tesis-n2389-Visconti

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar
Tesis de Posgrado
Estudio de los procesos deEstudio de los procesos de
transducción involucrados en latransducción involucrados en la
capacitación de espermatozoidescapacitación de espermatozoides
Visconti, Pablo Eduardo
1991
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
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Cita tipo APA:
Visconti, Pablo Eduardo. (1991). Estudio de los procesos de transducción involucrados en la
capacitación de espermatozoides. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2389_Visconti.pdf
Cita tipo Chicago:
Visconti, Pablo Eduardo. "Estudio de los procesos de transducción involucrados en la
capacitación de espermatozoides". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires. 1991.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2389_Visconti.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2389_Visconti.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2389_Visconti.pdf
mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
Lic. Pablo Eduardo Visconti
ESTUDIO DE LOS PROCESOS DE
TRANSDUCCION INVOLUCRADOS EN LA
CAPACITACION DE ESPERMATOZOIDES
DIRECTOR: Dr. Jorge G. Tezón
Tesis presentada para optar por el titulo de
Doctor en Ciencias Químicas
A ")k..¿'IC'
1991 2M
A Patricia, a mis hermanas y a mis padres.
La tarea de ablandar el ladrillo todos los dias, la tarea de
abrirse paso en la masa pegajosa que se proclama mundo, cada mañana
topar con el paralelepipedo de nombrerepugnante, con la- satisfaccion
perruna de que todo este en su sitio, la misma mujer al lada, los
mismos zapatos, el mismosabor de la mismapasta dentifrica, la nisma
tristeza de las casas de enfrente, del sucia tablero de ventanas de
tiempo con su letrero Hbtel de Belgique.
nurlacnua wm M um dawmw MMM M mua
transparente en cuyo centro tomamoscafé con leche y abrimos el diario
para saber lo que ocurrio en cualquiera de los rincones del ladrillo
de cristal. Negarse a oue el acto delicado de girar el picaporte, ese
acto por el cual todo podria transformarse, se cunpla con la fria
eficacia de un reflejo cotidiano. Hasta luego, querida. Que te vaya
bien.
Apretar una cucharita entre los dedos y sentir su latido de
metal. su advertencia sospechosa. como duele negar una cucharita,
negar una puerta, negar todo lo que el hábito lame hasta darle
suavidad satisfactoria. Tanto mássimple aceptar la fácil solicitud de
la cuchara, emplearla para revolver el café.
Y no que este mal si las cosas nos encuentran otra vez cada dia y
son las mismas. aue a nuestro lado haya la misma nuyer, el mismo
reloj, y que la novela abierta sobre la mesa eche a andar otra vez en
la bicicleta de nuestros anteojos, ¿por que estaria mal?
Pero comoun toro triste hay que agachar la cabeza, del centro
del ladrillo de cristal empujar hacia afuera, hacia la otro tan cerca
de nosotros, inasible como el picador tan cerca del toro. Castigarse
los ojos pirando eso que anda por el cielo y acepta taimadamente su
nombre de nube, su replica catalogada en la memoria. No creas que e:
teléfono va a darte los números que buscas. ¿Por aue te los daria?
Solamente vendra lo que tienes preparado y resuelto. el triste reflejo
de tu esperanza, ese mono que se rasca sobre una nesa y tiembla de
frio. Rómpele la cabeza a ese mono, corre desde el centro natia la
pared y abrete paso. ¡0h cómocantan en el piso de arriba! Hay un piso
de arriba en esta casa, con otras gentes. Hay un piso de arriba donde
vive gente que no sospecha su piso de abajo, y estamos todos en e:
ladrillo de cristal. Ysi de pronto una polilla se para al borde de un
lapiz y late comoun fuego cenicienta, mirala, yo la estoy mirando,
estoy palpando su corazón pequeñisimo, y la oigo, esa polilla resuena
en la pasta de cristal congelado, no todo esta perdido. Cuandoabra la
puerta y me asome a la escalera, sabré que abajo eapieza la calle; no
el molde ya aceptado, no las casas ya sabidas, no el hotel de
enfrente; la calle, la viva floresta donde las caras van a nacer
cuando las mire, cuando avance un poco más, cuando con los codos y las
pestañas y las uñas me rompa minuciosamente contra la pasta del
ladrillo de cristal, y juegue mi vida mientras avanzo paso a paso para
ir a comprar el diaria a la esquina.
Jul io Cortazar
¿mmm
Quiero agradecer particuïarmente a1 Dr Jorge Tezon, que
fue mi jefe y director en 1os úïtimos 5 años. Por mi
formación cientifica, por 1a confianza que me tuvo desde e]
primer momento,por permitirme expresar mis disidencias, por
su apoyo constante que se pïasmó en e] trabajo cotidiano.
Por todo eso y por muchas otras cosas, gracias Jorge.
Este estudio fue reaïizado en e] Instituto de Bio1ogia
y Medicina Experimenta], deseo agradecer a sus autoridades
e] haberme brindado un ámbito en donde formarme y
desarroïïarme profesionaïmente.
Parte de 10s experimentos fueron reaïizados en e]
Instituto de Ingenieria Genética y Bioïogia Moiecular, deseo
agradecer a1 Dr Torres e] haberme permitido desenvoïver en
esta institución comosi fuera integrante de 1a misma.
Deseo expresar mi agradecimiento a1 CONICET, a 1a
Organización Mundia] de 1a saïud y a 1a Fundación Antorchas.
que me han brindado ayuda financiera ya sea en forma de
becas o de apoyo a mi investigación.
Quiero agradecer a 1as Dras Mirtha Fïawiá y Maria
Teresa Te11ez-Iñón por su invaïorabïe ayuda en 1a
realización de 10s experimentos de medición de actividad
enzimática. A e11as 1es agradezco también 1a confianza que
me otorgaron y su buena disposición para 1a discusión de mis
resuitados.
A 1a Dra Patricia Cuasnicú, quiero agradecer1e sus
consejos, 1a discusión de mis trabajos, su ayuda en 1a
medición de 1a reacción acrosoma] y su estímulo constante.
A 1a Dra Si1via Moreno, quiero agradecerIe todas sus
enseñanzas, su apoyo y 91 préstamo de genisteina.
Entre todos Ios investigadores de] IBYME, quiero
agradecer especiaïmente a 10s Dres Jorge B1aquier. Eduardo
Charreau, Leonardo Bussman, Marta Tesone, Lino Barañao,
Aiberto Baïdi, Juan Carïos Ca1vo y Omar Pignataro, que me
brindaron su ayuda desinteresadamente cada vez que 1a
necesite.
Quiero agradecer también:
A Leonora Rochwerger, por todos
10s momentos que pasamos juntos, por haberme ayudado a
discutir experimentos y a medir 1a reacción acrosoma1, por
nuestras peieas y nuestras reconciIiaciones, por su
compañerismo.
A Patricia Miranda, por haberme
escuchado en todo momento, por ser una exceïente compañera,
por 1a coïaboración en 10s experimentos de genisteina, por
haber soportado estoicamente mi desorden.
A Jorge Muschietti, por su
coIaboración en ios ensayos de cicïasa y por 1os partidos de
padd1e.
A Maria Laura Gomez. por su
co1aboración en Ios experimentos reïacionados con 1a PKC.
A Patricia De1court, por su ayuda
técnica, por su caïidez, y por haber entendido que no soy
"tan bueno".
A Aida B1asco, por 1a co1aboración
brindada en 10s experimentos de reacción acrosomai.
A Licia Battagiia por su
coiaboración en ios experimentos de incorporación de suifato
y de quinasas, por haber entendido mis propuestas y por
continuarestas investigaciones.
A Lucrecia Piñeiro, Mercedes
Sanchez y Mónica Vazquez por 1a hospitaïidad con que me
recibieron en Estados Unidos.
A mis compañeros y amigos de]
1aboratorio, Adriana Dawidowski, Danieïa Conesa, Esteïa
De1court, Eïsa Morra, Marta Morra, Siivina Perez Martinez,
Debohra Cohen, Viviana Spotorno, Adriano Brande11i, Laura
Suter y Guiïïermo Lanuza, por todos Ios momentos gratos que
compartimos.
A Marce10 Lamami y Ricardo Damnoti
por su exce1ente trabajo de dibujo y fotografia, y por toda
1a ayuda que me dieron para 1a compaginación de esta tésis.
A Maria Laura Pisano y Mary Di
Vietro por haberme ayudado siempre con 1as búsquedas
bib1iográficas.
A Josefina Yanguas, Horacio Gomez, Zuïema
Rinaïdo, Marceia Bertorini, Wa1ter Miïani Ci1sa, Maria
Si1va, Juan José Ciesïak, Daniel Nieva y todo 91 persona] de
secretaria, bioterio y 1impieza, por hacer posibie e]
trabajo diario gracias a su tarea organizativa.
A mis compañeros y amigos de]
IBYMEy de] INGEBI, Andrés Lemoine, Hernán Guerrero, Liliana
Dain, Paula Stein, Migue] Bïey, Patricia Saragüeta, Siïvia
Lugo, Aïejandro Krimer, Javier Libré, Fabiana Guerra.
Esteban V1aducik, Mónica Ritta, Beatriz Campos, Horacio
Daud, Aïejandro Mïadovan, Laura Bocanera, Carina Shayo.
Si1via Sobrado, Ethe] Païavicino, Néstor Annibaïi, Fabian
Gabelïi, RoxanaSchi11aci. Gerardo Piroïi, Claudia Gri110,
Danieï Moses, Ju1io Simón, Rosa Inés Barañao, Omar Coso,
Horacio Martineto, Leonardo Erijman, y a todos 1os demás,
por hacer de 1a cotidianeidad de un trabajo aïgo muy
especia].
A mis amigos Ruth Rosenstein.
Marce1o de Las Heras, Cïaudia Tomes, Cora Cymeryng y Laura
Dada, por haber compartido horas de seminarios. Junto con
eïios, a Horacio Nastri, Marisa Ramirez, Jorge Manghi,
Ernesto Marceca, Ada1i Pecci, Gerardo Caba11ero, Siïvia
Guarnieri, Gustavo Braier e Hi1da Ladenheim, por haber
estado en todo momento a1 1ado mio.
A Roïfie muy especiaImente.
A mis hermanas y a mis padres, por
e1 apoyo y 1a ayuda que me dieron siempre.
A mi esposa, Patricia, que
compartió conmigo todo Io bueno y todo 1o maïo de estos
ú1timos años.
Indice
INDICE
CAPITULOI: La comunicación entre céluias.
.1 Introducción.
.2 Proteinas de unión a GTP. Proteinas G.
.3 Sistema adeniïato ciclasa/AMPc.
.4 Quinasa de proteinas dependiente de AHPc.
.5 Sistemade] fosfatidiïinosito].
.6 Sistemas de transporte aniónico presentes en 1a
membranaplasmática.
HHHHHH
CAPITULOII: Fertiïizacion en mamíferos
II.1 E1 espermatozoide.
II.1.1 Morfoïogia de] espermatozoide
II.1.2 La membranaplasmática. Dominios de
superficie.
II.1.3 La cabeza.
II.1.4 E1 fïageïo.
11.2 Maduración de] espermatozoide en el epididimo.
II.3 Capacitación deï espermatozoide.
II.3.1 Capacitación “in vivo“.
II.3.2 Capacitación "in vitro“.
II.3.3 Eventos que ocurren durante 1a
capacitación.
II.3.3.1 Activación de]
sistema adeniïato cicïasa/
quinasa de proteinas.
