tesis-n5011-Grandellis

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Tesis Doctoral
Identificación de la proteína quinasaIdentificación de la proteína quinasa
dependiente de calcio isoforma 3 dedependiente de calcio isoforma 3 de
Solanum tuberosum (StCDPK3):Solanum tuberosum (StCDPK3):
estudio genómico, transcripcional yestudio genómico, transcripcional y
bioquímicobioquímico
Grandellis, Carolina
2011
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Cita tipo APA:
Grandellis, Carolina. (2011). Identificación de la proteína quinasa dependiente de calcio
isoforma 3 de Solanum tuberosum (StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y bioquímico.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Grandellis, Carolina. "Identificación de la proteína quinasa dependiente de calcio isoforma 3 de
Solanum tuberosum (StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y bioquímico". Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES 
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 
 
 
Identificación de la proteína quinasa dependiente 
de calcio isoforma 3 de Solanum tuberosum 
(StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y 
bioquímico 
 
 
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de 
Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLOGICAS 
 
 
Autor: Lic. Carolina Grandellis 
Directora de tesis: Dra. Rita M Ulloa. 
Consejera de estudios: Dra. Sara Maldonado 
 
Lugar de trabajo: Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y 
Biología Molecular (INGEBI - CONICET) 
 
Lugar y fecha Buenos Aires, 2011 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Serendipity 
Agradecimientos 
 
 
 
Blanca y Jorge Grandellis 
Ceci 
Chapi 
CONICET 
Danita 
Dari Grandellis 
David Hannapel 
el Doc 
Euge 
Eze 
Fede 
Fer Bravo 
Francisca 
Gaby Soto 
Gladis 
Gusty Grandellis 
Ignacio 
INGEBI 
Irma 
Jorge Muschietti 
José Chema 
José Gerde 
Laurita Grandellis 
Leti 
Llera Andrea 
Lu López 
Lula 
M. Laura 
Magalí 
Mari 
Marianas 
Marina 
Marina A 
Mary 
Matías 
Mauro 
Mercedes Rivero 
Mirtha Flawia 
Naty 
Noe 
Noé Durán 
Norma 
Norma 
Paulis 
Rita 
Romi Fox 
Romi Rebozzio 
Ruben 
Ruben 
Sabi 
Salito 
Sandra 
Sara Maldonado 
Sergio Feingold 
Susana Alvarado 
Tere 
Tía Monona 
Tian Lin 
Tim 
Vero 
Vilma 
Virginia H 
 
 
 
 
 
Resumen 
Identificación de Solanum tuberosum proteína quinasa dependiente de 
calcio 3 (StCDPK3): estudio genómico, transcripcional y bioquímico 
 
 
Las CDPKs acoplan un sensor de calcio a un dominio quinasa y coordinan respuestas 
fisiológicas frente a estímulos. StCDPK3 codifica una CDPK funcional homóloga a isoformas de 
tomate y tabaco. Se amplificó el gen StCDPK3 (11366 pb), se generó y purificó la proteína 
recombinante y se determinaron sus parámetros cinéticos. Antagonistas de calmodulina 
disminuyen la actividad de 6xHisStCDPK3. La proteína recombinante se autofosforila y fosforila 
histonas. Se generó un anticuerpo policlonal que detecta a StCDPK3 en extractos particulados 
de hojas. 
StCDPK3 se expresa en respuesta a PGA y ABA, pero disminuye en respuesta a GA. Líneas 
transgénicas de fusión del promotor a GUS indican que es activo en hojas, raíces, ojos y brotes 
de minitubérculos y en estolones elongantes. La actividad GUS disminuye tras la elongación del 
estolón previo al inicio del crecimiento radial y aumenta en tubérculos tempranos. 
El factor de transcripción NtRSG es fosforilado por NtCDPK1. Se subclonó su homólogo en papa 
que es fosforilado in vitro por 6xHisStCDPK3. Además, StCDPK3 fosforila a StABF1. StCDPK3 
podría participar en la transducción de señales asociada a procesos de crecimiento y 
elongación durante el desarrollo del tubérculo (modelo I), el desarrollo de raíces y brotes 
(modelo II) y como quinasa específica del FT StRSG (modelo III). 
 
Palabras clave: StCDPK – transducción de señales – autofosforilación –fitohormonas - 
proliferación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract 
 
Identification of Solanum tuberosum calcium dependent protein kinase 3 
(StCDPK3): genomic, transcriptional and biochemical studies. 
 
CDPKs couple calcium sensors to a kinase domain, and coordinate physiological responses to 
stimuli. StCDPK3 encodes an active CDPK homologous to tobacco and tomato isoforms. The 
gene was amplified (11366 bp), the recombinant protein was produced and kinetic parameters 
were evaluated. Calmodulin antagonists, CPZ and 48/80 reduce 6xHisStCDPK3 activity. The 
recombinant protein autophosphorylates and is able to phosphorylate histones. A policlonal 
antibody was produced that detected StCDPK3 in particulate extracts from leaves. 
StCDPK3 is induced in response to PGA and ABA, but is reduced after GA treatment. Transgenic 
lines carrying the StCDPK3promotor fused to GUS displayed GUS activity in leaves, roots, 
minitubers eyes, sprouts and in elongating stolons. When stolon elongation ceases before the 
onset of radial growth, GUS activity was downregulated to be later detected in early tubers. 
NtRSG is a transcription factor (TF) phosphorylated by NtCDPK1. The potato homologue, 
StRSG, was subcloned. In vitro, 6xHisStCDPK3 could phosphorylate NtRSG and StRSG, and an 
ABA transcription factor, StABF1, suggesting that these TFs could be endogenous targets of the 
kinase. StCDPK3 could play a role in elongation and proliferation events associated to tuber 
development (model I), root and sprout growth (model II) and as a specific kinase for StRSG 
(model III). 
 
Keywords: StCDPK – plant signaling – autophosphorylation- phytohormones – proliferation 
 
 
Índice 
Introducción general 1 
Introducción 1 
Objetivo general: 1 
Objetivo específico e Hipótesis 1 
Transducción de señales 1 
Transducción de señales en vegetales 2 
Mecanismos de fosforilación en vías de transducción de señalización 3 
El calcio como segundo mensajero en organismos vegetales 4 
Regulación del catión calcio en plantas 4 
Superfamilia de las Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio y Quinasas 
relacionadas a SNF1 
6 
Subfamilia de las Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio (CDPKs) 7 
Regulación de las CDPKs mediada por calcio, fosforilación reversible y 
autofosforilación, fosfolípidos y proteínas 14-3-3 
7 
Regulación por iones calcio 8 
Regulación por fosforilación reversible y autofosforilación 9 
Regulación por fosfolípidos 9 
Regulación por proteínas 14-3-3 10 
Funciones de las CDPKs durante el crecimiento, desarrollo y diferenciación, en 
respuesta a hormonas 
10 
Funciones de las CDPKs durante el crecimiento, desarrollo y diferenciación 10 
Funciones en respuesta a hormonas 11 
Identificación de sustratos de CDPKs y sistemas de señalización 12 
Modelo de trabajo: el cultivo Solanum tuberosum 14 
Brotación del tubérculo de Solanum tuberosum 16 
Formación del tubérculo en Solanum tuberosum 17 
Los fitocromos sensan la longitud del día 18 
Las giberelinas demoran la tuberizacion 19 
Síntesis de GAs en tejidos aéreos 20 
Las giberelinas poseen un efecto local en el estolón 21 
Efecto del ABA sobre la tuberización 22 
Efecto de sacarosa sobre la tuberización 22 
Familia de factores de transcripción de tipo BEL1 enSolanum tuberosum: un modelo 
para el transporte del RNA 
22 
La familia de los factores de transcripción BEL1 y KNOX de Solanum tuberosum 22 
Resultados 24 
Capítulo 1 24 
Objetivo 24 
Antecedentes de la línea de investigación 24 
Obtención de la secuencia codificante completa del gen StCDPK3 a partir de una 
biblioteca de cDNA 
24 
Alineamiento entre secuencias codificantes de StCDPKs1-5 26 
Obtención de anticuerpos específicos anti-StCDPK3 28 
Análisis de la secuencia aminoacídica de StCDPK3 28 
Resumen capítulo 1 29 
Capítulo 2 30 
Objetivo 30 
Consorcio de Secuenciación del Genoma de papa (PGSC: Potato Genome 30 
 
Sequencing Consortium) 
Análisis del gen StCDPK3 32 
Estrategias de subclonado de StCDPK3 32 
Screening de una biblioteca genómica de papa construida en vectores BACs 
(Bacterial Artificial Chromosome) 
32 
Identificación y confirmación por PCR de los BACs 33 
Amplificación de intrones de StCDPK3 33 
Análisis de intrones, sitios de splicing y señal de poliadenilación 36 
Análisis del contenido GC de CDPKs 37 
Resumen capítulo 2 37 
Capítulo 3 38 
Objetivo 38 
Caracterización bioquímica de StCDPK3 38 
Obtención de la proteína recombinante 6xHisStCDPK3 38 
Ensayos de Western blot con anticuerpos anti-StCDPK3 y anti-His 39 
Caracterización Bioquímica de 6xHisStCDPK3 40 
Actividad enzimática in vitro de 6xHisStCDPK3 40 
Análisis de la dependencia de calcio sobre la actividad CDPK en sobrenadantes de 
cultivos 
40 
Efecto de diferentes Inhibidores o antagonistas de calmodulina sobre la actividad 
de 6xHisStCDPK3. 
41 
Ensayos de fosforilación de diferentes sustratos e inhibidores 41 
Determinación de Parámetros cinéticos 42 
Determinación de concentración de calcio suficiente para obtener actividad 
enzimática de 6xHisStCDPK3 
44 
Ensayos de Fosforilación de Histona y auto-fosforilación en gel de StCDPK3 His6x: 45 
Predicción de sitios de fosforilación in silico 46 
Ensayo de autofosforilación de 6xHisStCDPK3 mediante electroforesis de geles 
bidimensionales (2D) 
47 
Evaluación del anticuerpo en extractos proteicos de plantas 50 
Resumen capítulo 3 53 
Capítulo 4 54 
Objetivo 54 
Estudios de expresión de la isoforma StCDPK3 54 
Expresión tisular de StCDPK3 en plantas de papa Solanum tuberosum y en diferentes 
estadios de desarrollo de una planta\ 
54 
Ensayo de RT-PCR semicuantitativa 54 
Ensayo de Northen Blot 55 
Expresión de StCDPK3 en condiciones de estreses bióticos y abióticos 56 
Fitohormonas 56 
Giberelinas (GA), Acido Indol Acético (AIA), Ácido Absícico (ABA 56 
Estrés biótico 58 
Ácido poligalacturónido (PGA) 58 
Estrés abiotico 59 
Híper-osmótico (NaCl), bajas temperaturas y oscuridad 59 
Expresión de StCDPK3 durante la brotación de la papa 59 
Resumen capítulo 4 60 
Capitulo 5 62 
Objetivo 62 
Estrategias utilizadas para identificar la región promotora de StCDPK3 62 
 
