde el Zn du­
rante el procedimiento de purificación, con lo cual resulta
una metaloenzima atípica. Hasta hace muypoco no habia acueg
do sobre la estequiometria del complejo Zn-enzima; varios
autores concuerdan ahora en 8 iones Zn (II)/octámero (Tsuhmwto
et al., 1979; Sommer& Beyersmann, 1984).
Bevan et al., (1980) y luego Jaffe et al. (1984) en­
contraron en ALA-Dde higado bovino que la enzima tiene un
requerimiento de 4 iones Zn/octámero para expresar actividad
en forma completa y que es necesario que los grupos -SH estén
reducidos para ligar apropiadamente al ión metálico. Además
si la purificación se realiza en presencia de ZnCl2 10 yM,la
holoenzima contiene 8 iones Zn/octámero, presumiendo que la
función de estos últimos 4 iones adicionales es la de mante­
ner la estructura homooctamérica (Tsukamotoet al., 1979,1980;
Jaffe et al., 1984).
Seehra et al.(1981) informaron que la presencia del Zn
no sería obligatoria para la actividad de ALA-De incluso
podría ser innecesaria trabajando con concentraciones altas
(20 mM)de un reactivo tiólico, coincidiendo en que el papel
del metal seria el de permitir que ALA-Dtuviera una con­
formacióncatalítica apropiada.
El número de coordinación del Zn en ALA-Dfue investi­
gada por Hasnain et al. (1985) estableciendo que la ligadura
seria con 3 átomos de S y 1 de N u 0. El Zn (1 atg/subunidad)
protegería de la oxidación al aire a sus ligandos tiólicos
pero no a otros grupos -SH. Asi este metal tendria un rol es­
tructural permitiendo a la enzima adoptar 1a conformación
requerida para ser cataliticamente activa, sin unir o acti­
var al sustrato directamente, lo que ha sido confirmado por
Gibbs et a1. (1985 a).
Jaffe & Hanes, (1986) utilizando NaBH4para reducir
la base de Schiff formada entre 14C-ALAy la holoenzima y
la apoenzima con y sin grupos -SH modificados, concluyen
que la enzima posee 4 sitios activos por octámero o sitios
con reactividad media y que además no son necesarios grupos
-SH reducidos ni Zn++ en la enzima para que se produzca la
base de Schiff.
A1 ser sulfhidrilica, esta enzima es inhibida por me­
tales pesados, estableciéndose que el grado de inhibición
seria inversamente proporcional al producto de solubilidad
de sus respectivos sulfuros (Granick & Mauzerall, 1958 a).
Uno de los metales más estudiados en cuanto a sus efeg
tos sobre el ALA-Des el plomo (Pb) y resulta frecuente la
utilización de la medida de la actividad de esta enzima como
indice sensible de la exposición al mismo. (De Bruin, 1968;
Hernberg et al., 1970; Chisolm et al., 1985). La acción in­
hibitoria deeste metal ha sido comprobadatanto in vivo co­
mo in vitro (Gibson et al., 1955; Wilson et al., 1972) compor
tándose en este último caso comoun inhibidor no competitivo
(Weissberg y Voytek, 1974).
Las investigaciones de Wilson et al. concluyen que el
Pb en concentraciones de orden pMera un inhibidor efectivo
de ALA-Daún en presencia de tioles aunque esto no fue deteg
tado por otros autores en enzima de distintas fuentes, que
lograron revertir el efecto inhibitorio por agregado de Glg
tation reducido, Cisteina o Ditiotreítol (de Barreiro, 1969;
Mitchell et a1., 1977; Fujita et a1., 1981; Chilsom et a1.,
1985).
El Cd que en ciertas concentraciones puede activar y
revertir el efecto del Pb, con una preincubación con la en­
zima invierte su efecto inhibiéndola (Mitchell et a1., 1977;
Davis y Avram, 1978, 1980).
También ejercen efecto inhibitorio el Cu, Hg y Ag que
forman sulfuros de baja solubilidad (Abdulla et a1., 1976;
Meredith et a1., 1974).
La observación de que el Zn puede compensar el efecto
inhibitorio de iones metálicos pesados en ALA-Dde tejidos
de mamíferos indica una reactivación de la Zn-enzima por
desplazamiento del ión extraño (Fínelli et al. 1975) pero
según Gibbs et al. (1985 a), el Zn y el Pb tendrían sitios
de unión a la enzima independientes. En base a estudios flug
rométricos afirman que el Zn cambia la reactividad de los
grupos -31frente a la oxidación y a la acción del DTNBmien­
tras que el Pb no los afecta.
Ademásde los grupos tiólicos se ha propuesto que en
la enzima aislada de higado bovino, el aa histidina tiene
importancia en la catálisis (Tsukamotoet a1., 1975) mientras
que arginina se encontraría en la de espinaca (Liedgens et
24.
a1., 1983). En B¿_spheroides, Nandi & Shemin (1968 b) postu
laron a la lisina involucrada en el sitio activo. En ALA-D
humana ha sido confirmado inequívocamente por Gibbs y Jordan
(1986) por comparación de lisil-ALA obtenido químicamente y
el aa aislado del sitio activo unido a sustrato 14C.
Estudios con enzima de bacterias (Nandi & Shemín,
1968 b) y de mamíferos (Cheh & Neilands, 1976; Jordan & Seehra,
1980 a) establecieron que el tratamiento con NaBH4en preseg
cia de sustrato marcadoradioactivamente inactiva a la enzi­
ma y que la marca se incorpora a la misma por reducción de
la unión entre el sustrato y la enzima. Aplicando esta meto­
dologia, Nandi & Shemin (1968 a y b) fueron los primeros en
estudiar el mecanismo de reacción de ALA-Den R.spheroides.
Batlle & Stella (1978) postularon que en una primera etapa
una molécula de 5 ALA(I) forma una base de Schiff a través
de la combinación de su grupo ceto con un grupo amino de un
residuo lisina del sitio activo de la subunidad (I) de
ALA-D(Fig. 10).
