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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las almohadillas nupciales de los anfibios anuros:
un estudio histológico y ultraestructural de una sinapomorfía muy antigua.

Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLOGICAS

María Celeste Luna

Director de tesis: Julián Faivovich
Consejero de Estudios: Julián Faivovich

Lugar de trabajo: Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia”

Buenos Aires, 2018

ADVERTENCIA NOMENCLATURAL: Los cambios taxonómicos aquí
presentados, incluyendo nuevos taxa, nuevas combinaciones y sinónimos, no son
válidos como actos nomenclaturales y no están disponibles, en concordancia con el
Articulo 8.3 del Código Internacional Zoológico.

Las almohadillas nupciales de los anfibios anuros:
Un estudio histológico y ultraestructural de una sinapomorfía muy antigua.

RESUMEN
Los caracteres sexuales secundarios son rasgos que a pesar de no estar directamente
involucrados en la fecundación, tiene una gran importancia en la biología reproductiva de
múltiples especies. Las almohadillas nupciales constituyen caracteres sexuales secundarios en los
anfibios anuros. Están formadas por modificaciones en los tejidos epidérmicos y dérmicos, y
usualmente se encuentran dispuestas en el primer digito de la mano de los machos.
En esta tesis relevamos la composición estructural y la diversidad de almohadillas
nupciales, basándonos en un muestreo a gran escala de la diversidad morfológica y filogenética
existente. Nuestros resultados muestran que las almohadillas nupciales están caracterizadas por
la presencia de glándulas mucosas especializadas en el componente dérmico. Pudimos observar
también, la co-ocurrencia de otros tipos glandulares en algunas especies, y caracterizamos la
histoquímica de estas glándulas en todas las especies estudiadas. Sobre la base de la ocurrencia y
composición del componente epidérmico, describimos tres morfologías primarias de
almohadillas nupciales: (A) Almohadillas nupciales con proyecciones epidérmicas papilares
(PEPs o papilas), en donde las proyecciones epidérmicas están formadas por la evaginación de la
dermis y epidermis; (B) Almohadillas nupciales con proyecciones epidérmicas no papilares
(PENPs), en donde las proyecciones epidérmicas no presentan un núcleo dérmico formando la
papila; y (C) Almohadillas nupciales sin proyecciones epidérmicas, en donde las almohadillas no
presentan modificaciones epidérmicas pero presentan un engrosamiento del componente dérmico
con respecto a la piel adyacente.
Como parte de la comprensión del origen de este este sistema de caracteres, también
comparamos las almohadillas nupciales con estructuras similares reportadas en urodelos,
encontrando múltiples diferencias en su estructura dérmica y epidérmica.
Realizamos un análisis comparativo de las almohadillas nupciales con otros caracteres
sexualmente dimórficos presenten en anfibios, y discutimos acerca de la diversidad morfológica,
coloración, control hormonal, uso como carácter taxonómico y rol en la reproducción de las
almohadillas nupciales, estableciendo hipótesis de homología a utilizar en futuros estudios
filogenéticos.
Finalmente optimizamos varias de las hipótesis de homología propuestas dentro de las
hipótesis filogenéticas más recientes de los grandes clados de anuros con el objetivo de estudiar
las transformaciones más importantes de este sistema de caracteres en la historia evolutiva de los
anfibios anuros.

Palabras claves: almohadillas nupciales, histología, caracteres sexuales secundarios, glándulas
especializadas, anuros.

The nuptial pads in anuran amphibians: a histological and ultrastructural study of an
ancient synapomorphy

ABSTRACT
The secondary sexual characters are features that are not directly involved in fertilization
but have a great importance in the reproductive biology path of several species. The nuptial pad
is a secondary sexual character found in anuran amphibians. It includes modified epidermal and
dermal tissues and usually is located on the first digit of the hand of males.
In this thesis, we review the structure and diversity of nuptial pads based on a large-scale
sample of morphological and phylogenetic diversity. Our findings show that all nuptial pads are
characterized by the presence of specialized mucous glands in the dermal component. We also
report the co-occurrence of other types of glands in some species and characterize their
histochemistry in all species studied. On the basis of the occurrence and structure of the
epidermal component, we describe three primary nuptial pad morphologies: (A) Nuptial pads
with papillary epidermal projections (PEPs, or simply, papillae), in which epidermal projections
formed by the epidermis and a dermal evagination are present; (B) Nuptial pads with non-
papillary epidermal projections (NPEPs), in which the epidermal projections lack a dermal core
forming a papilla; and (C) Nuptial pads without epidermal projections, which lack projections
but have a slight thickening of the dermal area with respect to the adjacent skin.
In order to understand the evolutionary history of this character, we also compared
nuptial pads with the ones reported in urodeles, finding several structural differences, on both
epidermal and dermal strata.
We compare nuptial pads with other secondary sexual traits as well, and discuss several
related topics, including morphological diversity, coloration, hormonal control, use as a
taxonomic character, their role in reproduction, stablishing homology hypothesis to be applied in
future phylogenetical studies.
Finally, we optimized several homology hypotheses in the most recent phylogenetical
hypotheses of the larger clades of anurans with the aim to study the most important
transformations of this character system in the evolutional history of anuran amphibians.

Key words: nuptial pads, histology, secondary sexual characters, specialized glands, anurans.
AGRADECIMIENTOS

Quería agradecer a la Universidad de Buenos Aires y en particular a la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales por posibilitar mi formación académica, pero mucho más importante por ser
el espacio donde conocí a mis amigos y por primera vez me sentí parte.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, al Instituto Smithsoniano y la
Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por las becas y los subsidios otorgados
(Beca CONICET, Smithsonian predoctoral fellowship, PICT 404/2013, 820/2015).
Al Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” (MACN) y al Museo
Nacional de Historia Natural (NMNH) por permitir la realización de esta investigación. En
particular a Fabián Tricárico (MACN) y a Scott Whittaker (NMNH) por la asistencia técnica en
los procedimientos de microscopia electrónica de barrido. A Helen Wimer (NIH), Lynne Parenti
(NMNH), y Cristian Ituarte (MACN) por el acceso a los laboratorios de histología. A Isabel
Farias por la preparación de las muestras de microscopia electrónica de transmisión. A Darrel R.
Frost, Christopher Raxworthy, y David Kizirian (AMNH), Celio F. B. Haddad (CFBH), Robert
F. Inger y Alan Resetar (FMNH), Jose P. Pombal Jr. (MNRJ), y Taran Grant (MZUSP) por
autorizar el acceso a las colecciones herpetológicas y permitir los préstamos de especímenes. Al
staff del NMNH y del MSC, especialmente a Kevin de Queiroz, Jeremy Jacobs, Kenneth Tighe,
Robert Wilson, Addison Wynn y David Johnson por la asistencia y el acceso a los laboratorios
durante mi estadía en Washington D.C.
A la División de Herpetología del MACN, por ser mi casa desde hace tantos años. A todos los
integrantes de esta familia, y a todos los que pasaronpor esta casa, por todos los momentos
compartidos y su constante apoyo. En particular al Dr. Julián Faivovich por permitirme la
oportunidad de realizar mi tesis de Licenciatura y luego la realización de este doctorado. Por
confiar en mi y por ayudarme a concretar esta meta tan importante para mi.

