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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar Tesis Doctoral Arándanos: micoflora contaminante,Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos de fungicidasmicotoxinas, residuos de fungicidas y cinéticas de degradacióny cinéticas de degradación Munitz, Martín Sebastián 2013-02-15 Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Munitz, Martín Sebastián. (2013-02-15). Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos de fungicidas y cinéticas de degradación. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Munitz, Martín Sebastián. "Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos de fungicidas y cinéticas de degradación". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2013-02-15. http://digital.bl.fcen.uba.ar http://digital.bl.fcen.uba.ar mailto:digital@bl.fcen.uba.ar UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Industrias Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos de fungicidas y cinéticas de degradación. Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial. Martín Sebastián Munitz Director de tesis: Silvia Liliana Resnik Consejero de Estudios: Stella Maris Alzamora Lugar de trabajo: Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias de la Alimentación, Universidad Nacional de Entre Ríos, Monseñor Tavella 1450, Concordia, Entre Ríos. Fundación de Investigaciones Científicas Teresa Benedicta de la Cruz, Dorronzoro 141, Luján, Buenos Aires. Buenos Aires, 2012 Arándanos: micoflora contaminante; micotoxinas; residuos de fungicidas y cinéticas de degradación Los arándanos son susceptibles a enfermedades fúngicas y a contaminación por micotoxinas, y esta es la razón de las aplicaciones de fungicidas. Estas contaminaciones pueden tener repercusiones en los rendimientos productivos y crear dificultades a la exportación. Los objetivos fueron identificar los hongos causantes de las enfermedades de arándanos en la Región de Salto Grande, Entre Ríos, una de las principales áreas de producción y exportación de arándanos en Argentina, y su capacidad para generar toxinas, y la cinética de degradación de azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin, así como su ocurrencia en productos de arándanos. Varias especies fúngicas, algunas con la capacidad de producción de micotoxinas, se han identificado por primera vez en los arándanos. Las metodologías desarrolladas para la cuantificación de los fungicidas fueron precisas y exactas. La degradación siguió una cinética de primer orden, ajustando mediante un modelo exponencial, con valores de R2 mayores a 0,96. La distribución de los pesticidas durante la elaboración de jugo de arándano reduciría más del 25% de fungicidas si se eliminan el agua de lavado y escaldado. Los productos de arándano han tenido elevada ocurrencia de los pesticidas, probablemente por el uso de la fruta de descarte para su elaboración. Palabras claves: arándanos – contaminación fúngica – micotoxinas – fungicidas – cinética de degradación Blueberries: contaminant mycoflora; mycotoxins; fungicides residues and degradation kinetics Blueberries are susceptible to fungal diseases and mycotoxin contaminations, and this is the reason of fungicide applications. These contaminations may impact on productive yields and make export difficulties. The objectives were to identify fungi that cause blueberry diseases in the Salto Grande Region, Entre Ríos, one of the main production areas and exportation of blueberries in Argentina, and its ability to generate toxins, and the kinetics of degradation of azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil and pyraclostrobin, as well as their occurrence in blueberry products. Several fungal species, some of them with mycotoxins production capacity, have been identified for the first time in blueberries. The developed methodologies for the quantification of the fungicides were precise and accurate. Degradation followed a first order kinetics, fitting using an exponential model, with R2 values higher than 0,96. The distribution of pesticides during the elaboration of blueberry juice would reduce more than 25% of fungicides if are eliminated the washing and blanching water. Blueberry products have had high occurrence of pesticides, probably for the use of scrap fruit for their elaboration. Key words: blueberries – fungal contamination – mycotoxins – fungicides – degradation kinetics AGRADECIMIENTOS Debo mucho a muchos y lo agradezco infinitamente. Los que a continuación menciono son especiales por su ejemplo y apoyo: Dra Silvia Resnik, gran ser humano y profesional. Incondicional. Su guía científica hizo posible este trabajo. Dra Marisa Montti, al brindarme la oportunidad de trabajar en su laboratorio y su acompañamiento permanente. A la Facultad de Ciencias de la Alimentación de la Universidad Nacional de Entre Ríos y a su Rector Ing. Jorge Gerard, que me permitió acceder a una beca para realizar mi Doctorado. A la Fundación Teresa Benedicta de La Cruz y a su Directora Dra Ana Pacín, por los análisis de micotoxinas. Dra Stella Alzamora, por su calidez y apoyo a lo largo de mi doctorado. Al D r Lucas González por su aporte en el trabajo relacionado a la identificación de microorganismos. A Paula y Carolina del laboratorio MICA de la UBA por los trabajos que llevamos a cabo juntos. A Marcela, Analía y Paula por su colaboración. A las empresas arandaneras Blueberries S.A. e Integrity de la ciudad de Concordia, Entre Ríos, en las personas: Nicolás Cutro, Darío Azcarate, Gastón Otamendi, al contribuir con la materia prima, arándanos, sin la cual esta tesis no hubiera sido posible. Mucho más que sólo colegas: Fabricio, Silvia, Bibi, Gladys, Celia y Micaela A Julieta y Martín Bof por su aguante, a Susana y Manuel, mis padres, y a Iriel, mi hermana. A las que están ARRIBA: mi abuela Betty y mi compañera de primeros pasos en este trabajo: María Rosa Chaulet. I INDICE I. OBJETIVOS 1 II. INTRODUCCIÓN 2 II.1. Generalidades de arándanos 2 II.2. Propiedades del arándano 3 II.3. Comercialización 5 II.3.1. Breve reseña histórica y situación mundial 5 II.3.2. El cultivo del arándano en Argentina 6 II.4. Características generales del cultivo 8 II.4.1. Fertilización y tratamiento del suelo 8 II.4.2. Heladas 11 II.4.3. Cosecha 12 II.5. Tratamiento postcosecha de arándanos 13 II.5.1. Empaque de arándanos 13 II.5.2. Refrigeración 16 II.5.3. Aplicación de atmósferas modificadas y controladas 17 II.5.4. Bromurado 17 II.6. Alimentos elaborados con arándanos 18 II.6.1. Jugo de arándano 18 II.6.2. Néctares 21 II.6.3. Pasas de arándano 22 II.6.4. Otros 22 II.7. Enfermedades de los arándanos 22 II.7.1. Podredumbre por Alternaria 24 II.7.2. Podredumbre gris 24 II.7.3. Antracnosis 25 II.7.4. Roya 26 II.7.5. Momificación de arándanos (Mummy berry) 26 II.8. Micotoxinas 27 II.8.1. Clasificaciónde las micotoxinas 28 II.8.2. Principales micotoxinas 29 II II.8.2.1. Aflatoxinas 29 II.8.2.2. Fumonisinas 32 II.8.2.3. Ocratoxina A 36 II.8.2.4. Tricotecenos 37 II.8.2.5. Zearalenona 40 II.9. Calidad del arándano para exportación 41 II.10. Manejo integrado de plagas 43 II.10.1. Pesticidas agrícolas 44 II.10.2. Formulaciones 46 II.10.3. Formas de acción 47 II.10.4. Evaluación toxicológica 48 II.10.5. Propiedades fisicoquímicas de los pesticidas 49 II.10.5.1. Volatilización 49 II.10.5.2. Solubilidad 50 II.10.5.3. Coeficiente de adsorción de carbono orgánico (Koc) 50 II.10.5.4. Coeficiente de Partición Octanol/Agua (Kow) 50 II.10.5.5. Propiedades ácido – base 51 II.10.6. Períodos de carencia y limite máximo de residuos 51 II.11. Evolución de los residuos de pesticidas en el tejido vegetal 52 II.11.1. Depósito de pesticidas 53 II.11.2. Eliminación progresiva de los residuos 54 II.11.2.1. Crecimiento del sustrato vegetal. Eliminación aparente 54 II.11.2.2. Tipo de aplicación y formulación 55 II.11.2.3. Causas mecánicas y físicas 55 II.11.2.4. Degradación química 55 II.11.3. Curvas de disipación o persistencia 56 II.11.3.1. Tiempo de vida media 58 II.12. Fungicidas aplicados en la Región de Salto Grande 59 II.12.1. Boscalid 59 II.12.2. Pyraclostrobin 60 II.12.3. Fludioxonil 62 II.12.4. Cyprodinil 63 II.12.5. Azoxystrobin 65 II.13. Metodología analítica 66 III III. MATERIALES Y MÉTODOS 162 III.1. Plan de muestreo 162 III.1.1. Muestreo de arándanos en campo 162 III.1.2. Muestreo de arándanos envasados 164 III.1.3. Muestreo de productos elaborados con arándanos 165 III.2. Micoflora 165 III.2.1. Aislamiento de la micoflora contaminante 165 III.2.1.1. Equipos y medios de cultivo para el aislamiento 165 III.2.1.2. Procedimiento para el aislamiento de la micoflora contaminante 166 III.2.2. Identificación de la micoflora contaminante 167 III.2.2.1. Equipos y medios para la identificación 167 III.2.2.2. Procedimiento para la identificación de la micoflora contaminante 169 III.2.2.3. Identificación de los aislados de Fusarium 171 III.2.2.3.1. Desarrollo de los aislados en medio Agar hoja de Clavel (CLA) 171 III.2.2.3.2. Desarrollo de los aislados en Agar hoja de Clavel con cloruro de potasio (CLA-KCl) 172 III.2.2.4. Identificación de los aislados de Aspergillus y Penicillium 172 III.2.2.5. Identificación de aislados de otros géneros 173 III.3. Capacidad toxicogénica 173 III.3.1. Medios de cultivo, reactivos y equipamiento para la determinación de la capacidad toxicogénica 173 III.3.1.1. Medios de cultivo para la determinación 173 III.3.1.2. Reactivos, columnas y estándares para la determinación 174 III.3.1.3. Equipamiento para la determinación 176 III.3.2. Procedimiento para la determinación de capacidad toxicogénica 