La subunidad (II) se une a otra molécula de ¿ALA(II)
mediante un enlace no covalente. Los contactos entre las sug
unidades (sitios A y B) pueden ser de diferentes tipos: in­
teracciones iónicas o puente hidrógeno entre restos tirosina,
triptofano o -SH, enlaces covalentes entre grupos -SH y Zn
o interacciones hidrofóbicas.
En esta etapa inicial se producen interacciones entre
el carboxilo y el amino terminales de las dos moléculas de
25.
mPum...Íu­l.OI* wnun(Iuu.\\\\\\\\\\Rxx.\\\\\.\\\\\\.\\\\\k\\\\\\\l.vI_u(a(I(ItHSAANwwwAw\üwmmmwz.A-.uQSNN5undA _m ._¡.-u¡\.\.\..n..\K\..l\\...:xN.'I“xvm«\\.\\w.\\\\\\u\\\.\h \RKMn._¡.1..."u.u.(¡cuzlnx..u...\Ñ\\\\\\\\\\\.\\xxï.N....«WQVAHuM_('NI('N/ImuÍ.,\.\\.\\\\\\\....\..un....5.beSx.lWü““&wxmnxc“¿KRWn __usxcun\....xx..\s\\\..I.. ..\..\Ion“
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.
un.*
-DMECANISMO DE LA SINTESIS DE PBG POR ACCION DE ALA
__ >­PROPUESTO POR BATTLE Y STELLA ( 1978
FIGURA 10.
26.
sustrato y dos residuos de carga contraria de 1a enzima. El
grupo histidina de la subunidad (I) estabilizaria el carba­
nión resultante y la base de Schiff. En la segunda etapa, el
carbanión estabilizado efectuaria un ataque nucleofilico so­
bre un grupo U carbonilo de la molécula de «SALA(II). Luego
se produce una condensación aldólíca y un reordenameinto de
electrones y protones mediados por los residuos histidina y
lisina de ambas subunidades.
En 1a quinta etapa tiene lugar un tipo de transamina­
ción cuyo resultado es la separación del producto PBGde su
unión covalente con la enzima y en la sexta ocurre un reor­
denamientoelectrónico de los restos histidina.
La conclusión de los trabajos de Nandi & Shemin era
que la molécula de 6.ALAinvolucrada en la base de Schiff
daria luego el lado acético (A) del PBG,postulación efectua
da trabajando con un inhibidor competitivo del sustrato, el
ácido levúlico.
Esto ha sido revisto por el laboratorio de Jordan.Tra­
bajando con enzima de mamíferos establecieron un orden de
unión inverso de las dos moléculas de sustrato al sitio ac­
tivo, diferenciándolas por utilización de sustrato radioac­
tivo en cantidades estequiométricas y sustrato no marcado en
exceso. Al tener un sitio de unión mayor afinidad por el sus
trato, el PBGresultante tuvo marcación preferencial indican
do que el mecanismo más probable es aquél en el cual la
primer molécula de ó ALAque se une integra el lado propió
nico (P) del producto. (Jordan &_Seehra, 1980 a y b; Jordan
& Gibbs, 1985).
Comparando la actividad de ALA-Den tejidos hematopoyé
ticos, su mayor expresión la alcanza en nonmflúastos basófi­
los (Battistini et a1., 1971). El eritrocito madurono con­
tiene las enzimas mitocondriales de la biosintesis del hemo
(Schmid & Shemin, 1955; Granick & Levere, 1964) ya que no pg
see mitocondrias pero si las enzimas citosólicas, entre ellas,
la ALA-D.Aunque solo un remanente del contenido de las en­
zimas permanece, parecería que los eritrocitos poseen la mig
ma concentración de ALA-Dque los normoblastos nucleados y
con mitocondrias, aunque ya no tendria importancia funcional.
La actividad del ALA-Dhepático parece ser mucho mayor
durante el desarrollo embrionario que en el higado de un ra­
tón adulto, alcanzando el nivel normal al momentodel naci­
miento. (Freshney & Paul, 1971). El aumento de actividad en
el estado embrionario está probablemente relacionado con la
gran proporción de células eritroides en el higado fetal
(Freshney & Paul, 1971). Inmediatamente después del nacimien
to la actividad decrece, posiblemente porque la hematopoye­
sis ocurre ahora en la médula ósea, y luego aumenta lenta­
mente (Russell & Coleman, 1963).
Por ensayos de inmunoreactividad se concluyó que ALA-D
fetal es cataliticamente el doble de activa por molécula de
ALA-Dadulta inmunoquimícamente reactiva (Doyle & Schimke,
1969). Esta mayor reactividad podria atribuirse a un activa­
28.
dor tisular, a una estructura terciaria másefectiva o a una
modificación en la estructura primaria que afecta al sitio
catalítico pero no alantigénico (Doyle & Schimke, 1969).
Estos autores se inclinan por esta última posibilidad ya que
la ALA-Dfetal resulta menos labil al calor y más estable
a la digestión con tripsina,pero no pudieron encontrarse
otras diferencias esenciales.
ALA-Dde tejidos hematopoyéficos<3no, tienen idénticas
caracteristicas físicas y químicas (Coleman, 1968) pero la
observación de que la fenilhidracina no tiene efecto en 1a
enzima hepática indicariacfiferafles mecanismosfisiológicos
de control en la inducción o síntesis de ALA-Den los teji­
dos no hematopoyéticos (Coleman, 1968).
Weissberg & Voytek (1974) encontraron que ALA-Dfetal
y adulta de higado y eritrocitos de cobayos presentan el mig
mo comportamiento en DEAE-celulosa y en geles de acrilamida,
tienen el mismo pH óptimo, punto isoeléctrico y KM,pero ob
servaron diferencias en las inhibiciones in vitro por hemina
(mayor inhibición en las enzimas purificadas de glóbulos rg
jos que de hepatocitos), Pb y Hg en presencia o no de glutg
tion. Estos resultados atribuirian al contenido celular de
los agentes activantes de grupos tiólicos, un posible rol
en la regulación de ALA-Din vivo.