A Sebastián Grimaudo, por darme la oportunidad de transitar el camino de la educación y
ayudarme a aprender a enseñar.
A Escuela de Animales, por regalarme este espacio y por hacerme sentir parte de un proyecto tan
hermoso como este. Por darme la oportunidad de crecer y aprender día a día de cada uno de
ustedes. Los quiero.
A todas las personas que me ayudaron a poder finalizar esta tesis. A Perz por leer y aportar a mi
manuscrito el cual constituyó el primer capítulo de esta tesis, pero más que nada por ser un
amigo y referente. A Agus por editar los arboles más extensos de la historia y por siempre querer
calmar mis ansiedades. A Seba por mis mates favoritos y a Lau por todas las charlas y por
siempre querer que este bien. A Katy por caminar conmigo esta tesis. Por todas las palabras de
aliento, por todos los mensajes, audios, gifs y fotos a cualquier hora de la noche, en todo
momento, para ayudarme a no bajar los brazos. Gracias por el aguante y por tu amistad.
A todos mis amigos. A los cercanos por todas las charlas y por todo el apoyo. Por los encuentros
en donde se habla de la tesis, y también por todos esos otros en donde la regla es no hablar de
eso! A los lejanos (solo en distancia), por todos sus mensajes de aliento que siempre ayudan a
seguir y a ver la meta más cerca.
A Berny por escucharme constantemente hablar de la tesis. Por siempre alentarme y brindarme
tu sonrisa. Por aparecerte en mi camino cuando estoy pensando en vos (aunque no me creas que
eso paso). Gracias por tu amistad.
A Andrés y Carlos por dejarme ser parte de las campañas más memorables de mi vida. A Fabro,
por siempre preguntar y alentar. A los tres, por todos los consejos, pero más que nada por ser
grandes amigos. Por todas las risas, por todas las frustraciones, por todo lo vivido y por las
mejores trasnoches entre historias y asados quemados. Porque sin importar los caminos que
andemos y las distancias kilométricas, este cariño crece y se afianza. Gracias.
A mis Biolocas, Eli, Ivi, Lily, Lu y Mari. Por ser incondicionales. Por todo el amor que me dan
cada día. No puedo poner en palabras lo agradecida que me siento de tenerlas como amigas. Por
todos los momentos compartidos. Porque con solo verlas ya soy feliz. Porque van pasando los
años y este lazo sigue creciendo y cada vez se hace más fuerte y puro. Las amo.
A Fabio por ser mi compañero de vida y por transitar esta etapa tan estresante a mi lado. Gracias
por ser tan comprensivo y por brindarme tu ayuda y tu dulzura constante. Por quedarte
literalmente a mi lado estos últimos días, por ayudarme en todo (desde hacer una comida a darme
un abrazo muy fuerte cuando lo necesitaba). Gracias por “leerme” así de bien. Por intentar
disminuir mi locura con tu amor. Te amo fofito.
A mi familia por todo el apoyo y por todo su amor. A Gi por ser mi hermana y mi amiga. Gracias
por siempre siempre generar espacios para vernos y compartir. A Thiago por toda su dulzura y su
amor. Por compartir todos tus chistes que siempre me sacan una sonrisa y también por todas tus
curiosidades que acrecientan mis ganas de aprender. Por brindarle a esta familia la mejor de las
compañías. A Mama por ser mi mama, con todo lo que eso implica. Por todo tu amor y por
siempre siempre siempre preocuparte y querer que sea feliz. Los amo.