177 III.3.2.1. Determinación de aflatoxina y zearalenona 178 III.3.2.2. Determinación de fumonisinas 179 III.3.2.3. Determinación de ocratoxina A 180 III.3.2.4. Determinación de tricotecenos 181 III.4. Pesticidas 181 III.4.1. Reactivos, estándares y equipamiento para el análisis 181 III.4.2. Puesta a punto de la metodología 184 III.4.3. Preparación de las muestras 185 III.4.4. Metodología de extracción 186 III.4.5. Determinación cromatográfica 186 IV III.4.5.1. Determinación por ECD 186 III.4.5.2. Determinación por NPD 187 III.4.6. Diseño experimental para el estudio de cinéticas de degradación 187 III.4.7. Determinación del tamaño de los arándanos 188 III.4.8. Elaboración de jugo de arándano y comportamiento de los pesticidas en el proceso 188 III.5. Análisis estadístico 189 III.5.1. Expresión de los resultados y métodos estadísticos 189 III.5.1.1. Frecuencia de aislamiento y densidad relativa de géneros y especies 189 III.5.1.2. Test asintótico para igualdad de proporciones 190 III.5.1.2.1. Definición de valor p 192 III.5.1.3. Test exacto de Fisher 192 III.5.1.4. Análisis unidimensional y regresión lineal 193 III.5.1.5. Comparación de líneas de regresión 194 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 195 IV.1. Flora fúngica contaminante de los arándanos 195 IV.1.1. Géneros 195 IV.1.2. Identificación de especies fúngicas 200 IV.1.3. Frecuencia de aislación y densidad relativa de las especies aisladas 208 IV.1.4. Hongos potencialmente productores de toxinas 214 IV.2. Capacidad toxicogénica 216 IV.3. Pesticidas 224 IV.3.1. Validación de la metodología analítica 224 IV.3.1.1. Selección del polímero y pH de extracción 224 IV.3.1.1.1. Azoxistrobin, boscalid y pyraclostrobin 224 IV.3.1.1.2. Fludioxonil y cyprodinil 231 IV.3.1.2. Velocidad de agitación 235 IV.3.1.2.1. Azoxistrobin, boscalid y pyraclostrobin 235 IV.3.1.2.2. Fludioxonil y cyprodinil 236 IV.3.1.3. Modo de extracción 238 IV.3.1.4. Perfil de tiempos de extracción 238 IV.3.1.5. Tiempo y temperatura de desorción 242 IV.3.1.6. Análisis unidimensional y regresión lineal 248 IV.3.1.6.1. Curvas de calibración con estándares 250 IV.3.1.6.2. Curvas de calibración con matriz adicionada 254 IV.3.1.6.3. Comparación de rectas de regresión 258 V IV.3.1.6.4. Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) 260 IV.3.1.6.5. Exactitud del método 261 IV.3.2 Curvas de degradación 263 IV.3.2.1. Productos técnicos 263 IV.3.2.2. Azoxistrobin 264 IV.3.2.3. Boscalid 267 IV.3.2.4. Pyraclostrobin 271 IV.3.2.5. Cyprodinil 274 IV.3.2.6. Fludioxonil 277 IV.3.3. Elaboración de jugo de arándano 280 IV.3.3.1. Balance de materia etapa por etapa 281 IV.3.3.2. Balance para los distintos fungicidas estudiados 282 IV.3.4. Ocurrencia de pesticidas en muestras comerciales 285 IV.3.4.1. Arándanos para consumo 285 IV.3.4.2. Jugos de arándano y complejos vitamínicos 288 V. CONCLUSIONES 291 VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFÍCA 294 VII. ANEXO 326 1 I. OBJETIVOS Los arándanos son altamente susceptibles a enfermedades fúngicas y a contaminación por micotoxinas, es por ello que la utilización de fungicidas es una práctica común en los cultivos de esta fruta. Estas contaminaciones impactan por un lado en el rendimiento productivo, y por otro dificultan las exportaciones, si no se cumple con los requerimientos de calidad de los países importadores. Se plantean como objetivos generales de la presente tesis doctoral, en primer lugar, identificar los hongos causantes de las enfermedades de los arándanos y su capacidad para generar toxinas, en la Región de Salto Grande, que es una de las mayores áreas productivas y exportadoras de arándanos de Argentina. En segundo lugar, la cinética de degradación de los pesticidas que se aplican localmente, y la ocurrencia de los mismos en productos elaborados a partir de arándanos. Los objetivos específicos son: Identificar la micoflora presente en las variedades de arándanos cultivadas en la Región de Salto Grande, provincia de Entre Ríos. Determinar la capacidad de producir micotoxinas por las cepas aisladas en el campo. Desarrollar y validar metodologías analíticas para la cuantificación de los pesticidas utilizados en Concordia, Entre Ríos, en el cultivo de arándanos. Determinar la cinética de degradación de pesticidas en el campo. Estudiar la influencia de las distintas etapas del proceso de elaboración de jugo de arándano en el contenido final de pesticidas. Evaluar la ocurrencia de los pesticidas en estudio en muestras comerciales de arándanos y productos elaborados con esta materia prima. 2 II. INTRODUCCIÓN II.1. Generalidades de arándanos Los arándanos son pequeñas bayas esféricas de 7 a 25 mm de color azul claro a oscuro, que contienen pequeñas semillas y presentan un sabor agridulce muy característico. Provienen de plantas florales de la familia Ericaceae, género Vaccinium (Corrêa Antunes y col., 2008). Los nombres recibidos por la fruta en distintos idiomas son:blueberry en inglés, bleuet en francés, mirtillo en italiano y portugués, y heidelberre en alemán. Las especies encontradas comunmente son las que se detallan en la tabla II.1: Tabla II.1: Especies comunes de arándano Nombre científico Nombre vulgar Tipo de cultivo Vaccinium corymbosum Arándano alto (“Highbush”) Cultivado Vaccinium angustifolium Arándano bajo (“Lowbush”) Silvestre Vaccinium ashei Arándano ojo de conejo Cultivado El arándano alto es la especie de mayor difusión en nuestro país, si bien la de ojo de conejo ha ganado popularidad en los últimos años, por su tolerancia a valores de pH ácidos del suelo, mayor resistencia a las sequías, mayor producción de fruta e incremento en la conservación postcosecha. El interés por el cultivo de arándanos en la zona de influencia de la región de Salto Grande, provincia de Entre Ríos, es una alternativa que comenzó a explotarse comercialmente hace pocos años, debido a las condiciones agroecológicas de la zona, la posibilidad de llevar adelante una diversificación en la oferta exportable, con la ventaja comparativa de la contraestación para la exportación en fresco, principalmente al hemisferio norte. En la provincia de Entre Ríos las principales variedades cultivadas, que pertenecen al “arándano alto”, son Misty, Emerald, Jewel y O`Neal, con cualidades nutritivas y contenido apreciable de antioxidantes. Los arándanos son frutas climatéricas, es decir que continúan con su proceso de maduración si una vez que alcanzada su madurez fisiológica, son arrancados de la planta. Cuando llegan a la madurez fisiológica, comienzan a sufrir numerosos cambios 3 de color, firmeza y sabor, lo que se conoce como maduración organoléptica, y es la responsable de que sean atractivos para el consumo. Sin embargo, una vez alcanzado el estado de máxima calidad (color, sabor y textura), sobreviene rápidamente el de sobre madurez o senescencia, asociado a un excesivo ablandamiento, pérdida de sabor y de color. Para evitar este deterioro de la fruta, surgen numerosas técnicas de postcosecha como el enfriamiento, almacenamiento en atmósferas controladas, etc. Estas bayas poseen una tasa de producción de etileno baja de 0,1 a 1,0 ml/kg x h a 5°C, con una vida promedio de postcosecha que oscila entre 10 y 18 días cuando se utilizan condiciones óptimas de conservación (Cantwell, 2001; Gamage y Shafuir Rahman, 2003; Mitcham y col., 2007). Duarte y col. (2009) informaron de períodos de conservación mayores a 24 días. Generalmente, para la conservación se emplean temperaturas de -0,5 a 0°C, humedades relativas de 90 a 95%, y atmósferas controladas con 2 a 5% O2 y 12 a 20% CO2 (Leyte y Forney, 1999a, b; Cantwell, 2001; Gorris y Peppelenbos, 2003; Kader, 2007). Las bayas son susceptibles a la pérdida de agua, lo que lleva al arrugamiento de la fruta y a su pérdida de brillo (Chiabrando y Giacalone, 2011). Para minimizar este problema, la humedad relativa se debe mantener en lo valores mencionados anteriormente, tanto en el almacenamiento como en el entorno de la fruta, siempre bajo temperaturas óptimas de 0±0,5°C (Leyte y Forney, 1999b; Mitcham y col., 2007). El mercado estadounidense tiene exigencias particulares referidas al tratamiento de los arándanos. Los mismos deben ser tratados con bromuro de metileno previo a la exportación, principalmente para controlar plagas cuarentenarias como la mosca de la fruta. II. 2. Propiedades del arándano Numerosos estudios han informado que el arándano presenta propiedades beneficiosas para la salud. Se utiliza para el tratamiento de infecciones urinarias, ya que ciertos componentes de la fruta inhiben el crecimiento de bacterias como Escherichia coli, principal causa de cistitis, entre otras (Ofek y col., 1991; Frontela y col., 2010). Las antocianinas y otros compuestos fenólicos son componentes característicos de este tipo de frutas (Del Río y col., 2010). No sólo imparten un color característico, sino también, propiedades antioxidantes (Heinonen y col., 1998; Azevedo y col., 2010; 4 Fu y col., 2011). Los beneficios terapéuticos de estos compuestos incluyen protección antioxidante y mantenimiento de la integridad del ADN (Bagchi y col., 2004). Las antocianinas han sido mencionadas también como agentes antiinflamatorios, anticancerígenos y antimutagénicos, y protectores cardiovasculares (Bagchi y col., 2004; Olsson y col., 2004; Yi y col., 2006; Lau y col., 2007; McDougall y col., 2008; Seeram, 2008; Huntley, 2009; Aiyer y Gupta, 2010; Basu y col., 2010a, b). Según Grace y col. (2009), los extractos de antocianinas provenientes de los arándanos poseen propiedades hipoglucémicas, que se podrían utilizar en el tratamiento