La hemina también ejerce efecto inhibitorio en la enzi
ma de origen bacteriano (Yamasaki & Moriyama, 1971; Ho &
Lascelles, 1971) y se determinó que es capaz de inhibhrcompe
29.
titivamente a ALA-Dde higado de ratón (Doyle & Shimke,1969).
Hemolibre y hemoglobina, pero no otras hemoproteinas inhi­
ben la ALA-Dde eritrocitos humanos (Calíssano et a1., 1966)
asi comola protoporfirina IX a la enzima de igual origen
(Steiner et a1., 1964) y a 1a de B¿_ggheroides (Nandi et a1.,
1968). Mientras que la inhibición por hemina, protoporfirina
y protoporfirinógeno era baja o insignificante, la copropor­
firina III y el coproporfirinógeno III resultan inhibidores
más efectivos del ALA-Dde Neurospora crassa (Muthukrishnan
et a1., 1972).
Biosintesis de uroporfirinóggno III.
E1 siguiente paso de la biosintesis requiere la conden
sación de 4 moléculas de PBGpara obtener un macrociclo te­
trapirrólico, el uroporfirinogeno III(Uro'geno III). Esta
reacción está catalizada por un complejo enzimático llamado
Porfobilinogenasa (PBG-asa) compuesto por 2 proteínas distin
tas: la PBG-Deaminasa(PBG-D)(Uro'geno I sintetasa, Hidroxi­
Metilbilano sintetasa) (E.C. 4.3.1.8) y la uro'geno III-Co­
sintetasa (Uro-CoS)(Isomerasa) (E.C.4.2.1.75) que difieren
en su estabilidad frente al calor. (Bogorad &Granick,1953).
La PBG-Des relativamente estable y lentamente convier
te a1 PBGen Uro'geno I mediante una condensación repetida
cabeza-cola; con eliminación de NH3. La UroCoSno actúa sobre
PBGni Uro'geno I pero si está presente la PBG-Docurre una
modificación en la orientación de uno de los anillos pirró­
licos sintetizándose el Uro'geno III. (Fig. 11).
30.
P
A \ \ 2
NH
+
“a” n.
(1)
p
A \
\A
- NH
X
O .
(2) XÏNHJ Deamnasa
(MX-OH
P A
A P
p A
A P uno A P'
K (501 Cosintetasa (6).Uro'gen-I
P 5 A
A P
zo ¡o
A A
P 15 P
(Mt (7)Uro'gen—m
(13m. H (15)‘ Preuro'gen‘
(mas Me
pMe AM2 P p
A“ \ / PM' A ‘ A \
\. . / . . .. \ NH \ NH
NH HN
x COZCHzPh 4. ‘
- N + NH
(snx-cozau‘ Me ¿ Me 3
(10)x - cozn Ñ\ l; (,6,
(u) x - CHO m)
A = cu,co,u, v = (:H,(:H,(:o,u_ AI- = CH¡C()¡Me,
l"“ Cll,(‘ll,('.(),Mu, A“ = cu,c«>.u, 1'" -_-(ill,Cll,(L().l(,
o = “C. A -"N.
FIGURA 11. BlOSINTESIS DE UROPORFIRINOGENOIII.
31.
UroCoSse inactiva por calentamiento a 559G durante
30minEnla mayoria de las fuentes estudiadas, el complejo
PBG-asaes citoplasmático aunque existen evidencias de su
asociación a membranas (Falk & Dresel, 1960; Carell & Kahn,
1964; Rossetti et a1., 1986).
La PBG-Dha sido purificada y estudiada de varias fueg
tes: germen de trigo (Frydman & Frydman, 1970); R. sEheroidgg
(Davies & Neuberger, 1973; Jordan & Shemin, 1973); guglggg
gracilis (Williams et a1., 1981) eritrocitos de ave (Llambías
& Batlle,1971 a) y de humanos (Frydman & Feinstein, 1974),
higado bovino (Sancovich et a1., 1969) y de rata (Piper & Van
Lier, 1977), callos de soja (Llambías & Batlle, 1971 b), ho­
jas de espinaca (Bogorad, 1962; Higuchi & Bogorad, 1975),en­
contrando que es una enzima sulfhidrilica y por lo tanto
fuertemente inhibida por p-cloromercuribenzoato y N-etilma­
leimida (Jordan & Shemin, 1973; Frydman & Feinstein, 1974).
Los agentes quelantes de iones metálicos no tienen efecto,
por lo menos en 1a enzima de R. sEheroides (Jordan & Shemin,
1973). En 1a enzima aislada de casi todas las fuentes se en­
contró que es un monómerode PMalgo inferior a 40.000 dal­
tons, salvo en eritrocitos humanosdonde se informó 25.000
daltons (Frydman & Feinstein, 1974).
Ha sido clonado y secuenciado un cDNAque codifica 1a
PBG-Dde eritrocitos humanos, demostrando que el gen existe
como una sola copia en el genoma humano (Raich et a1., 1986).
Tambiénse determinó la secuencia nucleotidica del gen es­
tructural de PBG-Dde E. coli consistente en 942 pares de
bases que codifican al monómero (Thomas & Jordan, 1986).
A su vez, 1a UroCoSse ha obtenido de callos de soja
(Llambías & Batlle, 1971 b), hígado bovino (Sancovich et als,
1969) y de rata (Clement et a1., 1982; Kohashi et a1., 1984),
Euglena gracilis (Rossettí, 1978; Hart & Battersby, 1985) e­
ritrocitos humanos (Frydman & Feisntein, 1974) y de pollo
(Granick & Mauzerall, 1958), espinaca (Bogorad, 1962) bazo
de ratón (Levin, 1968, 1971) y germen de trigo (Higuchi &
Bogorad, 1975).