Índice
Capítulo 1. Estructura y diversidad de almohadillas nupciales en anuros.
1. Introducción ................................................................................................................................. 1
2. Materiales y Métodos ................................................................................................................... 5
2.1.Especímenes .................................................................................................................................. 5
2.2.Terminología .................................................................................................................................. 5
2.3.Microscopia óptica ........................................................................................................................ 6
2.4.Microscopia electrónica de barrido ............................................................................................... 6
2.5.Microscopia electrónica de transmisión ........................................................................................ 7
2.6.Procedimientos histológicos .......................................................................................................... 7
3. Resultados ...................................................................................................................................... 8
3.1.Estructura de las almohadillas nupciales ....................................................................................... 8
3.1.1. Componente dérmico .............................................................................................................. 8
3.1.2. Componente epidérmico ....................................................................................................... 10
A. Almohadillas nupciales con proyecciones epidérmicas papilares o papilas .......................... 10
B. Almohadillas nupciales únicamente con proyecciones epidérmicas no papilares ................. 13
C. Almohadillas nupciales únicamente sin modificaciones epidérmicas ................................... 14
3.1.3. Morfología y posición de los poros de las glándulas sexualmente dimórficas ...................... 14
3.1.4. Coloración ............................................................................................................................ 15
3.1.5. Comparación de las ANs con otras estructuras sexuales secundarias ................................... 15
3.1.6. Distribución espacial de las almohadillas nupciales ............................................................. 17
4. Discusión ..................................................................................................................................... 18
4.1.El componente dérmico .............................................................................................................. 18
4.2.El componente epidérmico .......................................................................................................... 21
4.2.1. Coloración y cornificación ................................................................................................... 21
4.2.2. Otras estructuras cornificadas en anuros ............................................................................... 25
4.3.Almohadillas nupciales en hembras ............................................................................................ 26
4.4.Comparación con almohadillas nupciales en caudados ............................................................... 27
4.5.Control hormonal ........................................................................................................................ 28
4.6.Las almohadillas nupciales como carácter taxonómico ............................................................... 32
4.7.Rol en la reproducción– Roles variables en el amplexo? ............................................................. 37
5. Referencias .................................................................................................................................. 48
Capítulo 2. Almohadillas nupciales en caudados y anuros basales
1. Introducción ...............................................................................................................................67
1. Almohadillas nupciales en Caudata ............................................................................................ 67
2. Almohadillas nupciales en anuros basales y Anomocoela .......................................................... 69
3. Objetivos .................................................................................................................................... 70
2. Materiales y Métodos ................................................................................................................. 71
1. Especímenes ............................................................................................................................... 71
2. Terminología y técnicas de análisis ............................................................................................ 71
3. Optimización de caracteres ......................................................................................................... 71
3. Resultados ................................................................................................................................... 73
1. Almohadillas nupciales en caudados .......................................................................................... 73
2. Análisis estructural en caudados ................................................................................................ 74
3.2.1. Estructuras cornificadas en los extremos de deos manuales y pedales .................................... 74
3.2.2. Estructuras cornificadas cubriendo diferentes áreas de la piel ................................................. 75
3. Diversidad de almohadillas nupciales en anuros basales............................................................. 80
3.3.1. Ascaphidae .............................................................................................................................. 80
3.3.2. Leiopelmatidae ........................................................................................................................ 81
3.3.3. Bombinatoridae ....................................................................................................................... 81
3.3.4. Alytidae ................................................................................................................................... 83
3.3.5. Rhinophrynidae ....................................................................................................................... 84
3.3.6. Pipidae ..................................................................................................................................... 85
3.3.7.Scaphiopodidae ........................................................................................................................ 87
3.3.8.Pelodytidae ............................................................................................................................... 89
3.3.9.Pelobatidae ............................................................................................................................... 90
3.3.10.Megophryidae ........................................................................................................................ 91
4. Hipótesis de homología .............................................................................................................. 94
5. Optimización de caracteres en anuros basales y Anomocoela................................................... 109
4. Discusión ................................................................................................................................... 110
1. Caudados .................................................................................................................................. 110
4.1.1.Composición estructural de las AN en caudados .................................................................... 110
4.1.2.Biología reproductiva y control hormonal .............................................................................. 112
4.1.3.Otros caracteres sexualmente dimórficos en caudados ........................................................... 113
2. En qué grupo evolucionaron por primera vez las almohadillas nupciales ................................. 114
3. Anuros basales y Anomocoela .................................................................................................. 115
4.3.1.Evolución de las AN en anuros .............................................................................................. 115
4.3.2.Área de cobertura de las ANs ................................................................................................. 116
4.3.3.Ocurrencia y morfologíade las proyecciones epidérmicas ...................................................... 117
4.3.4.Coloración .............................................................................................................................. 119
4.3.5.Componente dérmico ............................................................................................................. 120
4.3.6.Otros caracteres sexuales secundarios en anuros basales y Anomocoela ................................ 120
4.3.7.Biología reproductiva ............................................................................................................. 122
4.3.7.1.Coocurrencia de almohadillas nupciales y cuidado parental paterno, ¿una explicacion
mecanistica? .................................................................................................................................... 125
5. Referencias ............................................................................................................................... 129
Capítulo 3. Almohadillas nupciales en Notogaeanura (Neobatrachia)
1. Introduccón ............................................................................................................................. 144
1.1. Almohadillas nupciales en Neobatrachia ................................................................................. 144
1.2.Objetivos ................................................................................................................................... 145
2. Materiales y Métodos.............................................................................................................. 146
2.2.Terminología y técnicas de análisis ........................................................................................... 146
2.3.Optimización de caracteres........................................................................................................ 146
3. Resultados ............................................................................................................................... 147
3.1.Almohadillas nupciales en Notogaeanura ................................................................................. 147
3.1.1.Calytpocephalellidae .............................................................................................................. 147
3.1.2.Myobatrachoidea .................................................................................................................... 148
3.1.3.Brachycephaloidea ................................................................................................................. 152
3.1.4.Hemiphractidae ...................................................................................................................... 157
3.1.5.Ceratophridae ......................................................................................................................... 159
3.1.6.Odontophrynidae .................................................................................................................... 160
3.1.7.Rhinodermatidae .................................................................................................................... 161
3.1.8.Telmatobiidae .........................................................................................................................162
3.1.9.Cycloramphidae ..................................................................................................................... 163
3.1.10.Hylodidae ............................................................................................................................. 164
3.1.11.Batrachylidae........................................................................................................................ 166
3.1.12.Alsodidae ............................................................................................................................. 167
3.1.13.Hylidae ................................................................................................................................. 168
3.1.14.Leptodactylidae .................................................................................................................... 181
3.1.15.Allophrynidae ....................................................................................................................... 184
3.1.16.Centrolenidae ....................................................................................................................... 184
3.1.17.Dendrobatoidea .................................................................................................................... 187
3.1.18.Bufonidae ............................................................................................................................. 188
3.2.Grupos externos I ...................................................................................................................... 193
3.2.1.Heleophrynidae ...................................................................................................................... 193
3.2.2.Nasikabatrachidae .................................................................................................................. 194
3.2.3.Sooglossidae ........................................................................................................................... 195
3.3.Grupos externos II ..................................................................................................................... 195
3.3.1.Brevicipitidae ......................................................................................................................... 195
3.3.2.Hemisotidae ........................................................................................................................... 195
3.3.3.Arthroleptidae ........................................................................................................................ 196
3.3.4.Hyperoliidae ........................................................................................................................... 196
3.3.5.Microhylidae .......................................................................................................................... 197
3.3.6.Ptychadenidae ........................................................................................................................ 198
3.3.7.Micrixalidae ........................................................................................................................... 198
3.3.8.Phrynibatrachidae ................................................................................................................... 198
3.3.9.Conrauidae ............................................................................................................................. 198
3.3.10.Petropedetidae ...................................................................................................................... 199
3.3.11.Pyxicephalidae ..................................................................................................................... 199
3.3.12.Ceratobatrachidae ................................................................................................................. 200
3.3.13.Nyctibatrachidae................................................................................................................... 200
3.3.14.Ranixalidae ........................................................................................................................... 200
3.3.15.Dicroglossidae ...................................................................................................................... 201
3.3.16.Ranidae................................................................................................................................. 201
3.3.17.Rhacophoridae ...................................................................................................................... 202
3.3.18.Mantellidae ........................................................................................................................... 202
3.4.Hipótesisde homología propuestas ............................................................................................ 203
3.5.Optimización de caracteres en Notogaeanura ............................................................................ 203
4. Discusión .................................................................................................................................. 204
4.1.Evolución de las AN en Notogaeanura ...................................................................................... 204
4.2.Áreade cobertura de las ANs ..................................................................................................... 206
4.3.Diferenciación del componente epidérmico con respecto a la epidermis adyacente .................. 206
4.4.Morfología de las proyecciones epidérmicas ............................................................................. 207
4.5. Coloración ................................................................................................................................ 208
4.6.Componente dérmico ................................................................................................................ 208
4.7.Biología reproductiva ................................................................................................................ 209
4.8.Relación entre la ocurrencia de ANs con el cuidado parental .................................................... 216
Conclusiones generales a la tesis .................................................................................................. 219
5. Referencias ............................................................................................................................... 222

Capítulo 1. Estructura y diversidad de
almohadillas nupciales en anuros
Capítulo 1

1. INTRODUCCIÓN

Los caracteres sexuales secundarios en anfibios han llamado la atención en la
comunidad científica por muchos años. Los estudios primarios en biología reproductiva
y morfología han enfocado su atención en la estructura de la cola de los caudados, los
cambios en coloración durante el periodo reproductivo, los sacos vocales y las
almohadillas nupciales (ej., Swammerdam, 1737; Rösel von Rosenhof, 1758; Rusconi,
1821), junto a otros caracteres que fueron identificados prosteriormente (e.j., Noble,
1931; Liu, 1936; Conaway & Metter, 1967). Todas estas caracterisiticas, las cuales se
hacen evidentes durante la etapa reproductiva se conocen como caracteres sexuales
secundarios (CSSs) e incluyen cual diferencia entre los sexos que no este relacionada
con el desarrollo gonadal y sus ductos (Darwin, 1871; Turner & Bagnara, 1976; Sever
& Staub, 2011). Dentro de los anuros el carácter sexualmente dimórfico mayormente
reportado son las almohadillas nupciales (ANs). Su presencia, y menos frecuente,
algunos comentarios sobre su estructura macroscópica, son comúnmente incluidos
como información estándar en las descripciones taxonómicas. Aun así, las referencias
de la presencia de ANs en la literatura taxonómica se encuentranlejos de reflejar
conocimientos acerca de su estructura, diversidad y rol en la biología reproductiva.
Aunque los primeros estudiosos de la biología de los anuros reportaron la presencia o
ausencia de almohadillas nupciales en los anuros (por ejemplo, Swammerdam, 1737;
Rösel von Rosenhof, 1758), Lataste (1876) fue el primero en estudiar y describir en
detalle las ANs de las especies de anuros europeos reconocidas hasta ese momento.
Proporcionó un análisis histológico que se centró en las estructuras epidérmicas y
definió diferentes morfologías (Tabla 1). Leydig (1877) y Boulenger (1897)
describieron y esquematizaron en detalle la distribución de almohadillas a lo largo de
las manos de anuros europeos, Ecker & Wiedersheim (1882) y Gaupp (1904)
proporcionaron una descripción histológica exhaustiva de las almohadillas nupciales de
Pelophylax kl. esculentus, mientras que Kändler (1924) describió la histología de las
almohadillas en varias otras especies europeas. Noble (1931) también describió la
presencia y la diversidad de almohadillas nupciales en muchos anuros, como lo hizo Liu
(1936) en su estudio de caracteres sexualmente dimórficos en anuros de China.
Desde la década de 1920 y hasta el día de hoy, se continúan realizando
contribuciones acerca de las almohadillas nupciales de diversas especies, centrándose
principalmente en los cambios histológicos asociados con los ciclos de andrógenos (ej.,
Capítulo 1