de la diabetes. Otros estudios han mostrado evidencias de que dietas ricas en arándanos y otras bayas, con alto contenido en antocianinas, son efectivas para prevenir y/o revertir enfermedades neuronales degenerativas, relacionadas con la edad, como ser el mal de Parkinson, Alzheimer, problemas motrices, etc., y estrés oxidativo (Joseph y col., 1999; Galli y col., 2002; Joseph y col., 2005; Lau y col., 2005; Galli y col., 2006; Lau y col., 2007; Shukitt-Hale y col., 2008; Willis y col., 2009; Krikorian y col., 2010). En la tabla II.2 se detalla el contenido nutricional de estas frutas: Tabla II.2: Factores nutricionales del arándano fresco� Composición Nutricional del Arándano cada 142 g Calorías 100,00 Kcal Zinc 0,16 mg Proteínas 0,97 g Cobre 0,09 mg Grasas 1,00 g Manganeso 0,41 mg Carbohidratos 20,50 g Vitamina C 18,90 mg Fibra 3,00 g Tiamina 0,07 mg Calcio 9,00 mg Riboflavina 0,07 mg Hierro 0,24 mg Niacina 0,52 mg Magnesio 7,00 mg Ácido pantoténico 0,13 mg Fósforo 15,00 mg Vitamina B6 0,05 mg Potasio 129,00 mg Ácido fólico 9,30 mg Sodio 9,00 mg Vitamnia A 145,00 IU Fuente: NRAES (2010) La “Food and Drug Administration” (FDA) lo cataloga como un alimento entre bajo y libre de grasas y sodio, libre de colesterol y rico en fibras y vitamina C. 5 II.3. Comercialización II.3.1. Breve reseña histórica y situación mundial Para realizar esta reseña histórica se sintetizaron conceptos vertidos por la página Arándanos Argentinos (2010). Los arándanos silvestres “lowbush blueberry” han constituido una parte importante de la dieta de la fauna y aborígenes nativos norteamericanos, desde épocas inmemorables, según lo informado por los exploradores Lewis y Clark. Los europeos lo desconocían, razón por la cual, su consumo comenzó recién a principios del siglo XIX. En 1830 se iniciaron pruebas experimentales transplantando plantaciones silvestres, y en 1893, Antón Gass comenzó en Michigan una de las más grandes plantaciones, hasta ese momento. La primer comerciante de arándanos conocida, fue Elizabeth White, quien comenzó a comprar plantas de alta producción de origen silvestre. Logró colectar una importante cantidad de variedades, comenzando con ellas una investigación privada, de la cual concluyó que estas plantas necesitaban un suelo ácido de muy buen drenaje y que su polinización se hacia con insectos; además, innovó una técnica de multiplicación asexual. Esta información fue la base para las siguientes investigaciones. El botánico Frederick Coville, quien pertenecía al departamento de agricultura de Estados Unidos, comenzó su trabajo en conjunto con la señora White, quien le permitió convertir su granja en una estación experimental, que a su vez era de carácter comercial. Estos experimentos dieron como resultado que en 1960 el número de variedades atribuidas a Coville rondaban las 30, algunas de las cuales aún se continúan cultivando. Actualmente la investigación en Norteamérica incluye prácticas de cultivo para zonas específicas en donde se han podido reducir las enfermedades, los ataques de insectos y disminuir el estrés de algunas plantasprovocado por temperaturas extremas, inundaciones y heladas. Los arándanos se introdujeron en America del Sur en la década del 80 para evaluar su potencial como cultivo en las distintas regiones. En 1993, Chile contaba con tan sólo 580 hectáreas plantadas, y muy pocas reportadas en Argentina. Desde ese momento, el crecimiento de las hectáreas plantadas en ambos países se incrementó rápidamente. En la cosecha 2003/2004 el país transandino contaba con alrededor de 2500 ha, exportando aproximadamente 9700 tn de fruta; mientras que nuestro país poseía 1200 ha y exportaba 900 tn. Este rápido incremento del área plantada y de los 6 volúmenes vendidos se debió principalmente a los buenos precios de la fruta que se comercializaban a países del hemisferio norte en contraestación, y a una mayor demanda mundial de estas bayas (Bañados, 2006; Corrêa Antunes y col., 2008). Estados Unidos es el principal productor, consumidor, exportador e importador de arándanos del mundo, y junto con Canadá abarcan el 90% del área productiva total, seguida por Chile, Argentina, Nueva Zelanda, Australia y Sudáfrica. En Europa los principales productores son Francia, Holanda, Alemania, Polonia y España. Los principales compradores de estas frutas son Japón, Italia, Inglaterra, Bélgica y Holanda. Canadá es el principal proveedor de fruta congelada, pero a diferencia de su vecino norteamericano, la producción canadiense es en su mayoría silvestre. La ventaja de la producción de Chile y Argentina es que pueden suministrar arándanos a los países del hemisferio norte en contraestación, es decir, cuando ellos se encuentran en estación invernal y no pueden abastecerse con su propia producción (Corrêa Antunes y col., 2008; Dansa, 2008; Molina y col., 2010). II.3.2. El cultivo del arándano en Argentina En el país hay plantadas más de 5000 ha de arándanos (Molina y col., 2010). Las principales provincias productoras de arándanos son Entre Ríos, Tucumán y Buenos Aires, con iniciativas en San Luis, Río Negro, Mendoza, Salta, Catamarca y San Juan. En la provincia de Entre Ríos, las plantaciones se centran principalmente en la ciudad de Concordia y alrededores (Región de Salto Grande), abarcando aproximadamente el 50% de la producción nacional (Bruzone, 2010), seguido por Federación y Gualeguaychú,. En los últimos tiempos se manifestó un crecimiento del cultivo a lo largo del corredor Zárate – Baradero – San Pedro en la provincia de Buenos Aires, con aproximadamente 1300 ha plantadas, ubicándose en segundo lugar después de Entre Ríos con plantaciones de más de 1500 ha (Ros, 2005; Bruzone, 2007; Molina y col., 2010). Otras ciudades bonaerenses que cuentan con este cultivo son Mercedes, Sierra de los Padres, Tandil, entre otras. La zona de pedemonte en Tucumán, genera cerca del 9% de la producción nacional (Bruzone, 2007). En 2009 - 2010 las exportaciones de arándanos fueron similares a las correspondientes al período anterior, equivalente a 10400 tn. Los principales destinos fueron Estados Unidos (66%), Reino Unido (20%), registrándose una merma del 30% en las ventas a la Unión Europea (Santillán, 2009; Bruzone, 2010). 7 Debido a problemas climáticos sucedidos durante el 2009, la temporada 2009 - 2010, finalizó con una producción similar a la campaña anterior, con alrededor de 12000 tn cosechadas. Mucha fruta quedó sin cosechar, y ese remanente se destinó al mercado interno para industria y gastronomía (Bruzone, 2010). En el caso de Concordia, la reducción en el volumen cosechado fue del 30% como consecuencia de las lluvias y los fuertes vientos registrados. Además, hubo un efecto negativo sobre la calidad de la producción (Bruzone, 2010). Argentina actualmente ocupa el segundo lugar como exportador del hemisferio sur, detrás de Chile, y aporta el 2% de la producción mundial. El consumo interno de estas bayas no está muy evolucionado en nuestro país, si bien existe una tendencia creciente, debido principalmente a la mayor concientización de la población sobre el consumo de productos naturales con propiedades beneficiosas para la salud, como es el caso de los arándanos. Éstos pueden encontrarse en supermercados como productos frescos en bandejas plásticas denominadas “clamshells” de 125 g cada una. Por otro lado, el sector gastronómico y el industrial cada vez demandan más esta fruta para incorporarla en sus productos. En la figura II.1 se observa un esquema aproximado del calendario anual de la producción primaria. Figura II.1: Calendario anual de la producción primaria En el esquema puede apreciarse que la época de cosecha suele extenderse desde septiembre a enero. Debido a las grandes heladas que afectaron a toda la región de Salto Grande y que produjeron daños, muchas veces irreversibles en las plantaciones, los productores esperan que la cosecha 2012 termine a mediados de diciembre. 8 II.4. Características generales del cultivo II.4.1. Fertilización y tratamiento del suelo Las plantas de arándanos son arbustos originarios del norte de Norteamérica, regiones con clima frío y suelos muy ácidos, livianos y turbosos. Se puede adaptar a diferentes condiciones climáticas (Lavado, 2006). El rango de pH del suelo debe oscilar entre 4 y 5,5, siendo el valor óptimo entre 4,5 y 4,8. Estos valores provocan la inhibición de las bacterias nitrificadoras presentes en el suelo, por lo que los mismos son pobres en nitratos. Debido a esto, las plantas no presentan capacidad de absorción de nitratos. Lavado (2006) no recomienda su adición a este cultivo, pues no se podrían absorber provocando además un incremento en el pH. Por otro lado, las plantas se ven obligadas a adecuar su sistema radicular y asociarse con ciertos hongos llamados “micorrizas” para mejorar su capacidad de absorción de nutrientes. Los lotes utilizados para la obtención de la fruta empleada en el desarrollo de la presente tesis, se encuentran ubicados sobre terrazas antiguas de erosión del río Uruguay, con suelos arenosos, relieve suavemente ondulado y pendientes largas. Una descripción detallada de las principales características de los suelos de la región de interés se resumen de la siguiente manera (Lavado, 2006; Rivadeneira, 2012): Serie Yuquerí Chico: Son suelos arenosos a areno francos, rojizos, sobre materiales arcillo-arenosos rojizos, encontrados a una profundidad de 65 a 85 cm, generalmente con cantos rodados. Son suelos bien drenados a algo excesivamente drenados, escurrimiento superficial moderado. Su permeabilidad es moderada, muy rápida en los horizontes superficiales y moderadamente lentos en los materiales sub- superficiales. Constan de una napa freática profunda. Son suelos con un leve peligro de erosión. Serie Yuquerí Grande: Son suelos muy arenosos, poseen más del 80% de esta fracción mineral, de característico color rojizo o rojo amarillento que yacen sobre materiales más arcillosos que se encuentran a más de 120 cm de profundidad, siendo común encontrarlos también hasta 200 cm de profundidad. En algunos casos constituyen verdaderos médanos. Son suelos bien a excesivamente drenados, y escurrimiento superficial moderado. Su permeabilidad es moderada, con una napa freática profunda. Presentan peligro de erosión. 