Tambiénresultó una enzima sulfhidrilica en todos los
sistemas estudiados. Es inhibida por metales divalentes como
Zn++, Cd++, Cu++ (Clement et a1., 1982). En cuanto al PMno
existe acuerdo entre las distintas fuentes o a veces de és­
tas entre si, probablemente por la existencia de fenómenos
de asociación y disociación de un número variable de unida­
des (Llambias & Batlle, 1971 b , Rossettí et a1., 1980).
El mecanismo por el cual la PBG-Dpolimeriza al PBGy
1a estructura del producto de esta enzima han sido sujetos
de numerosas especulaciones y hasta la fecha no han sido acla
radas. El orden de ensamblaje de las 4 unidades pirrólicas
ha sido establecido como que a la PBG-Dse une primero el
anillo A, luego el B, C y finalmente el D (Battersby et a1.,
1979 a, 1983 a y b); (Jordan & Seehra, 1979; Seehra & Jordan,
1980). El sustrato de la UroCoSpuede suponerse que sea el
producto inmediato de la PBG-Do algún intermediario entre
éste y el Uro'gen I. La estructura del sustrato podria lle­
var el anillo D en la misma posición que el Uro'gen III y
esa reacomodación podria efectuarse en algún nivel entre
el monopirrol y el tetrapirrol ya que Uro'geno I no se con
vierte en isómero III por Uro-CoS solo o con adición de PBG­
D (Granick y Mauzerall, 1958) por lo que la isomerización
ocurre en un estadio anterior a la ciclación.
Se intentó estudiar el rol de di y tripirroles como
posibles intermediarios pero los resultados no fueron con­
cluyentes (Hoare & Heath, 1960; Gurne & Shemin, 1973;
Frydman et al 1973; Battersby et al, 1973).Se POStUIaba que
estos pirrilmetanos serian comunesa ambas series isoméri­
cas. Frydmanet al. (1976) en base a estudios realizados
con 2-aminopirrilmetanos sintéticos propusieron un mecanis­
mo que se basa en que la Uro-CoS no es una enzima en si mis
masino una proteína especifica que modificaria 1a actividad
de PBG-Dsobre la condensación del PBG, actuando desde el cg
mienzode la reacción, sintetizando un dipirrol invertido,
cabeza-cabeza, que luego se transformaria en un tripirrol y
por último en el Uro'geno III. Este mecanismo implica que no
hay pirrilmetanos intermediarios comunesen las reacciones
catalizadas por la PBG-Dy la Uro-CoS.
Por otro lado, con estudios espectroscópicos de experi
mentos de inhibición con iones amonio se llegó a postular la
existencia del tetrapirrol (aminometíl)bilano. (Radmer&
34.
Bogorad, 1972; Davies & Neuberger, 1973).Battersby et al.
(1977, 1978a, 1981) postularon que en este tetrapirrol,
ocurría un reacomodamiento intramolecular para dar el Uro'
geno III,concluyendoamique era el intermediario real
(Battersby et a1., 1978 b).
Pero luego se vió que si 1a inhibición se efectuaba
con hidroxilamina o concymetilhidroxilamina se obtenían otros
intermediarios análogos que tenían la mismafacilidad que el
aminometilbilano en convertirse enUnfgem>I no enzimática­
mente con liberación de la base usada para la inhibición,pero
no se transforman en Uro'geno III (Radmer & Bogorad, 1972).
E1 grupo de Scott, trabajando con (2-11 13C)PBGy PBG-D
13€ un intermediario al que llamaron "pre­detectaron por NMR
uroporfirinógeno" (Burton et a1., 1979). Este intermediario
actuaria como sustrato de Uro-CoS en ausencia de PBG-D(Jordan
et a1., 1979) implicando que las enzimas actuarian consecuti­
vamente y no en asociación como se habia supuesto hasta en­
tonces (Frydman & Feinstein, 1974; Higuchi & Bogorad, 1975).
En ausencia de Uro CoS, el preuroporfirinógeno se transforma­
ria químicamente en Uro'geno I.
Posteriormente Battersby et al. (1979 b) obtuvieron evi
dencias para afirmar que el intermediario era el hidroxime­
tilbilano, correspondiente a 1a estructura 5) en 1a Figura
11 y no un intermediario cíclico. Postulan que la PBG-Dune
las moléculas de PBGdando un tetrapirrol lineal y 1a UroCoS
encierra el anillo y lo ordena. En ausencia de Uro-CoS, el
35.
producto de PBG-D,que es inestable, se cicla químicamente
en forma rápida a Uro'geno I. La existencia del hidroximetil
bilano fue confirmada por Scott et al. (1980) pero con cier­
tas reservas ya que no satisfacia totalmente los espectros
obtenidos en NMR13C y 15N.
En 1986, trabajando en la caracterización de las espe­
cies que se acumulan durante la reacción enzimática con el
complejo PBG-asa por medio de espectroscopia NMRIHy 130,
estos investigadores postulan la existencia de varios inter­
mediarios probables sin descartar el Hidroximetilbilano (Evans
et al, 1986 a) pero que en realidad este no seria el produc­
to verdadero de la PBG-D,sino especies de azafulveno (Fig.
12) (Evans et al., 1986 b).
FIG. lg. AZAFULVENO
Recientemente Jordan & Warren (1987) encontraron evi­
dencias de la existencia de un cofactor dipirrilmetano unido
covalentemente al sitio catalítico de la PBG-Daislada de
36.
E. coli. Este cofactor sería el responsable de unirse a1
sustrato y de dirigir la síntesis del tetrapirrol, no in­
corporándose luego en el preuroporfirinógeno.
Decarboxilación de uroporfirinogeno III.