Amplificación de región promotora de StCDPK3 62 
Ensayo de RACE 5´para determinar el sitio +1 de transcripción 64 
Análisis in sílico de la región promotora de StCDPK3 64 
Amplificación del promotor de StCDPK1 66 
Generación de líneas transgénicas de papa fusionando promotor a gen reportero 67 
Construcción del plásmido binario 67 
Transformación mediada por A. tumefaciens 69 
Chequeo de líneas transgénicas mediante PCR 71 
Ensayo histoquímico de GUS y ensayo fluorométrico de actividad beta-
glucuronidasa 
72 
Ensayo de actividad beta-glucuronidasa fluorométrico 72 
Ensayo de actividad beta-glucuronidasa histoquímico 73 
Ensayo histoquímico en plantas propagadas in vitro 73 
Ensayo histoquímico en minitubérculos obtenidos in vitro y en plantas de 
invernadero: 
74 
Rusticación y fenotípico de las plantas transgénicas 75 
Resumen capítulo 5 76 
Capítulo 6 78 
Objetivo 78 
Ensayos de actividad quinasa in vitro con posibles sustratos de CDPKs 78 
Homología de secuencia y posibles sustratos 79 
Sustratos de CDPKs 81 
Nicotiana tabacum REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG): Factores de 
transcripción de la familia bZIP de plantas 
81 
Ensayos de fosforilación para determinar si StCDPK3 es capaz de fosforilar a NtRSG 82 
Amplificación de Solanum tuberosum RSG (StRSG) 83 
Subclonado y expresión de la proteína recombinante StRSG 85 
Análisis de la Estructura Genómica de StRSG 85 
Fosforilación de StRSG mediado por StCDPK3 in vitro 86 
El factor de transcripción ABF (Factor de unión a ABRE: elemento de respuesta a 
ABA) es fosforilado por CDPKs de Arabidopsis. 
87 
Ensayos de fosforilación de StABF1 mediado por 6xHisStCDPK3 88 
Ensayo de movilidad electroforética en gel (EMSA) con StABF1 y 6xHisStABF1 89 
Resumen capítulo 6 90 
Capítulo 7 92 
Introducción 92 
Familia de factores de transcripción de tipo BEL1: un modelo para el transporte del 
ARN 
92 
La familia de los factores de transcripción BEL1 de Solanum tuberosum 92 
Identificación de nuevas isoformas BELs 93 
Objetivos 93 
Resultados 93 
Nuevos miembros de la familia BEL1 de Factores de Transcripción 93 
Amplificación nuevos miembros de la familia BELs 94 
Alineamiento entre StBEL5 y las nuevas isoformas stBEL6 y StBEL33 95 
Análisis de RT-PCR de los nuevos genes BELs 97 
Estudio de interacción ente miembros de la familia BELs y proteínas KNOX 98 
Evaluación de interacción de los nuevos genes StBELs con proteínas Knox. 99 
Ensayo de actividad beta-galactosidasa cuantitativo 101 
Interacción de las nuevas isoformas BELs con proteínas Knox de tabaco 102 
 
Resumen capítulo 7 102 
Conclusiones 104 
Materiales y Métodos 110 
1. Cepas bacterianas 106 
Escherichia coli 106 
 Condiciones de cultivo 106 
Transformación de células competentes de E. coli por shock térmico. 106 
Preparación de células termo-competentes de E. coli. 106 
Transformación de células termo-competentes de E. coli. 106 
 Agrobacterium tumefaciens 106 
 Cepas y condiciones de cultivo. 110 
Transformación de células competentes de A. tumefaciens 111 
Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens 111 
Transformación de células competentes de A. tumefaciens 111 
2. Material vegetal 111 
Medio de multiplicación 111 
Sistema de tuberización in vitro 112 
Plantas en invernadero 112 
Micropropagación de plantas in vitro 112 
Generación de Líneas de plantas de papa transgénicas 112 
Tratamientos estreses abióticos y bióticos 112 
3. Metodología del ADN recombinante 112 
Plásmidos 112 
Oligonucleótidos iniciadores 113 
 Mini preparación de ADN plasmídico 115 
Purificación de ADN plasmídico utilizando kits comerciales: 115 
Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de Agarosa. 115 
 Amplificación de insertos por PCR 115 
 Digestiones con enzimas de restricción 115 
Reacciones de ligación 115 
Cuantificación del ADN y ARN 116 
4. Localización cromosómica de StCDPK3 116 
5. Extracción de proteínas 116 
Extracción de proteínas para western blot 116 
Extracción de proteínas para ensayo fluorométrico de GUS 116 
Cuantificación de proteínas totales 117 
6. Generación de plantas transgénicas por transformación de plantas 
mediante Agrobacterium tumefaciens 
117 
Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens 117 
Reactivos utilizados para la transformación 117 
Extracción de ADN genómico de plantas transgénicas 118 
PCR para chequeo de plantas transgénicas. 118 
Rusticación 118 
7. Expresión y purificación de proteínas recombinantes 118 
Purificación de proteínas recombinantes de fusión a GST: 119 
Purificación de proteínas recombinantes de fusión a His: 119 
8. Producción de anticuerpos anti-NTV-StCDPK3 119 
9. Southern, Northern y Western Blots 120 
Ensayos de Southern blot 120 
Ensayo de Northern Blot 120 
 
Marcado radiactivo de las sondas 121 
Ensayo de Western blot 121 
10. Metodología del ARN 121 
Extracción de ARN mediante RNeasy Plant Mini Kit y RT-PCR mediante kit 
SuperScript® III One-Step RT-PCR 
121 
Extracción de ARN mediante TRizol 122 
Determinación de la calidad del ARN 122Tratamiento con DNAsa 122 
Síntesis de cDNA 122 
11. Ensayos de actividad CDPK 123 
Ensayos de Fosforilación de StRSG in vitro 123 
Ensayo de movilidad electroforética en gel (EMSA) 124 
12. Ensayos con levaduras 124 
Medios de Levaduras 125 
 
 
125 
Transformación de levaduras 125 
Determinación de actividad enzimática de beta-galactosidasa 125 
Ensayo de tinción GUS (actividad β-glucuronidasa) 125 
Ensayo fluorométrico de actividad β-glucuronidasa. 125 
13. Electroforesis Geles 2D 126 
Ensayos de autofosforilación y fosforilación 126 
14. Bioinformática 127 
Bibliografía 128 
ANEXO I 133 
ANEXO II 137 
ANEXO III 139 
ANEXO IV 143 
1 
 
Introducción general 
 
Introducción 
 
Objetivo general: Estudiar procesos de transducción de señales durante el desarrollo de la 
planta de papa Solanum tuberosum y en respuesta a diferentes estímulos. El proceso de 
conversión de señales o estímulos en respuestas específicas permite descifrar el 
comportamiento biológico de los organismos y ampliar el conocimiento sobre ellos. 
 
Objetivo específico: Estudiar a nivel génico, bioquímico y proteico a StCDPK3 (Solanum 
tuberosum Proteína Quinasa dependiente de calcio 3). El calcio es un segundo mensajero 
importante en plantas implicado en procesos de transducción de señales. Las proteínas 
quinasas dependientes de calcio (CDPKs) sensan las elevaciones transitorias del catión y 
generan respuestas especificas en diferentes células y frente a distintas señales. Los objetivos 
particulares se detallan a continuación: 
 
 Identificar y amplificar la secuencia codificante completa del gen StCDPK3 a partir de una biblioteca de cDNAs 
 Expresar y purificar la proteína recombinante en bacterias 
 Caracterizar enzimáticamente a StCDPK3 
 Identificar y analizar la secuencia genómica del gen StCDPK3 y determinar su localización cromosómica. 
Analizar las secuencias intrónicas y exónicas 
 Amplificar las secuencias promotoras de StCDPK3 y construcción de un plásmido de fusión al gen reportero 
GUS. Ensayo de RACE 5’ para determinar sitio de inicio de transcripción. 
 Obtener un anticuerpo policlonal especifico contra StCDPK3 
 Determinar la expresión del gen en tejidos, estadios de desarrollo y en respuesta a diversas señales o estímulos 
mediante tinción de GUS, Northen blot y RT-PCR 
 Búsqueda de posibles sustratos de StCDPK3 basada en reportes previos para CDPKs homólogas 
 Identificar y amplificar al factor de transcripción REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG). Expresar el factor de 
transcripción recombinante en sistema bacteriano. Inducción y expresión de la proteína recombinante 
 Evaluar de la capacidad de StCDPK3 recombinante de fosforilar a los sustratos StRSG y StABF. 
 
Hipótesis 
 
 El gen StCDPK3 se expresa diferencialmente durante el ciclo de vida de la planta de 
papa y responde a estímulos bióticos y abióticos. Codifica para una proteína CDPK 
activa que participa en procesos de transducción de señales 
 
Transducción de señales 
 
La capacidad que poseen las células para percibir y actuar frente a señales a través de su 
membrana es fundamental para la vida. En organismos multicelulares, células que poseen 
diferentes funciones intercambian una gran variedad de señales. Las células vegetales 
responden a hormonas de crecimiento y a variaciones de la intensidad lumínica, por ejemplo. 
En células animales, las células intercambian información sobre las concentraciones iónicas y 
de glucosa en fluidos extracelulares, o también sobre la distribución celular correcta durante el 
desarrollo embrionario. En todos los casos, la señal representa información que es detectada 
por receptores específicos y son convertidos a una respuesta celular, que siempre involucra un 
proceso químico. Esta conversión de la información en un proceso químico, se denomina 
transducción de la señal y es una propiedad universal de las células. A menudo el resultado 
 
 
 
2 
 
final de una vía de señalización es la fosforilación de unas pocas proteínas blanco, que 
modifican su actividad y como consecuencia, la actividad de la célula (Lehninger, Cap. 12, 3 
Ed. 2002) 
 
Transducción de señales en vegetales 
 
Las plantas superiores son organismos sésiles que perciben estímulos del ambiente como por 
ejemplo la luz y señales químicas, y responden a esos estímulos modificando su actividad 
celular. Las vías de señalización utilizan una red compleja de interacciones para coordinar 
respuestas bioquímicas y fisiológicas como la floración, maduración de frutos, germinación, 
regulación de la fotosíntesis y desarrollo de brotes y raíces, entre otros procesos. De esta 
forma, al detectar una señal o estímulo, éste es transmitido a través de una vía de 
transducción, luego genera cambios en la actividad de factores de transcripción, y coordina 
modificaciones en la expresión de genes. En la Fig. 1.1 se describen la mayoría de las señales 
con las cuales las plantas tienen que lidiar durante su ciclo de vida, y antes las cuales deben 
generar respuestas que le permitan sobrevivir. 
 