Aron, 1926; Horié, 1939; Greenberg, 1942; Inger & Greenberg, 1956; Lofts, 1964;
Rastogi, 1976; Izzo et al., 1982, Epstein & Blackburn, 1997; Yang, Zhang y Cui, 2004).
Parakkal & Ellis (1963) describieron la almohadilla nupcial en Rana pipiens (Ranidae),
utilizando la histología y, por primera vez, la Microscopía Electrónica de Transmisión
(MET). Komnick & Stockem (1970) y Kurabuchi & Inoue (1981) fueron los primeros
investigadores en estudiar el componente epidérmico de las almohadillas nupciales
mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) en Xenopus laevis (Pipidae). Este
tipo de análisis fue seguido por Zweifel (1983) y Tyler & Lungerhausen (1986) en la
superficie de las almohadillas nupciales de algunas especies de hylidos, limnodynastes y
pelodryadines usando MEB, y por Kurabuchi (1993, 1994) en hylidos, ranidos y
rhacophoridos usando MEB y MET. Estos autores definieron varias morfologías,
observando la variación interespecífica en el número de células que formaban cada
proyección y la densidad de las proyecciones. Thomas et al. (1993) agregaron datos
histológicos e histoquímicos para 14 especies con glándulas sexualmente dimórficas
(GSD), y Brizzi et al., (2003a) revisaron la información disponible sobre el componente
dérmico de las almohadillas nupciales en ese momento. La morfología en algunos
ranidos y bombinatoridos fue estudiada por Brizzi, Delfino & Jantra (2003b) y
Kyriakopoulou-Sklavounou et al., (2012). Se puede consultar la Tabla 1 para conocer
algunos ejemplos de la terminología utilizada para describir la morfología de las
almohadillas nupciales.
En el contexto de varios estudios taxonómicos y sistemáticos, la aparición de
almohadillas nupciales y la morfología también se han estudiado externamente con
diferentes niveles de detalle en varios grupos (por ejemplo, Parker, 1934, 1940; Wright
&Wright, 1949; Inger, 1966; Duellman, 1970; Lynch, 1971; Tyler, 1968; Tyler &
Davies, 1978; Scott, 2005; Grant et al., 2006; Cisneros-Heredia & McDiarmid, 2007;
Duellman & Lehr, 2009; Barrionuevo, 2017). Unos pocos estudios, centrados en grupos
específicos, realizaron análisis más detallados. En una tesis de maestría inédita, Wray
(2000) examinó las almohadillas nupciales de los géneros de hylidos Duellmanohyla y
Ptychohyla. Wray, estudió la morfología de las almohadillas externamente mediante
MEB, informando las variaciones encontradas, la densidad de las proyecciones,
ubicación y densidad y tipos de poros glandulares. Cisneros-Heredia & McDiarmid
(2007) proporcionaron una clasificación revisada de almohadillas nupciales en
Centrolenidae, teniendo en cuenta estudios previos (por ejemplo, Flores, 1985,
Ayarzagüena, 1992, Lynch & Ruiz-Carranza, 1996, Tabla 1). Luna et al. (2012)
Capítulo 1

estudiaron la diversidad de almohadillas nupciales en 26 especies de phyllomedusines
(Hylidae) utilizando MEB y procedimientos histológicos. Aunque la mayoría de estas
contribuciones son relevantes para los grupos que cubren, la mayoría de los
investigadores no estudiaron las almohadillas nupciales usando histología, dejando así
la variación estructural del estrato dérmico desconocida.
Otros caracteres sexuales secundarios, al menos superficialmente similares a
almohadillas nupciales se han descrito en la mano y otras partes del cuerpo, como el
antebrazo (ej., Bombina, Bombinatoridae, Leydig, 1877), brazo superior (ej.,,
Hyloscirtus armatus group, Hylidae ; Duellman et al., 1997; Faivovich & De la Riva,
2006), región pectoral (ej., Algunas o todas las especies de los géneros Alsodes
[Alsodidae], Boophis [Mantellidae], Hoplophryne [Microhylidae], Insuetophrynus
[Rhinodermatidae], Leptodactylus [Leptodactylidae], Leptodactylodon [Arthroleptidae],
Nanorana, Quasipaa [Dicroglossidae], Oreolalax, Scutiger [Megophryidae],
Telmatobius [Telmatobiidae], Barbour & Loveridge, 1928; Liu, 1936; Heyer, 1969;
Barrio, 1970; Lynch, 1978; Blommers-Schlösser, 1979; Amiet, 1981; Nguyen et al.,
2013; Barrionuevo, 2017), labio superior (Leptobrachium, Megophryidae, Liu, 1950),
mandíbula inferior (ej., Ascaphus, Ascaphidae; Noble & Putnam, 1931) , e incluso en
los dedos de los pies (ej., Bombina, Leydig, 1877). La mayoría de estos caracteres han
sido tratados simplemente como almohadillas nupciales desarrolladas en áreas
corporales distintas de las manos (Duellman & Trueb, 1986), o incluso estados dentro
de la misma serie de transformación de almohadillas nupciales (ej., las "espinas del
pulgar" en Leptodactylus; Heyer , 1998; Ponssa, 2008).
Las hipótesis sobre el rol biológico de las almohadillas nupciales en los anuros son
probablemente tan antiguas como sus primeros informes (Swammerdam, 1737), y la
mayoría de las ideas giran en torno a un incremento en la fuerza del macho en el
momento de agarre de la hembra durante el amplexo, aunque por diferentes motivos.
Algunos autores señalaron la dificultad del macho que sostiene a la hembra durante el
amplexo acuático (Lataste, 1876; Boulenger, 1897, 1910, 1912; Noble, 1931; Parker,
1940; Duellman &Trueb, 1986; Brizzi et al., 2003a), mientras que otros enfatizaron la
necesidad de evitar que el macho fuera desplazado por los machos competidores
(Savage, 1932, 1934, 1961, Wells, 1977, 2007). Thomas et al. (1993) fueron los
primeros autores en sugerir que las GSDs de las almohadillas nupciales también podrían
tener una función secretora de feromonas.
Capítulo 1

En este capítulo, presentamos la diversidad morfológica y estructural de las
almohadillas nupciales en anuros basados en morfología externa, microscopía
electrónica e histología, y comparamos estos resultados con otros CSDs y otras
estructuras cornificadas en anuros. Sobre la base de estos datos, y junto a la revisión de
toda la literatura relevante disponible, presentamos una discusión sobre la estructura, la
diversidad y la función de las almohadillas nupciales en la biología reproductiva de los
anuros.