La decarboxilación de las 4 cadenas laterales del áci
do acético del Uro'geno III dando origen a 4 restos metilo
en el Copro'geno III es realizada por una enzima citosólica,
la Uro'geno decarboxilasa (Uro-D) o porfirinógeno carboxilíg
sa (E.C. 4.1.1.37), que puede actuar sobre un gran número
de porfirinógenos sustituidos con ácido acético ya que no
tiene especificidad de tipo isomérico (Jackson et a1., 1976a;
Smith & Francis, 1979) pero lo hace con distintas velocida­
des, habiéndose observando que para reticulocitos de conejos
el orden sería Uro'geno III ) Uro'geno IV > Uro'geno II >
Uro'geno I. (Mauzerall & Granick, 1958).
Durante la bíosíntesis del hemo la Uro-Ddecarboxila
secuencialmente comenzandopor la cadena de ácido acético
del anillo D y continúa en el sentido de las agujas del re­
loj por las cadenas acéticas de los anillos A, B y finalmen­
te C (Jackson et a1., 1976 b) con la formación de los porfi­
rinógenos intermediarios hepta, hexa y pentacarboxílicos
(Batlle & Grinstein, 1962, 1964; San Martín & Grinstein,1968;
Tomío et al, 1970) (Fig. 13).
La decarboxilación sería un proceso bifásico ya que
inicialmente ocurriría una rápida eliminación del primer
grupo carboxilo del uroporfirinógeno y luego una eliminación
37.
Uro'geno III Hepta'geno III hexa'geno III
P M
M P
—> a
M M
P
penta'geno III c0pro'geno III
FIGURA 13. BIOSINTESIS DE COPROPORFIRINOGENO A PARTIR DE
UROPORFIRINOGENO.
más lenta de los tres grupos restantes (Tomio et a1.,
1970). El grupo de Elder et al. (1977 b, 1983) han confir­
madoestos resultados al postular que la Uro-Dconsistiría
en una única proteina formada por 2 subunidades y que exig
tirían dos sitios cataliticos por molécula de enzima aunque
de Verneui].«3t al.(1980) postulan la existencia de cuatro sitos cata
38.
líticos diferentes.
Esta enzima ha sido purificada de bacterias(Hoare &
Heath, 1959) reticulocitos de conejos (Mauzerall & Granick,
1958) eritrocitos de aves (Tomio et a1., 1970; San Martin et
a1., 1969) bazo de ratón (Romeo& Levin, 1971), hojas de ta­
baco (Chen & Miller, 1974) hígado de rata (Smith & Francis,
1979; Aragonés et a1., 1972; San Martin et a1., 1976; Rios
et a1., 1984), higado de pollo (Taira & San Martin de Viale,
1984) higado bovino (Straka & Kushner, 1983), eritrocitos hu
manos (Elder et a1., 1983; de Verneuil et al. 1983); (Elder
& Tovey, 1977 a) y de pollo (Kawanishi et a1., 1983). Es una
enzima que es inhibida por reactivos de grupos sulfhidrilos
por lo que al menos un grupo tíólico estaria involucrado en
1a reacción enzimática (Straka & Kushner, 1983). Comoera de
esperar Glutation y cisteína incrementan la actividad de la
enzima mientras que el oxígeno, probablemente por oxidación
del sustrato, la disminuye.
DeVerneuil et al (1983) obtuvieron una proteína que
se comporta electroforéticamente como un monómerode PM46.000,
aunque la enzima nativa purificada de glóbulos rojos frescos
presentaría un PMde 58.000 daltons en columnas de tamices
moleculares. Esta diferencia podría atribuirse a proteólisis
de la enzima durante el almacenamiento de los glóbulos rojos
a 49C.
Uro-Deritrocitaria es fuertemente inhibida por algunos
++ .++ ++ , ++
metales como Cu , Hg y Pt pero no se afecto con Fe ,
39.
+++ , .
Fe y Pb++. En higado bov1no,Straka y Kushner (1983) in­
formaron un monómerode PM57.000 daltons que resulta inhi­
bido por Fe++, Co++, Cu++, Zn++ y Pb++.
En 1a actualidad ha sido clonado y SECUGHCíaÓOun
cDNAde longitud completa que codifica para la Uro-D huma­
na, lo cual constituye una herramienta valiosa en el estu­
dio de las enfermedades causadas por alteraciones genéticas
en esta enzima.Romeoet a1.(1986) demostraron que la estrug
tura primaria es de 367 aminoácidos y que Uro-D está codifi
cada por un solo gen. E1 análisis de 1a expresión de este
gen indicó 1a existencia de una sola especie de mRNA,tanto
en eritrocitos comoen otros tejidos y que su acumulación
se deberia a una activación transcripcional del gen de Uro-D.
Conversión de coproporfirinógeno III en protoporfirinógeno IX.
El copro'geno III es facilmente transportado a la mi­
tocondria donde es sustrato de la coproporfirinogeno oxidasa
(coproporfirinógeno decarboxilasa oxidativa) (copro'genasa)
(E.C. 1.3.3.3). Esta enzima descarboxila oxidativamente los
grupos propiónicos de las posiciones 2 y 4 transformándolas
en vinilos. Presenta alta especificidad por el sustrato ya
que no son utilizadas ni Copro'geno I ni COproporfirina III
(Meyer & Schmid, 1978).
En la conversión se descarboxila primero la cadena de
ácido propiónico de 1a posición 2 y en otra etapa, el de la
posición 4 para dar los correspondientes grupos vinilos
Cavaliero et al., 1974; Elder et al., 1978; Yoshinaga & Sano,
40.
1980 a). El intermediario monovinilico, el harderoporfiri­
nógeno, fue aislado por primera vez de la glándula de Harder
en ratas (Jackson et al., 1978). Este grupo luego corroboró
su real participación comointermediario.
Se ha postulado que el copro'geno III es descarboxila­
do oxidativamente a harderoporfirinógeno en el sitio de la
enzima cuya configuración es tal que solo aceptará el grupo
lateral del ácido 2-propiónico. Esta molécula rota en el seg
tido de las agujas del reloj y asi puede reaccionar el 2-prg
pionato en el mismositio activo de la superficie de la en­
zima, obteniéndose el protoporfirinógeno IX. (Gameset al.,
1976).