II.3.3.2 Cambios en 91 metaboïismo
respiratorio.
II.3.3.3 Variación en 1a concentración
intraceïular de iones.
3 3 4 Cambios en el acrosoma.
.3.3.5 Cambios en e] núcïeo.
3 3 6 Modificaciones de 1a membrana
plasmática.
16
17
20
22
25
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34
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41
41
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57
58
58
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60
60
II.4 La reacción acrosoma].
11.4.1 Significado biológico de 1a reacción
acrosoma].
11.4.2 Morfoïogia y cinética de 1a reacción
acrosomal.
II.4.2.1 Distinción entre reacción
acrosoma] "verdadera" y
"falsa".
II.4.2.2 Ensayosutiïizados para
cuantificar 1a reacción
acrosoma] "verdadera".
II.4.2.3 Naturaleza exocitótica de 1a
reacción acrosoma].
11.5 Inductores fisioïógicos de 1a reacción acrosomai.
11.5.1 Componentes de] suero.
11.5.2 Sustancias bioactivas circuïantes.
11.5.3 G1icosaminoglicanos.
11.5.4 Zona pelïúcida.
II.6 Mecanismosbioquímicos que controïan 1a reacción
acrosoma].
II.7 Evidencias sobre mecanismosde transducción de
señales existentes en espermatozoides de
mamíferos.
II.7.1 Proteinas G­
II.7.2 Iones­
II.7.2.1 Calcio
II.7.2.2 H*­
II.7.2.3 Sodio y Potasio
II.7.2.4 Bicarbonato
II.7.3 Nucïeótidos cicïicos­
11.7.4 Lipidos y recambio de fosfolipidos.
CAPITULOIII: Materiaïes y Métodos
III.1 Modeioexperimenta] utiïizado.
III.2 Incubación de los espermatozoides.
III.3 Medición de Ios niveïes de AHPc.
III.4 Tratamiento de 1as cé1u1as para Ios ensayos
enzimáticos.
III.5 Actividad de adenilato ciclasa.
III.6 Actividad de fosfodiesterasa de nucleótidos
ciclicos.
III.7 Presencia de Calmodulina.
63
64
67
67
67
69
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75
75
79
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81
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97
102
106
108
112
114
III.8 Actividad de PKC.
III.9 Incorporación de Suïfato radioactivo.
III.10 Medición de 1a reacción acrosomal.
10
115
116
117
III.11 Electroforésis en geles de poliacrilamida. 118
III.11.1 Estimación de] peso moïecuïar. 120
III.11.2 Preparación de geles. 120
III.12 Extracción de proteinas de membranade
espermatozoides. 122
III.13 Transferencia eïectroforética e Inmunoblot
(Western Blot). 122
III.14 Medición de receptores para ésteres de forbo]. 124
III.15 Medición de 1a concentración de proteinas. 125
III.16 Reactivos utiïizados. 125
CAPITULO IV: Rggyïación de Ios niveIes de AMPc en
espermatozoides de hamster 127
IV.1. Introducción 128
IV.2. Resu1tados 130
IV.2.1 Medición de AMPcen espermatozoides. 130
IV.2.2 Acción de activadores de 1a quinasa C. 130
IV.2.3 Efecto deï Ca2* sobre 1a acumulación
de AMPcinducida por ésteres de forbol. 136
IV.2.4 Efecto de] HC03' sobre 1a acumuïación
de AHPcinducida por ésteres de forbol. 142
IV.2.5 Efecto de bloqueantes de] transporte
aniónico en 1a acumuïación de AMPc
inducida por ésteres de forbo]. 146
IV.3 Discusión 151
CAPITULOV: Estudio de 1as enzimas relacionadas con 1a
sintesis 1 degradación del AMPc. 161
V.1 Introducción 162
V.2 Resuïtados 163
V.2.1 Fosfodiesterasa de AMPc. 163
V.2.1.1 Locaïización subceluïar. 163
V.2.1.2 Efecto de] pH sobre 1a
actividad de fosfodiesterasa
de espermatozoides de hamster. 165
V.2.1.3
V.2.1.4
Efecto de] ca1cio y de 1a
calmoduïina sobre 1a actividad
de fosfodiesterasa de
espermatozoides de hamster.
Efecto de Ios ésteres
forbol sobre la actividad de
fosfodiesterasa de
espermatozoides de hamster.
V.2.2 Caïmodulina.
V.2.3 Adeniïato ciclasa.
V.2.3.1 Locaïización subcelular y
regulación.
V.2.3.2 Efecto deï calcio y de 1a
V.2.3.3
V.2.3.4
V.2.3.5
V.3 Discusión
CAPITULOVI: Estudio de
calmoduïina sobre 1a actividad
de adenilato cicïasa de
espermatozoides de hamster.
Efecto de] HCOa' sobre 1'
actividad de adeniïato ciclasa
de espermatozoides de hamster.
Efecto de Ios ésteres de
forbol sobre 1a actividad de
adenilato ciclasa de
espermatozoides de hamster.
Efecto de bloqueante' de]
intercambio aniónico sobre 1a
actividad de adeniïato cicïasa
de espermatozoides de hamster.
1a regyïación de un
ggiónico presente en espermatozoides epididimarios de
QQEQLQL¿
V1.1 Introducción
V1.2 Resultados
VI.2.1 Presencia de un transportador aniónico.
Inhibición por bïoqueantes específicos.
VI.2.2 Efecto de activadores de 1a quinasa C
sobre 1a incorporación de suïfato.
V1.3 Discusión
165
de
167
170
170
170
173
178
182
185
187
transportador
193
194
196
196
196
204
CAPITULOVII: Investigación de la presencia de guinasa C
en espermatozoides de hamster
VII.1 Introducción
VII.2 Resultados
VII.2.1 Purificación parcial de una proteina
con actividad de quinasa dependiente
de calcio y fosfolípidos.
VII.2.1 Unión de (3H)PdBua extracto de
espermatozoides.
VII.2.2 Reconocimiento inmunológico de
quinasa C de proteinas.
VII.3 Discusión
CAPITULOVIII: Regulación de la reacción acrosomal
espontánea en espermatozoides epididimarios de hamster.
VIII.1 Introducción
VIII.2 Resultados
VIII.2.1 Efecto del bicarbonato extracelular
sobre la reacción acrosomal en
espermatozoides epididimarios de
hamster.
Efecto del pHextracelular sobre la
reacción acrosomal dependiente de
bicarbonato.
Efecto de la alcalinización
intracelular por cloruro de amonio
sobre la reacción acrosomal.
Efecto del aumento en la
concentración de potasio sobre la
reacción acrosomal dependiente de
bicarbonato.Efecto de bloqueantes del transporte
aniónico sobre la reacción acrosomal
dependiente de bicarbonato.
Efecto de análogos de AMPcsobre la
reacción acrosomal dependiente de
bicarbonato.
Efecto del ionóforo de calcio sobre
la reacción acrosomal dependiente de
bicarbonato.
VIII.2.2
VIII.2.3
VIII.2.4
VIII.2.5
VIII.2.6
VIII.2.7
207
208
209
209
209
210
215
218
219
221
221
223
223
226
226
229
230
VIII.2.8 Efecto de 10s ésteres de forbol sobre
1a reacción acrosomal y sobre 1a
viabilidad de los espermatozoides. 232
VIII.3 Discusion 236
CAPITULOIX: Estudios sobre 1a participación de guinasag
gg tirosina en 1a reacción acrosgmg] espontánea de
espermatozoides. 242
IX.1 Introducción. 243
IX.2 Resultados. 245
IX.2.1 Efecto de la toxina de B. pertussis
sobre 1a reacción acrosoma] espontánea
de espermatozoides epididimarioe de
hamster. 245
IX.2.2 Efecto de la genisteina sobre 1a
reacción acrosoma] espontánea de
espermatozoides de hamster. 245
IX.2.3 Efecto de 1a genisteína sobre 1a
fosforiïación en tirosina de proteínas
extraídas de espermatozoides
capacitados. 250
Ix.3 Discusión 252
CAPITULOX: Discusión final 255
CAPITULOXI: Referencias 261
AE
AMPc
ADP
5’AMP
ATP
BSA
14o
CaM
CEso
Ci
cpm
DIDS
dioïeina
DMSO
EDTA
EGTA
ES
GMPc
GTP
3H
mCi
mM
MQ
Actividad especifica
3’.5' fosfato cicïico de adenosina
5’ difosfato de adenosina
5’ monofosfato de adenosina
5' trifosfato de adenosina
a1búmina sérica bovina
Carbono catorce
Caïmodu1ina
Concentración efectiva media
Curie
cuentas por minuto
4,4’ Diisotiocianatoesti1beno-2,2’­
ácido disu1fónico
1,2 diOIeoii g1icero1
Dimetiïsuïfóxido
ácido etiïéndiamino tetraacético
ácido eti16ng]ico]-bis(B-aminoeti1 éter)
tetraacético
error standard
3'.5' fosfato cicïico de guanosina
5' trifosfato de guanosina
Tritio
Moïar
mi1iCurie
mi1imo1ar
ng
nM
OAG
PBS
PdBu
PKC
pmo]
PMSF
Quin 2 AM
Rf
rpm
SDS
SITS
TCA
TEMED
TPA
Trís
U9
u1
uM
umo]
15
nanogramo
nanom01ar
1-01e0112-acetil gïiceroï
Buffer fosfato saïino
éster de forbo] 12,13 dibutirato
quinasa C de proteínas
picomoï
Fïuoruro de fenilmetiïsu1f0ni1o
2-[(2-bis[Carboximet11]-amino-5-met11fenoxi)­
metí1]-6-metox1-8-bis[carbox1meti1]­
aminoquino1intetrakis-[acetoximeti1] éster
movi1idadeïectroforética reïativa a1 frente
revo1uciones por minuto
Dodeci] Su1fato de Sodio
4-acetamido-4’-isotio—cianatoest11beno-2,2‘­
ácido disu1fón1co
ácido tric1oroacético
N,N,N’,N’-Tetramet11eti1endiamina
éster de forbo] 12-miristato 13-acetato
tris[h1drox1met11]am1no-metano
microgramo
microïitro
m1cromo1ar
m1cromo1
Capítulo l
La comunicación entre células
17
QAPIIQLQ I
u ic ci 1 l
1.1 Introducción.
Los organismos unice1u1ares son capaces de realizar
todas 1as funciones necesarias para mantener 1a vida. La
cé1u1a puede incorporar nutrientes de] medio ambiente,
moverse y 11evar a cabo reacciones metabó1icas que 1a
proveen de energia y Ie permiten sintetizar nuevas moïécuïas
para sobrevivir y reproducirse. En 1os organismos
muïtice1u1ares 1a situación es mucho más comp1eja. Las
distintas funciones se distribuyen en pobïaciones ce1u1ares,
organizadas en órganos y tejidos. Para coordinar 1as
distintas funciones existen mecanismos, mediante Ios cua1es.
1as ceïuïas individuaïmente o agrupadas pueden comunicarse
con otros grupos ce1u1ares.
En organismos superiores existen dos métodos primarios
de comunicación entre cé1u1as: hormonas circulantes y
neurotransmisión. En ambos sistemas 1as cé1u1as se comunican
entre si mediante mensajeros quimicos. La principa]
diferencia entre estos dos sistemas se encuentra en su
direccionaïidad. Las neuronas envian mensajes discretos a un
grupo especifico de céïuïas bïanco, que pueden ser ceïuïas
muscuïares, secretorias u otras cé1u1as nerviosas. Este tipo
de comunicación interce1u1ar tiene 1ugar en sitios
especificos conocidos comosinapsis.