Capítulo 1

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Especímenes

Examinamos 1145 machos adultos de 507 especies que representan 250 géneros de
52 familias de anuros; constituyendo el muestreo más inclusivo y representativo de las
almohadillas nupciales de anuros (Apéndice). Como resultado de estas observaciones
preliminares, seleccionamos 258 especímenes de 212 especies para histología y
microscopia electrónica de barrido (MEB). Este subconjunto representa 139 géneros y
46 familias.También examinamos otras ares del cuerpo en donde se observan caracteres
sexuales secundarios (espinas pectorales, espinas de la mandíbula inferior y
modificaciones cornificadas en el dedo II y el pecho). Para comprender los niveles de
variación intraespecífica, analizamos más de un macho en varias especies. Cuando fue
posible, seleccionamos especímenes en condiciones reproductivas activas, evidenciados
por la presencia de sacos vocales parcialmente dilatadas. Los códigos de colección
institucional son los recomendados por Sabaj (2016).

2.2. Terminología

A lo largo de este trabajo empleamos la terminología de Thomas et al. (1993) donde
las "breeding glands" de Anura se definen como glándulas sexualmente dimórficas
(GSDs). Seguimos las recomendaciones de Altig (2007) y Bragulla & Homberger
(2009) y distinguimos la queratinización de la cornificación. La queratinización implica
la diferenciación del epitelio (queratinocitos) junto con la síntesis de filamentos y
proteínas de queratina; puede ser un producto de una sola célula (por ejemplo, dientes
labiales de renacuajos) o muchas células (por ejemplo, dientes de mandíbulas de
renacuajos, garras). El proceso de cornificación requiere la queratinización previa de las
células e involucra células muertas y queratinizadas (corneocitos) conectadas por
desmosomas en el estrato córneo, y la síntesis de proteínas asociadas a filamentos de
queratina (KAPs, sigla en inglés para Keratin Associated Proteins), que se conectan con
los filamentos de queratina a través de enlaces disulfuro. En el caso particular de la
epidermis de los anfibios, las células de la capa cornificada aún retienen su núcleo
(paraqueratosis). El término pigmentación se usa cuando hay evidencia de células
Capítulo 1

pigmentarias (cromatóforos) que constituyen un patrón de coloración (Bagnara &
Matsumoto, 2007). Los dedos están numerados II-V (Fabrezi & Alberch, 1996).
La mayoría de las almohadillas nupciales incluyen elevaciones que tienen diferentes
nombres en la literatura (consulte la Tabla 1). Luna et al. (2012) introdujeron el término
"proyección epidérmica/s" (PE/PEs) para referirse a estas estructuras en un intento de
proporcionar un término neutral que no implique nada sobre su estructura histológica. A
lo largo de esta tesis estamos adoptando este término, pero sobre la base de nuestros
resultados estamos introduciendo mejoras adicionales (Ver RESULTADOS).

2.3.Microscopía óptica

El análisis morfológico y estructural de almohadillas nupciales se realizó bajo un
microscopio estereoscópico de disección Nikon SMZ 800. Las fotografías fueron
tomadas usando el software Micrometrics1SE Premium 4 o la cámara Sony RX-100.
Las imágenes de alta resolución de algunas muestras se hicieron con un
estereomicroscopio Zeiss V20. Las secciones histológicas se estudiaron con un
microscopio Nikon Eclypse 200 y se documentaron utilizando una cámara Nikon DS-
Fi1 con el software NIKON NIS-Elements D. Las mediciones se realizaron utilizando el
software ImageJ (Rasband, 1997-2016, https://imagej.nih.gov/ij/).

2.4.Microscopio electrónico de barrido (MEB)

Las muestras se fijaron en una solución al 10% de formaldehído y se almacenaron en
etanol al 70%. Las almohadillas nupciales se retiraron, y se deshidrataron a través de
una serie ascendente de etanol hasta 100%. Se sometieron a un secador de punto crítico
de (EMS 850 y 030 Baltec CPD), fueron recubiertas con oro: paladio (40:60) (SC 7620
Mini Sputter Coater Termo VG Scientific y Cressington Sputter Coater 108A), y
enviadas para MEB usando un microscopio Philips XL30 TMP New Look. Algunas
muestras fueron montadas en las secciones transversales con el fin de obtener imágenes
de la porción secretora de las glándulas y la morfología de las ANs de perfil; mientras
que otras muestras tenían la epidermis hacia arriba para facilitar la visualización
microscópica de la morfología externa del área de la almohadilla nupcial, ductos
glandulares, y la densidad y ornamentación de las proyecciones. En algunos
Capítulo 1

especímenes también se removió el estrato córneo para revelar la estructura epidérmica
subyacente.

2.5.Microscopía electrónica de transmisión (MET)

Pequeñas muestras de regiones de almohadilla nupcial se fijaron con glutaraldehído
al 2% y paraformaldehído al 4% en 0,1 mol l-1 buffer fosfato de Sorensen (pH 7,2)
durante 6 horas a 48ºC. Las muestras se enjuagaron en 0,1 mol l-1 de buffer fosfato y se
fijaron posteriormente durante 1 h en 1% de OsO4 en el mismo buffer. Las muestras se
deshidrataron y se incrustaron en resina de araldita. Las secciones semifinas (1 μm) se
tiñeron con azul de toluidina al 1% en Na2CO3 al 1% y se examinaron con un
microscopio óptico. Las secciones ultrafinas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato
de plomo (Reynolds, 1963), y se observaron con un microscopio electrónico de
transmisión Jeol JEM 1200EX II a 60 KeV. Las imágenes se grabaron con una cámara
digital ES500W Erlanshen CCD Gatan.

2.6.Procedimientos histológicos

Las muestras se deshidrataron en una serie ascendente de etanol, se aclararon en
tolueno y se embebieron en Paraplast. Todas las muestras se seccionaron a 5-6 μm y se
tiñeron con Tricrómico de Masson modificado para describir la morfología general de
las almohadillas (Goldner, 1938). Los estudios técnicos histoquímicos se realizaron
usando tinción estándares incluyendo Alcian Blue (AB), pH 2,5 (Bancroft, 2002) para
glicoconjugados ácidos y ácido periódico de Schiff (PAS) para glicoconjugados neutros,
utilizando Hematoxilina como contraste (Bancroft, 2002). Para algunas muestras, se
realizó la tinción Alcian Blue con ácido perfórmico (PAAB) para revelar sulfuros unido
a proteínas (Bancroft, 2002). Una selección de muestras fue tratada con peróxido de
hidrógeno al 10% por 48hs. para determinar la naturaleza de las coloración de las
almohadillas nupciales de coloración oscura (modificado de Liu et al., 2013). Las
propiedades histoquímicas de las glándulas se registraron como positiva (+), negativa
(-) o equívoca (±) para evitar los efectos de la variación en la historia de fijación de los
especímenes.