Esta enzima mitocondrial fue estudiada y purificada a
partir de varias fuentes comolevadura (Pulson & Polglase,
1974), higado de rata (Batlle et al., 1965)y bovino (Yoshüuga
& Sano, 1980 b).
En mamíferos, aves y plantas la enzima requiere O2
(Sano & Granick, 1961 ; Granick & Mauzerall, 1958 b); Batlle
et al., 1965);en microorganismosanaeróbicos estrictos utili­
za un aceptor de Hidrógenodistinto,la S-adenosil-L-Metionina
(Tait, 1969, 1972).
La enzima de higado bovino no contenía grupos prosté­
ticos comohemo o flavina y tampoco se detectó la presencia
de metales. La actividad enzimática no fue afectada por reag
tivos de grupos sulfhidrilos, metales o quelantes de metales.
Se encontró activación por fosfolipidos (Yoshinaga & Sano,
1980 b).
Formación de protoporfirina IX.
La protoporfirinógeno oxidasa (protoporfirinogenasa)
(E.C. 1.3.3.4) catalíza el siguiente paso del camino bio­
sintético del hemo, es decir la oxidación de Protoporfiriné
geno IX a Protoporfirina IX.
La reacción, que consiste en la oxidación de seis hi­
drógenos del anillo del porfirinógeno, es poco probable que
ocurra no enzimáticamente debido al medio anaeróbico reduc­
tor de la mitocondria. La postulación de si era un proceso
espontáneo o catalizado por una enzima o incluso por la co­
progenasa, fue discutida hasta que Sano y Granick (1961)
dieron pruebas de que se trataba de una reacción enzimática
catalizada por la proto'geno-oxidasa. Luego Jackson et al.
(1974) comprobaronque la reacción es esteroespecifica tenieg
do lugar solo de un lado del anillo porfirinico, lo cual no
podria ocurrir si la oxidación fuera no enzimática.
Esta enzima fue parcialmente purificada y estudiada
en Saccharomycescerevisiae (Poulson & Polglase, 1975),E.coli
(Polglase et al., 1975), e higado de rata (Poulson, 1976).
Actúa especificamente sobre proto'gen IX, ni el uro'gen I o
III ni el copro'gen I ó III pueden ser sustratos, aunque
reacciona parcialmente con monovinilporfirinógeno (Jackson
et al., 1978).
Camadroet al. (1985) purificaron la proto'geno oxida­
sa de higado humano, encontrando que es sensible a inhibición
por metaloporfírinas.
42.
El mecanismo de la reacción está aún poco aclarado.
Jones et al. (1984) sugirieron que de los 4 átomos de hídré
geno en posiciones meso que se pierden durante la transfor­
mación a protoporfirína IX, 3 de ellos son removidos como
hidruros y el restante comoprotón.
Formación de Hemo.
El paso final de la síntesis del hemocomprende la ín­
corporación del hierro ferroso en la protoporfirína IX me­
diante una reacción catalizada por la Ferroquelatasa (Fq)
(hemosintetasa, protohemoferro-liasa)(E.C.4.9.9.1.1).
Ha sido encontrada en plantas (Jones, 1968; Little &
Jones, 1970; Porra, 1975) levaduras y bacterias (Porra &
Jones, 1963; Jones & Jones, 1970; Dailey & Lascelles, 1974;
Dailey, 1977, 1982) y en mitocondrias de células animales
(Labbe & Hubbard, 1960; Hanson & Dailey, 1984). En tejidos
humanos, ha sido estudiada en médula ósea (Bottomley, 1968)
reticulocitos (Langelaan et al., 1969) e hígado (Camadroet
al., 1984) entre otros.
La inserción del hierro puede ocurrir no enzimaticamen
te (Mauzerall & Graníck, 1958; Heikel et al., 1958; Tokunaga
& Sano, 1966; Kassner & Walchak, 1973) y el rol de una enzi­
ma ha sido cuestionado. Sin embargo, se comprobó que en con­
diciones donde no hay reacción significante sin material ce­
lular, se logra formar hemocon extractos tisulares cuyas ag
tividades eran dependientes de proteínas.Taketani y Tokunaga
(1982) vieron que anticuerpos contra ferroquelatasa bovina
43.
purificada inhibian la reacción in vitro. Esto evidencia el
requerimiento de una enzima en el último paso de formación
del hemo.
La ferroquelatasa está localizada en el interior de
la membrana interna mitocondrial (Jones & Jones, 1969; Mac
Kay et al., 1969) y los lípidos juegan un rol importante en
su actividad. (Mazanowskaet al., 1966; Simpson & Poulson,
1977). La enzima purificada de higado de rata contiene con­
siderables cantidades de ácidos grasos y la adición exógena
de los mismos estimula marcadamente su actividad (Taketani
& Tokunaga, 1981), no ocurriendo lo mismo con la enzima pu­
rificada de hígado bovino (Taketani & Tokunaga, 1982; Dailey
& Fleming, 1983). Se postuló (Taketani & Tokunaga, 1981) que
los lípidos ayudarian a la solubilización de la porfirina y/o
la transferencia del ión metálico de un medio acuoso a uno
no acuoso y a mantener la conformación activa de la enzima.
Diversos investigadores han notado el efecto inhibito­
rio del oxigeno sobre la actividad de la ferroquelatasa(Porra
& Jones, 1963; Labbe & Hubbard, 1960; Mazanowska et al., 1966;
Koller et al., 1976; Llambías, 1976) posiblemente por oxida­
ción de grupos -SH esenciales, oxidación del Fe++ que no
puede utilizarse comosustrato o por efecto indirecto de ox;
dación de la fracción lipidica.