18
La acción hormona] es en genera] menos directa. Aunque
existen 1os mecanismos autocrinos y paracrinos, en 10s
cua1es una hormona actúa, respectivamente, en 1a misma
ce1u1a que 1a secreta o en céïuias adyacentes, 1a forma más
extendida de 1a comunicación hormona] es e] sistema
endocrino. En este sistema una g1ándu1a 1ibera hormonas a1
torrente sanguíneo que actúan a distancia sobre céïuias
bïanco.
La comunicación nerviosa actúa a distancias cortas y
tiene 1ugar en pocos miiisegundos. Por e] contrario, 1a
comunicación hormonaï afecta céiuïas situadas en cuaïquier
parte de] organismo, pudiendo producir un efecto varias
horas después. A nive] moïecuïar. ambos sistemas operan
interaccionando con receptores especificos en 1as céiuias
bïanco. Estos receptores son capaces de detectar a1
mensajero y activar un mecanismode señaies intraceïuïares,
cuyo fin ú1timo será reguïar ios distintos procesos
ceiuiares ta1es comosecreción, contracción, metaboiismo,
repiicación y/o transcripción de] DNAy sintesis proteica.
Los receptores pueden ser intraceiuïares, comoen e1 caso de
1os receptores a hormonasesteroideas, o extrace1u1ares,
para e] caso de 1as hormonas proteicas y de Ios
neurotransmisores. En estos ú1timos, 1a principai barrera
para e1 fïujo de información es 1a membranapïasmática. Aqui
ias señaies externas deben ser traducidas a señaïes
intrace1u1ares, 1as cuaies son iïamadas segundos mensajeros.
19
En términos moiecuïares e] proceso depende de una serie
de proteinas ubicadas en 1a membranap1asmática. cada una de
1as cuaïes transmite información induciendo un cambio
conformaciona] a 1a proteina siguiente. En a1gún punto 1a
información se traduce en una moïecula pequeña o a1 f1ujo
orientado de iones, que aumentan su concentración en e1
interior de 1a cé1u1a. La difusión de estos segundos
mensajeros permite 1a rápida propagación de una seña] por
toda 1a cé1u1a.
E1 número de segundos mensajeros capaces de reguïar una
gran variedad de procesos bioquímicos y fisio1ógicos en
distintos tipos ce1u1ares es muypequeño, en otras païabras
1os mecanismos de transducción de señaïes son marcadamente
universaïes. Los mensajeros conocidos son capaces de regular
una gran variedad de procesos bioquímicos y fisio1ógicos. La
investigación de 1os segundos mensajeros invoïucrados en una
dada respuesta bioïógica es de fundamenta1 importancia para
comprender 1a regulación de dicha respuesta.
Los receptores invoïucrados en mecanismos de
transducción de señaïes puedencïasificarse en tres cïases
principaïes, 10s que están acop1ados a proteinas que unen
GTP, Ios que poseen actividad de tirosina quinasa y aqueïïos
que están acop1ados a canaïes iónicos. En muchos casos estos
mecanismosestán interconectados.
20
1.2 Proteinas de unión a GTP. Proteínas G.
Las proteinas G son una famiïia de proteinas
invoïucradas en Ios procesos de transducción de señaïes en
ce1u1as eucariontes. que producen e] acop1amiento entre
receptores de membrana activados y enzimas efectoras o
cana1es iónicos. Tienen una estructura comúnconsistente en
tres po1ipeptidos: una cadena a1fa responsabïe de 1a unión a
nuc1eótidos de guanina (39-52 kDa), una cadena beta (35-36
kDa) y una cadena gamma (8 kDa).
Las proteinas G se encuentran en un cicïo entre un
estado inactivo unido a GDP y un estado activo unido a GTP
(fig. I.1). Cuando GDPesta unido, 1a subunidad a1fa está
asociada a 1as subunidades beta y gamma (G.GDP) formando un
comp1ejo unido a membrana. Cuando GTP está unido, 1a cadena
aïfa (G.GTP) se disocia de 1as subunidades beta y gamma. La
cinética de conversión entre G.GDP y G.GTPes 1enta en
ausencia de un receptor activado, e] cua} actúa como
cataïizador de] intercambio de GDPpor GTP. La liberación de
Ga.GTPaïtera 1a actividad de 1a enzima efectora o de] cana]
iónico. La subunidad aïfa tiene además actividad de GTPasa
que hidroliza GTPa GDPy termina 1a activación. Todos Ios
receptores capaces de activar a proteinas G son
gïicoproteinas integraies de membrana. La transmisión de una
seña1 extraceïular se efectúa mediante un cambio
conformaciona] de} receptor que provoca 1a activación de 1a
proteina G (119.293).
E21
F G RA 1
Mecanismode activación de enzimas reguladas por proteínas G
G'GDP
p Gu‘GDP'E HR H-R-G-GDP
' GTP
E G
H2o G * px GDP'GTP’ o . . ­
Precursor a E H R HRGGTP
Ga'GTP
Producto
Interacción entre el receptor, la proteína G, GTP,y el
efector. La explicación de este esquema se puede ver en el
texto.
22
Las proteinas G regu1an 1a respuesta a hormOnas de 1a
adeniiato ciciasa de céiuïas somáticas (119), de 1a
fosfodiesterasa de GMPcen retina (292), y de canaïes de
potasio en corazón (202) y se sugiere su acción en 1a
reguiación de fosfo1ipasa C (60), fosfoïipasa A2 (152,164),
fosfoiipasa D (39.40) y canaies de caïcio (138,201). De
todos estos casos ei mejor estudiado es e] de 1a reguiación
de 1a sintesis de AMPcpor 1a adeniiato ciciasa.
1.3 Sistema adeniïato cicïaea/AMPc.
En 1958, Sutherïand y Rai] (255) descubrieron 1a
mo1écu1a de AMPc. En 1971 Rodbeiï y co]. (261) demostraron
que ei GTPes esencia] para e1 mecanismo de transducción que
genera AMPc.Antes que 1a información pueda fiuir a través
de 1a membrana, una señal externa debe unirse a su receptor,
en 1a superficie de 1a cé1u1a y una molécuïa de GTP debe
interaccionar con 1a proteina G correspondiente. Existen dos
tipos de proteinas G iigadas a ia adeniiato cicïasa, una
estimuiatoria denominada G. y otra inhibitoria denominada
Gi. Gs está reïacionada con un receptor estimuiatorio (Ra).
La unión de un 1igando a este receptor provoca un cambio
conformaciona] en e] receptor que se transmite a través de
1a membranaa Gs. De esta forma se cataïiza e] intercambio
de GDPpor GTPprovocando 1a disociación de 1a subunidades
Os por un 1ado y beta-gama por eï otro. La subunidad a.
activa a 1a adeni1ato cicïasa (fig. 1.2).
23
FIQURA 1.2
Mecanismo de estimu1ación e inhibición de Ia adenilato
ciclasa mediadapor receptor
GTP GDP
GB!GS -GDP ° o
GSa‘GTP Gm-GTP G"GDP
P‘ H
l 20 HZO P¡
La actividad de] comp1ejo a.—GTP se termina por 1a
hidró1isis dei GTP a GDP. La misma subunidad a posee
actividad de GTPasa. La toxina dei cóiera es capaz de
inhibir 1a actividad de GTPasapor ADPribosiïación de 1a
subunidad aifa. A1 no poder hidroiizar GTP, 1a subunidad a
mantiene a 1a adeniïato cicïasa activa. Otra forma de
impedir 1a hidró1isis de] GTPy mantener 1a actividad de 1a
enzima es usar análogos no hidroïizab1es de GTPtaïes como
GppNHp o GTPgamaS. E1 F' es capaz de activar este camino
metabó1ico debido a su propiedad de formar e1 compïejo
A1F4'. Este comp1ejo se une a1 GDPformando una estructura
anáïoga a1 GTPque mantiene activa a 1a enzima (55).
La Gi está acoplada a otro tipo de receptores
denominados R1, Ios cuaïes a1 unirse a sus iigandos
respectivos sufren un cambio conformaciona] que es
transmitido a 1a proteina Gi. En este caso también se
produce una disociación de 1as subunidades aifai de 1a beta­
gama (fig 1.2). Una de 1as hipótesis para 1a inhibición de
1a adeni1ato ciciasa es que 1a subunidad beta por acción de
masas despiaza e] equilibrio:
Gea+ Ga_— Gone
dando 1ugar a una G. inactiva. Esta hipótesis no descarta
que además 1a subunidad Gai tenga capacidad para inhibir a
1a enzima. La bacteria Bordeteïïa pertussis produce una
toxina capaz de ADP-ribosiIar a 1a subunidad 01, esta toxina
bioquea 1a inhibición de 1a adeniïato cicïasa (119).
25
La adeniIato cicïasa de céïuïas eucariontes existe en
múitipies especies moïecu1ares, 1a mayoria de e11as son
activadas a través de un mecanismoque involucra proteinas
G. Sin embargo existen otras formas de activación de aïgunas
de estas especies mo1ecu1ares. En numerosos sistemas se ha
encontrado que 1a adeni1ato cicïasa puede ser activada
directamente por caicio-ca1modu1ina (178,257). Lefkowitz y
co1. describieron recientemente una activación directa de 1a
adeniïato cicïasa de eritrocitos de pavo por fosforiïación
mediante PKC(341). Otro compuesto que activa a 1a adeniiato
ciclasa en cé1u1as somáticas es 1a forskoïina, una moiécuïa
de origen vegeta]. Aparentemente 1a acción de este compuesto
se ejerce sobre 1a unidad cataïitica de 1a adeniïato cicïasa
(119).
1.4 Quinasa de proteinas dependiente de AMPc.
En cé1u1as eucariontes, 1as respuestas fisio]ógicas a1
aumento en Ios niveïes de AMPcse ejercen a traves de 1a
activación de una quinasa de proteinas, denominada "proteina
quinasa A”. En ausencia de AMPc,esta enzima es un tetrámero
inactivo que contiene 2 subunidades regulatorias y 2
subunidades cataïiticas. La unión de AMPca 1as subunidades
regu1atorias a1tera su afinidad por 1a subunidad cataïitica
y provoca su disociación en un dimero de subunidades
reguïatorias y 2 subunidades monoméricasactivas.
En presencia de AMPc,1a subunidad cata1itica existe
como una proteina monomérica de peso moïecular 40.800. Esta
26
subunidad es 1a responsabïe de 1a mayor parte de 1as
respuestas fisioiógicas de 1as céiuias eucariontes a]
aumento de AMPc(303).
La principa1 función conocida de 1a subunidad
regulatoria es unirse a 1a subunidad cata1itica e
inactivar1a en ausencia de AMPc. Existen 2 tipos de
subunidad reguiatoria, I y II. La subunidad reguïatoria de
tipo II contiene un sitio de autofosforiiación, mientras que
1a de tipo I no se autofosforiia, pero contiene un sitio de
a1ta afinidad para MgATP. Estos dos hechos tienen
importancia en 1a reguïación de su actividad por AMPc(303).
Cada subunidad regulatoria contiene 2 sitios de aita
afinidad para ei AMPc,que pueden ser distinguidos por su
afinidad a diferentes anáïogos de AMPc.La región de 1a
subunidad regu1atoria que se une a 1a subunidad cataiitica
se denomina bisagra. Esta región contiene una secuencia
aminoacidica simiiar a 1a de ios sustratos de 1a subunidad
cataiitica (303).