 
Fig 1.1. Listado de señales endógenas y exógenas que funcionan como estímulos en plantas y generan 
una vía de transducción de señales que culmina con una respuesta específica (Gilroy y Trewavas, 2001) 
 
Como los animales, las plantas vasculares poseen mecanismos de comunicación entre tejidos 
que coordinan y dirigen el crecimiento y desarrollo, para adaptarse a las condiciones de 
oxígeno, nutrientes, luz, temperatura y para advertir la presencia de químicos nocivos y 
patógenos. Algunos mecanismos de señalización en plantas son conservados entre animales, 
como por ejemplo proteínas quinasas, proteínas de andamiaje, nucleótidos cíclicos, bombas 
iónicas electrogénicas, y canales iónicos regulados por voltaje. Algunos otros mecanismos, son 
similares a los sistemas bacterianos de dos componentes, y otros son únicos en plantas, como 
3 
 
aquellos para sensar las condiciones lumínicas, quinasas que fosforilan residuos serina o 
treonina, fosfatasas, proteínas de andamiaje que coordinan la formación de complejos 
proteicos, enzimas para la síntesis y degradación de nucleótidos cíclicos, y 100 o más canales 
iónicos (aproximadamente 20 son activados por nucleótidos cíclicos). También se encuentran 
en plantas fosfolípidos inositoles, y quinasas que interconvierten estos lípidos por 
fosforilación. Por otro lado, las proteínas G heterotriméricas y proteínas tirosina quinasas son 
mucho menos predominantes en los genomas de plantas, como también los receptores 
esteroides nucleares, de unión a DNA, que probablemente están ausentes en vegetales. A 
pesar de que las plantas carecen del sistema de rodopsina, que posee retinal como pigmento 
para sensar las luz, tienen una colección de otros mecanismos sensores de la luz que no se 
encuentran en los genomas animales, como los fitocromos y los criptocromos. Por otro lado, 
poseen otros compuestos que generan respuestas específicas y son similares a algunos 
compuestos animales: en vez de prostaglandinas, poseen jasmonatos; y en vez de hormonas 
esteroides, poseen brasinosteroides. Los brasinosteroides inactivan a la quinasa CTR-1, que a 
su vez activa una cascada de MAPK que conduce a la activación del factor de transcripción 
EIN3 (Insensible a Etileno 3). Este factor de transcripción induce la síntesis de ERF1 (Factor de 
Respuesta a Etileno), que activa genes de respuesta a etileno. Durante el curso de la evolución, 
el receptor de etileno de las plantas vasculares derivó de una cianobacteria endosimbionte, y 
la proteína quinasa de histidina bacteriana, se transformó en la proteína serina/treonina 
quinasa de plantas. 
 
Mecanismos de fosforilación en vías de transducción de señalización 
 
La condición de sésiles ha impedido que los organismos vegetales puedan escapar de 
condiciones ambientales cambiantes de forma repentina, y en consecuencia han desarrollado 
mecanismos para sensar estos cambiosy adaptar su fisiología, crecimiento y desarrollo a tales 
condiciones. Estas adaptaciones, involucran reacciones que deben ser rápidas y dinámicas, es 
decir, las actividades enzimáticas y modificaciones en los programas de expresión génica 
deben ser adecuados temporalmente para permitirle sobrevivir a condiciones adversas o 
cambios ambientales. Los procesos post-traduccionales de fosforilación y desfosforilación de 
proteínas son un mecanismo común en todos los organismos, que ha sido exitoso por su 
rápidez de acción. La fosforilación se realiza a través de la actividad de enzimas quinasas que 
típicamente están integradas a una cascada de señalización. Se estima que un 30% de las 
proteínas de una célula eucariota es fosforilado y el 5% del genoma de las plantas codifica para 
proteínas quinasas, indicando la importancia de esta modificación a nivel celular (Colcombet y 
Hirt, 2008). 
 
Las interacciones proteína-proteína tienen roles fundamentales en procesos celulares, como 
por ejemplo procesos de transducción de señales, ciclo celular, regulación metabólica, 
conformación proteica, etc. Además, la regulación de estas interacciones en tiempo y espacio 
definido es esencial para que el organismo sobreviva. Una de las vías más importantes que 
permiten regular estas interacciones proteína-proteína es a través de modificaciones post-
traduccionales, entre ellas, la fosforilación resulta un mecanismo primordial. La fosforilación 
reversible de residuos amino acídicos específicos puede generar cambios en la conformación y 
en la carga de las moléculas. Estos cambios pueden conducir a la generación de sitios activos 
de acoplamiento de otras moléculas, o a la activación o inactivación de enzimas (Tufan et al, 
2010). 
La fosforilación de proteínas es entonces un mecanismo conservado y básico en los 
organismos vivos que les permite sobrevivir a lo largo de su ciclo de vida. 
 
 
El calcio como segundo mensajero en organismos vegetales 
4 
 
 
El calcio representa el ion más versátil en organismos eucariotas. Está involucrado en casi 
todos los aspectos del desarrollo de una planta y participa en muchos procesos regulatorios. 
Debido a su flexibilidad para presentar diferentes números de coordinaciones y geometrías 
complejas, el calcio fácilmente forma complejos con proteínas, membranas y ácidos orgánicos. 
Además, esta característica le confiere al catión toxicidad celular a concentraciones elevadas, 
debido a que rápidamente formaría complejos insolubles con los grupos fosfatos de la célula. 
 
Por otro lado, el hecho de que la concentración de calcio espacial y temporal sea altamente 
coordinada y regulada, quizás ha concretado el camino evolutivo hacia la emergente 
señalización mediada por este catión cuya concentración es tan variable. El primer reporte 
acerca de la importancia del calcio en plantas se realizó en el alga verde de género Chara, y 
demostró que existen cambios en la concentración citosólica de calcio, que indican una 
función como segundo mensajero. A partir de ese reporte, numerosos artículos han 
demostrado que aumentos transientes de la concentración citosólica del catión están 
involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos, que incluyen respuesta a estreses 
abióticos, hormonas, y patógenos. Varios grupos además han reportado que cambios 
concretos en la concentración de calcio citosólica se disparan ante otros segundos mensajeros 
como ácido nicotínico dinucleótido fosfato (NAADP), Inositol trifosfato (IP3), Inositol 
hexafosfato (IP6), Esfingosina-1-fosfato, y ADP ribosa cíclica (cADPR). También se verificó que 
la identidad y la intensidad de un impulso específico del estímulo, resulta en una alteración de 
la concentración de calcio que es específica de ese estímulo y dinámica. 
 
La heterogeneidad de aumentos en la concentración citosólica de calcio libre en términos de 
duración de la señal, amplitud y frecuencia, han llevado a A.M. Hetherington a formular el 
IoﾐIepto de さCalcium signaturesざ o さsellosざ, Iu┞a defiﾐiIióﾐ es さcarácter peculiar o especial de 
algo, que lo hace diferente de los demásざ. Estos さsellosざ, Hasados eﾐ las difeヴeﾐtes aﾏplitudes, 
frecuencia y concentración, resultan en una respuesta específica para un estímulo. Las 
investigaciones surgidas posteriormente sugieren que aunque la distribución en forma y 
espacio de los aumentos de la concentración de calcio son críticos e importantes para la 
respuesta al estímulo, un nivel de regulación adicional y también importante lo constituyen las 
proteínas de unión a calcio, que funcionan como proteínas sensoras de calcio. Estas proteínas 
son capaces de decodificar y liberar la información codificada en las さsignatures” o さsellosざ, y 
la liberan en forma de interacciones proteína-proteína, cascadas de fosforilación definidas o 
respuestas transcripcionales (Kudla et al, 2010) 
 
Brevemente, la información procesada por las células de los organismos consiste en la 
percepción de un estímulo y continúa con una respuesta fisiológica apropiada. La propagación 
y amplificación de estas señales incluye la generación de cambios rápidos en los niveles 
subcelulares de segundos mensajeros. Los segundos mensajeros, como el Ca2+, los nucleótidos 
monofosfato cíclicos, los inositoles polifosfato, y otras moléculas pequeñas, transmiten la 
señal alterando el comportamiento de proteínas celulares específicas. 
Estos segundos mensajeros entonces transducen el estímulo a efectores río abajo que pueden 
ser enzimas, proteínas del citoesqueleto, factores de transcripción, etc. Estos efectores son los 
responsables de los cambios en la expresión de genes y de expresión de proteínas, cambios en 
la actividad metabólica y en el patrón de desarrollo (Defalco et al, 2010) 
 
Regulación del catión calcio en plantas 
 
La concentración de calcio se encuentra fuertemente regulada por transportadores (Fig 1.2). 
En condiciones normales la concentración citosólica de calcio se mantiene baja (100-200 nM) 
debido a que a elevadas concentraciones resulta tóxico. Como consecuencia, se establece un 
5 
 
gradiente de concentración considerablemente alto entre el citosol y los reservorios del catión. 
En células vegetales, la vacuola central es el principal reservorio intracelular. La hipótesis sobre 
la señalización de calcio sugiere que existe un patrón de influjo del catión espacial y temporal, 
y que este influjo codifica información que coordina una adecuada respuesta celular. 
 
La señal de calcio se define como el balance entre la activación de su canales en diferentes 
membranas celulares, que se sigue de la inactivación de esos canales y la activación de 
transportadores para finalizar el influjo de calcio y rebalancear la homeostasis celular, ambos 
procesos están regulados estrictamente (Kudla et al, 2010). En la Tabla 1.1 se detallan los 
canales y transportadores que generan el influjo y la salida (efflux) de calcio. 
 