Numerososestudios sobre la especificidad de la ferro­
quelatasa demuestran que esta enzima puede utilizar deuterg
porfirina, mesoporfirina, hematoporfirina y 2,4-diacetildeu­
44.
teroporfirina con mejor eficiencia que con su sustrato fisio
lógico, la protoporfirina IX (Simpson & Poulson, 1977;Taketani
&Tokunaga, 1982). El mejor sustrato para la ferroquelatasa
es una porfirina sin sustituyentes en los anillos A y B. La
esterifícación o sustitución de las cadenas laterales de á­
cido propiónico en los anillos C y D de la protoporfirina IX
da compuestos que no son sustratos, indicando que estos sus­
tituyentes deben ser importantes para la formación del complg
jo enzima-sustrato (Honeybourneet al., 1979).
Ademásdel Fe (II), otros metales divalentes pueden ser
incorporados enzimáticamente en la protoporfirina IX, como
el Zn (II) (Camadro et al., 1984) y el Co (II) (Jones & Jones
1969; Sinclair et al., 1979). Por otra parte metales divalen
tes como Cu, Mn, Pb y Hg inhiben marcadamente la actividad
de ferroquelatasa (Taketani & Tokunaga, 1981).
Dailey et al. (1986) postularon un modelo de unión del
Fe al sitio activo de la enzima a través de 2 grupos -SH ve­
cinos y de unión de la porfirina por interacción de su cadena
propionato con residuos arginilos.
El mecanismode reacción propuesto sería un modelo ci­
nético secuencial Bi-Bi, donde el Fe se une primero al sitio
activo, luego la porfirina liberándose primero el hemocomo
primer producto y luego los protones (Dailey & Fleming,1983).
45.
CAPITULO III. REGULACION DEL CAMINO BIOSINTETICO DEL HEMO.
Existen múltiples mecanismosde control para lograr una
fina regulación del camino biosintético del hemo, ya que la
cantidad producida de éste debe ser la adecuada para las ne­
cesidades del organismo.
La organización subcelular de los múltiples pasos de
la biosintesis presenta sitios potenciales de control regula
torio, ya sea por transferencia de enzimas, cofactores o in­
termediarios entre organelas. Pero más importante parece ser
la regulación de la cantidad y actividad de las enzimas invg
cradas, ya que disturbios asociados a esta modulación condu­
cen a los estados patológicos conocidos comoporfirias.
Regulación primaria.
El control metabólico primario es ejercido sobre el pg
so de la biosíntesis catalizado por 1a enzima ALA-S, tanto
por motivos termodinámicos como porque su producto es el pri
mer precursor del camino y los sustratos glicína y Succinil
CoAestán disponibles en abundancia. ALA-Ses la enzima lí­
mitante de la velocidad total de la síntesis de hemo, tanto
en hígado comoen eritrocitos (Granick, 1966; Marver et al,
1966 a; Granick & Sassa, 1971). Su actividad in vivo es la
más baja de todas las actividades de las enzimas de la bio­
síntesis del hemoy una caracteristica importante de ALA-S
es su rápida inducibilidad (Moore, 1980).
El control por retroinhíbición o retroalimentación ne­
gativa tiene particular importancia en 1a regulación de ALA-S
46.
hepática. Granick & Sassa postularan al hemo como co-represor
de 1a sintesis enzimática: experimentos con inhibidores de
la sintesis proteica en hepatocitos indican un sitio post­
transcripcional para la inhibición por hemo (Sassa &Granick,
1970; Tyrell & Marks,1972). El gen regulador del operón hemo
induciria la sintesis de un aporepresor proteico, que en pre
sencia de hemoactuaria comoco-represor y formaría el reprg
sor activo de la sintesis de ALA-S.
Este actuaria sobre el gen operador, bloqueando la trans
cripción del gen estructural, impidiendo la formación del
mRNAde ALA-Sy por lo tanto reprimiendo la sintesis de novo
de la proteina enzimática (Granick, 1966). Comola vida media
de ALA-Sy su mRNAen higado es relativamente corta, 60-70
minutos en rata (Marver et al., 1966b; Tschudy et al.,1965a)
y 180-300 minutos en embrión de pollo (Sassa & Granick,1970;
Strand et al, 1972), la regulación primaria de esta enzima
a nivel de su sintesis constituye un mecanismode control
muysensible.
Ha sido postulada la existencia de un pool regulatorio
de hemo, el que seria responsable del control por retroalimeg
tación negativa sobre ALA’S(Granick et al.,1975; Bonkowsky
et al., 1980). Las sustancias inductoras de ALA-Sserian
aquellas capaces de disminuir el tamañoo alterar la cinéti
ca de este pool. Se postula la existencia de uno o mas pools
de hemolibre, probablemente ubicados en mitocondria,citosol
y reticulo endoplasmático (Kappas et al., 1983). Se presumen
que son muy pequeños y de muy rápido recambio y aunque su
existencia permanecehipotética hay evidencia de su funciona
47.
lidad en hepatocitos
En principio se pudo demostrar, tanto en células eri
troides comoen hepatocitos, inhibición de la actividad de
ALA-Spor hemo solamente en preparaciones purificadas. En
homogenatostotales es difícil de evaluar esta inhibición
debido a la juxtaposición de ALA-Sy Ferroquelatasa en la
mitocondria, lo que puede hacer que la concentración local
endógena de hemosea lo suficiente comopara ejercer efecto
inhibitorio. La inhibición de la actividad de ALA-Sfue ob­
servada con concentraciones de hemo entre 10"4 y 10-5 M
(Bottomley & Smithee, 1969 a; Aoki et a1., 1971; Scholnick
et a1., 1969, 1972 b), superiores a las determinadas por
Sinclair &Granick (1975), que sugirieron en cultivos de he
patocítos de ave, que la represión por retroalimentación ng
gativa de ALA-Socurriría a niveles tan bajos como 10-7­
10'8 M
Wolfson et al (1979) midieron la actividad de ALA-S
en mitocondrias intactas aisladas de hígado de rata mientras
simultáneamente era generado, con distintas velocidades, he­
movia ferroquelatasa. Con niveles de hemo 75 veces superig
res a los fisiológicos no se observó inhibición de ALA-S,
indicando que este no seria un mecanismoregulatorio impor­
tante en la biosintesis de hemo. Esto ha sido confirmado
también con mitocondrias de higado de embrión de pollo (Pirola
et al, 1984).