9 Serie Puerto Yeruá: Son suelos imperfectamente drenados, franco-arenosos a areno-franco sobre materiales muy densos y poco permeables, franco-arcillo-arenosos a arcillo-arenosos. Están desarrollados sobre materiales arcillosos lacustres, removidos y mezclados con una capa de material fluvial franco-arenoso más reciente. Presentan suaves ondulaciones, generalmente con pendientes de 1 - 2%. Son suelos moderadamente bien drenados, con escurrimiento superficial moderado. Su permeabilidad es rápida en los horizontes superficiales y muy lenta en los sub- superficiales, con una napa freática profunda. Presentan leve peligroa la erosión. Estas características corresponderían a suelos arenosos rojizos que comprenden las series Yuquerí Chico y Yuquerí Grande, y suelos arenosos pardos que comprenden la serie Puerto Yeruá. El uso de fertilizantes promueve el rápido crecimiento en plantas jóvenes para que lleguen a su madurez en el mejor estado, y una vez que el tamaño fue alcanzado, el objetivo primario es maximizar el rendimiento de los frutos y su calidad (INTA, 2012). Este proceso se debe llevar a cabo tanto en el período de implantación como en el de producción. En el primero, se debe utilizar un fertilizante rico en fósforo, que permita un adecuado crecimiento del sistema radical. El segundo se realiza en varias etapas para asegurar los requerimientos del crecimiento y desarrollo del cultivo (Lavado, 2006). La mayor parte de las aplicaciones se realizan a través del riego y mediante pulverizaciones foliares. En la figura II.1 puede apreciarse que la aplicación de fertilizantes se lleva a cabo a lo largo de prácticamente todo el año. Sin embargo, el arándano presenta requerimientos bajos de nutrientes, por lo que el uso excesivo de los mismos puede afectar negativamente a estas plantas (Lavado, 2006). Lo que se detalla a continuación es el resumen de las prácticas comunes realizadas en campos de la región de Salto Grande, recolectadas a través de entrevistas personales con encargados de campos arandaneros e ingenieros agrónomos. Debido a las exigencias de oxígeno, las plantaciones se realizan sobre montículos de tierra denominados camellones de aproximadamente 20 cm de altura y 1,20 m de ancho (Figura II.2). Este movimiento de tierra facilita el drenaje, evitando la saturación con agua del sitio de plantación que provocaría la asfixia radicular. Los camellones 10 están separados entre sí una distancia de alrededor de 3,5 m. Las plantas tienen una distancia promedio de 1 m entre ellas. Sobre el camellón se aplica una cobertura orgánica o “mulch” compuesta por aserrín, corteza y hojas de pino. El origen de la corteza y aserrín de pino provienen del residuo de la industria maderera, mientras que las hojas o pinochas se recogen directamente de las plantaciones de pino. Estos materiales no emanan olores molestos. Las funciones del “mulch” son: • Ayudar a mantener un correcto balance hídrico en la planta. • Realizar control de la maleza. • Modificar la temperatura del suelo y reducir las fluctuaciones térmicas en el mismo. • Ayuda a mantener una estructura porosa. • Mantener un pH constante. • Promover una distribución uniforme de las raíces. Figura II.2: Camellones en plantaciones de arándanos Entre los camellones se mantiene la cobertura vegetal natural para evitar la formación de polvo que pueda adherirse a los frutos. En los lomos se instala un sistema de riego artificial por goteo (Figura II.3), con tuberias de 16 mm y con goteos cada 30 cm, con caudales adecuados para satisfacer las necesidades hídricas y de nutrientes mediante la fertirrigación (fertilización a través del sistema de riego). 11 Figura II.3: Sistema de riego por goteo II.4.2. Heladas Las heladas son la causa de importantes pérdidas en la agricultura, dependiendo de su intensidad, duración y fase fenológica del cultivo. El riesgo se incrementa ante la posibilidad de que el fenómeno se produzca fuera de la época invernal. Las “heladas tardías” afectan a los brotes tiernos o floraciones, siendo su control, de suma importancia para el productor arandanero (Entrevistas, 2010). El agua del interior de las células y de los espacios intercelulares es la que sufre constantes cambios de estado de líquido a sólido cuando la temperatura externa es suficientemente baja. El cambio de estado genera la formación de cristales grandes que dan lugar a la ruptura de los tejidos. Se pueden producir además necrosis o quemado de los mismos, cuando la temperatura alcanza los -2°C (Molina y col., 2010). Una forma práctica, común en la mayoría de los campos arandaneros, para evitar el efecto nocivo de las heladas es la aspersión de agua, de manera que sea ésta la que se congele sobre la superficie de las plantas y no el agua intra e intercelular (Figura II.4). Otra técnica empleada para combatirla es la generación de humo desde la madrugada anterior (Entrevistas, 2010; Molina y col., 2010). 12 Figura II.4: Sistema antihelada en plantaciones de arándanos II.4.3. Cosecha Si bien son frutas climatéricas, deben cosecharse parcial o totalmente maduras ya que de lo contrario no logran desarrollar el sabor deseado (Mitcham y col., 2007). Cuando su destino es el mercado en fresco casi siempre se cosechan a mano, mientras que aquellas frutas destinadas al procesamiento se pueden cosechar mecánicamente. La capacidad para resistir el daño durante las operaciones de cosecha varía considerablemente entre las variedades. Las frutas de algunas variedades deben ser recolectadas tan pronto como cambian al azul oscuro, pero hay otras variedades que no están maduras aun cuando hallan cambiado al azul oscuro. Estas frutas deben ser recolectadas después que desarrollen un buen sabor, pero mientras se mantengan suficientemente firmes para una adecuada comercialización (Mitcham y Mitchell, 2007). La cosecha manual tiene numerosas ventajas frente a la mecanizada para el caso puntual del arándano. Debido a que estas frutas presentan un amplio rango de grados de madurez y requieren ser cosechadas varias veces, la gente puede determinar con exactitud la calidad del producto y seleccionar la madurez adecuada. Los trabajadores bien entrenados pueden cosechar las bayas con rapidez, sin dañarlas (Gamage y Shafuir Rahman, 2003; Thompson, 2007). Las bandejas empleadas para la recolección de arándanos se observan en la figura II.5. 13 Figura II.5: Bandejas para recolección de arándanos en el campo II.5. Tratamiento postcosecha de arándanos II.5.1. Empaque de arándanos El empaque de arándanos para exportación en la Región de Salto Grande, tiene como objetivo principal asegurar y resguardar la calidad de la fruta, manteniendo sus características y propiedades naturales. Para lograr esto, se llevan a cabo procesos de clasificación por tamaños, selección y envasado, en concordancia con los requerimientos y parámetros establecidos por el mercado internacional. La fruta fresca llegada del campo se pesa en la sala de recepción, y se envía a cámara de pre-refrigeración, en espera de su empaque. El día en que se lleva a cabo el proceso, según la orden de producción, se pesa la fruta por remito y variedad para el control de peso pre-proceso. La sala de empaque se encuentra separada por una cortina sanitaria de cloruro de polivinilo (PVC) que no permite la contaminación cruzada entre salas. La secuencia de empaque se detalla a continuación, y puede también ser apreciada en la figura II.6: La fruta se vuelca manualmente en una cinta transportadora de inicio. Esta abastece las diferentes líneas de clasificación a través de separadores de cangilones, que permiten que se eleve la fruta. En cada línea existen clasificadoras por tamaño fijas, que descartan aquellas bayas de tamaño no comercializable para el mercado internacional. Las que continúan en la línea pasan por mesas de clasificación, donde el personal puede eliminar la fruta de calidad de industria. 14 La fruta descartada por las clasificadoras por tamaño o por el personal, se conduce por cintas transportadoras hacia el área de descarte, en donde se pesa y se paletiza, destinándola luego a la industria. La fruta elegida para exportación circula por la línea hacia una clasificadora por tamaño variable, la cual separa en distintas líneas según el tamaño, en chico, mediano y grande, desembocando en las maquinas envasadoras. La definición del tamaño dependedel cliente y de la variedad de arándano, siendo, para la variedad Emerald por ejemplo: chico (<15 mm), mediano (15 a 20 mm) y grande (>20 mm). Las máquinas envasadoras fraccionan la fruta y la disponen en cestillas de PET (polietilentereftalato) reciclables denominadas "clamshells" de 125 g, que se agrupan de a 12 en bandejas de cartón corrugado (1,5 kg). Finalmente estas bandejas se agrupan de a 40 en masters (cajas) de poliestireno expandido con capa de aluminio. A continuación se transportan a través de cintas transportadoras hacia donde se imprime el código de trazabilidad. Los estibadores realizan el paletizado, mientras que otro operario coloca los esquineros, los flejes, y una vez completo el pallet, se realiza el ajuste de flejes y se pega la tarjeta de identificación. Los pallets se transportan a cámaras con temperaturas de 10ºC hasta el momento de su despacho. 