La activación de 1a hoioenzima invoiucra un compïejo
ternario que contiene una subunidad reguïatoria, una
cataïitica y AMPc.Para esta activación participan 1os dos
sitios de unión para AMPc,y ambos sitios deben ser ocupados
antes de que ocurra 1a disociación (fig. I.3). La ho]oenzima
de tipo II existe principaïmente en estado fosforiïado.
Estando fosforiïada 1a subunidad regulatoria tiene una
ï
.
27
F URA .3
Modeïo propuesto para 1a activación de 1a hoïoenzima de tipo
I de 1a quinasa de proteínas dependiente de AMPc
INACTIVA
.- SUBUNIDAD- Cmm m
SUBUNIDAD- R —>
ID­
INACTIVA
AMPc lo)
;€?%%
AMPc lo) 1¿“EJ
La unión de AMPc a uno de los sitios incrementa su
accesibíïídad del otro sitio. El sitio de unión de 7a
subunídad cataïítíca a7 péptído se indica como(ll).
afinidad menorpor 1a subunidad cataïítica, de esta forma se
disocia a una menor concentración de AMPcque 1a hoïoenzima
desfosforiïada. La desfosforiïación puede ocurrir sóïo
cuando 1a hoïoenzima se encuentra disociada, por 10 tanto,
e1 proceso de reasociación en teoria puede ser facilitado
por 1a participación de fosfatasas (303).
1.5 sistema de] fosfatidilinositol.
Muchos neurotransmisores, hormonas y factores de
crecimiento provocan tras su interacción con sus respectivos
receptores 1a rápida mobiïización de] ca1cio intraceïuïar.
En 1975, Miche11 (211) sugirió que e] recambio de
fosfoinositidos estaba reïacionado con e1 aumento dei
calcio intrace1u1ar. En 1981 (25) se demostró que un
fosfoïipido minoritario de 1a membrana pïasmática, e]
fosfatidiïinositoï 4,5-bifosfato (PIP2) es rápidamente
hidro1izado por una fosfoïipasa C a inosito] 1,4,5
trifosfato (IP3) y diaciïgïiceroï, en respuesta a 1a
activación de un receptor de membrana.
Actuaïmente se conoce que 1a fosfoïipasa C especifica
de fosfoinosítidos no es una soïa proteína. La mayoria de
1as fosfo1ipasas C purificadas pueden ser asignadas a una de
5 c1ases de isoenzimas inmuno1ógicamentedistintas (258).
A1gunasde estas isoenzimas podrían ser regu1adas a través
de un mecanismo que invo1ucre proteínas G. Las evidencias a
favor de esta hipótesis están basadas principaïmente en 1a
observación de que 1a ruptura de fosfatidiiinositoï a
inosito1 1,4,5 trifosfato y diaciïgïicero] puede ser
estimu1ada por e] agregado de análogos de GTP no
hidroïizabIes (42). E1 agregado de f1uoruro, que en su forma
de A1F4',estabiïiza a 1a proteina G en su forma activa
(55), también es capaz de estimuïar 1a formación de inosito]
1,4,5 trifosfato tanto en ceïuïas enteras como preparados
1ibres de céïulas (42).
Aïgunos factores de crecimiento como el derivado de
p1aquetas (PDGF) y e1 epidérmico (EGF) son capaces de
estimuïar 1a actividad de fosfoïipasa C (319). Los
receptores para EGFy PDGF, a1 igua] que e] de insuïina y e1
de otros factores de crecimiento difieren de otros
receptores que se acopïan a proteinas G en dos aspectos
importantes: poseen actividad de tirosina-quinasa intrínseca
y no presentan homo1ogia en 1a secuencia aminoacidica con 1a
famiïia de receptores que se acoplan a proteinas G.
Recientemente se ha demostrado que 1as fosfoïipasas de tipo
II pueden ser fosforiladas en residuos de tirosina
dependiendo de 1a presencia de PDGF o EGF (200,203). Este
hecho sugiere un mecanismo independiente de proteina G. Aún
no se sabe si esta fosforiïación aumenta 1a actividad de
fosfoïipasa C. Otra posibiïidad es que 1a fosfori1ación
favorezca e] acceso de 1a enzima a1 sustrato.
En 1983, Berridge y sus co]. (291) demostraron que eï
IP3, que es uno de los productos tempranos de 1a hidróïisis
de1 PIP2, sirve como mediador de 1a ïiberación de] ca1cio
intraceïuïar de un depósito interno, probabïemente de]
30
reticuio endopiasmático. Los estudios de Nishizuka (229)
muestran evidencias de que e] otro producto de 1a hidróiisis
de] PIP2, e] 1,2 diaciigiiceroi (DAG)inicia 1a activación
de una quinasa de proteínas especiaiizada, 1a PKC.
Durante 1a fase temprana de 1a respuesta ce1u1ar a
1igandos, Ias dos vias reguiatorias mencionadas comienzan a
ejercer su acción en pocos segundos. Bajo condiciones
basaies 1a concentración de caicio intraceiuïar osciia entre
100 y 400 nM. La membrana piasmática es reiativamente
impermeabie a1 caicio y posee mecanismos de expuïsión de
este ión como 1a ca1cio-ATPasa y 91 intercambiador Na‘/Ca2*
que ie permiten a 1a céiuïa mantener 1a homeostasis de este
ión (52). Las evidencias de que 91 IPs se comporta como un
mensajero intrace1u1ar para e] caicio se obtuvieron a partir
de estudios de microinyección de esta moiécuia en cé1u1as
intactas (26). Aparentemente e] IPs actúa sobre receptores
especificos, probabiemente localizados en ei reticuio
endopiásmico, iiberando calcio de sus reservorios
intraceiuiares.
E1 diaciigiicero] normalmente está ausente de ias
membranas. Cuando un receptor de esta via es estimuiado,
aparece transitoriamente y desaparece en pocos segundos o a
io sumo en un minuto. En este breve iapso activa a 1a PKC
con ios consiguientes efectos moduiadores sobre otras
enzimas. Esta activación perdura mientras e] diaci1giiceroi
se mantiene unido a 1a quinasa. La desaparición se produce
tanto por 1a formación de fosfatidiiinosito1 nuevamente,
31
como por 1a 1iberación de ácido araquidónico, que a su vez
puede convertirse en otro mensajero (prostagïandinas y/o
1eucotrienos). Sin embargo 1a fosfori1ación de proteinas por
1a PKCproïonga y amp1ifica e1 estimu1o, dependiendo de 1a
estabi1idad de1 residuo fosfato incorporado. Aunque tanto
1as señaïes de ca1cio como 1as de diaciïgïiceroï son
transitorias, muchasveces pueden actuar sinérgicamente para
provocar respuestas ceIu1ares (26).
La PKC, identificada en 1977. es una proteina presente
en 1a mayor parte de Ios tejidos y órganos (176,212). En 1a
mayoria de 1os tipos ceïuïares. esta enzima se encuentra en
e] citopIasma en una forma inactiva (162), y aparentemente
se trasïoca a membranas cuando Wascé1u1as son estimuladas
(173).
La PKCrequiere calcio y fosfoïipidos. particuïarmente
fosfatidiïserina para su activación. E1 diaci191icero1
incrementa 1a afinidad de 1a enzima por 91 caïcio y de esta
forma 1a activa sin un incremento neto en 1a concentración
de caïcio (156,166). Por Io tanto, 1a activación de 1a PKC
es bioquimicamente dependiente de calcio, pero
fisioïógicamente independiente de este ión. Obviamente 1a
enzima puede ser activada sinérgicamente por e] aumento
simuïtáneo de ca1cio y de diaci191icer01. La
fosfatidiïserina es totaïmente necesaria para 1a actividad
de 1a enzima y no puede ser rempïazada por otros
fosfoïipidos comofosfatidi1etan01amina, fosfatidiïinositoï,
fosfatidiïcoïina o esfingomieïina (161).
La PKCpuede ser activada también por proteóïisis
11mitada con ca1paina, y 1a consiguiente 1iberación de
subunidades de menor peso moïecuïar (149,165). EI componente
mas pequeño es enzimáticamente activo y totaïmente
independiente de1 ca1cio, de fosfoïipidos, y de
diaciïgïiceroï. Nose conoce 1a significación fisioïógica de
esta activación.
Distintos diaciïgliceroIes son capaces de producir 1a
activación de 1a PKC"in vitro". Es importante que uno de
1os dos ácidos grasos esté insaturado (166). Entre estos se
encuentran e] 1,2-dioctanoi1 gïiceroï y e] 1.2-didecanoi]
gïiceroï (182). Todos 1os diaci1gïicero1es activos tienen 1a
configuración 1,2-sn, 1os otros estereoisómeros son
inactivos (256). Entre Ios diaci1gïicero1es 1iberados
fisio1ógicamente, 1a dioïeina (1,2 dio1eoi1 91icero1) es
incapaz de estimuiar a 1a quinasa a1 ser agregada a una
suspensión de ce1u1as enteras, si bien 10 puede hacer en
preparados 1ibres de cé1u1as (91,182). E1 1-01eoi1 2-aceti1
g1icer01 (OAG) en cambio, se interca1a en 1a membrana de
céïuïas intactas y activa a 1a PKC directamente. Por eso
este diaciïgïicerol se utiïiza a menudo para expïorar e]
pape1 de esta enzima en una dada respuesta ceïuïar (157).
Los ésteres de forbo), promotores de tumores, taïes
comoe] forbo] 12-O-tetradecanoi1 13-acetato (TPA). activan
a 1a PKCdirectamente, tanto in vivo como in vitro (54,332).
De igua] forma que el diaci191icer01, 1os ésteres de forboï
incrementan dramáticamente 1a afinidad de 1a enzima por 91
calcio, dando comoresultado una activación completa de la
PKCcon concentraciones fisiológicas de calcio.
La acción de la PKCen la respuesta producida frente a
un estimulo fue demostrada primeramente para la liberación
de serotonina por plaquetas. Posteriormente se demostró que
la PKCestaba involucrada en reacciones de secreción y de
exocitósis de una gran variedad de tipos celulares (161).
Numerosas lineas de investigación sugieren que la PKC
modula el transporte o el intercambio de iones mediante la
fosforilación de proteinas de membrana (canales, bombas e
intercambiadores). Se ha propuesto que la PKCjuega un papel
en la expulsión del calcio inmediatamente después de su
mobilización al citosol. y, en la regulación de la actividad
de la proteina ATPasatransportadora de calcio (90,219,311).
La proteina intercambiadora de Na*/H’ parecería ser otro
sustrato de esta enzima, con lo cual la PKC podria ser
responsable del aumento del pH citoplasmático mediada por
este intercambiador (28.49.267). En muchos casos la unión
covalente del fosfato producida por la PKCes resistente a
la acción de fosfatasas y, por lo tanto las consecuencias de
esta fosforilación puedenpersistir por largos periodos. Es
posible que otros sistemas de transporte sean modulados por
la PKC.
La PKCinterviene en la desensibilización de receptores
de membrana (receptores a agonistas alfa y beta
adrenérgicos, a insulina, a factores de crecimiento. etc.).
Este mecanismo ha sido observado en condiciones homóïogas,
es decir sobre receptores que actúan sobre e1 metaboïismo
de] fosfatidiiinositoï activando a 1a PKC, como en
condiciones heteró1ogas, en e] caso en que 1a
desensibiïización se produce sobre receptores no
invoïucrados en 1a activación de esta quinasa.