Capítulo 1

3. RESULTADOS
3.1.Estructura de las almohadillas nupciales
Las almohadillas nupciales (ANs) son áreas de la piel modificadas, ubicadas en el
margen medial del dedo II de la mayoría de los anuros machos, cuya característica
invariable es la presencia de glándulas sexualmente dimórficas (GSDs) en la dermis. La
morfología externa de las ANs usualmente involucra un aumento de espesor del
epitelio, debido al incremento de la epidermis, de la dermis, o de ambas, comparadas
con la piel adyacente (Figs. 1A, B, D, y E). Sin embargo, en algunos casos, el aumento
de espesor epitelial no es evidente; en estos casos, la visualización de los acinos
glandulares por transparencia puede indicar la presencia de ANs (Figs. 1C, F).
La epidermis de los anfibios consta de cuatro a siete capas de células epiteliales
(Fox, 1986). La capa más externa es el estrato córneo (una capa), seguido del estrato
granuloso (una capa), el estrato espinoso (de una a varias capas) y el estrato basal más
interno (una capa). La dermis está formada por un estrato esponjoso donde
generalmente se encuentran diferentes tipos de glándulas y un estrato compacto. Tanto
la epidermis como la dermis pueden variar en espesor, dependiendo de la región del
cuerpo que cubren. En nuestro estudio, describimos los componentes epidérmicos y
dérmicos de las almohadillas nupciales por separado.
3.1.1. El componente dérmico
El componente dérmico de las ANs generalmente muestra un aumento en el espesor
del estrato esponjoso y compacto en comparación con la piel adyacente (Fig. 2A). El
área se caracteriza por la presencia de GSDs. En la mayoría de las especies que
estudiamos, estos GSDs se correspondencon lo que Brizzi et al., (2002) llamaron
glándulas mucosas especializadas (GMEs). Sólo en un caso observamos la ocurrencia
conjunta con lo que Brunetti et al., (2012) llamaron glándulas serosas especializadas
(GSEs, Fig. 2B, ver Tabla 2). La disposición dérmica más común incluye la presencia
de GMEs altamente empaquetadas e hipertrofiadas, sin glándulas mucosas ordinarias
(GMOs), ni glándulas serosas ordinarias (GSOs) (Brizzi et al., 2003a; este trabajo). Sin
embargo, en algunas pocas especies se observa la presencia de GMOs y GSOs dispersas
en el área de la AN (Fig. 2C, Tabla 2).
Capítulo 1

Las glándulas mucosas especializadas (GMEs) están formadas por un conducto
intraepidérmico, un cuello y una porción secretora (Fujikura et al., 1988; Brizzi et al.,
2002). La porción secretora se compone de una monocapa de células columnares y una
cubierta contráctil de células mioepiteliales que es discontinua y la rodea (Fig. 2D). Las
células columnares tienen núcleos basales y gránulos secretores, con abundante
desarrollo de retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi (Fujikura et al., 1988:
figura 2D). La parte apical de las células tiene una serie de microvellosidades que
sobresalen en la luz del compartimento secretor (Fig. 2E). La densa vascularización
alrededor de las glándulas hace contacto con la porción secretora de las mismas. Las
glándulas mucosas ordinarias (GMOs) difieren de las glándulas mucosas especializadas
en tamaño y morfología. Los GMOs son más pequeños que los GMEs (Brunetti et al.,
2012), y su porción secretora está formada por un epitelio plano a cúbico, mientras que
los GMEs suelen tener un epitelio cilíndrico.
Los GMEs de las almohadillas nupciales tienen la misma estructura que las presentes
en otras partes del cuerpo (por ejemplo, en glándulas mentoniana y glándulas laterales).
Morfológicamente, las células de la porción secretora de las glándulas mucosas
especializadas varían de cubicas a columnares, con núcleos redondeados y basales, y
gránulos secretores en la porción apical de las células (Fig. 3A). Las células secretoras
cúbicas están asociadas con un lumen más amplio; el aumento en la altura de esta
monocapa a un epitelio cilíndrico determina un lumen más estrecho. Lo más frecuente,
es encontrar estas GMEs hipertrofiadas, pero en algunas especies no existe un aumento
de tamaño tan evidente de las glándulas, a pesar de que todas las muestras estudiadas se
encontraban en estado reproductivo. El nivel de agregación de las glándulas varía de
dispersas a muy compactas (Figuras 3B, C), y su porción secretora puede disponerse en
una o más capas dependiendo de la especie (Figuras 3D, E). La morfología de las
glándulas mucosas especializadas varía entre las especies, siendo alveolar (acinar, Fig.
3F) o tubuloalveolar (Fig. 3G), con un estrato esponjoso más delgado o más grueso,
respectivamente. Típicamente, los GMEs consisten en glándulas simples, pero en al
menos dos especies del total en estudio, se observan glándulas alveolares ramificadas
(Fig. 3H). Usualmente, las glándulas son alargadas dorso-ventralmente, pero en algunos
casos encontramos que el eje más largo de la porción secretora de la glándula era
paralela a la epidermis (Fig. 3I).
Capítulo 1

En los análisis histoquímicos de las GMEs, todas las especies reaccionan
positivamente para glicoconjugados neutros (PAS+) y algunas también son positivas
para glicoconjugados ácidos (AB +) (Figuras 5A, B, Tabla 2). También se revela un
resultado positivo con la tinción con PAAB en la capa superior de almohadillas
nupciales cornificadas, la cual corrobora la presencia de grupos disulfuro en el estrato
córneo (Figuras 5C, D); este resultado es congruente con la presencia de queratina y
proteínas asociadas a la queratina (KAP, Alibardi, 2010a). No fue posible realizar
tinciones para lípidos en nuestro estudio, debido a que la mayoría de las muestras
provenían de colecciones conservadas; por lo tanto, la diferenciación de los GSEs se
basó principalmente en diferencias morfológicas evidenciadas por microscopía óptica y
un resultado negativo para la tinción de PAS y AB. La prueba de peróxido de hidrógeno
reveló la pérdida de pigmentación en los melanocitos dérmicos, pero no afectó la
coloración epidérmica de las almohadillas nupciales oscuras lo cual demuestra que la
melanina no está involucrada en la coloración del estrato córneo (Figs.5E, F; ver
sección Coloración y Cornificación).
3.1.2. Componente epidérmico
La epidermis de la almohadilla nupcial puede mostrar modificaciones extremas en
comparación con la piel adyacente debido a un aumento en las capas celulares del
estrato espinoso y / o cambios en la morfología de las células en los estratos espinosos y
corneo (células cuboidales mas turgentes). Reconocemos tres morfologías principales de
almohadillas nupciales: (A) Almohadillas nupciales con proyecciones epidérmicas
papilares (PEPs o simplemente papilas), cuando tienen proyecciones epidérmicas
formadas por una evaginación epidérmica y dérmica (Figura 6A). Esta es la morfología
más común (74.1% de todas las especies analizadas). (B) Almohadillas nupciales con
proyecciones epidérmicas no papilares (PENP), donde las proyecciones epidérmicas
carecen de un núcleo dérmico formando una papila. Esta es la morfología menos común
(2.1% de todas las especies analizadas, Fig. 6B). (C) Almohadillas nupciales sin
proyecciones epidérmicas (sin PEs), cuando no hay proyecciones, pero hay un ligero
aumento en el grosor del área dérmica con respecto a la piel adyacente (23.8% de todas
las especies analizadas, Fig. 6C).
(A) Almohadillas nupciales con papilas. Las papilas se caracterizan por un
aumento en el número de capas del estrato espinoso y cambios con respecto a la piel
Capítulo 1