15 Figura II.6: Diagrama de flujo de la cadena productiva del arándano Cosecha Transporte Balanza Recepción Empaque Volcado Selección y Clasificación Cámara de pre- enfriamiento Descarte a Industria Envasado y paletizado Despacho Puerto Clientes Balanza para pesada pre-proceso Aeropuerto Bromurado, Refrigeración, Atmósferas modificadas o controladas Clientes 16 A lo largo de la línea de empaque se realiza un muestreo aleatorio, representativo, para que sea analizado en el laboratorio de control de calidad. El muestreo es estratificado, es decir, que consiste en subdividir imaginariamente el lote en forma horizontal, de manera de obtener varias partes, o sublotes. Luego de cada una de las partes formadas, se extrae una muestra al azar, cuyo tamaño dependerá del tamaño del sublote, pero que en general, debe ser superior al 3% del tamaño del lote. Con todas las pequeñas muestras obtenidas, se obtiene la muestra final, que será representativa de ese lote. Este procedimiento se lleva a cabo con una frecuencia de una hora. II.5.2. Refrigeración La refrigeración es una de las técnicas de conservación de alimentos más antigua y utilizada en el mundo para reducir el deterioro postcosecha de frutas y hortalizas frescas (Gamage y Shafuir Rahman, 2003). Al disminuir la temperatura se genera una reducción de la tasa respiratoria con lo cual se retrasa el comienzo de la senescencia del vegetal, además de minimizar el deterioro microbiológico. Estas bayas deben refrigerarse hasta alcanzar temperaturas próximas a las de conservación dentro de las 4 horas desde el momento de la cosecha, reduciendo al mínimo la pérdida de calidad (Entrevista, 2010). Dentro de las técnicas de enfriamiento normalmente utilizadas en los empaques de fruta fresca, para el caso del arándano, no se aconseja la utilización de agua debido a que al humedecer las bayas se facilitaría el ataque microbiano. Por otro lado, el enfriamiento en cámaras frigoríficas tampoco sería útil debido a la ineficiencia del sistema para reducir la temperatura de la pulpa de la fruta en poco tiempo. Por estos motivos, se recomienda la refrigeración con un sistema de aire forzado, donde una corriente de aire frío se hace pasar a través de los envases, impulsado por ventiladores o forzadores de aire ubicados en uno de los extremos de la carga (Leyte y Forney, 1999b). Mientras que por aire forzado se logra bajar la temperatura de la pulpa desde 20 - 25°C hasta 1,5°C en 2 hs, se requieren 48 hs utilizando una cámara convencional (Yommi y Godoy, 2002). Las pérdidas de postcosecha se pueden disminuir notoriamente si se reduce la temperatura a los valores óptimos que oscilan entre -0,5 y 0°C (Cantwell, 2001; Mitcham y col., 2007). La temperatura baja debe mantenerse inclusive durante la etapa de transporte de los frutos. En estas condiciones la tasa respiratoria disminuye, permitiendo retrasar el comienzo de la senescencia. 17 II.5.3. Aplicación de atmósferas modificadas y controladas En las atmósferas modificadas (AM) o controladas (AC) se eliminan o añaden gases para crear una composición atmosférica alrededor del producto que difiera de aquella del aire, que es de aproximadamente 78% de N2, 21% de O2, y 0,03% de CO2 (Madrid y col., 1994). Usualmente esto involucra la reducción de oxígeno y/o la elevación de las concentraciones de dióxido de carbono (Leyte y Forney, 1999a). Las AM y AC solamente difieren en el grado de control, la AC es más exacta (Brody, 1996). El uso de la atmósfera modificada en el empaque y durante el transporte, con un 15 a 20% de dióxido de carbono, y un 5 a 10% de oxígeno, reduce el crecimiento de Botrytis cinerea y otros microorganismos, y reduce la tasa de respiración y el ablandamiento, extendiendo así su vida postcosecha (Prange y col., 1995; Kader, 2007; Mitcham y col., 2007). Si bien las temperaturas bajas son esenciales, la combinación con atmósferas ricas en CO2 y pobres en O2, ayuda a prolongar el período de conservación. El uso de estas técnicas de conservación debe considerarse como un complemento de la temperatura y humedad relativa apropiadas (Kader, 2007). Por otra parte, concentraciones de O2 menores al 1,5% producen fermentaciones de la fruta con aparición de olores desagradables. El CO2 protege además a las bayas del ataque microbiano, principalmente de hongos causales de podredumbres postcosecha. Sin embargo, cuando la concentración de este gas supera el 25% se generan olores desagradables como consecuencia de la respiración anaeróbica, el metabolismo fermentativo (Prange y col., 1995; Kader, 2007), y el pardeamiento del epicarpio (Mitcham y col., 2007). II.5.4. Bromurado El bromuro de metilo se utiliza como tratamiento postcosecha de arándanos, principalmente de aquellos que se exportan a Estados Unidos. Se trata de un biocida que permite controlar eficientemente hongos, bacterias, virus, insectos, etc. Es un producto químico muy efectivo que se airea en forma rápida. Sus desventajas son la elevada toxicidad para el hombre y la destrucción de la capa de ozono, motivos por los cuales, se están realizando investigaciones para poder reemplazarlo (Valeiro, 2008). Principalmente se emplea para el control de plagas cuarentenarias como por ejemplo Ceratitis capitata y Anastrepha fraterculus, mosca de la fruta, (Molina y col., 18 2010). El bromurado consiste en una fumigación con el principio activo a una temperatura de la pulpa de 21°C durante tres horas y media, con posterior aireación y enfriamiento hasta 0,5 – 1°C. Para mantener las temperaturas durante el transporte, se colocan geles y/o mantas térmicas, y se cierra el palet (Zapata y col., 2010). II.6. Alimentos elaborados con arándanos Actualmente se genera, de la producción de arándanos en nuestro país, un descarte de aproximadamente el 10% de fruta (por tamaño, falta o exceso de maduración, etc.) y se estima que este porcentaje irá en aumento por la lógica saturación de los mercados que aumentaran sus exigencias, alcanzando como mínimo 4500 – 6000 tn/año de fruta a la que hay que buscarle mercados alternativos. Algunos de ellos son la transformación de la fruta por proceso de deshidratación en pasas de arándanos, la elaboración de jugos, mermeladas y bebidas alcohólicas, entre otros (Almenar y col., 2007; Oliveira de Moraes, 2007; Barba y col., 2011; Chiabrando y Giacalone, 2011). II.6.1. Jugo de arándano De todos los procesos tecnológicos que involucran al arándano, la elaboración de jugo, es actualmente el principal a nivel industrial en Argentina. Es una herramienta importante para buscar una alternativa comercial a la fruta de descarte y enriquecer la dieta de los consumidores (Heinonen y col., 1998; Joseph y col., 1999; Galli y col., 2002; Bagchi y col., 2004; Olsson y col., 2004; Joseph y col., 2005; Lau y col., 2005; Galli y col., 2006; Yi y col., 2006; Lau y col., 2007; McDougall y col., 2008; Seeram, 2008; Shukitt-Haley col., 2008; Huntley, 2009; Willis y col., 2009; Aiyer y Gupta, 2010; Azevedo y col., 2010; Basu y col., 2010a, b; Krikorian y col., 2010; Fu y col., 2011). Existen muchas diferencias con respecto al procesamiento de arándano para la elaboración de jugo, principalmente en los equipos y condiciones de operación empleados en el proceso. Sin embargo, se puede reconocer un lineamiento general (Arthey y Ashurst, 1996; Stewart, 2005). La fruta proveniente del campo, una vez alcanzada su madurez comercial, generalmente se somete a un congelamiento mediante un sistema de IQF (congelamiento rápido individual) y posteriormente se almacena entre -50°C y -23°C para evitar su deterioro microbiano, sensorial y nutricional. Llegado el momento de 19 comenzar el proceso de elaboración, la fruta se descongela hasta alcanzar 5°C aproximadamente (Skrede y col., 2000; Lee y col., 2002; Rossi y col., 2003; Brambilla y col., 2008). Este descongelamiento parcial lleva aproximadamente 12 hs (Rossi y col., 2003). Una vez alcanzada la temperatura deseada y previa a la trituración de la fruta, algunos investigadores proponen realizar un proceso de escaldado o sulfitado para favorecer la inactivación de enzimas, principalmente de la polifenoloxidasa, causantes de la destrucción de antocianinas y otros compuestos fenólicos de importancia para la calidad y valor nutricional del producto terminado. El tratamiento térmico también incrementaría la permeabilidad de las células del pericarpio de la fruta con lo que ayudaría a la extracción de antocianinas y flavonoles. El escaldado se realiza a 85°C durante 3 min en túneles donde se inyecta vapor y luego se enfría con agua (Rossi y col., 2003; Brambilla y col., 2008). Otra posibilidad, según Lee y col. (2002), es realizar el escaldado a 95°C durante 2 min y luego enfriar rápidamente hasta 38°C. Este mismo autor experimentó también un proceso de sulfitado (100 ppm SO2) en lugar del tratamiento térmico, para lo cual adicionó metabisulfito de potasio en dos etapas, la primera antes de la trituración y la segunda luego de la misma. A continuación se lleva a cabo la trituración de la fruta pudiéndose emplear para ello distinta clase de equipamiento, aunque aquellos comunmente usados en la industria son los molinos de rodillos o cuchillas. Sólo se requiere una suave trituración en comparación con otras frutas. Una vez que se realizó la reducción del tamaño de la fruta se procede a la