La PKCy 1a quinasa de proteínas dependiente de AMPc
transmiten información a través de diferentes caminos, sin
embargo muchas veces tienen una respuesta ce1u1ar común.
Estas enzimas tienen a menudo 105 mismos sustratos
proteicos, y 11egan a fosforiiar 1os mismos residuos de
serina y treonina. Estos dos sistemas de señales pueden
interactuar en dos formas distintas. Ambossistemas pueden
contraponerse, o actuar sinérgicamente,ya sea que inhiban o
amplifiquen ïas respuestas producidas por e] otrosistema de
transducción (161).
1.6 Sistemas de transporte aniónico presentes en 1a membrana
pïasmatica.
Hasta hace reïativamente poco tiempo se consideraba que
los procesos de transporte iónico de relevancia fisiológica
só1o invoïucraban 91 transporte de cationes. mientras que
ios aniones se 1imitaban a mantener 1a e1ectroneutra1idad.
Actuaïmente se conoce que Ios aniones tienen un papel muy
importante en numerosos procesos de transporte
transepiteïia1es (por ej: de agua) que invoïucran mecanismos
especificos comoe1 intercambio aniónico y e1 cotransporte
aniónico-catiónico (140). También se conoce que e]
intercambio aniónico a niveï de membranaen eritrocitos, es
fundamenta] para e] transporte de C02 como bicarbonato a
través de 1a sangre. Los aniones también están invo1ucrados
en 1a reguïación de1 pH intraceïuïar y de1 vo1umenceluïar.
E1 diagrama de 1a figura 1.4 esquematiza tres
mecanismosgeneraïes por Ios cuaïes Ios aniones atraviezan
1a membranap1asmática. La e1ectrodifusión (d) es e1 proceso
mediante 91 cua] se tiende a iguaïar e] potenciaï
e1ectroquímico de] anión a ambos 1ados de 1a membrana. La
difusión aniónica tiende a disipar 1os gradientes aniónicos
creados por procesos de transporte activos. En muchas
cé1u1as se ha encontrado que 1a eiectrodifusión contribuye
muypoco a1 transporte aniónico en situaciones normaIes.
E1 segundo tipo de transporte invoiucra un intercambio
e1ectroneutro de aniones (f). En este caso están acopïados
eï infiujo y e] efïujo de aniones. Este transporte iónico no
produce una transferencia neta de carga eïéctrica a través
de 1a membrana p1asmática, y es por Io tanto un proceso
e1ectricamente "silencioso". Debido a que no transporta
corriente, no infïuencia e1 potenciai de membrana de 1a
céïuïa. Otra caracteristica es que e] flujo de aniones de un
1ado de 1a membrana(cis) a1 otro (trans) es dependiente de
1a presencia de aniones transportabies en trans.
E1 cotransporte (a, b, c) es un tercer tipo de
transporte aniónico en e] cua] 91 f1ujo de aniones y
——1 _'
36
F A 4
Esquemade los distintos tipos de transporte aniónico
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La explicación de los distintos tipos de transporte aníóníco
presentes en células de vertebrados se puede ver en el
texto.
37
cationes esta acop1ado. E1 cotransporte se identifica a
menudopor 1a dependencia de] fïujo de cationes con 1a
concentración aniónica y viceversa. Sin embargo, 1a
demostración de 1a existencia de un cotransporte requiere
que ei flujo de 10s aniones y cationes sea mutuamente
dependiente y tenga una estequiometria definida. La mayor
parte de 105 sistemas de cotransporte son e1éctricamente
"si1enciosos". ya que no existe un fïujo neto de cargas, por
1o tanto no afectan e] potencia] de membrana.
Los sistemas de transporte a y b de 1a figura I.4 son
capaces de acumu1ar iones cïoruro en contra de un gradiente
e1ectroquimico. La energia necesaria para este transporte se
obtiene por e] fïujo de iones sodio a favor de] gradiente.
Por 10 tanto, e] cotransporte depende de 1a remoción de1
sodio por 1a acción de 1a Na*/K* ATPasa (f). Este úïtimo es
un proceso de transporte activo primario debido a que está
directamente acoplado a1 consumo de energia (ATP). Por e]
contrario. e1 cotransporte de] cloruro en contra de su
gradiente electroquimico se considera un transporte activo
secundario, ya que 1a energia se obtiene de] movimiento de
sodio. Este a su vez depende del mantenimiento de un
gradiente de sodio por un proceso de transporte activo
primario.
Los g1óbu1os rojos son céïuïas especiaiizadas en e]
transporte rápido de aniones a través de 1a membrana
plasmática. Esta propiedad confiere a Ios eritrocitos un
pape] importante en e] transporte de C02 a través de 1a
sangre. El C02 formado en los tejidos difunde a las células
en donde es transformado por una anhidrasa carbónica en
bicarbonato y protones. Los protones son captados por la
hemoglobinaI y un mecanismo de transporte aniónico
intercambia el bicarbonato intracelular por cloruro presente
en la sangre. De esta forma, el C02 puede ser almacenado
como bicarbonato plasmático, lo que aumenta mucho la
capacidad transportadora de C02 de la sangre (140).
Para que este mecanismotenga relevancia fisiológica,
el intercambio debe darse durante el pasaje del eritrocito
por los capilares pulmonares. Para maximizar la velocidad de
este transporte, es posible encontrar en el glóbulo rojo una
gran cantidad de moléculas especializadas. stas son
proteinas integrales de membrana, tienen un peso molecular
de 95 kDa y se conocen con el nombre de capnoforina. Se ha
demostrado que esta molécula es la responsable del
intercambio rápido entre aniones (140).
El sistema de intercambio aniónico es altamente
selectivo en eritrocitos. El cloruro es transportado más de
un millón de veces más rápido que un catión de tamaño
similar como el potasio. El sistema también presenta
selectividad para aniones según la secuencia HCOa' > Cl' >
Br' > SCN' > I', el flujo de ioduro es unas 300 veces más
lento que el del bicarbonato. Los aniones divalentes comoel
sulfato son transportados unas 1.000 veces más lentamente
que el cloruro. La alta selectividad no está relacionada a
la afinidad de los distintos aniones por la molécula sino
más bien a 1a ve1ocidad con 1a que cada anión es translocado
a través de 1a membrana (140).
Los compuestos derivados de] estiïbeno SITS y DIDS son
potentes inhibidores de] intercambio aniónico, estos
compuestos reaccionan cova1entemente, mediante un mecanismo
e1ectrofi1ico con 1a moïécuïa de capnoforina. Previamente a
esta reacción covaïente 1os residuos isotiociano dei DIDS y
de1 SITS se unen reversibïemente (140).
En otros sistemas ceïuïares se han descripto
intercambiadores aniónicos que mantienen muchas de 1as
propiedades de 1a capnoforina. Aïgunas de 1as simiïitudes
son 1a cinética de saturación con autoinhibición, una a1ta
dependencia con 1a temperatura, 1a interacción competitiva
con bromuro, nitrato y tiocianato y 1a capacidad de ser
inhibidas por SITS y DIDS. Una de las principaïes
diferencias es 1a incapacidad de discriminar entre cïoruro y
suïfato (140). Es posibïe que las mo1écu1as responsabïes deï
intercambio aniónico en diferentes cé1u1as presenten
ana1ogias y diferencias estructuraïes.
Capítqu II
Fertilización en mamíferos
41
AP T
F r iliz i í r
11.1 E1 espermatozoide
11.1.1 Morfoïogia del espermatozoide
E1 espermatozoide es e1 producto fina] de 1a
gametogénesis en e] macho, proceso que ocurre en ios túbulos
seminiferos de] testicuïo. La gametogénesis invoïucra una
serie de divisiones mitóticas de 1as espermatogonias. dos
divisiones meióticas de 10s espermatocitos, un
remodeïamiento morfo1ógico de 1a espermátide. y 1a
1iberación de 1a ceïuïa 1ibre en e] 1umen del túbuïo
seminifero mediante e] proceso conocido comoespermiación.
La espermatogénesis produce una célu1a en 1a que tanto
su estructura comosu función están aïtamente diferenciadas.
y es a1 mismotiempo totipotente, siendo capaz de combinarse
con e] óvu1o dando 1ugar a1 proceso que 11evará a 1a
formación de un nuevo individuo.
E1 espermatozoide de mamíferos tiene dos componentes
principaïes, 1a cabeza, y e1 flageïo (fig. II.1). La cabeza
está compuesta por un acrosoma, un núc1eo, citopïasma y
cantidades remanentes de estructuras de] citoesque1eto. E1
acrosoma es un gránuio secretorio de gran tamaño que rodea y
recubre 1a porción anterior deï núcïeo. E1 núc1eo de]
espermatozoide es haploide, contiene un único miembro de
_——
7
42
F A 1
Esquema general de un espermatozoide de mamífero
CABEZA: FLAGELO
, E PIEZA CONECTORA
Mmmm».
PIEZA
FINAL
La cabeza deï espermatozoide está adherida a 7a pieza
conectora del flagelo. Las otras regiones del flagelo son la
pieza media; 7a pieza principal y 7a pieza final. La pieza
media contiene 7a vaina mitocondriaï y 7a pieza principal,
7a vaina fibrosa.
43
cada par cromosómico, y 1a cromatina esta muy condensada. E1
fiageïo de 1os espermatozoides de mamíferos estácompuesto
por cuatro segmentos: 1a pieza conectora (cuello), 1a pieza
media, 1a pieza principa], y 1a pieza fina] (fig. II.1).
contiene un axonema centra1, ordenado en un compïejo de
microtúbuïos y rodeado por fibras que se extienden desde 1a
cabeza hasta e] finaï posterior de] axonema. La porción
anterior o pieza media dei fïagelo contiene mitocondrias
envueïtas en una hé1ice compacta que rodea 1as fibras
densas, 1a porción posterior o pieza principaï contiene una
vaina fibrosa que rodea 1as fibras densas. Las fibras densas
y 1a vaina fibrosa conforman e1 citoesque1eto deï flageïo.
La cabeza, a1 igua] que e1 fïageïo, está rodeada por 1a
membranap1asmática y contiene muy poco citopiasma (92).
Las estructuras especiaïizadas dei espermatozoide son
marcadores de su funcionalidad. E1 acrosoma contiene enzimas
esenciaïes para 1a fertiïización, y 91 f1age1o 1a fuente de
energia y la maquinaria necesaria para 1a motiiidad. La
función de estos componentes es asegurar 1a entrada a1 óvuio
de] materiaï genético que contiene e] núc1eo. Esta entrada
da 1ugar a 1a combinación de 1os pronúcïeos hapïoides
mascu1ino y femenino, con 10 que finaïiza 1a reproducción y
se inicia e] desarroïïo.
11.1.2 La membranapïasmática. Dominios de Superficie.
La membrana pïasmática de] espermatozoide está
subdividida en dominios regionales finamente deïineados que
difieren tanto en su función comoen su composición. La
heterogeneidad de 1a superficie del espermatozoide se
manifiesta mediante estudios sobre 1a carga de superficie,
1a unión de 1ectinas, e] perfi] de criofractura. y 1a unión
de anticuerpos. La membranap1asmatica de] espermatozoide,
según se deduce de estos estudios, es un mosaico de dominios
restringidos que refïejan 1as funciones especia1izadas de 1a
superficie y de ios componentes citopïasmáticos de1
espermatozoide.