adyacente, en la morfología de las células de los estratos granuloso y el estrato corneo
que forman estas proyecciones (Figuras 7A-C). Los cambios morfológicos del estrato
granuloso incluyen un aumento en la turgencia celular, una morfología celular de plana
a cubica y, en algunas especies, la aparición de proyecciones citoplásmicas en la
porción apical de las células. El estrato basal consiste en una monocapa de células
columnares dispuestas sobre la membrana basal. El núcleo de la papila está formado por
una evaginación dérmica del estrato esponjoso hacia la epidermis. Esta evaginación está
densamente vascularizada (Fig. 7A). Cada papila está formada por múltiples células
epidérmicas que también pueden mostrar una ornamentación elaborada (Figs.7D, E).
Las técnicas de MEB y la microscopía óptica revelan la morfología del estrato
granuloso como un molde positivo del estrato córneo (Figuras 7D-G). A lo largo de los
márgenes de la almohadilla nupcial, las papilas suelen ser menos conspicuas y/ o
encontrarse deprimidas (Fig. 7H). Con frecuencia encontramos algunas papilas
parcialmente fusionadas entre sí (por ejemplo, Luna et al., 2012: fig. 3E).
Las almohadillas nupciales con papilas incluyen seis morfologías diferentes que se
caracterizan por su forma y estructura histológica. Además, se dividen en dos clases de
tamaño. Las papilas pequeñas tienen un diámetro entre 15-170 μm y una altura entre 20-
250 μm; incluyen papilas truncadas, redondeadas, irregulares, cónicas y espiculares. Las
papilas con forma de espina tienen un diámetro entre 200-800 μm, una altura entre 150-
600 μm. Estos tipos se describen a continuación.
A1. Papilas pequeñas
A1.1. Papilas truncas: Estas papilas tienen un ápice aplanado. Las células del estrato
córneo son delgadas y aplanadas. Las células del estrato granuloso son turgentes y
presentan un margen apical plano en contacto con el estrato córneo (Figuras 8 A, E, I,
M).
A1.2. Papilas redondeadas: son de hemisféricas a elípticas, y la mayoría de ellas son
proporcionalmente uniformes con un perfil regular. Lasornamentaciones que cubren las
papilas son uniformemente cortas (Figuras 8B, F, J, N) o más largas y conspicuas en el
ápice (Figuras 8C, G, K, O). Los diámetros de las papilas redondeadas varían entre las
especies. Son necesarios más análisis para determinar si su variación es continua o si
forman clases discretas de tamaño.
Capítulo 1

A1.3. Papilas irregulares: estas papilas no son truncas ni redondeadas; su tamaño y
forma varían a través de la superficie de la almohadilla nupcial. Estuvieron presentes en
varios especímenes de la misma especie, lo que indica que este estado no es el resultado
de variación ontogenética, teratología o artefacto de preparación (Figuras 8D, H, L, P).
A1.4. Papilas cónicas: tienen un ápice en punta. Las células del estrato granuloso son
de morfología turgente y columnar. La superficie de las papilas puede ser lisa u
ornamentada y mostrar diferencias en la orientación con respecto a la epidermis (recta o
inclinada, figuras 9A-P).
A1.5. Papilas espiculares: son las papilas más pequeñas (≈ 15-20 μm de ancho) y
solo son visibles como espículas diminutas, escasamente distribuidas, con un aumento
de 30X (Figuras 10A, B). Esta estructura papilar se produce en Scinax fuscovarius
(Hylidae), Xenopus epitropicalis y X.tropicalis. La MEB revela que en S. fuscovarius la
piel es lisa, excepto en las áreas donde se producen las papilas, en donde se encuentra
ligeramente elevada con respecto al resto de la almohadilla nupcial (Fig. 10C,
recuadro). Las papilas espículares en X. epitropicalis y X. tropicalis están más
densamente distribuidas que las de S.fuscovarius (Fig. 10D, recuadro). El estrato córneo
en las tres especies está formado por una monocapa que se invagina en la epidermis,
dando como resultado una apariencia de plegado. La principal diferencia es el estrato
córneo de color oscuro en las especies de Xenopus (Figuras 10E frente a F). La dermis
en S. fuscovarius está compuesta enteramente de GMEs bien desarrollados (Fig. 10E).
La dermis de la almohadilla nupcial de X. epitropicalis presenta GMEs y GSEs bien
desarrollados (Fig. 10F), mientras que la de X. tropicalis está compuesta completamente
de GMEs bien desarrollados. El núcleo dérmico reducido solo es evidente en secciones
en serie de las espículas (Figuras 10F, G).
A2. Papilas en forma de espina
Las papilas con forma de espina son fácilmente distinguibles externamente de las
papilas cónicas por el número de PEs y su tamaño. Siempre ocurren en pequeños
números (1 a ~ 40, dependiendo de la especie: Figuras 11A, B) y sus diámetros son más
grandes que los de las papilas cónicas (200-800 μm frente a un máximo de 170 μm,
respectivamente; 11C, D). Los análisis histológicos muestran que la epidermis consiste
de cinco a diez capas, principalmente debido a un aumento en las capas celulares del
Capítulo 1

estrato espinoso. El estrato granuloso incluye una monocapa de células turgentes,
cuboidales, de tamaño notablemente mayor que las de otras morfologías de las papilas
(Figura 10E). El estrato córneo sigue siendo una monocapa, pero es de mayor espesor
que en todas las demás morfologías de las almohadillas nupciales. En la dermis, solo se
encuentran unos pocas GMEs, generalmente en la base de las PEs. Como consecuencia,
relativamente pocos poros (según lo revelado por MEB) ocurren cerca de las bases de
las espinas individuales (Fig. 11F). El núcleo dérmico de la papila está compuesto
principalmente por fibras de colágeno abundantes y dispuestas laxamente. Aunque no
hay datos cuantitativos disponibles, hay un aumento evidente en la vascularización de la
dermis (Fig. 11G) en proporción a las otras morfologías de las almohadillas nupciales.
B) Almohadillas nupciales con proyecciones epidérmicas no papilares (PENPs).
Estas almohadillas nupciales tienen PEs sin evaginación dérmica formando una papila.
Estas PEs son de perfil trunco o plano. Se encuentran solo en unas pocas especies y se
distinguen además de la mayoría de las proyecciones epidérmicas papilares por poseer
el diámetro más pequeño y por el número de células involucradas en cada PE.
Comentamos a continuación las pocas especies que estudiamos con este tipo de
almohadilla nupcial.
Se observaron PENPs truncos solo en Pseudis platensis (Hylidae) y los PENPs
planos en Rhinophrynus dorsalis (Rhinophrynidae). Con poco aumento, estas
estructuras son indiscernibles (Figuras 12A, B). Los estudios mediante MEB muestran
que cada proyección tiene un ápice truncado en perfil (Figs. 12 C, D, recuadros). Cada
PE está formada por la modificación de una sola célula del estrato córneo. Las
principales diferencias entre las almohadillas nupciales con PENPs altas y bajas son las
formas de las células de los estratos córneo y granuloso. En las PEPs altas, el estrato
granuloso tiene células en forma de pera y la PE en el estrato córneo está formada por
una única célula con una proyección columnar que es notablemente más alta que ancha
(Figuras 12E, G). En la almohadilla nupcial con PENPs bajas, el estrato granuloso tiene
células cuboidales, y el estrato córneo está formado por una sola célula con una
proyección baja que es notablemente más ancha que alta (Figuras 12F, H). La mayoría
de las glándulas (GMEs) tienen una porción secretora formada por células columnares
con una gran luz, y sus ejes más largos suelen ser paralelos a la superficie de la
epidermis (Fig. 3). Estas PENPs altas o bajas no se pueden confundir con papilas
Capítulo 1