Influjo de calcio Salida de calcio 
 Canales dependientes de voltaje en la membrana plasmática 
 Canales gatillados por ligando en la membrana plasmática 
 Canales dependientes de voltaje en la membrana vacuolar 
 Canales gatillados por ligando en membranas vacuolares y del 
retículo endoplasmatico 
 
 Antiporters calcio-proton 
 ATPasas-P 
 
Tabla 1.1. Canales y transportadores que median la liberación y captura de calcio en las células vegetales 
 
Las señales de calcio son parte de un lenguaje intracelular que permite la comunicación entre 
células. Estas señales necesitan esencialmente decodificadores que traduzcan la información 
que contienen. Para lograr esta necesidad, las plantas utilizan una batería de CBPs (Calcium 
Binding Proteins o Proteínas de Unión a Calcio) que sensan las señales, sufren cambios 
conformacionales y permiten la interacción río abajo con los demás efectores de la cascada de 
señalización. El motivo estructural de unión a calcio más común encontrado en proteínas se 
denomina EF-hand. Este motivo, altamente conservado, consiste en29 aminoácidos con una 
estructura hélice-giro-hélice. Se asemeja a una mano con el dedo índice y el pulgar extendido 
en ángulos rectos al resto de los dedos, enroscada hacia la palma formando la curvatura o 
loop. La curvatura (loop) consiste en 12 aminoácidos con residuos que coordinan al calcio. La 
unión de calcio genera cambios conformacionales que exponen bolsillos hidrofóbicos. A su vez 
estos sitios facilitan la interacción con otras proteínas. Estos motivos ocurren típicamente en 
pares y facilitan la unión a calcio de alta afinidad de forma cooperativa. 
 
 
Fig 1.2 Esquema de los sistemas transportadores de calcio en una célula de Arabidopsis thaliana. Las vías 
de flujo del catión Ca2+ que han sido identificadas a nivel molecular son: canales activados por 
6 
 
nucleótidos cíclicos (CNGC), Receptores de Glutamato (GLR), canales de dos poros 1 (TPC1), Receptor 
sensor de Ca2+ (CAS), ATPasa autoinhibida por calcio, ATPasa de calcio tipo ER (ECA), ATPasa de metales 
pesados 1 (HMA1), y el intercambiador catiónico (CAX). (Kudla et al, 2010). 
 
Superfamilia de las Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio y Quinasas relacionadas a 
SNF1 
 
La superfamilia de las CDPK-SnRK consiste en 7 tipos de proteínas quinasas serina/treonina: 
 
 Proteinas Quinasas dependientes de Calcio (CDPK) 
 Quinasas relacionadas con CDPK (CRKs) 
 Quinasas fosfoenolpiruvato carboxilasas (PPCKs) 
 Quinasas relacionadas a quinasas PEP carboxilasa (PEPRKs) 
 Proteinas Quinasas dependientes de calmodulina (CaMKs) 
 Proteinas quinasas dependientes de calcio y calmodulina (CCaMKs) 
 SnRKs 
 
Dentro de esta superfamilia, las isoformas individuales contienen dominios regulatorios 
característicos, localizaciones subcelulares y especificidad de sustratos. Las CDPKs y al menos 
una SnRK en Arabidopsis han sido implicadas en decodificar senales de calcio (Hrabak, 2003). 
 
Las señales de calcio generan respuestas fisiológicas a traves de las interacciones con proteínas 
blancos, muchas de las cuales contienen motivos EF-hand. En plantas, al menos hay 5 clases o 
subfamilias de proteínas quinasas, pertenecientes a la familia CDPK/SnRK, que contienen EF-
hands en su estructura o interaccionan con proteínas con este motivo. Las CDPKs y las CCaMKs 
contienen motivos EF-hands en sus dominios C-terminales. Las SnRK3s (grupo 3 de las quinasas 
relacionadas a SNF-1) unen proteínas que contienen 3 EF-hands, y algunas son activadas por 
calcio directamente. Algunos miembros de las clases de quinasas CaMK y CRK, unen 
calmodulina pero se desconoce si su actividad esta modulada por calcio/calmodulina (Harmon, 
2003). 
 
Las 5 subfamilias representadas en el diagrama (Fig 1.3 y 1.4) son reguladas por calcio directa o 
indirectamente. Dos subfamilias unen calcio (CDPK y CCaMK) y tres (CCaMK, CaMK and CRK) 
unen calmodulina. Una subfamilia, (SnRK3) une calcineurina y proteínas tipo-B (CBL). 
 
 
 
 
Fig 1.3 Superfamilia de las CDPKs y SnRK (Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio y Quinasas 
relacionadas a SNF1): se detallan en el diagrama las 5 subfamilias pertenecientes a esta superfamilia de 
proteínas: CDPK (Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio), CCaMK (Quinasas reguladas por Calcio o 
Calcio/Calmodulina), CaMK (Quinasa dependiente de Calcio/Calmodulina), CRK (Quinasas dependientes 
de CDPK) y SnRK3 (Quinasas relacionadas a SNF1 tipo III) (Hrabak et al., 2003) 
Superfamilia de las CDPK/SnRK 
CDPK 
 
Proteínas 
Quinasas 
dependientes de 
Calcio 
 
CCaMK 
Quinasas reguladas 
por Calcio o Calcio-
Calmodulina 
CaMK 
Quinasas dependientes 
de Calcio/Calmodulina 
CRK 
Quinasas 
relacionadas con 
CDPK- 
SnRK3 
Quinasa 
relacionada con 
SNF1 Tipo 3 
7 
 
 
 
 
 
Fig 1.4. Diagrama de las 5 subfamilias quinasas. En violeta se representó el dominio amino terminal 
(NTV); en rosa el dominio quinasa; en negro el dominio autoinhibitorio, que posee sitios de unión para 
interaccionar con calmodulina (CCaMKs y algunas CRKs) o con el dominio regulatorio (CDPKs), en celeste 
el dominio regulatorio que puede ser: tipo visinina, con 3 motivos EF-hands (CCaMKs) o CBL binding 
(SnRK3) o similar a calmodulina (CDPKs). Las CRKs presentan sitios EF-hands degenerados o no 
funcionales; y en rojo el dominio C terminal variable. 
 
Subfamilia de las Proteínas Quinasas Dependientes de Calcio (CDPKs) 
 
Dentro de la superfamilia de las CDPKs/SnRK se encuentran las Proteínas Quinasas 
Dependientes de Calcio, o CDPKs. Las CDPKs son proteínas monoméricas, con un peso 
molecular que oscila entre 40-90 KDa. Consisten en 5 dominios, un dominio amino terminal 
variable (NTV), un dominio quinasa, un dominio autoinhibitorio, un dominio regulatorio (tipo 
calmodulina: CaM-LD) y un dominio carboxilo terminal de longitud variable (Harmon, 2003). 
Las CDPKs presentan la característica única de acoplar el sensor de calcio directamente a una 
respuesta. Las CDPKs están presentes en plantas, ciliados, y algunos parásitos del género 
Apicomplexa (Wurzinger et al, 2011) 
 
Regulación de las CDPKs mediada por calcio, fosforilación reversible y autofosforilación, 
fosfolípidos y proteínas 14-3-3 
 
 
 
Regulación por iones calcio 
 
Motivo EF-hand
degenerados
Tipo visinina
Motivo Asociado
Dominio de uniὀn a CBL
Motivo EF-hand
Dominio Quinasa
Dominio Regulatorio
Dominio Bisagra
(Autoinhibitorio)
CDPK
CRK
CCaMK
CaMK
SnRK3
8 
 
El calcio es la principal molécula reguladora de las CDPKs. Los motivos EF-hand presentan 
diferencias en el número y en la secuencia de aminoácidos, generando que distintas isoformas 
de CDPKs presenten diferentes afinidades por el catión. Las isoformas de CDPK de soja 
denominadas α ┞ γ poseeﾐ uﾏHヴales de aItivaIióﾐ poヴ IalIio ケue difieren en más de 10 veces 
ふla isofoヴﾏa α pヴeseﾐta uﾐ uﾏHヴal de aItivaIióﾐ ﾏu┞ Hajo de apヴo┝iﾏadaﾏeﾐte ヶヰﾏM de 
calcio). En la actualidad co-existen dos modelos (KliﾏeIka ┞ Musz┞ﾑska, ヲヰヰΑ) que explican la 
activación de las CDPKs por calcio (Fig 1.5): 
 
 
Fig 1.5. Mecanismo propuesto de activación de CDPKs. 
 
1- El primer modelo propone que el dominio tipo calmodulina (CaM-LD), que contiene 
dos lóbulos (N y C terminales) cada uno conteniendo dos motivos EF-hand, se une al 
dominio quinasa a través de una cadena (tether) flexible. Si se genera una señal de 
calcio, el CaM-LD se una al dominio bisagra liberando el autoinhibidor y activando la 
quinasa. 
2- El segundo modelo propone que el dominio CaM-LD se encuentra unido previamente 
al dominio bisagra cuando los niveles de calcio en la célula son basales. El lóbulo C-
terminal del dominio regulatorio posee dos iones Ca2+unidos. Cuando el lóbulo N-
terminal une otros dos iones Ca2+ se produce la activación. Este modelo se encuentra 
respaldado por las evidencias más actuales. El Kd propuesto para el lóbulo N-terminal 
es de 1 M, consistente con este modelo. Se propone que la conformación del lóbulo 
N-terminal se modifica cuando une calcio e induce un cambio conformacional en la 
interacción del dominio autoinhibitorio con el dominio quinasa. 
 
 
Fig 1.6. Mecanismo propuesto para la activación y representación esquemática. La medialuna azul 
representa el dominio quinasa inactivo. La medialuna con un ángulo representa el dominio quinasa 
activo. Los pequeños círculos representan los lóbulos N y C terminales del CAD (Dominio de Activación 
por Calcio). Las líneas magenta y celeste representan CH1 y CH2 (hélice 1 y 2). 
 
Por otro lado, recientemente se ha determinado la primera estructura de CDPKs activada por 
calcio e inactivada de Apicomplexa, un protista. La unión del calcio dispara un cambio 
9 
 
conformacional extenso que constituye un nuevo mecanismo de plegamiento del motivo EF-
hand. El CAD (CDPK activated domain o dominio activado por CDPK), contiene 4 motivos EF-
hand y el dominio bisagra (junction). En la forma inactiva, cada par de motivos EF-hands forma 
un lóbulo, y los dos lóbulos se encuentran separados entre sí por dos hélices largas, 
denominadas CH1 y CH2. Esta área ocluidadel sitio activo es el dominio quinasa (KD: Kinase 
Domain). La unión de calcio dispara entonces una reorganización del dominio de unión a calcio 
hacia un plegamiento altamente intrincado, que lo aleja del sitio catalítico (Fig 1.6). Los autores 
sugieren que este mecanismo puede ser común a las CDPKs de diferentes especies, pero las 
estructuras deben des descriptas en cada caso particular para comprobar tal afirmación 
(Wernimont et al, 2011). 
 