Los principaies dominios de la membranapïasmática en
1a cabeza en ios espermatozoides de 1a mayoria de 10s
mamíferos son (fig. II.2): (a) e] capuchón acrosoma]
anterior y e] segmento ecuatoriaï, que rodean a1 acrosoma y
(b) 1a región postacrosoma], que cubre 1a cabeza desde su
región posterior hasta 91 acrosoma. La membrana piasmática
de1 f1age1o está separada por e] annuïus en un dominio que
rodea 1a pieza media y en otro dominio que rodea 1a zona
posterior o pieza principai por 91 annuïus, un aniïïo
fibroso que rodea 10s componentes dei axonema y que está
firmemente unido a 1a membrana (92).
45
FIGURAlll;
Dominios de 1a membrana plasmática‘ en 1a cabeza de Ios
espermatozoides de ratón y conejo
ACROSOMA
J_-----------"mx ANTEMOR
¡ZSEGMENTO
ANHLO ¿ECUATOMAL
POSTERIOR "
REGmN
RATON POSLACROSO- CONEJO
MAL
ANmLo
POSTEMOR
El dominio del acrosoma anterior es más extenso en aquellos
espermatozoides que poseen una cabeza espatulada, como 7a
del conejo. El dominio correspondiente a7 segmento
ecuatorial, recubre 7a parte posterior del acrosoma y es
mayor en espermatozoides con cabeza falciforme. El anillo
posterior divide el dominio postacrosomal de 7a cabeza deï
dominio de 7a pieza media del flagelo.
11.1.3 La cabeza.
La cabeza de 10s espermatozoides de mamíferos está
ocupada mayoritariamente por e] núcïeo y e] acrosoma, e]
citopïasma se ve reducido a un voïumen minimo durante 1as
úïtimas etapas de 1a espermatogénesis (fig. II.3). E1
acrosoma se encuentra en e] fina] anterior de 1a cabeza. por
debajo de 1a membranap1asmática, profundadamente endentado
en su parte posterior por e] núcleo.
E1 vo1umen de] núcïeo de] espermatozoide es menor que
e] de cé1u1as somáticas, y su cromatina está muy condensada.
Las dos divisiones meióticas que ocurren durante 1a
espermatogénesis producen un genoma hap1oide, es decir que
soïo un cromosomade cada par está presente en e1 núcïeo de]
espermatozoide (92).
E1 acrosoma se origina a partir del compïejo de Go1gi
en 1a espermátide y contiene 1as enzimas necesarias para que
91 espermatozoide penetre y/o se fusione con 1a membrana
pïasmática de] huevo para Iograr 1a ferti1ización. Esta
estructura de membranas se sitúa en forma de capuchón por
sobre 91 núc1eo en 1a porción anterior de 1a cabeza de]
espermatozoide (92).
La membranaacrosoma} interna esta adherida firmemente
a 1a porción anterior de 1a envoïtura nucïear; mientras que
1a membrana acrosoma1 externa se encuentra por debajo de 1a
membranapïasmática. E1 acrosoma consiste en dos segmentos:
47
FIGQRA L1,;
Estructura de la cabeza de los espermatozoides de cobayo y
humanos
MEMBRANAS HEMBRA NAS
Acrosoma
Plasma
Acrosomal extl
Acrosomal into
Envollura Núcleo
nuclear
Plasma
Acrosomal exterior
Acrosomal interna
Envollura nuclear
Acrosoma
_- _ __Acrosoma anterior
——- ——Segmento ecuatorial
Región postacro Somal
Núcleo __A_c_rgsomaanterior
"seqmenlo ecuatorial
Regiónposlacrosomal "Hen meme
Anillo
posterior ¡'¡ÏzÏa media
La membranaplasmática en los dominios correspondientes al
acrosoma anterior y al segmento ecuatorial rodean a la
membrana acrosomal externa. La membrana acrosomal interna
rodea a la envoltura nuclear. El acrosoma es más delgado en
la región del segmento ecuatorial.
e] acrosoma anterior y e1 segmento ecuatoria], que se
encuentran por debajo de Ios dominios de 1a membrana
p1asmática que 11evan e] mismo nombre. Durante 1a reacción
acrosoma], 1a membranaacrosoma] externa se fusiona y se
vesicuïiza con 1a membranap1asmática, y 1a mayor parte del
contenido de] acrosoma se 1ibera (fig. II.4). La membrana
acrosoma1 interna y e] segmento ecuatoria] persisten hasta
1a fusión espermatozoide-huevo en 1a mayoria de ias especies
(335).
11.1.4 E1 fïagelo.
E1 fïageïo de 10s espermatozoides de mamíferos está
compuesto por cuatro segmentos: 1a pieza conectora (cue110),
1a pieza media, 1a pieza principaï, y 1a pieza fina] (fig.
II.1). Las principaïes estructuras que se encuentran en e]
f1age1o son e1 axonema, 1a vaina mitocondria], 1as fibras
densas externas, y 1a vaina fibrosa.
E1 axonema está compuesto por un comp1ejo de
microtúbu1os dei tipo "9 + 2“ que se extiende a 10 Iargo de
todo e1 fïageïo. La pieza media contiene 1a vaina
mitocondria], mientras que 1a pieza principa] contiene 1a
vaina fibrosa. Las mitocondrias y 1a vaina fibrosa se
encuentran por debajo de 1a membranap1asmatica en 1a pieza
media y en 1a pieza principal respectivamente. Las fibras
densas externas se extienden desde e] extremo posterior de
1a pieza conectora hasta e] extremo posterior de 1a pieza
principa] y están situadas entre 1as mitocondrias y e]
49
F GURA I 4
Esquemade 1a progresión de una reacción acrosoma] típica
CAPUCHON
ACROSOMAL
f \ MEMBRANA
1 ACROSOMAL
a INTERNA
‘ c
ü
o \
° 2
0
I
¿o 21
0 o
0
A B C D
SE = SEGMENTO ECUATORIAL
axonema en 1a pieza media, y entre 1a vaina fibrosa y e]
axonemaen 1a pieza principe] (243.343).
E1 fïageïo provee 1a energia de movimiento necesaria para
que e] espermatozoide encuentre 1a superficie de] huevo y
1ogre 1a fertiïización. Los diferentes e1ementos que
constituyen e] fïageïo están involucrados en generar 1as
ondas que producen 1a fuerza y en propagar 1as ondas desde
1a base de1 f1ageïo hasta su punta (92).
II.2 Maduración del espermatozoide en e1 epididimo.
Cuando Ios espermatozoides de ios mamíferos dejan e1
testicu1o no son capaces de ferti1izar a1 ovocito. Esta
capacidad 1a adquieren a través de su 1ento pasaje a través
de] epididimo. Este proceso se denomina maduración
epididimaria [para revisiones recientes (8,17,66,93)]. E1
sitio en donde e] e] espermatozoide adquiere capacidad
fertiïizante varia de especie a especie. En aïgunas especies
(cerdo), es en e] segmento dista] deï caput epididimario
mientras que en otras especies (rata) es en e] segmento
dista] dei corpus deï epididimo (76). Es poco probabïe que
todos 1os espermatozoides aïcancen su capacidad fertilizante
simuïtaneamente. Aparentemente aïgunos espermatozoides
11egan a ser fértiïes más rápido (en una región más proxima1
de] epididimo) que otros. Sin embargo, como regia, 1a
mayoria de ios espermatozoides no a1canzan su p1ena
capacidad ferti1izantehasta que no 11egan a1 cauda
epididimario (335).
51
Uno de 1os cambios más importantes que ocurren durante
1a maduración epididimaria es e] desarroïïo de 1a capacidad
de1 espermatozoide para moverse. Los espermatozoides
testicu1ares son inmótiïes o muypoco motiïes. Esto es asi
no soïo en e] testículo sino también cuando son suspendidos
en una soïución fisioïógica. Por otra parte. los
espermatozoides ya maduros, ais1ados de] cauda de]
epididimo, inician un movimiento activo y progresivo 1uego
de ser expuestos a una soïución saïina fisioiógica. La
incapacidad de1 espermatozoide testicu1ar para moverse se
debe probabïemente en gran parte a la "inmadurez" de 1a
membrana p1asmática, ya que si estos espermatozoides son
desmembranados y expuestos a ATP, AMPcy Mgz‘ se mueven tan
activamente como Ios maduros (151,213,326).
E1 epididimo posee una aïta capacidad para absorber y
secretar fluidos. La composición quimica (46,142,188) y 1a
osmoïaridad (75) de] fluido secretado por e] epididimo varia
de un segmento a otro. Por 10 tanto, se puede esperar que 1a
membranap1asmática de] espermatozoide, que está expuesta
directamente a1 fiuido epididimario, se aitere paso a paso a
medida que e] espermatozoide atravieza 1as distintas
regiones. No queda duda acerca de que 1a membrana p1asmatica
es uno de 1os sitios en 91 que se producen 10s mayores
cambios durante e] tránsito de] espermatozoide a través de]
epididimo [para revisión (93.100,240)]. E1 aumento en 1a
capacidad de] espermatozoide para unirse a 1a zona pe11ucida
a medida que avanza a través de1 epididimo (73,241,249,272),
indica c1aramente una aïteración quimica de 1a membrana
pïasmática. E1 cambio en 1a carga negativa neta de
superficie es otra señaï de 1as modificaciones que ocurren
en e1 espermatozoide durante su maduración (14,141,215).
La membrana pïasmática de] espermatozoide ya esta
cubierta por numerosas macromoïécu1as cuando eI
espermatozoide deja e1 testículo (17,265). Durante su pasaje
a través dei epididimo estas moïécuIas preexistentes se
pierden o a1teran; y, nuevas macromoïécu1as originadas en 91
epididimo son absorbidas y/o integradas a 1a membrana
p1asmática (17,93). Las más importantes de estas
macromoïécuïas son gïicoproteínas (47,167,271). Los cambios
en 1as características de 1as 91icoproteinas preexistentes
estarían mediados, a1 menos parciaïmente, por enzimas como
1a gaïactosii-transferasa y 1a sia1i1-transferasa que se
encuentran en e] fïuido epididimario (24,130,133), asi como
por una proteina de] tipo de 1a a1fa-1actoa1búmina
(131,155). Los cambios en 1a capacidad de unión a 1ectinas
de 1a membrana p1asmática de] espermatozoide indican que
aïgunos residuos gïicosidicos terminaïes de ias
gïicoproteinas son aïterados durante 1a maduración
(134,225).
Las 91icoproteinas no son 1as únicas moïécuïas de 1a
membrana que cambian durante 1a maduración. También varia 13
composición 1ipidica, 1o que produce cambios en 1as
características fisicas y quimicas de 1a membranapïasmática
(226,247,280). E1 hecho de que e] epididimo, particuïarmente
en 1a zona de] corpus, tenga una actividad de sintesis de
co1ester01 muyaïta (132) sugiere que e] coïesteroï es uno
de ios 1ipidos que se integran a 1a membrana de]
espermatozoide durante su maduración.
Es importante destacar que 1a membranapïasmatica que
corresponde a 1a cabeza de] espermatozoide no es 1a única
parte de 1a membrana que sufre modificaciones químicas
durante 1a maduración. Se ha descripto 1a absorción y/o
integración de giicoproteínas y otros péptidos a 1a membrana
p1asmática correspondiente a 1a región de] flagelo
(48,239,305).
II.3 Capacitación de] espermatozoide.