despectinización, para lo cual la materia prima se coloca en recipientes de acero inoxidable y se le adicionan enzimas comerciales. La concentración de enzimas a agregar, la temperatura óptima de trabajo, así como el tiempo de proceso, dependerá del pool comercial empleado. Por ejemplo, Brambilla y col. (2008) trabajan con 0,7 g/kg de enzima a temperatura ambiente durante 1 hora. En cambio, Skrede y col. (2000) utilizan 8 ml de una solución (1:10, v/v en agua) a 43°C durante 2 hs. Para verificar que el proceso de despectinizado fue completo, sin importar cuáles fueron las condiciones de operación, se realiza la prueba de precipitación con alcohol. Si presentan precipitados se debe a que aún quedan pectinas sin hidrolizar, las cuales son insolubles en alcohol. Una vez completada la despectinización se procede a la extracción del jugo en una etapa de prensado. En la misma se pueden utilizar por ejemplo filtros prensa de bolsa con o sin el agregado de coadyuvantes, como cáscara de arroz. En la figura II.7 Se puede observar un diagrama de flujo del proceso descripto. En general, cuando se 20 utilizan coadyuvantes, las presiones de prensado pueden ser menores y rondarían las 5 atmósferas (Skrede y col., 2000; Lee y col., 2002). En caso contrario alcanzarían valores de aproximadamente 8,7 atmósferas (Rossi y col., 2003; Brambilla y col., 2008). Figura II.7: Diagrama de flujo del proceso de elaboración de jugo de arándano 21 Los rendimientos de extracción dependen mucho de las condiciones de operación y fundamentalmente de la variedad de arándano, debido a que poseen distinto contenido de agua, sólidos solubles, etc. Mientras que en algunas variedades el jugo se puede extraer más fácilmente, inclusive por sólo presionar la fruta con los dedos, en otras es más dificultoso. Los rendimientos de extracción por lo general oscilan entre 75 y 83%. La etapa siguiente en el proceso de elaboración es la pasteurización mediante un sistema de HTST (alta temperatura – corto tiempo), por ejemplo 90°C durante 1 minuto. Una vez finalizada la misma, el jugo puede ser filtrado y embotellado para ser comercializado como jugo de arándano directamente en las góndolas de los supermercados. Sin embargo, muchas industrias comercializan jugo concentrado, que se obtiene mediante una concentración del mismo, desde los 15°Brix iniciales hasta aproximadamente 74°Brix. II.6.2. Néctares Los néctares siempre han sido populares en Europa y otros países del mundo, pero han ganado gran aceptación en la última década también en Estados Unidos (Stewart, 2005). La diferencia entre un néctar y un jugo clarificado es que este último debe estar libre de partículas en suspensión y turbidez. Los néctares son dispersiones estables con una proporción significativa de pulpa no disuelta en la solución viscosa. Este producto contiene una cierta cantidad de partículas en suspensión, de las cuales la pectina es la más importante. Usualmente en la fabricación de néctares se suelen agregar endulzantes, ácidos proveniente de la fruta y estabilizantes. En la producción de néctares la fruta se hace pasar a través de un “finisher” para lograr la dispersión de todas las partículas de la fruta y eliminar las semillas y otras partes de la fruta, dejando un producto homogéneo y estable. Las etapas claves para fabricar un buen néctar son el triturado y la homogeinización, asegurando con ellas un “cloud” o dispersión estable. La eliminación de gases del néctar mediante el desaereado ayuda a estabilizar el jugo y prevenir el “off-flavor” y la degradación del color (Arthey y Ashurst, 1996). Los jugos pulposos pueden prepararse empleando enzimas que destruyen la estructura intercelular de las protopectinas, lo que deja a la pectina en estado coloidal, que es lo importante en este tipo de sistema de polidispersión. En el caso de utilizar 22 preparados enzimáticos, se debe posteriormente realizar un tratamiento térmico para inactivar las enzimas. Si la viscosidad y estabilidad de la dispersión no son los adecuados, se agregan coloides hidrofílicos o estabilizantes al néctar (Arthey y Ashurst, 1996; Stewart, 2005). II.6.3. Pasas de arándano La producción de pasas de arándanos es una alternativa viable para el aprovechamiento del descarte de los empaques. Se podría utilizar un secadero sencillo instalado en la propia finca de los productores, ya que la deshidratación se puede realizar a temperaturas de aproximadamente 105°C con corrientes de aire forzado para reducir los tiempos de proceso. El producto final debe contener una humedad menor al 25% según el Código Alimentario Argentino. En los casos en que las pasas se envasen herméticamente, se permite un contenido de humedad de hasta 35%. II.6.4. Otros Los arándanos suelen utilizarse también en la fabricación de vinos, licores, dulces, mermeladas, te saborizado, pulpas, complementos dietarios, y para enriquecer productos tales como barras de cereales, yogures, etc. (Cinbas y Yazici, 2008). II.7. Enfermedades de los arándanos Los nutrientes presentes en los arándanos, combinados con una actividad acuosa óptima y valores ácidos de pH, hacen que esta fruta sea particularmente susceptible al deterioro fúngico (Almenar y col., 2007). Las enfermedades fúngicas que afectan tanto a la planta como a los frutos, junto con el ataque de insectos, representan las principales causas de pérdidaen la producción de arándanos pre y postcosecha (Cline, 1997; Ellis y col., 2004; Ellis y Nita, 2008), lo que se traduce en una reducción en términos económicos. Si bien las principales enfermedades fúngicas se generan postcosecha y durante el almacenamiento, el grado de deterioro estará directamente relacionado con las condiciones de precosecha, los potenciales inóculos y el almacenamiento de las frutas (Cappellini y col., 1972). Las podredumbres más significativas encontradas a nivel mundial, y los patógenos de mayor incidencia descriptos son: podredumbre por Alternaria, generada 23 principalmente por Alternaria tenuissima (Cappellini y col., 1972; Smith y col., 1996; Cline, 1997; Wright y col., 2004; Luan y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera y col., 2009), podredumbre gris por Botrytis cinerea (Cappellini y col., 1972; Cappellini y Ceponis, 1977; Cappellini y col., 1983; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Smith, 1998; Tournas y Katsoudas, 2005; Vásquez y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera y col., 2009), antracnosis por Colletotrichum gloeosporioides (telemórfica: Glomerella cingulata) y Colletotrichum acutatum (Cappellini y col., 1972; Hartung y col., 1981; Daykin y Milholland, 1984; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Cline, 1997; Guerber y Correll, 1997; Wright y col., 1998, 2008a; Barrau y col., 2001; Polashock y col., 2005; Verma y col., 2006, 2007; Yoshida y col., 2007; Wharton y Schilder, 2008; Rivera y col., 2009), podredumbre blanda por Phomopsis vaccinii (Smith y col., 1996; Cline, 1997; Gabler y col., 2004), momificación de bayas por Monilinia vaccinii-corymbosi o Sclerotinia vaccinii-corymbosi (Cline, 1997; Lehman y Oudemans, 1997, 2000; Lehman y col., 2007; Scherm y Copes, 1999; Copes y col., 2001; Cox y Scherm, 2001a, b, c; Scherm y col., 2001, 2004; Ngugi y col., 2002a, b; Ngugi y Scherm, 2004; Penman y Annis, 2005; Wharton y Schilder, 2005; Tamowski y col., 2008) y especies de los géneros Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma y Mucor (Cappellini y col., 1972; Cappellini y Ceponis, 1977; Smith y col., 1996; Cline, 1997; Wright y col., 2008a, c; Wright, 2009). En Argentina, los principales agentes responsables del deterioro del arándano en el cultivo han sido identificados como Alternaria tenuissima (Wright y col., 2004, 2008a, c; Rivera y col., 2009); Botrytis cinerea (Vásquez y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera y col., 2009); Dothichiza caroliniana (Baino y col., 2007); Pucciniastrum vaccinii (Dal Bello y Perelló, 1998; Wright y col., 2008c; Rivera y col., 2009); Pestalotiopsis guepini (Wright y col., 1998, 2008c; Rivera y col., 2009); Colletotrichum gloeosporioides (Wright y col., 1998, 2008a; Rivera y col., 2009); Nigrospora sphaerica (Wright y col., 2008b); Bipolaris cynodontis (Rivera y col., 2009; Sisterna y col., 2009); y Fusarium solani (Pérez y col., 2007). Rivera y col. (2009) describieron otras enfermedades producidas por Rhizoctonia solani, Botryosphaeria spp., Fusicoccum spp., Dothiorella spp., Phomopsis spp., Nigrospora sacchari, Cylindrocladium spp., Curvularia spp., Phoma spp., Phytophthora spp., Rhizopus stolonifer, Aspergillus spp., Penicillium spp., y Trichoderma spp. En los ítems siguientes se describen las enfermedades fúngicas más prevalentes. 