Además, quisieron determinar si el mismo mecanismo es común a otras CDPKs, y para esto 
resolvieron otras estructuras de CDPKs, incluyendo una de la especie Plasmodium. Las 
proteínas CpCDPK3-CAD (Cryptosporidium parvum, un protista) y PfCDPK-CAD 
(Plasmodium falciparum, también protista) fueron capturadas en un posible intermediario 
conformacional, que aporta información sobre el orden de los pasos de activación. PfCDPK3-
CAD adopta un plegamiento activado, a pesar de contener una secuencia EF-hand inactiva en 
su lóbulo amino terminal. En este trabajo proponen que las CDPKs de Apicomplexa poseen un 
modo de activación similar (Wernimont et al, 2011). 
 
Regulación por fosforilación reversible y autofosforilación 
 
Las proteínas CDPKs pueden regularse por fosforilación, ya sea mediada por quinasas río arriba 
de una vía de señalización, o por autofosforilación. Por ejemplo, en la proteína NtCDPK2 
(tabaco), la serina 40 y la treonina 65 son fosforiladas en respuesta a estrés. Esta fosforilación 
resulta en un incremento de su actividad en 10-200 veces. La treonina 65 sufre 
autofosforilación in vivo intra-molecular, y la serina 40 es blanco de una proteína quinasa río 
arriba. Además se requiere que NtCDPK2 localice en membrana para que sea fosforilada, 
indicando otro nivel de regulación. NtCDPK3 es fosforilada al menos en 2 sitios en el dominio 
NTV por quinasas río arriba, primero en la serina 54 y en otro sitio aún no identificado (Witte 
et al, 2010). 
 
Se ha observado autofosforilación de CDPKs tanto nativas como recombinantes. Se han 
definido algunos sitios de autofosforilación de CDPKs pero se desconoce su función fisiológica. 
Por ejemplo, la autofosforilación in vitro de una CDPK de maní (Arachis hipogea) es necesaria 
para su activación, sin embargo, la autofosforilación de WbCDPK (Psophocarpus 
tetragonolobus) la transforma en una CDPK inactiva. También, cuando WbCDPK se incuba con 
una fosfatasa activa in vitro, la CDPK recupera su actividad (KliﾏeIka ┞ Musz┞ﾑska, 2007). 
 
Regulación por fosfolípidos 
 
Además del calcio, cuando determinados fosfolípidos se encuentran en el citosol, hay un 
aumento de la fosforilación mediada por CDPKs in vitro. Esto se ha demostrado para avena en 
CDPKs parcialmente purificadas (Schaller et al, 1992), AtCPK1 de Arabidopsis (Harper et al, 
1993), DcCPK1 de zanahoria (Daucus carota,) (Farmer & Choi, 1999) y ZmCPK11 de maíz (Zea 
mays) (Szczegielniak et al., 2000; 2005). La estimulación de la actividad CDPK mediada por 
fosfolípidos sugiere que la asociación con las membranas celulares podría modificar su 
actividad. Debido a que diferentes CDPKs específicamente son estimuladas por diferentes 
fosfolípidos, se considera que estos efectos tienen una relevancia fisiológica. Existe evidencia 
que muestra que estos fosfolípidos actúan como segundos mensajeros en transducción de 
señales y podrían ser moléculas efectoras. 
 
http://www.thesgc.org/structures/2QG5/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Witte%20CP%22%5BAuthor%5D
10 
 
Regulación por proteínas 14-3-3 
 
En muchos casos se ha observado que las proteínas blanco fosforiladas deben asociarse a una 
proteína adaptadora especializada, también denominadas proteínas de andamiaje (scaffold), 
para completar la transmisión de la señal. La proteína adaptadora más conocida es la proteína 
14-3-3. Existen en A. thaliana 12 isoformas de 14-3-3, 3 de ellas son capaces de unir y activar a 
AtCPK1 in vitro y en presencia de calcio. AtCPK1 contiene un sitio en el dominio N-terminal que 
es similar al motivo consenso de unión de las proteínas 14-3-3. Este sitio consenso consiste en 
R-S/T-X-S-X-P (Arg-Ser/Thr-X-Ser-X-Pro, donde X es cualquier aminoácido), y la Serina resultaría 
fosforilada. Además, otras dos CDPKs de Arabidopsis, AtCPK24 y AtCPk28 también poseen esos 
sitios Ioﾐseﾐso ふKliﾏeIka ┞ Musz┞ﾑska, ヲヰヰΑぶ. 
 
Funciones de las CDPKs durante el crecimiento, desarrollo y diferenciación, en respuesta a 
hormonas 
 
Funciones de las CDPKs durante el crecimiento, desarrollo y diferenciación 
 
Muchos procesos de desarrollo y crecimiento en plantas son regulados por influjos de calcio. 
Algunos estreses abióticos como estrés oxidativo e hiposmótico aumentan la concentración 
citosólica de calcio en la línea de células de tabaco BY-2, lo cual retrasa el progreso del ciclo 
celular. Un estudio realizado en zanahoria demuestras que el calcio aumenta la frecuencia 
embriogénica y su privación detiene la formación de embriones somáticos. Además, se detectó 
la acumulación de una CDPK soluble de 55 KDa solamente en embriones somáticos, cigotos, 
endosperma y plántulas de sándalo (Santalum album). Esta CDPK, al poseer una expresión 
tejido específica y regulada durante el desarrollo, podría estar involucrada en procesos como 
la embriogénesis, el desarrollo de las semillas y la germinación. 
Otro ejemplo sucede en arroz, donde una CDPK denominada SPK se expresa de forma 
exclusiva en el endosperma de las semillas inmaduras, sugiriendo que están involucradas en 
las vías biosintéticas de productos de almacenamiento. Esta hipótesis se confirmó utilizando 
SPK antisentido, y se observó que no acumulaban productos de almacenamiento, como por 
ejemplo almidón y en cambio, estas líneas de plantas antisentido para SPK producían semillas 
con gran concentración de sacarosa. Esto demuestra que SPK es una quinasa de la enzima 
sacarosa sintasa que podría ser importante para la biosíntesis de productos de 
almacenamiento (Asano et al, 2002) 
Por otro lado, la germinación y crecimiento del tubo polínico requiere una reorganización 
intensa del citoplasma y del citoesqueleto. Se cree que estos procesos son dependientes de 
calcio. Al estudiar células del tubo polínico de Agapanthus umbellatus, esta hipótesis fue 
confirmada. Para ello, se demostró una elevada actividad de proteína quinasas en la región 
apical del tubo, mientras que el resto de las células del tubo, que no presentaban crecimiento 
activo, mostraban una actividad quinasa uniforme (Moutinho et al., 1998). 
En Solanum tuberosum, la tuberización es un proceso de desarrollo complejo que resulta en la 
diferenciación de un tallo especializado, el estolón; en un órgano de almacenamiento: el 
tubérculo. Estímulos hormonales y ambientales están involucrados en la inducción de la 
tuberización. Además, es necesaria la presencia de calcio intracelular para este proceso, ya que 
antagonistas de calmodulina lo inhiben. Se han estudiado isoformas de CDPKs durante la 
tuberización. Dos actividades CDPKs, StCDPK1 y StCDPk3 poseen diferente distribución celular 
y se encontraron asociadas con estadios de desarrollo distintos, StCDPK3 se expresa en 
estolones tempranos en elongación, y StCDPK1 se expresa durante el desarrollo del ápice del 
estolón (Raíces y col, 2003). Estos datos sugieren la activación secuencial de CDPKs específicas 
con diferentes propiedades bioquímicas, coordinando las múltiples señales de calcio que se 
disparan al inicio del proceso de tuberización (Raíces y col, 2003) 
 
11 
 
Funciones en respuesta a hormonas 
 
Las CDPKs modulan las respuestas generadas por fitohormonas, generalmente por giberelinas 
(GAs), citoquininas y auxinas. Uno de los primeros ejemplos y mejor documentado lo 
constituye la influencia de las giberelinas sobre la actividad CDPK en semillas de arroz tratadas 
con esta hormona. La actividad quinasa de la CDPK de arroz parcialmente purificada, resultó 
ser 10 veces mayor que en las plantas control. Además, el tratamiento con la fitohormona 
generó un aumento delARNm de otra isoforma de CDPK presente en plántulas de arroz, 
denominada OsCDPK13 (Abbasi et al, 2004). Por otro lado, en tabaco, se observó una 
acumulación del ARNm de NtCDPK4 luego del tratamiento con GA. Esta acumulación de los 
niveles del transcripto alcanzó un máximo a los 60 minutos y luego retornó a sus niveles 
iniciales en un lapso posterior de 2 hs. 
También en células de aleurona de cebada, las GAs influyen sobre la expresión de HvCDPK1 
(Hordeum vulgare). En plantas que expresaban una forma inactiva de HvCDPK1, resultó 
inhibida la secreción, la vacuolación celular y la acidificación vacuolar. Se postuló en dicho 
estudio que HvCDPK1 podría funcionar como regulador de eventos post-transcipcionales 
asociados con la secreción celular (McCubbin et al, 2004). 
 
Un sistema de regulación diferente se observó en raíces de arroz: las raíces fueron tratadas 
con bajas temperaturas y se detectó una disminución en la actividad de una CDPK de peso 
molecular aproximado de 45 KDa. Esta disminución en la actividad no se detectaba frente al 
tratamiento exógeno de la fitohormona ácido abscísico (ABA). Estos datos sugieren que la 
actividad de esta proteína quinasa de 45 KDa es regulada por ABA y está involucrada en la 
respuesta a estrés por bajas temperaturas en arroz (Komatsu, 2001). 
 
Otro ejemplo lo aportan estudios realizados en ACPK1 (Proteína Quinasa estimulada por ABA 
1) del mesocarpio de la uva (Vitis vinifera x V. labrusca), donde ABA estimuló la actividad 
quinasa y aumentó los niveles del ARNm, aunque no simultáneamente. La estimulación de la 
actividad CDPK fue rápida (luego de 15 minutos de tratamiento con ABA) y sugiere que esta 
enzima medía la respuesta temprana. Se postula que ABA está asociada a modificaciones post-
traduccionales de la CDPK. Además, el tratamiento provocó un aumento en los niveles del 
ARNm. Los autores sostienen que ACPK1 podría poseer un rol en la vía de señalización 
mediada por ABA pero asociada al desarrollo de la planta. En tabaco, también se encontró que 
GA y ABA generan una acumulación del ARNm de NtCDPK1 luego de 12 hs de tratamiento con 
cada fitohormona. 
 