Otro modode regulación, propuesto por Kurashima et
al (1970) en hepatocitos de rata, atribuiria al hemola ca­
48.
pacidad de alterar la transferencia de la enzima que está
siendo sintetizada en los poli-ribosomas hacia la mitocon­
dria. Las ratas tratadas con alilisopropilacetamida (AIA,
potente inductor de ALA-S)y hemina, acumulan una conside­
rable cantidad de ALA-Ssoluble, precursor de 1a enzima mi
tocondrial, que es procesado postraduccionalmente. Estos
resultados indicarian la inhibición por hemode la trans­
ferencia de ALA-Sde citosol a mitocondria, sitio de funcig
namiento enzimático, constituyendo otro modode regular la
sintesis de hemo.
Trabajando luego in vitro con hepatocitos de pollos,
pudo establecerse que el transporte a mitocondria y el pro­
cesamiento del precursor citosólico de ALA-Ses inhibido por
concentraciones de hemina tan bajas como 3 pM (Hayashi et al.,
1983). Una posibilidad que estos autores argumentan para ex­
plicar el efecto inhibitorio sobre la transferencia citosol­
mitocondria, residiria en 1a capacidad del hemopara interag
tuar con el precursor de la enzima, interfiriendo con el sig
tema de transporte a mitocondria.
Debido a la importantísima función que cumple la hemo­
globina, la sintesis de hemoen los eritrocitos y su control,
ha sido extensamente investigada (Levere et al., 1967; Neuwirt
et al., 1969; Bottomley & Smithee , 1969 a y b; Aoki et al,
1971). Durante la diferenciación de las células eritroides
en el estroma de la médula ósea una célula madre primitiva
se diferencia para dar los precursores del eritrocito, con
pérdida de mitocondrias y haciendo persistir tan solo las
49.
enzimas solubles en el glóbulo rojo maduro. El hemo juega
un rol importante, tanto en la regulación de su propia sin
tesis comoen el control de la sintesis de la globina,al­
canzado por coordinación de la actividad de varias enzimas
citoplasmáticas involucradas en la producción de globina.
El Hemoestimula la sintesis de globina y es necesa­
rio para una continua iniciación de la sintesis de la apoproteina
durante la diferenciación eritroide (Grayzel et al., 1966)
probablemente por supresión de la formación de un represor
translacional, es decir inhibidor de la iniciación de la
cadena peptidica (Gross & Rabinowitz, 1973).
En el proceso de diferenciación eritroide se requiere
Fe aportado por la transferrina plasmática. La acción regu­
latoria del hemose ejerceria por inhibición de la disocia­
ción del Fe de la transferrina, con lo cual éste no puede
ser tomadopor los reticulocitos (Neuwirt et al, 1969;
Pónka et a1., 1973).
Encélulas eritroides, el sitio de represión o inhi­
bición de la regulación del hemosobre su propia sintesis
ha sido objeto de controversia. Hoffmanet al. (1980) tra­
bajando con una linea celular de leucemia humana producto­
ra de hemoglobinas en presencia de hemina, demostraron un
incremento de la sintesis celular de hemopor elevación de
las actividades enzimáticas de ALA-S,ALA-Dy ferroquelatg
sa, atribuible a hemina. La regulación de la bíosintesis
del hemoen células eritroides no estaria ejercido a través
de un control por retroalimentación del producto final so­
50.
bre la formación de ALA-S.Células de eritroleucemia trans
formadas por virus Mouse-Friend y tratadas con dimetilsul­
fóxido (DMSO)presentan niveles elevados de ALA-S y mRNA
de globina a las 24 hs (Ross et a1., 1972), ALA-Den 36h,
PBG-Den 48 h y hemoglobina a las 96 h luego del tratamieg
to con DMSO(Sassa, 1976). Esta inducción de las enzimas
del camino, que se probó también con otros inductores,tig
ne el mismo orden secuencial con el que funcionan en la
biosintesis y ALA-Sno sería la enzima limitante ya que a­
dición de ALAen este sistema no acelera la formación de
hemo. En cambio, ferroquelatasa si tendría un rol limitan
te en células eritroides: la producción de hemoglobina no
tiene lugar si la actividad de esta enzima no se ve aumen
tada en células tratadas con DMSOaunque las otras enzimas
esten inducidas (Sassa, 1976).
La actividad de ALA-Seritrocitaria, a diferencia de
la hepática, puede aumentarse por hipoxia (Falk & Porra,
1964) y eritropoyetina (Bottomley & Smithee, 1969 b). A su
vez la enzima hepática es inducible por drogas liposolubles,
incluso las utilizadas en terapéutica, insecticidas, este­
roides, etc. que no alteran a ALA-Sde eritrocitos (Wada
et a1., 1967). La única clase de esteroides capaces de in­
ducir tanto la enzima de higado de embrión de pollo como
la de células eritropoyéticas, son los que poseen configura
ción 5 flH-, estimulando la formación de hemoglobina (Levere
et a1., 1967; Gordon et a1., 1970; Mizoguchi & Levere, 1971).
La estimulación parecería ser independiente de la acción de
51.
la eritropoyetina, siendo inducidas las sintesis de hemo
y globina de manera coordinada (Mizoguchi & Levere, 1971).
Mecanismosde control adicionales.
Si bien la retroinhibición de ALA-Spor hemo es el
mayor factor regulatorio de la sintesis hepática de hemo,
podrian pensarse otros puntos adicionales de control. Fue
ron sugeridos por ejemplo la disponibilidad intracelular
de glicina, sustrato de ALA-S,pero fueron vanos los in­
tentos de encontrar anormalidades en el metabolismo de eg
te aminoácidoque justificaran el desarrollo de porfirias,
ya