24 II.7.1. Podredumbre por Alternaria El hongo responsable es principalmente Alternaria tenuissima (Cline, 1997). Es una de las enfermedades más comunes en el arándano y sus daños son de importancia. Los hongos del género Alternaria producen manchas foliares de forma y tamaño variables, dispersas en la lámina o comenzando por el ápice o por los bordes. Pueden aparecer sobre ambas caras de las hojas y abarcar gran parte de las mismas. También producen atizonamiento y cancros en tallos y pudrición de frutos en pre y post cosecha (Rivera y col., 2009). Se genera el hundimiento de la fruta cerca del cáliz tal como lo muestra la figura II.8. Figura II.8: Arándano contaminado con Alternaria La superficie afectada suele cubrirse con una masa de esporas negro grisáceas. Las frutas tienden a rajarse, aparecen manchas oscuras, reblandecimiento y pudrición. La diseminación se produce por el viento, lluvia, etc. (Cline, 1997). Es necesario refrigerar lo más rápido posible, realizando un adecuado control de temperatura y humedad durante el almacenamiento. II.7.2. Podredumbre gris � Botrytis cinérea produce manchas y muerte del tallo, manchas foliares pardas, irregulares que no respetan las nervaduras, podredumbres de flores y frutas en pre y postcosecha. En las flores genera manchas castañas en los pétalos, pudiendo desprenderse los pedúnculos florales quedando el racimo prácticamente sin frutas. Los órganos afectados se cubren de un moho grisáceo. En las frutas se observan manchas oscuras, reblandecimiento y pudrición (Rivera y col., 2009). Este hongo aún sigue creciendo a 0°C, sin embargo el crecimiento a esta temperatura es muy lento (Mitcham y col., 2007). Por estos motivos se recomienda, al igual que en el caso anterior, refrigerar los frutos lo más rápido posible después de la cosecha. 25 En la figura II.9 puede apreciarse un arándano contaminado con Botrytis cinerea. Figura II.9: Arándano contaminado con Botrytis cinerea II.7.3. Antracnosis Glomerella cingulata es el nombre que recibe el hongo cuando se encuentra en su estado de reproducción sexual (teleomorfo), mientras que en el estado asexual (anamorfo) se conoce como Colletotrichum gloeosporioides (Smith y col., 1996). El hongo mencionado anteriormente, y Colletotrichum acutatum producen antracnosis, generando pudriciones blandas, con una tonalidad levemente bronceada, donde las bayas se ven cubiertas por exudados de color salmón. Estos microorganismos suelen afectar no sólo a los frutos, sino también a flores y hojas. Dan lugar a atizonamiento de flores, las que adquieren una coloración que va de marrón a negra. En las hojas producen manchas café pequeñas, circulares e irregulares (Cline, 1997; Gutiérrez, 2010). También causan tizón y cancro en tallos (Rivera y col., 2009). La diseminación de la enfermedad se produce por el traslado de las esporas del hongo de una planta enferma a otra sana, mediante la lluvia y el riego durante la floración y desarrollo de frutos. Como medidas preventivas se recomienda evitar el riego excesivo, refrigerar las bayas de forma inmediata una vez recolectadas (Gutiérrez, 2010). En la figura II.10 se observan frutos afectados por la enfermedad: Figura II.10: Arándano con antracnosis 26 II.7.4. Roya Esta enfermedad es producida por Pucciniastrum vaccinii. Este hongo es altamente específico y ataca tanto hojas como frutos de arándano (Hong, 2005). La infección se produce al trasladar el viento las esporas provenientes de plantas enfermas hacia aquellas sanas. Cuando las condiciones ambientales son las propicias, se produce la germinación de estas esporas y la penetración a través de estomas y lenticelas. Se presenta como manchas foliares cloróticas que posteriormente se tornan necróticas, junto con la aparición de pústulas amarillo anaranjadas, en la cara inferior de la hoja. Esto se corresponde con manchas castaño rojizas en la cara superior de las mismas. Si el ataque es severo, se produce una desfoliación prematura, lo que afecta el rendimiento de la cosecha siguiente (Rivera y col., 2009). En las frutas se observan manchas púrpura rojizas principalmente alrededor del cáliz. Los frutos muestran pústulas amarillas como puede apreciarse en la figura II.11. Figura II.11: Arándano con roya II.7.5. Momificación de arándanos (Mummy berry) Molininia vaccinii-corymbosi (Sclerotinia vaccinii-corymbosi) es el causante de esta enfermedad. Ataca tanto frutos como hojas, causando importantes pérdidas. Como primer paso, elhongo genera atizonamiento de brotes y hojas, con manchas color café en la nervadura central. Se aprecian esporas de color grisáceas. Los frutos maduros se observan momificados, grises, arrugados, duros y suelen caer prematuramente (Figura II.12). La infección primaria se produce por la germinación de esclerocios (masa compacta de micelio) que dan lugar a la aparición de apotecios con ascosporas que producen la infección en tallos y hojas. Posteriormente se diseminan los conidios por el viento e insectos infectando las flores (Gutiérrez, 2010). 27 Figura II.12: Arándano contaminado con Molininia vaccinii-corymbosi II.8. Micotoxinas El término "micotoxina" combina la palabra griega "micos", que significa hongo, y la palabra latina "toxicum", que significa veneno. Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por algunos hongos, que pueden ser encontrados principalmente en vegetales, alimentos y forrajes. Los géneros más importantes que presentan especies productoras de toxinas incluyen Alternaria, Aspergillius, Fusarium y Penicillium. Una especie puede producir más de una toxina y cepas provenientes de distintos géneros pueden producir las mismas toxinas. (FAO, 2003). Como las micotoxinas son contaminantes naturales producidos por hongos y éstos son ubicuos, el hombre siempre ha estado expuesto a estos compuestos en su alimentación. Casi todas las micotoxinas son químicamente estables, por lo cual tienden a sobrevivir el almacenamiento de materias primas y la elaboración de alimentos, incluyendo procesos como la cocción a temperaturas muy elevadas (JECFA, 2001, 2012). Por esto es importante evitar en lo posible, las condiciones que conducen a la formación de micotoxinas. No se puede eliminarlas por completo del suministro de alimentos pues la mayoría provienen de los cultivos. Es de suma importancia la identificación de contaminantes fúngicos en fruta fresca, debido a que algunos de estos hongos pueden crecer y producir micotoxinas en dichos productos (Tournas y Katsoudas, 2005). Una micotoxina se considera "importante" si se ha demostrado su capacidad para tener efectos considerables sobre la salud de las personas y la productividad de los animales en diversos países (FAO, 2003). La presencia de un hongo que se sabe que produce toxinas no supone de manera automática la presencia de la toxina asociada, ya que en la producción de micotoxinas 28 participan numerosas variables. De la misma manera, la falta de moho visible no garantiza que el alimento no tenga toxinas, ya que el moho podría haberse eliminado y dejado intacta la micotoxina. Según la FAO (2003) y actualizado con JECFA (2008, 2012), las principales micotoxinas a tener en cuenta, a nivel mundial son las aflatoxinas, la ocratoxina A, los tricotecenos, zearalenona y las fumonisinas. Sin embargo, no hay que descartar otras micotoxinas emergentes como las toxinas de Alternaria, beauvericina, citrinina, patulina, toxinas tremorgénicas, entre otras. Greco y col. (2012) determinaron la presencia de micotoxinas en arándanos argentinos, producidas por especies de Alternaria. Por ello en esta tesis no se ha incluido el estudio de dichas toxinas. Sin embargo, con excepción de este estudio sobre metabolitos de Alternaria, poco se conoce sobre la capacidad de los hongos contaminantes del arándano de producir micotoxinas. II.8.1. Clasificación de las micotoxinas La imposibilidad de clasificar a estos compuestos en forma simple, ha llevado a considerar formas de clasificación que consideran aspectos más refinados tales como, mecanismos moleculares, activación biológica, o estructura química. De acuerdo con esto, el autor japonés Yoshio Ueno, ha clasificado a las toxinas más importantes de acuerdo con su afinidad con las organelas celulares, definiendo entonces, características toxicológicas y transformaciones metabólicas (FAO, 1994). Según este criterio las micotoxinas se clasifican en: a. Inhibidores de la producción de energía: actúan inhibiendo la actividad de la adenosintrifosfatasa (ATPasa), inhibiendo en consecuencia, la fosforilación oxidativa celular. Ej.: citreoviridinas; luteoskirina, ergocromos, etc. b. Inhibidores de síntesis de proteínas: actúan inhibiendo el inicio de la síntesis, tricotecenos tales como verrucarina A, fusarenona-X, nivalenol, etc., o inhibiendo la elongación y terminación de la proteína, tricotecenos tales como deoxinivalenol, crotocina, verruvarol, etc. Otras micotoxinas inhiben en forma competitiva la actividad de la fenilalanil-t RNA sintetasa (Ocratoxina A). c. Modificadores del citoesqueleto: actúan modificando las funciones de los microfilamentos y microtúbulos celulares (griseofulvina, citocalasinas, cloropéptido). 