Las auxinas también regulan la expresión y la actividad de las CDPKs. En hojas de tabaco 
tratadas con ácido indol acético (AIA), se corroboró un leve aumento en los niveles del 
transcripto de NtCDPK1, mientras que el tratamiento de plantas de mung bean (Vigna radiate) 
con esta auxina generó una disminución en los niveles del ARNm, alcanzando un máximo a las 
6 hs de tratamiento. A su vez, en suspensiones de microcallos de alfalfa (Medicago sativa), 
tratadas con la auxina sintética ácido 2,4-dichlorofenoxiacético, se observó la acumulación de 
un transcripto de CDPK. El nivel máximo del ARNm de MsCPK3 se encontró luego de 2 hs del 
comienzo del tratamiento. En hipocotilos de pepino, se detectó actividad de una CDPK de 50 
KDa luego del tratamiento con AIA. 
 
Las citoquininas también modifican los niveles del transcripto CsCDPK3 de pepino, y este 
efecto es diferente en distintos órganos vegetales. El tratamiento con bencil-adenina (una 
citoquinina sintética) regula positivamente a los niveles del ARNm de esta quinasa en 
cotiledones en oposición a un efecto inhibitorio (regulación negativa) en raíces. 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Abbasi%20F%22%5BAuthor%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McCubbin%20AG%22%5BAuthor%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Komatsu%20S%22%5BAuthor%5D
12 
 
Una observación importante se realizó en arroz, donde se estudió un receptor de 
brasinosteroides, denominado BRI1 y su influencia sobre la actividad CDPK y MAPK. La 
aplicación exógena de brasinosteroide aumentó la actividad de MAPK y CDPKs. En plantas 
control y líneas de plantas transgénicas antisentido para OsBRI1 sólo se evidenció un aumento 
en la actividad CDPK, pero no en la actividad MAPK. Esto sugiere que los brasinosteroides 
pueden activar una CDPK a través de un receptor diferente de BRI1. 
 
Por último, la fosforilación de proteínas dependiente de calcio está involucrada en la respuesta 
a etileno. La hormona etileno está involucrada en varios procesos fisiológicos como 
maduración del fruto, abscisión de las hojas y senescencia, y también en respuesta a estreses 
ambientales como daño e invasión por patógeno (KlimeIka ┞ Musz┞ﾑska, ヲヰヰΑぶ. 
 
Identificación de sustratos de CDPKs y sistemas de señalización 
 
Las células deben tener mecanismos que mantengan la especificidad de la señalización 
mediada por calcio y de esa forma evitar entrecruzamientos (crosstalks) con diferentes vías. La 
especificidad individual de cada CDPK puede estar determinada por calcio, sensibilidad a 
lípidos, patrón de expresión, regulación post-transcipcional y secuencias amino acídicas. 
Además, varios motivos proteicos en los sustratos pueden aumentar la selectividad de las 
quinasas. Sin embargo los motivos encontrados generalmente son ambiguos y son 
insuficientes para explicar la especificidad de reconocimiento (Itoh et al, 2011). Varios estudios 
sobre mutantes pérdida de función y genes knockeados sugieren que cada isoforma de CDPK 
en plantas posee una función fisiológica distinta, tales como respuesta a estrés, estrés 
oxidativo, respuesta a GA, crecimiento del tubo polínico y regulación de estomas. 
 
La búsqueda de proteínas que interaccionan con el dominio NTV de CDPKs ha sido liderada por 
ensayos de dos híbridos o por Purificación de Afinidad en Tándem (TAP), aunque se han 
identificado solamente unos pocos sustratos. Estas técnicas pueden ayudar a entender los 
roles fisiológicos de cada CDPK y la compleja red de señalización mediada por calcio en plantas 
(Itoh et al, 2011). Por ensayos de dos híbridos, se ha demostrado que el dominio NTV de 
AtCPK32 participa en la interacción con el factor de transcripción ABF4, y McCDPK1 
(Mesembryanthemum crystallinum) también interacciona con su sustrato, CSP1 (Proteína 
sustrato de CDPK 1) (Itoh et al, 2011; Pathatkar y Cushman, 2000). 
 
La primera evidencia concluyente que ha logrado definir una vía de señalización entre la 
activación de CDPKs y la inducción de una respuesta in vivo se realizó en tabaco. Se aislaron 2 
cDNAs, denominados NtCDPK2 y 3, cuyos trancriptos aumentan luego de aplicar elicitores de 
defensa y estrés hiperosmótico. El elicitor Avr9 generó la respuesta más pronunciada. La 
función de NtCDPK2 se investigó utilizando plantas silenciadas para esta isoforma, que 
presentaron un fenotipo de respuesta hipersensible reducida y demorada. El silenciamiento se 
correspondió con una pérdida de la acumulación del ARNm de la CDPKs (Romeis et al., 2001). 
 
Otros trabajos de Romeis indican que una elevada señalización de CDPK compromete la 
activación de MAPKs inducidas por estrés, lo cual permite sugerir que las vías de CDPKs y 
MAPKs no son independientes y que es necesaria una regulación de ambas vías coordinada 
para controlar la especificidad de las respuestas a estreses bióticos y abióticos. 
 
En otros ejemplos, AtCPK3 y AtCPK6 de Arabidopsis participan en la regulación del cierre de 
estomas, en respuesta al ABA y al aumento en la concentración exterior de calcio. Además, en 
mutantes dobles y simples de cdpk3 y cdpk6, resultó afectada la permeabilidad de los canales 
permeables a calcio de la membrana plasmática de células de la guarda. Estos canales se 
activan por calcio y por ABA. Además, CPK4 y CK11 son críticas para la respuesta a ABA en 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Itoh%20T%22%5BAuthor%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Itoh%20T%22%5BAuthor%5D
13 
 
células de la guarda, debido a que fosforilan al ABF1 y ABF4 in vitro, que son factores de 
transcripción de respuesta a ABA. 
 
También en tabaco se ha demostrado que la CDPK1 regula la transcripción del factor de 
transcripción RSG (Represión del crecimiento del brote: REPRESSION OF SHOOT GROWTH) en 
respuesta a giberelinas. La fosforilación de la Serina 114 del RSG mediada por NtCDPK1 
promueve la interaccióncon proteínas 14-3-3, que regulan la localización intracelular de este 
factor de transcripción. En estudios posteriores realizados en tabaco, demostraron que el 
dominio NTV de NtCDPK1 le confiere actividad de quinasa específica de RSG, a una proteína 
heteróloga de Arabidopsis, AtCPK9 (para esto generaron una proteína quimera con el dominio 
NTV de tabaco y el resto de los dominios de AtCPK9). AtCPK9 no es capaz de fosforilar a RSG en 
su forma salvaje. Este hallazgo sugiere que el reconocimiento del sustrato por una CDPK 
sucede en una región independiente del dominio catalítico quinasa (Itoh et al, 2011), y 
probablemente sea en el dominio variable N terminal. 
 
Otros trabajos en Solanum tuberosum (papa) sugieren que StCDPK4 y StCDPK5 fosforilan a la 
enzima NADPH oxidasa y de esa forma regulan la producción de especies reactivas de oxigeno 
(ROS). Realizaron una expresión ectópica de un mutante activo constitutivo de StCDPK5 que 
provocó la producción de ROS en hojas de N. benthamiana. Esta producción de ROS se 
interrumpió al realizar un knock down de CDPK5 (Yoshioka, 2009). 
 
En síntesis, estos trabajos apuntan hacia un rol crítico de las CDPKs en diversos procesos 
biológicos (Kudla et al, 2010). Todo lo mencionado anteriormente se resume en la Fig 1.7. 
 
 
Fig 1.7. El sistema de señalización mediado por CDPK para traducir las signatures de calcio en 
fosforilación de proteínas. RSG: factor de transcripción (Repression of Shoot Growth), ABF: factor de 
transcripción de respuesta a ABA, (ABA response element binding factor). (Kudla et al, 2010). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Itoh%20T%22%5BAuthor%5D
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yoshioka%20H%22%5BAuthor%5D
14 
 
Modelo de trabajo: el cultivo Solanum tuberosum 
 
La papa (Solanum tuberosum L.) es un miembro de las Solanaceas, una familia importante 
económicamente que incluye tomate, pimienta, berenjena, petunia y tabaco. La papa ocupa 
un rango eco-geográfico amplio, y es uno de los cultivos más importantes entre los que 
producen estolones, que bajo condiciones ambientales apropiadas generan tubérculos. Su 
producción alcanzó en el ano 2009, 300 millones de toneladas (http://www.fao.org). Los 
tubérculos son una fuente importante dietaria de almidón, proteínas, antioxidantes y 
vitaminas, y a su vez ofrece un sistema de propagación vegetativa (http://www.nature.com/ 
nature/journal/v475/n7355 /full/nature10158.html) 
 
Las plantas de papa tuberizan bajo condiciones de días cortos y noches frías. La tuberización es 
un proceso morfo-fisiológico altamente coordinado que ocurre en estolones subterráneos, 
bajo la influencia de factores extrínsecos e intrínsecos. En la planta de papa, cada brote del 
tubérculo posee el potencial para tuberizar (Sarkar, 2008). La tuberización es un proceso de 
desarrollo único de algunas especies de Solanaceas, que bajo condiciones favorables se 
diferencian a órganos especializados subterráneos, o tubérculos. Los tubérculos son tallos 
subterráneos modificados, con entrenudos muy pequeños engrosados y hojas pequeñas 
subyacentes a los brotes axilares u さojosざ del tuHéヴIulo. Los tubérculos cumplen una función 
doble, como órganos de almacenamiento y como un sistema de propagación vegetal. En la Fig 
1.8 se muestra un esquema del ciclo de vida de la planta de papa. 
 