Los espermatozoides de mamíferos, madurados en e]
epididimo y eyaculados no están 1istos para fertiïizar a1
huevo. Poseen capacidad fertiïizante, sin embargoantes de
manifestaria, 10s espermatozoides deben pasar un cierto
tiempo en si tracto genita1 femenino. donde aparentemente,
sufren cambios fisio1ógicos (funcionaïes). Estos cambios.
que 11evan a1 espermatozoide a ser capaz de fertiïizar a1
huevo, se denominan en conjunto como capacitación.
Aún hoy, 40 años despues de] descubrimiento de 1a
capacitación por Chang (56) y Austin (5), aïgunos
investigadores dudan sobre 1a necesidad de 1a misma, ya que
espermatozoides epididimarios o eyacuïados, que jamás fueron
expuestos a1 tracto genita] femenino, son capaces de
ferti1izar huevos en un medio artificia1. Si se define a 1a
54
capacitación soïo comoe] fenómeno que tiene 1ugar en e]
tracto genital femenino, 1a duda está justificada. Sin
embargo, es más apropiado considerar que e] medio artificiaï
usado para inseminar huevos simuïa 1a acción capacitante del
tracto femenino. Si 1a capacitación no fuera un requisito,
entonces, los espermatozoides recien eyacuïados deberian ser
capaces de ferti1izar huevos inmediatamente. Existe un
retraso entre 1a inseminación y e] comienzo de 1a
fertiIización. Este 1apso puede estar entre una y varias
horas, dependiendo de 1a especie, y representa 91 tiempo
aproximado que 11eva 1a capacitación.
E1 término capacitación fue originaïmente propuesto
para referirse a 1os cambios fisioïógicos que ocurren en e]
espermatozoide y 1o hacen capaz de fertiïizar a1 ovocito
(6). Es indudabïe que 1a reacción acrosoma] que sigue a 1a
capacitación es necesaria para 1a fertiïización normal, y,
aïgunos investigadores insisten en que 1a reacción acrosoma1
debe ser considerada como parte de Ia capacitación (57).
Otros investigadores como Austin (7), Bedford (15) y
Yanagimachi (335), opinan que 1a capacitación y 1a reacción
acrosomaï deben considerarse fenómenos separados; 1a
capacitación seria entonces 1a serie de cambios que hacen
que e1 espermatozoide sea capaz de sufrir 1a reacción
acrosoma]. Mientras que 1a reacción acrosomal es un fenómeno
que ocurre en Ios espermatozoides pertenecientes a todo e]
reino anima], 1a capacitación, en cambio, es un fenómeno que
so1o ocurre en mamíferos y quizás en unos pocos animales que
no pertenecen a esta cïase. Tanto 1a capacitación como 1a
55
maduración epididimaria de Ios espermatozoides de mamíferos
podrian ser e] resultado de 1a adaptación evolutiva a 1a
fertiiización interna.
11.3.1 Capacitación “in vivo'.
La capacitación ocurre normaïmente en e1 tracto genita]
de 1a hembra en estro. E1 sitio en donde 1a capacitación
comienza y en e] que se compïeta puede variar dependiendo de
donde se depositan 10s espermatozoides durante e1 coito. En
especies en 1as que 10s espermatozoides son depositados en
1a vagina (en conejos y en humanos), 1a capacitación puede
comenzar durante e] pasaje deï espermatozoide a través de1
cueïïo o de] moco cervica] (125,179). En especies en ios que
e1 semen es depositado directamente en e] útero (muchos
roedores y cerdo), e] principaï sitio de capacitación es e]
oviducto (144).
No se conoce practicamente nada acerca de 1as
condiciones o factores que controïan 1a capacitación en e]
tracto femenino. Numerosas sustancias han surgido como
posibïes candidatos, entre eïïos enzimas como 1a beta­
amiïasa y beta-g1ucuronidasa (129), proteinasa y
neuraminidas (154,285), ariïsu1fatasa, fucosidasa y
aceti1hexosaminidasa (253.254), anhidrasa carbónica (61), y
su1fatasa de esteroides (181). g1icosaminogïicanos (135),
cateco1aminas (137), y taurina e hipotaurina (207). Se
necesitan más estudios para determinar si estas sustancias
están reaïmente invoïucradas en 1a capacitación de]
56
espermatozoide "in vivo". Cuaïesquiera sean estas
condiciones o factores capacitantes, no parecen ser muy
especificas de 1a especie, ya que espermatozoides y huevos
de una especie pueden efectivizar 1a fertiïización en e1
oviducto de otra especie (84.273).
11.3.2 Capacitación 'in vitro'.
En 1963, Yanagimachi y Chang (336) informaron que 10s
espermatozoides de mamíferos podian ser capacitados "in
vitro". Hoy en dia, se usan comunmente medios Tyrode y
Krebs-Ringer modificados con e] agregado de fuentes de
energia (g1ucosa, iactato, y piruvato) y de aïbúmina. Sin
embargono existe un medio único capaz de 1ograr 1a
ferti1ización "in vitro" (capacitación "in vitro" de]
espermatozoide) de todas ias especies. Un medio bueno para
1as gametas de una especie no necesariamente es bueno para
1as de otra.
Las conc1usiones sacadas por numerosos investigadores
acerca de que a1gunos reactivos bïoquean 1a capacitación
porque, en presencia de éstos, e1 espermatozoide no es capaz
de fertiïizar a1 ovocito, deben ser tomadas con precaución.
Estas concïusiones pueden o no ser ciertas, ya que 1a
capacitación no es e1 único proceso que debe ocurrir en e]
espermatozoide para que pueda fertiïizar. Para ser capaz de
fertiiizar a1 huevo, e1 espermatozoide debe ser aïtamente
móti] y capaz de sufrir 1a reacción acrosoma], asi como de
penetrar ias envoïturas deï huevo y fusionarse con su
57
membrana. Por 1o tanto, e] hecho de que una fertilización
ocurra "in vitro" siempre indica una capacitación
satisfactoria, pero e] hecho de que 1a ferti1ización "in
vitro" no se produzca no significa que 1a capacitación no se
haya producido.
Es muy común considerar a ia reacción acrosoma] como un
indicador de que 1a capacitación se produjo, sin embargo,
condiciones inusuaies o reactivos especiaïes (por ej:
ionóforos de caïcio) pueden inducir 1a reacción acrosoma],
sin capacitación. Por otra parte 1a ausencia de 1a reacción
acrosoma] no indica necesariamente que e] espermatozoide no
se haya capacitado.
11.3.3 Eventos que ocurren durante 1a capacitación.
II.3.3.1 Activación del sistema adeniïato cicïasa/quinasa de
proteinas.
No queda duda de que e] sistema adeniiato ciclasa y
quinasa de proteinas dependiente de AMPcjuega un importante
papa] tanto en 1a iniciación como en e] mantenimiento de 1a
moti1idad [para revisión (302)]. Es muyprobab1e que este
sistema esté activamente invoïucrado en 1a capacitación.
Existen evidencias de que 1a adeniïato cicïasa en e]
espermatozoide incrementa su actividad durante 1a
capacitación (23,217,288). E1 consiguiente aumento de AMPc
estimuia 1a actividad de 1a quinasa de proteinas dependiente
de AMPc.Esta estimuïación podria aïterar 1a estructura
terciaria y cuaternaria de 1a membranade] espermatozoide a
través de 1a fosfori1ación de proteinas de membrana (143).
con 1a consiguiente aïteración de 1a permeabiïidad de 1a
membranaa distintos iones.
II.3.3.2 Cambiosen 61 metabolismo respiratorio.
Existen evidencias acerca de que e1 espermatozoide
exhibe un metaboïismo aumentado (por ej: actividad
gïicoiitica y consumode oxigeno) iuego de permanecer en el
tracto genita] de 1a hembra (41). En muchas especies, 1os
espermatozoides exhiben un movimiento muy vigoroso, llamado
hiperactivación (334), poco después de iniciada 1a reacción
acrosoma]. Durante 1a capacitación podrian ocurrir aigunos
cambios en 1a membranap1asmática que hicieran más accesibie
1a energia a1 aparato motor de] espermatozoide.
II.3.3.3 Variación en 1a concentración intraceluïar de
iones.
Los espermatozoides mantienen gradientes iónicos a
través de 1a membrana plasmática, 1a concentración de
potasio es superior dentro de 1a cé1u1a que en 91 exterior,
mientras que 1a concentración de sodio es superior en 91
exterior ceïuïar. Se cree que e] gradiente iónico es
mantenido por 1a bomba intercambiadora Na’/K* ATPasa
(252,313). De acuerdo con Hyne y col. (146), en
espermatozoides de cobayo, aumenta 1a concentración de sodio
y disminuye 1a concentración de potasio, Iuego de 2 horas de
59
incubación en un medio capacitante. E1 medio usado por Hyne
y coï. es deficiente en potasio, y ïos cambios iónicos
pueden interpretarse como una inactivación gradua] de 1a
Nai/K* ATPasa en un medio 1ibre de potasio (335).
Está estabiecido que 1a reacción acrosoma] se
desencadena como consecuencia de 1a entrada masiva de caïcio
a través de 1a membrana p1asmática. Sin embargo se conoce
muypoco acerca de 1a cinética de entrada de] caïcio a1
espermatozoide durante su capacitación. La concentración
intraceïuïar de caïcio es baja debido a 1a presencia de una
bomba Caz‘ ATPasa y un intercambiador Na’/Ca2i presente en
1a membranapïasmática (43-45). Utiïizando 1a técnica de
queïantes f1uorescentes, como quin-2, para 1a medición de
ca1cio intrace1u1ar, Mahanes y co]. (198) no ha11aron
cambios en 1a concentración de caïcio intrace1u1ar de
espermatozoides de conejo, 1uego de ser incubados en un
medio capacitante. Este hecho podria deberse a que 1a
técnica de Quin-2 mide 1a concentración intraceïuïar
promedio de un número grande de céluïas. es posibïe que en
espermatozoides individuaïes se puedan observar cambios
discretos, en regiones 1oca1izadas de1 espermatozoide de 1a
concentración intraceïuïar de calcio.
II.3.3.4 Cambiosen e] acrosoma.
En 1a mayoria de 1as especies, 1a estructura de]
acrosoma no cambia marcadamente durante 1a capacitación
(15,70,340). E1 acrosoma de] hamster dorado es una
excepción. Su contorno y 1a textura de 1a matriz acrosoma]
cambian 1uego de que e] espermatozoide se expone a un medio
capacitante (337). La razón de esto no se conoce, pero
podria deberse a1 infïujo o efïujo de aïgunas moïéculas
pequeñas a través de 1a membrana pïasmática y 1a membrana
acrosomal externa. Aún no se ha estab1ecido si aïgunas
enzimas acrosomales que están en su forma inactiva pasan a
una forma activa durante 1a capacitación (124).
II.3.3.5 Cambiosen 91 núcïeo.
La cromatina de Ios espermatozoides de 1a mayoria de
1os mamíferos euterianos son estructuras muyestabïes debido
a1 entrecruzamiento extensivo de proteinas nucleares por
uniones disuïfuro (50). Esta estabilidad se mantiene a 1o
1argo de 1a capacitación (174).
II.3.3.6 Modificaciones de 1a membranaplasmática.
La membrana pïasmatica se encuentra expuesta
directamente a1 entorno capacitante, y es sobre esta que se
observan 1os cambios más importantes durante 1a
capacitación. Desde que Weinman y w111iams (325) y Piko
(251) postu1aron que 1a remoción o aïteración de materia1es
que recubrian a1 espermatozoide constituía una parte
importante de1 proceso de capacitación, 1a evidencia a
favor de este punto de vista ha crecido considerabïemente
[para revisión (59,238,334)].