29 d. Micotoxinas estrogénicas: provocan respuestas de crecimiento de masa del útero y de alteración de los niveles circulantes de hormonas (zearalenona). e. Generadores de temblor (tremorgénicas): actúan sobre el sistema nervioso central induciendo temblores generalizados en animales (penitrem A). f. Micotoxinas cancerígenas: provocan desarrollo de tumores en hígado y en corteza renal (aflatoxinas, esterigmatocistina). La clasificación por estructuras químicas similares es la más utilizada actualmente por los analistas, ya que facilita el desarrollo de metodologías analíticas. Sin embargo, han quedado varias micotoxinas fuera de esta clasificación, y se agrupan como toxinas del hongo productor, por ejemplo, toxinas de Fusarium, no mencionadas en otro grupo con similitud estructural (Cole y Cox, 1981). II.8.2. Principales micotoxinas II.8.2.1. Aflatoxinas Los mohos productores de aflatoxinas están muy extendidos por todo el mundo, en climas templados, subtropicales y tropicales, y pueden producir aflatoxinas, tanto antes como después de la cosecha, en numerosos alimentos y piensos, especialmente semillas oleaginosas, nueces comestibles y cereales. Las aflatoxinas químicamente corresponden a derivados isocumarínicos y son producidas por especies pertenecientes al género Aspergillus, donde se destacan Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nomius (Vaamonde y col., 2003). La actividad de agua óptima para la proliferación de A. flavus es alta (alrededor de 0,99). Se ha notificado que A. flavus puede proliferar a temperaturas de 10 a 43°C. La tasa de crecimiento óptima, hasta 25 mm al día, se produce a una temperatura ligeramente superior a 30°C. A. flavus produce aflatoxinas en el intervalo de temperaturas de al menos 15 a 37°C. No es posible especificar una temperatura óptima para la producción de toxinas, aunque se ha notificado que entre 20 y 30°C la producción es considerablemente mayor que a temperaturas más altas y más bajas (Montani y col., 1988; FAO, 2003). Los efectos de la actividad de agua y la temperatura sobre el comportamiento de A. parasiticus son similares a los antes descriptos para A. flavus. Según FAO (2003), se requiere un valor mínimo de actividad acuosa de aproximadamente 0,83 para el 30 crecimiento, y de 0,87 para la producción de aflatoxinas. Se han notificado valores óptimos para el crecimiento y la producción de toxinas de 30 y 28°C, respectivamente. Las aflatoxinas más importantes y estudiadas se pueden clasificar en B1, B2, G1, G2 (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), según su fluorescencia de color azul o verde en presencia de luz ultravioleta a 365 nm. Los derivados B2a y G2a se producen cuando se derivatizan las aflatoxinas B2 y G2 para su cuantificación. En la figura II.13 se pueden observar las estructuras químicas de las distintas aflatoxinas mencionadas. Figura II.13: Estructuras químicas de las aflatoxinas Las principales características y propiedades físicas de estas toxinas se detallan a continuación: Aflatoxina B1: 2, 3, 6a �, 9a �-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3', 2': 4,5] furo [2,3-h] [1]benzo-pirano-1,11-diona. - Forma: cristales - Punto de fusión: 268–269°C - Fluorescencia : azul - UV máx. (etanol): 362 nm - Peso molecular: 312,0633 - Fórmula molecular: C17 H12 O6 31 Aflatoxina B2: 2, 3, 6a, 8, 9, 9a �-hexadidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3',2': 4,5] furo [2,3-h] [1] benzo-pirano-1,11-diona. - Forma: cristales - Punto de fusión: 286–289°C - Fluorescencia : azul - UV máx. (etanol): 363 nm - Peso molecular: 314,0790 - Fórmula molecular: C17H14O6 Aflatoxina G1: 3, 4, 7a, 10a-tetrahidro-5-metoxi-1h, 12h-furo-[3',2': 4,5] furo [2,3-h]- pirano [3,4c] [1]-benzopirano-1,12-diona. - Forma: cristales - Punto de fusión: 244–246°C - Fluorescencia: verde - UV máx. (etanol): 362 nm - Peso molecular: 328,0582 - Fórmula molecular: C17 H12 O6 Aflatoxina G2: 3, 4, 7a, 9, 10, 10a �-hexahidro-5-metoxi-1h, 12h-furo [3',2': 4,5] furo [2,3-h]-pirano-[3,4c] [1]-benzopirano-1,12-diona. - Forma: cristales - Punto de Fusión: 237–240°C - Fluorescencia : verde - UV máx. (etanol): 363 nm - Peso molecular: 330,0739 - Fórmula molecular: C17 H14 O7 Aflatoxina B2a: 2-hidroxi derivado de B2 - Peso molecular: 330,0739 - Fórmula molecular: C17 H14 O7 Aflatoxina G2a: 2-hidroxi derivado de G2. - Peso Molecular: 346,0688 - Fórmula molecular: C17 H14 O8 32 En general, las aflatoxinas presentan las siguientes características: baja solubilidad en agua (10–30 �g/ml); solubles en cloroformo, metanol, acetonitrilo (AcN), acetona; son relativamente inestables al estado de sustancia pura, a la luz y al aire; son susceptibles a la hidrólisis alcalina y son afectadas al tratarse con amoniaco o con soluciones de hipoclorito de sodio (pH>10,5); son termorresistentes y estables en un rango de pH entre 3 y 10. Las aflatoxinas en general son inmunosopresoras. Actúan sobre las membranas celulares, inhibiendo el ADN y la síntesis de ARN; y sobre la incorporación de amino ácidos y fosfolípidos, por lo que alteran el metabolismo de lípidos (Pacin, 2008). AFB1 es uno de los metabolitos encontrados en la naturaleza que ha probado mayor potencialidad como agente cancerígeno (Williams y col., 2011). Es además, mutagénica y tóxica hepática (Pacin, 2008). II.8.2.2. Fumonisinas Se considera a diversas especies del género Fusarium como productores por excelencia de estas toxinas en maíz, entre ellos se destacan, Fusarium verticillioides (anteriormente conocido como F. moniliforme), F. proliferatum, F. subglutinans, F. thapsinum, F. anthophilum y F. globosum (Sanchis y col., 1995; Hinojo y col., 2006; Voss y col., 2007; JECFA, 2012). El Aspergillus niger, ha sido mencionado como productor de fumonisinas FB2 en los cultivos de hongos, café y en vino; y la FB4 en uvas, vinos y pasas (Frisvad y col., 2007; Logrieco y col., 2009, 2011; Mogensen y col., 2010; Knudsen y col., 2011). Fumonisina FB6, junto con FB2 se han determinado en cultivos estacionarios del hongo A. niger NRRL 326 (Mansson y col., 2010; Varga y col., 2010). Las principales características de estas micotoxinas se resumen a partir del último Addendum del JECFA (2012). La estructura química de las fumonisinas (Figura II.14) indica la existencia de un gran número de estereoisómeros. 33 Figura II.14: Estructura química de fumonisinas La fumonisina B1 es el diéster del ácido propano-1,2,3-tricarboxílico y 2S- amino-12S,16R-dimetil-3S,5R,10R,14S,15R-pentahidroxieicosano en el que los grupos hidroxi del C14 y C15 son esterificados con el grupo carboxilo terminal del ácido propano-1,2,3-tricarboxílico; la fumonisina B2 es el análogo desoxi de C10 de fumonisina B1 en el que los centros estereogénicos correspondientes en la columna vertebral de eicosano tienen la misma configuración. La FB1 es la forma molecular predominante producida por F. verticillioides; fumonisina B2 (FB2) y fumonisinas B3 (FB3) son tan activas como FB1 pero aparecen en menor concentración. Las fumonisinas constituyen un grupo numeroso ya que se han descripto y caracterizado 28 hasta el año 2002, los que fueron separados en cuatro familias principales, serie B, C, A y P (Bartók y col., 2010a). Las fumonisinas de la serie B agrupan las más importantes desde el punto de vista toxicológico FB1, FB2 y FB3. Como se mencionó FB1 es predominante y usualmente se encuentra en altos niveles. El cultivo de Fusarium verticicllioides en maíz o en medio líquido permitió identificar que FB1 constituye el 70-80% del total de los fumonisinas producidas, mientras FB2 entre 15-25 % y FB3 3-8 %. La serie A de fumonisinas, aisladas de las cultivos de Fusarium verticillioides y maíz entero, tiene un grupo N-acetil amida en la posición C2. El N-acetil derivado de la FB1 se lo abrevia como FA1 y el derivado de FB2 como FA2, éstas no presentan toxicidad. 34 La serie C, ha sido aislada de maíz mohoso, es químicamente similar a la serie B, excepto que el grupo metilo terminal de C1 falta en las fumonisinas de esta serie. Se ha demostrado la capacidad de F. verticillioides y F. proliferatum para producir simultáneamente los análogos de las series de fumonisinas B y fumonisinas C. Los aislamientos producen 10 veces más análogos de la serie de fumonisinas B que análogos de la serie C. Además, se ha confirmado que algunas cepas de F. oxysporum producen análogos de la serie de fumonisinas C. La serie P de fumonisinas fue aislada de cultivos de F. proliferatum en maíz y contiene el grupo 3-hidroxipiridinio en la posición C2 de la columna vertebral de las fumonisinas, en lugar de la amina que se encuentra en la serie de fumonisinas B. En el año 2006 se detectaron 37 nuevas fumonisinas y fueron agrupadas en su mayoría en las series anteriores, pero se descubrió una nueva serie denominada FBX (Bartók y col., 2006, 2008). La serie FBX es esterificada por otros ácidos carboxílicos diferentes al ácido tricarbálico (oxalsuccinico, cis-aconítico, oxalilfumárico). Además de la serie B algunos otros análogos pueden ocurrir en el maíz contaminado naturalmente a bajas concentraciones (<5 % del total de las fumonisinas presentes); pero se debe tener en cuenta que éstas formas, solo pueden ser detectadas por cromatografía líquida - espectrometría de masa con ionización por electrospray. En el 2010 se describieron nuevos compuestos pertenecientes a las fumonisinas, apolares, por lo tanto se supone que la absorción y toxicidad en los diferentes tejidos de seres vivos puede ser distinta a los anteriores. Los nuevos compuestos se denominan por ejemplo para la toxina FB1 esterificada EFB1, y se les ha sugerido los nombres PA EFB1 cuando esta esterificada con ácido palmítico (PA), iso-iso-EFB1 PA, EFB1 LA (ácido linoleico), la iso-EFB1, EFB1 OA (ácido oleico) e iso-EFB1 OA (Bartók y col., 2010b). La cantidad total de estos nuevos compuestos se estima componen el 0,1% de la concentración de FB1. La toxina FB1 cuenta con 10 centros quirales, por lo tanto teóricamente, pueden ser producidos 1024 estereoisómeros. Se han aislado ya 28 estereoisómeros de FB1 y los métodos tradicionales por HPLC y FLD podrían detectar estos estereoisómeros. El análisis de varios batch de estándares de FB3 obtenidos de distintos lotes de F. verticillioides ha presentado 10 a 40% del estereoisómero de FB3 (3-epi-FB3). Mogensen y col. (2009) mostraron que la producción de fumonisinas es diferente para A. niger en comparación con cepas de Fusarium productoras. Las cepas de Fusarium prefieren altas actividades acuosas (aw > 0,99) y bajas temperaturas (20- 35 25°C). A. niger prefiere menores aw y mayores temperaturas (25-30°C). La producción de fumonisinas por A. niger genera la necesidad de estudiar la capacidad de producción de cepas de esta especie ya que es comúnmente encontrada como contaminante en numerosos alimentos. Las fumonisinas debido a que son compuestos fuertemente polares, son solubles
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