 
Fig 1.8. Ciclo de vida de Solanum tuberosum 
 
Luego de un periodo invernal de dormición, los brotes axilares se reactivan y crecen para 
producir una planta genéticamente igual a la planta madre. Los tubérculos funcionan como 
órganos perpetuos de estas especies anuales, acumulan gran cantidad de almidón, poseen 
bajo contenido de grasas y un contenido proteico alto, similar al de los cereales. A su vez 
poseen la ventaja de una composición nutricional más equilibrada de amino ácidos esenciales. 
Un tubérculo de tamaño mediano provee la mitad de los requerimientos diarios de vitamina C. 
15 
 
Debido a sus propiedades nutricionales y a la facilidad de propagación, la papa es el tercer 
cultivo más importante en el mundo luego del arroz y el trigo en términos de consumo 
humano (http://www.cipotato.org/potato). Es procesado además para la obtención de 
almidón y alcohol (Tabla 1.2). 
 
Los tubérculos se forman en la región subapical de estructuras tipo tallos o estolones, que se 
desarrollan en la base del tallo principal. En condiciones no inductoras de la tuberización, los 
estolones crecen como tallos horizontales y, si son expuestos a una cantidad suficiente de luz, 
se tornan verdes y emergen del suelo para forman nuevos brotes. Durante este proceso, el 
estolón adquiere todas las características de un tallo principal, formando raíces y hojas y 
eventualmente, floreciendo. Bajo condiciones de bajas temperaturas o de días cortos, la 
elongación de los estolones se detiene y el ápice del estolón comienza a engrosarse para 
formar un tubérculo. Las etapas de formación del tubérculo han sido clasificadas en 8 estadios 
(Fig 1.9) (Kloosterman et al, 2005). 
 
 
 
 
 
Fig 1.9. Estadíos de tuberización obtenidos de plantas crecidas en macetas (arriba). Representación 
esquemática del desarrollo del tubérculo que consiste de 8 estadios de desarrollo que involucran un 
total de 25 días en condiciones inductoras de la tuberización (días cortos, 8 hs de luz) (abajo) 
(Kloosterman et al, 2005). 
El engrosamiento del ápice se correlaciona con una expansión y división celular radial de las 
células localizadas en la médula y en la corteza de la parte subapical del estolón. 
Subsecuentemente, se suceden rondas de división celular aleatoria y expansión de las células 
de la región perimedular, que contribuye a aumentar el tamaño del tubérculo. Estos cambios 
en la división celular están acompañados por un cambio definido en el programa de desarrollo 
de las células meristemáticas subapicales del estolón. Este cambio determina a la planta hacia 
la formación del tubérculo. El crecimiento del meristema también es determinado, y la división 
celular se detiene luego de unos pocos ciclos. El mecanismo de さdescargaざ de sacarosa cambia 
de apoplástico a simplástico, y disminuye la actividad de una enzima invertasa de pared 
celular. Esto se acompaña de un aumento rápido en la actividad de la enzima sacarosa sintasa 
y fructoquinasa. Durante la fase de crecimiento inicial y rápido, los tubérculos acumulan 
http://www.cipotato.org/potato
16 
 
compuestos de almacenamiento, principalmente en forma de almidón y proteínas (por 
ejemplo, patatina e inhibidores de proteasas), que sirven como fuente de energía a la futura 
planta. En su hábitat natural, la diferenciación de los tubérculos de papa ocurre en otoño o 
invierno temprano, dependiendo del genotipo. Estos tubérculos nuevos atraviesan un periodo 
de inactividad o endodormición, que se caracteriza por la ausencia de crecimiento de brotes, 
aún si son expuestos a condiciones inductoras de la tuberización. Este periodo fisiológico dura 
unos pocos meses y asegura la supervivencia de la planta durante las bajas temperaturas del 
invierno. La brotación del tubérculo es un fenómeno deseado cuando se requieren tubérculos 
semilla, en cambio, no se desea durante el almacenamiento, debido a que reduce la vida del 
tubérculo post-cosecha y disminuye su calidad nutricional (Rodríguez-Falcon et al, 2006). 
 
 
Papa-Solanum tuberosum 
 
Nutrición 
 
Un tubérculo de tamaño mediano contiene aproximadamente la mitad del requerimiento 
diario de un adulto de vitamina C, es bajo en grasas ya que contiene solo 5% del contenido 
graso del trigo y un cuarto las calorías que contiene el pan. Hervida, la papa contiene más 
proteínas que el maíz, y dos veces más de calcio. 
Historia 
 
Solanum tuberosum se originó en las montañas de América del sur donde se ha consumido por 
más 800 años. Los explorados españoles introdujeron la planta en Europa a fines de la década 
16 como una curiosidad botánica. Para el siglo 19 ya se había extendido a toda Europa, 
proveyendocomida abundante y económica para los trabajadores de la revolución industrial. 
Producción global 
 
Actualmente la papa es el cuarto cultivo más importante en el mundo, con una producción 
anual que alcanza las 300 millones de toneladas. Más de un tercio de la producción de papa 
proviene de países en desarrollo (en 1960 solo el 11% provenía de dichos países). 
http://www.cipotato.org/potato/ 
 
Tabla 1.2. Características nutritivas del cultivo Solanum tuberosum, historia y producción 
(http://www.cipotato.org/potato/) 
 
Brotación del tubérculo de Solanum tuberosum 
 
Luego de su formación, los tubérculos atraviesan un periodo de dormición que se caracteriza 
por la ausencia de brotes visibles. El estado de dormición comienza cuando se detiene la 
actividad meristemática durante la tuberización. La duración del periodo de dormición 
depende del trasfondo genético y es afectado por condiciones pre y post-cosecha. Al comienzo 
de la brotación del tubérculo, el mismo se vuelve una fuente de crecimiento para el brote en 
desarrollo. Esto se asocia con cambios estructurales y metabólicos y con cambios en los 
patrones de expresión génica. 
Además, las fitohormonas tienen un rol importante en la regulación y ruptura de la dormición 
(brotación). Las giberelinas (GAs) y las citoquininas (CKs) están involucradas en la ruptura de la 
dormición, mientras que el ABA y el etileno se han asociado con el mantenimiento de este 
proceso. En cuanto al efecto de auxinas, hay estudios que demuestran que la concentración de 
AIA libre en brotes disminuye durante la dormición, otros estudios de inmunolocalización 
sugieren que AIA podría estimular el crecimiento del brote promoviendo procesos de 
diferenciación tempranos. Se ha identificado el gen de respuesta a auxina ARF6 (auxin 
response factor family) como un marcador de la reactivación del meristema en tubérculos. 
En los años 50s ya existían indicios de que las GAs eran capaces de romper la dormición de los 
tubérculos. Estudios posteriores detectaron un aumento en la concentración de sustancias 
17 
 
similares a las GAs al comienzo de la brotación, sugiriendo que esta fitohormona regula este 
proceso. 
 
De todas formas, la función de las GAs en la brotación continúa siendo controversial, debido a 
que estudios cuantitativos demostraron altos niveles de GA1 y GA20 (forma bioactiva 
predominante) sólo en tubérculos que ya presentaban brotes activos, y en proceso de 
elongación. Además, la manipulación de los niveles endógenos de GA a través de la expresión 
ectópica de GA20 oxidasa1 y GA2 oxidasa1, no alteró el proceso de dormición, indicando que 
las GAs podrían ejercer mayor influencia durante sobre la brotación que durante la ruptura de 
la dormición. 
 
Las CKs pueden inducir de forma rápida la brotación en tubérculos en dormición. Se ha 
demostrado que hay un aumento de los niveles endógenos de CKs antes de la ruptura de la 
dormición, especialmente en los brotes apicales, laterales y en el tejido circundante. 
 
A nivel celular, la dormición se caracteriza por un arresto en la fase mitótica G1 de las células 
meristemáticas, demostrado a través de microdensitometría y medidas en citometría de flujo. 
Para la terminación de dicha fase se requieren unas ciclinas tipo D (CycD). Tres grupos de estas 
ciclinas han sido identificadas en Arabidopsis, CycD1, CycD2, y CycD3. Durante el ciclo de 
división celular, las ciclinas forman complejos con quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), 
que luego fosforilan proteínas relacionadas con el retinoblastoma. Esto permite la liberación 
de factores de transcripción de tipo E2F y genera la transición de la fase G1 a la fase S (Hartman 
et al, 2011) 
 
Formación del tubérculo en Solanum tuberosum 
 
Las variaciones del fotoperiodo determinan el tiempo de floración en muchas plantas, y en la 
planta de papa, es crucial para promover la diferenciación y formación del tubérculo. La 
longitud del día es percibida en las hojas, y bajo condiciones inductoras las hojas sintetizan una 
señal sistémica que es transportada hacia los estolones subterráneos para inducir el desarrollo 
del tubérculo. La planta de papa originariamente se cultivó en Sudamérica, en la región 
cercana al ecuador, donde la longitud del día es de aproximadamente 12 hs (condiciones 
denominadas de días cortos o DCs) y la temperatura es baja. Solanum tuberosum ssp. 
Andigena se encuentra adaptada a estas condiciones y tuberiza muy poco o nada cuando es 
cultivada a mayores temperaturas. Algunos cultivares más modernos como Solanum 
tuberosum ssp. tuberosum que son cultivados en el sur de Chile se encuentras más adaptados 
a condiciones de días más largos y temperaturas más elevadas, como son las condiciones en 
Europa y Norteamérica, por ejemplo (Fig 1.10) 
 
 
18 
 
Fig 1.10. Esquema de la señal mediada por el fotoperiodo que active una señal a larga distancia (flechas 
azules) que se mueve desde las hojas y a través del floema, para inducir la formación del tubérculo. 
Plantas de papa que responden al fotoperiodo presentan un comportamiento como el mostrado en las 
imágenes: ante días cortos inducen la formación de tubérculos, mientras que en condiciones de días 
largos se inhibe la tuberización 
 
Los días cortos, temperaturas bajas y baja concentración de nitrógeno en el suelo promueven 
la tuberización, mientras que la formación del tubérculo se retrasa por días largos (DLs), altas 
temperaturas y fertilizantes con alto contenido de nitrógeno. Las condiciones de DCs inducen 
la formación del órgano de reserva en todas las variedades de papa, aunque existen 
variaciones. S. tuberosum ssp. andígena y S. demissum son estrictamente dependientes de DCs 
para tuberizar, es decir, precisan 8 hs de luz y no produce tubérculos cuando son sometidas a 
días largos (16 hs de luz). Además, tampoco producen tubérculos bajo condiciones de DCs pero 
suplementadas con un pulso de 15 minutos de luz en el medio del periodo nocturno. (Fig 1.11) 
 
Estos resultados demuestran que las noches largas (NLs) son las que verdaderamente inducen 
la tuberización, más que las condiciones de DCs (Mariana Rodriguez-Falcon et al, 2006). 
 