61
Aún no se conoce exactamente que es 1a capacitación. La
remoción o a1teración de sustancias adsorbidas o integradas
a 1a membrana pïasmática de] espermatozoide durante su
maduración en e] epididimo, o 1uego de] contacto con e]
p1asma semina], constituye una parte muy importante de 1a
misma[para revisión (8,59,335)].
Se han descripto cambios en 1a distribución de varios
antígenos de superficie como función de 1a capacitación
(234,287,315.318). Estos cambios de superficie,
aparentemente son seïectivos, ya que existen numerosos
marcadores que no aiteran su distribución (69,187). Aqueïios
factores, cuya remoción promoveria 1a capacitación, se
denominan decapacitantes [para revisión (238)]. Muchos de
estos factores decapacitantes son componentes de] f1uido
epididimario o de1 p1asma semina] que estabi1izan 1a
membrana p1asmatica de] espermatozoide, controïando 1a
permeabi1idad de 1a membranapïasmática a ciertos iones,
previniendo de esta forma Ia reacción acrosoma] temprana.
Recientemente se han identificado un factor estabiïizante de
acrosoma (ASF), en conejo (307,328), y 1a ca1trina en toro
(63,64).
Un cambio en 1a naturaïeza intrínseca de 1a membrana
p1asmática, compatibïe con 1a caracteristica de
reversibiïidad de 1a capacitación, es Ia saïida de
co1ester01. Esta salida resu1ta en una disminución en 1a
reïación co1estero1/fosfoïipidos. Como aceptores de
coïesteroï "in vivo", se han propuesto 1as proteinas que
unen esteroides, presentes en el tracto genita] femenino
(78,80,81,121,122,181). Para 1a capacitación "in vitro", 1a
aïbúmina aparece como 91 candidato que provoca e1 efiujo de
coïestero1 (79,122,218). Más a11á de1 mecanismo de sa1ida de
coiestero1, se sabe que un infiujo de coiesteroï inhibe 1a
capacidad fertiiizante (79.94.122), mientras que 91 eflujo
de coiesteroï. se ve asociado con un aumento de 1a
fertiiización (99,180,181).
Se reconoceque 1a capacitación prepara a1
espermatozoide para 1a reacción acrosoma], que está
caracterizada por un aumento en 1a permeabiïidad a1 caicio y
1a fusión de membranas. E1 efecto neto de 1a disminución de
1a re1ación coiesteroï/fosfolípido es un aumento en 1a
f1uidez de 1a membrana. Basado en 1a evidencia existente en
eritrocitos (327), se ha sugerido que 1a disminución en e]
reïación coïesterol/fosfo1ipido, provoca un incremento en 1a
permeabiiidad a1 ca1cio (78). Otro efecto de] ef1ujo de
coiestero] seria e1 aumento en 1a susceptibiïidad de]
espermatozoide a 1a fosfoïipasa A2, 10 que provoca un
incremento en 1a producción de iisofosfoïipidos, conocidos
fusógenos de membranas bioïógicas (181). E1 aumento de estos
tres parámetros, 1a f1uidez, e} ca1cio intrace1u1ar, y 10s
1isofosf01ipidos son importantes para que ocurra 1a reacción
acrosoma] (335).
63
11.4 La reacción acrosomaï.
E1 acrosoma de 10s espermatozoides de mamíferos es una
organeïa rodeada por membranas que recubre 1a porción
anterior de1 núcïeo de] espermatozoide. Esta organeïa es e]
producto de] compiejo de Goïgi y es sintetizada y ensambïada
durante 1a espermiogénesis. Pese a que su forma y su tamaño
varia considerabïemente de especie a especie (9,98), su
estructura básica y su función es 1a misma en todos 1os
mamíferos euterianos (334). Las membranas (acrosomaï externa
y pïasmática) que recubren esta organeïa se fusionan y
vesicuïizan en respuesta a ciertos estimuïos fisioïógicos o
farmacoIógicos, 1o que 11eva a 1a 1iberación de] contenido
acrosoma1 a1 medio extraceïuïar. La fusión y vesicuïización
de 1a membrana acrosoma] externa con 1a membrana p1asmática
constituye 1a reacción acrosoma1, que puede ser considerada
un proceso exocitótico. La terminación de 1a reacción
acrosoma] es un requisito absoiuto para que ocurra 1a
ferti1ización (335).
En muchos trabajos se considera a1 acrosoma como un
1isosoma modificado. A1 igua] que esta organeïa, e] interior
de1 acrosoma tiene un pH ácido y contiene una serie de
enzimas hidroïiticas como1a hiaïuronidasa, beta-N-acetiï­
gïucosaminidasa y fosfatasa ácida, además de 1a proacrosina
(zimógeno de 1a proteasa de pH neutro acrosina) (92). Sin
embargo, e] acrosoma no está invo1ucrado en procesos
degradativos en e] interior de 1a céïuïa espermática y por
otra parte, es una vesicu1a exocitótica que Iibera su
contenido en respuesta a estimuïos especificos (112). Dado
que otras vesicuias secretorias contienen hidroiasas ácidas
y un pH interno bajo, posibïemente sea más apropiado
referirse a1 acrosoma comogránuio secretorio.
11.4.1 Significado bioïógico de 1a reacción acrosoma].
A medida que e1 espermatozoide avanza en e] tracto
reproductivo de 1a hembra, existen una serie de procesos
se1ectivos, con variantes según 1a especie, que limitan 1a
11egadadei espermatozoide a1 sitio de fertiïización. Estos
procesos se1ectivos son tanto anatómicos como ambientaïes.
Entre e110s se pueden inciuir: 1a interacción entre e1
espermatozoide y e] moco cervica], e] entorno iónico,
inciuyendo variaciones en e] pH, y ias secreciones dei
tracto reproductivo de 1a hembra. E1 espermatozoide que
11ega a 1a zona de 1a ampuiïa en ei oviducto encuentra
nuevas barreras se1ectivas asociadas a1 huevo ovuiado. Entre
estas barreras encontramos envoïturas ce1u1ares que forman
e] cumuius oophorus y 1a corona radiata, y matrices
extraceiuiares (giicosaminogïicanos de 1a matriz ceiuiar de1
cumuius y 1a zona pe11ucida). Estos procesos de seiección
servirian para que 1a interacción entre e1 espermatozoide y
e] huevo ocurra entre las gametas más competentes para
fusionarse satisfactoriamente [para revisión (159,297).
La reacción acrosomai por si misma puede ser
considerada como un proceso seiectivo necesario para
asegurar 1a 11egada de espermatozoides en estado óptimo a ia
65
zona pe11ucida. La zona pe11ucida es un producto secretado
por e] ovocito en crecimiento y constituye e] sitio iniciai
en 1a interacción espermatozoide-huevo (31). En muchas
especies, aqueiios espermatozoides que reaccionan
prematuramentetienen reducido su potenciai para fertiïizar
y no iogran penetrar 1a masa dei cumuius oophurus. Esto
ocurre debido a su adherencia a 1a región externa de 1a
matriz extraceiuiar que rodea a estas céiuias (65,294).
Aqueiios espermatozoides que sufren 1a reacción acrosoma]
dentro de 1a matriz extraceïuiar de] cumuius tienen una
menor capacidad para seguir penetrandoia. Esto es debido a1
hecho de que se adhieren a ias céiuias dei cumuius (297).
Finaimente aque1ios espermatozoides que sufran 1a reacción
acrosoma] 1uego de haber atravezado a1 cumuïus no iograrán
unirse a 1a zona pe11ucida. Como hecho genera], 10s
espermatozoides con e] acrosoma intacto pueden unirse a 1a
zona peiiucida. Esto ha sido comprobado en ratón (274), en
cerdo (250), en hamster (158,282), en oveja (72), en toro
(71,105,106), en conejo (232), en humanos (148), en cobayo
(223), y en rata (283). De estas especies, só]o en cobayo.
conejo y ratón, se ha comprobado que e] espermatozoide
reaccionado también es capaz de unirse a 1a zona pe11ucida
(216,223).
La función primaria de 1a reacción acrosoma] seria
permitir 1a penetración de 1a zona peiïucida por e)
espermatozoide y su acceso a1 espacio periviteiino. Una
consecuencia de 1a penetración es e1 desarroiïo en 1a zona
de un corte definido, que presumibiemente sea e] resuitado
de 1a digestión 1imitada de 1a matriz por parte de proteasas
asociadas a1 acrosoma. La contribución reïativa de fuerzas
mecánicas generadas por 1a motiïidad de] espermatozoide y 1a
digestión enzimática que median 61 pasaje deï espermatozoide
a través de 1a zona pe11ucida no está c1ara (159).
Una vez que e] espermatozoide reaccionado penetró 1a
zona, tiene capacidad para fusionarse con 1a membrana
pïasmática de] huevo. Dado que Ios espermatozoides con e]
acrosoma intacto no poseen esta capacidad (334,338), 1a
reacción acrosomaï y 1a resuïtante exposición de 1a membrana
acrosoma] interna y de1 segmento ecuatoria1 juegan un pape]
c1ave en e] proceso de fusión entre e] huevo y e]
espermatozoide. La naturaïeza de Ios componentes asociados
con 1a membrana acrosoma] interna y/o con e] segmento
ecuatoria] que actúan en 1a fusión no son conocidas con
cïaridad.
En resumen, e] significado bioïógico de 1a reacción
acrosomaï io podemos dividir en dos. En primer 1ugar, en 1a
mayoria de 1as especies estudiadas. 1a reacción acrosoma1
sirve comoproceso de seïección, que asegura sóïo 1a 11egada
de un espermatozoide viabïe con e] acrosoma intacto a1 sitio
inicial de 1a interacción huevo-espermatozoide (1a zona
pe11ucida). En segundo 1ugar, 1a inducción de 1a reacción
acrosoma] por 1a zona peïïucida asegura que e]
espermatozoide que aïcanza e] espacio periviteïino sea capaz
de fusionarse con 1a membranap1asmática de] huevo.
67
II.4.2 Morfología y cinética de 1a reacción acrosomaï.
II.4.2.1 Distinción entre reacción acrosoma] "verdadera" y
"falsa".
Dado que e] acrosoma contiene una variedad de enzimas
hidroiiticas, e] acrosoma del espermatozoide puede ser
"autodigerido" en espermatozoides muertos o moribundos. La
membrana acrosoma] externa y 1a membrana plasmática que 1a
recubre pueden ser destruidas (parciai o totaimente). Los
espermatozoides en este estado pueden ser considerados como
espermatozoides "reaccionados" a1 microscopio óptico. Por 1o
tanto es muyimportante distinguir entre 1as modificaciones
degenerativas de] acrosoma en espermatozoides muertos o
moribundos de 1a reacción acrosoma] fisioïógica que ocurre
en espermatozoides móti1es. Bedford (15) propuso 11amar
reacción acrosoma] "faïsa" a 1a de] primer caso y
"verdadera" a 1a del segundo.
II.4.2.2 Ensayos utilizados para cuantificar 1a reacción
acrosoma] 'verdadera'
E1 anáiisis de Ios mecanismos mOIecuïares invoiucrados
en 1a reacción acrosoma] de] espermatozoide requiere de una
metodo1ogia que permita asegurar en forma inequívoca e1
estado de su acrosoma.
Hoy en dia, e] mejor metodo para asegurar 91 estado de1
acrosoma es