 
 
Fig 1.14. La duración del día controla la tuberización en papas andigena. Las especies de andigena son 
estrictamente dependientes de días cortos (8-10 hs de luz) para tuberizar y no tuberizan bajo 
condiciones de días largos (14-16 hs de luz). La longitud total de la duración de la noche determinar la 
respuesta para tuberizar o no. La interrupción de una noche larga con un pulso de luz de 15 min inhibe 
la formación del tubérculo. 
 
Los fitocromos sensan la longitud del día 
 
En el genoma de la papa, dos genes que codifican fitocromos (PHYA y PHYB) se acumulan de 
forma estable en hojas y perciben la duración del dia. PHYB actúa en condiciones no 
inductoras de la tuberización (DCs + un pulso de luz durante la noche, DLs) como un represor 
de la tuberización (mediada por condiciones inductoras de DCs). En mutantes phyB, la vía que 
induce la tuberización está constitutivamente activada y estas plantas son capaces de tuberizar 
bajo cualquier condición (DLs o DCs). PHYB reprime la síntesis del estímulo tuberizante en 
hojas, bajo condiciones no inductoras (Fig 1.11). Las plantas phyB, además de perder el control 
por fotoperiodo que conduce a la tuberización, poseen un fenotipo elongado, similar al 
19 
 
generado por plantas cuando son tratadas con dosis saturantes de GAs (Rodriguez Falcon et al, 
2006) 
 
 
Fig 1.11 Esquema de acción de plantas mutante phyB. Poseen una activación constitutiva de la via 
inductora de la tuberización de DCs y son insensibles a la duración del dia. 
 
Las giberelinas demoran la tuberizacion 
 
Las GAs regulan el inicio de formación del tubérculo, ya que se retrasa por el agregado de GA3 
(un tipo de hormona GA, las diferentes hormonas varian en la cantidad de carbonos y cantidad 
de grupos oxidrilos). En cambio, al agregar inhibidores de la biosíntesis de la hormona,como 
tetciclacis, clorido de clorocolina (CCC), paclobutrazol o ancimidol, aumenta la formación de 
tubérculos en segmentos de entrenudos y en plantas de invernadero. El inicio de formación 
del tubérculo se corresponde con una disminución en el contenido de GA endógeno en el 
estolón. Además, al modificar los niveles endógenos de GAs por sobreexpresión o inhibición 
por antisentido del gen StGA20oxi1 (que codifica para la proteína GA20 oxidasa, de la 
biosíntesis de la hormona), resulta en un retraso o adelanto del inicio de la tuberizaoción en 
condiciones de DCs, demostrando una correlación entre los niveles de GA endogenos y el inicio 
de la tuberización (Rodriguez Falcon et al, 2006). 
 
Además, un mutante enano denominado andigena ga1 (bloqueado en un paso de la 
biosíntesis de la hormona), puede formar tubérculos en condiciones de días largos (condición 
no inductora de la tuberizacion. La transferencia a condiciones de DCs induce la tuberizacion 
rápidamente en estas plantas enanas, indicando que aunque el requerimiento de DCs es 
menos severo que en plantas salvaje, la tuberizacion en estos mutantes se encuentra regulada 
por el fotoperiodo. Esto indica dos vías independientes de tuberizacion: una vía dependiente 
del fotoperiodo, y una via dependiente de GAs. El balance entre el efecto inductor e inhibidor 
de estas vías determinan la formación del tubérculo. 
 
La proteína GA20-oxidasa y la GA3-hidroxilasa, catalizan los 2 últimos pasos en la via 
biosintética de las GAs, y la proteina GA2-oxidasa cataliza la degradación de formas bioactivas 
de las GAs a catabolitos inactivos. Estas enzimas codifican pasos regulatorios clave en la 
biosíntesis de GAs y la homeostasis, y además están sujetas a un control por retroalimentación 
por el producto final, GA1, y están reguladas en respuesta a fotoperiodo o fitocromos 
(Rodriguez Falcon et al, 2006). 
 
Vía Dias 
Cortos
Vía Dias 
Cortos
Señal
tuberizante
Señal
tuberizante
DLs DLs
Plantas salvajes Plantas phyB
Tuberización
20 
 
 
Fig 1.12. Ruta biosintética de la hormona GA. Se indica con un recuadro verde las enzimas GA20-oxidasa 
(GA20ox) que genera el precursor GA20 y la GA3-hidroxilasa (GA3ox) que genera GA1. 
 
Al estudiar los transcriptos del gen GA 20-oxidasa, no se detectaron cambios importantes en su 
expresión en condiciones de DCs o DLs. En cambio, si al estudiar al gen StGA3ox2 (codifica la 
proteina GA3-hidroxilasa): en condiciones de DLs, este ARNm se acumuló de forma abundante 
en estolones, pero no en tallos. Al transferir a condiciones de DCs, aumentó su expresión en el 
ápice y en los entrenudos de la planta, pero se reprime por completo en el estolón, regulando 
negativamente la síntesis de la hormona, durante la tuberización. 
 
Además, datos de microarrays sugieren el transcripto de GA2-oxidasa esta regulado 
positivamente en estolones inducidos. La expression del gen GA2-oxidasa aumenta temprano 
en condiciones inductoras de la tuberización, incluso antes de detectar visiblemente la 
hinchazón (swelling) del estolón, indicio del comienzo de formación del tubérculo y precede a 
la acumulación del transcripto TUB8, que posee un rol estructural y su expresión aumenta en 
estadios iniciales de la formación del tubérculo (Taylor et al, 1992) 
Entonces, la caída en los niveles de GA1 es un evento clave en la tuberización, sin embargo, 
todavía no es muy claro como esta señal dependiente de GA se integra con la señal generada 
por DCs, que proviene de las hojas de la planta (Rodríguez-Falcón, 2006) 
 
Síntesis de GAs en tejidos aéreos 
 
Para estudiar la función de la GA3-hidroxilasa, se generaron plantas transgénicas de papa 
sobreexpresando el gen StGA3ox2. Estas plantas presentan un fenotipo mas alto y un mayor 
contenido de GA1 en los brotes. De forma contraria a lo esperado, estas plantas tuberizan 
21 
 
antes en condiciones de DCs, y su rendimiento en tubérculos es mayor que en plantas salvajes. 
Esto parece indicar que altos niveles del precursor GA20 (sustrato de la GA3-hidroxilasa) posee 
un efecto negativo sobre la tuberización. Esta observación también esta respaldada por 
estudios donde sobreexpresan el gen GA20 oxidasa (genera GA20) y estas plantas tardaban 
mas en tuberizar en condiciones de DCs (Carrera et al, 2000). Pero también presentaron un 
efecto que promueve la tuberización, debido a un aumento en la síntesis de GA1 en el brote. 
Este resultado contradictorio, quizás se deba a que GA20 es un inhibidor más potente de la 
tuberización que GA1, o de forma alternativa, que GA20 y GA1 son transportadas hacia el 
estolón de forma diferente. Es posible que, GA20 sea transportada rápidamente e inhibe la 
tuberización, mientras que GA1 permanece en las células que la sintetizaron y actua solo en 
esas células. 
 
Como conclusion, de forma contraria a la idea general de que las GAs inhiben la tuberización, 
se cree que altos niveles de GAs en el estolón inhiben la tuberización, mientras que una alta 
tasa de conversión de GA20 a GA1 en los brotes la favorecen (probablemente disminuyendo los 
niveles de GA20 en los tejidos aéreos y de esta forma se transporta menos cantidad del 
precursor al estolón (Rodríguez-Falcón, 2006) 
 
Las giberelinas poseen un efecto local en el estolón 
 
Una planta andigena mutante de ga1, presenta un fenotipo de planta enana, y puede formar 
tubérculos en condiciones de DLs, corroborando que las GAs participan en la señalización 
mediada por el fotoperiodo. Pero, varias evidencias como la caída en los niveles de GA1 en el 
tip del estolón al inicio de la tuberización, promueven la idea de que el efecto inhibitorio es 
local, en el estolón. Recientemente, se encontró evidencia de que las GAs reprimen la 
diferenciación del estolón: líneas de papa salvajes y phyB fueron bloqueadas (ambas líneas) en 
vías de respuesta a GA, por expresión del alelo dominante gai-1. Este alelo codifica una 
proteina DELLA con una delecion de 17 aminoacidos que impide su degradación (mediada por 
GA) de forma tal que las respuestas a GA están permanentemente reprimidas. Esto conduce a 
un fenotipo enano severo en ambas trasfondos genéticos. Aunque la respuesta a GA esta 
comprometida, el tiempo de tuberización no resultó afectado en estos transformantes, 
sugiriendo que las vías de GA y fotoperiodo sobre la tuberización son independientes. 
 
 
 
Fig 13. Modelos de la via de señalizacion por GA. En 
presencia de GA, esta fitohormona se une al 
receptor GID1. En ausencia de GA bioactivas, las 
proteínas DELLAS reprimen las respuestas a GAs, y el 
receptor GID1 se encuentra unido a GA, 
promoviendo la interaccion con una proteína DELLA. 
El complejo GA-GID1-DELLA encuentra una SCF3 
ligasa que dispara la ubiquitinacion y degradación en 
el proteosoma 26S. Las proteínas DELLAs también 
pueden ser inactivadas por una via independiente 
de proteólisis en ausencia de la proteína F-box 
AtSLY1/OsGID2. La degradación o inactivación de las 
DELLAs libera la represión sobre las respuestas a GAs 
(Achard y Genschik, 2008) 
 
 
 
 
22 
 
 
Efecto del ABA sobre la tuberización 
 
Se cree que esta hormona esta implicada de alguna manera en la tuberización porque el 
agregado de ABA exógena indujo una mayor y mas temprana producción de tubérculos. In 
vitro, también se demostró que la aplicación de alta sacarosa y ABA condujo a una tuberización 
mas temprana. En medios con baja sacarosa o con GA, el ABA también estimula la formación 
de tubérculos, contrarrestando el efecto inhibitorio de las GAs. Sin embargo la tuberización no 
se asocia con un aumento de los niveles de ABA, ya que se observó una disminución en esos 
niveles en estolones inducidos durante el desarrollo. El mutante droopy (deficiente en ABA) de 
S. phureja tuberiza normalmente, indicando que no es necesaria la síntesis de ABA para la 
inducción de la tuberización. Se concluyó entonces que ABA no posee un papel esencial en la 
formacin del tubérculos y que el efecto estimulante de esta hormona es debido al efecto 
antagónico