truncas porque cada PE está formado por la modificación de una sola célula, mientras
que cada papila trunca está formada por múltiples células, confiriendo un mayor tamaño
(aproximadamente 15 μm frente a 50 μm de diámetro, respectivamente).
(C) Almohadillas nupciales sin proyecciones epidérmicas. La almohadilla nupcial
es una zona glandular engrosada, de color claro, evidente por transparencia al estudiar
con aumento (Figuras 13A y 1C). Esta AN es generalmente evidente con MEB debido a
que se distingue fácilmente de la piel adyacente por su epitelio engrosado (Fig. 13B)
debido al aumento del estrato esponjoso de la dermis, asociado con la hipertrofia de los
GMEs (Fig. 13C). Sin embargo, en algunos casos el epitelio es difícilmente distinguible
a través de MEB, a pesar de que el área glandular es evidente por la transparencia (Fig.
1F). No hay PEs, por lo que las modificaciones se restringen a la dermis (Fig. 13D). En
solo unos pocos casos, los acinos son difíciles de ver por transparencia debido a la
presencia de pigmentación epidérmica, aunque son evidentes por el epitelio engrosado
(por ejemplo, Conraua crassipes, Conrauidae). En caso de duda, una disección
superficial de la piel podría revelar el tejido glandular subyacente. En la Figura 14 se
muestra una representación esquemática de todas las almohadillas nupciales descritas
anteriormente.
3.1.3. Morfología y posición de los poros glandulares en las almohadillas
nupciales
La visualización de los poros en la almohadilla nupcial solo es posible a través de
MEB, aunque en algunos casos, especialmente cuando las papilas son muy altas, los
poros son apenas visibles (Luna et al., 2012). Cuando son visibles, es posible analizar la
densidad, la ubicación y la morfología de los poros.
Encontramos que los poros ocurren en los espacios entre las papilas (Figuras 15A,
D), en el ápice de cada papila (el caso más infrecuente, Fig. 15G), en el margen inferior
(cercanos a la base) de cada papila con forma de espina (1-3 por papilas, Fig. 15J), y
entre los límites de las células epidérmicas (en las almohadillas nupciales sin PEs, Fig.
15M). Los poros pueden estar rodeados por células epiteliales cornificadas que
delimitan un “reborde epidermico” en algunas especies (compárense las figuras 15B y K
con 15E, H y N). Histológicamente, las células epidérmicas del estrato córneo
Capítulo 115

sobresalen del resto de la piel y forman el reborde (compárense las figuras 15C, L con
15F, I, O).
3.1.4. Coloración almohadilla nupcial
La coloración de las almohadillas nupciales depende de tres factores: (1) la
ocurrencia de coloración en el estrato córneo (diferentes intensidades de color marrón
claro a negro), (2) el color de los acinos glandulares que es visible por transparencia a
través de la epidermis cuando el estrato córneo no está coloreado (diferentes
intensidades de blanco o beige), o más raramente (3) melanóforos en el límite entre el
estrato esponjoso y la epidermis que también son visibles por transparencia de la
epidermis cuando el estrato córneo no está coloreado. Los gránulos de melanina
también se encuentran en los estratos epidérmicos (estratos espinosos y granulosos) de
unas pocas especies. Las diferentes intensidades de color observadas entre las especies
podrían deberse no solo a las diferentes etapas de los ciclos hormonales o la edad de las
muestras conservadas, sino también a la variación en la calidad de preservación /
conservación o a artefactos de fijación. Como no pudimos producir una clasificación
útil de la coloración que tenga en cuenta todos estos factores, encontramos más práctico
distinguir las almohadillas nupciales de color claro y oscuro, donde las de color oscuro
incluyen todas las tonalidades o marrones y negras, y las de color claro las beige y
blanquecinas almohadillas.
3.1.5. Comparación de almohadillas nupciales con otras estructuras
queratinizadas
Espinas en la mandíbula inferior. Se compararon las espinas de la mandíbula
inferior y la morfología de la almohadilla nupcial en Discoglossus jeanneae, D. pictus
(Discoglossidae) y Platymantis dorsalis (Ceratobatrachidae); Debido a que
Petropedetes palmipes (Petropedetidae) carece de almohadillas nupciales, en su lugar
estudiamos la piel del dedo II (Figuras 16A, B). Las espinas de la mandíbula inferior en
los primeros tres casos muestran proporciones similares de GMOs y GMEs (Figuras
16C, E y G). En los casos de D. jeanneae y P. palmipes, se detectaron pocas GSOs (Fig.
16C). Los GMEs son PAS + y AB -. Las espinas de la mandíbula inferior tanto de
Petropedetes palmipes como las de Platymantis dorsalis están formadas por
proyecciones epidérmicas sin núcleo dérmico (Fig. 16E, recuadro). Las células de los
Capítulo 1

estratos granuloso y espinoso de las espinas son cúbicas y turgentes (Fig. 16E recuadro).
En Discoglossus, la estructura papilar está formada por una evaginación de la dermis y
la epidermis (Fig. 16C). La almohadilla nupcial de Discoglossus pictus tiene papilas en
forma de cono, mientras que la de P. dorsalis tiene pocos PEs dispersas. La primera
tiene solo GMEs, mientras que la última muestra adicionalmente GMOs (Figuras 16D,
H respectivamente). La piel del dedo II en P. palmipes muestra solo GMOs (Fig. 16F).
Espinas pectorales. Las espinas pectorales y almohadillas nupciales se compararon
en Alsodes gargola y Telmatobius rubigo, y se estudiaron en Leptodactylus rhodonotus,
una especie sin una almohadilla nupcial (ver la siguiente sección). La principal
diferencia en la disposición de las espinas pectorales en estas especies es que T. rubigo
tiene espinas dispersas en la región pectoral (Fig. 17A), mientras que en Alsodes hay un
parche pectoral discreto (Fig. 17D). El estudio histológico reveló que la estructura de las
espinas pectorales y de la piel pectoral adyacente es diferente de la almohadilla nupcial
en T. rubigo. La almohadilla nupcial tiene papilas en forma de cono, con GMEs
particularmente hipertrofiadas (Fig. 17B). Las espinas pectorales tienen una estructura
papilar, y la dermis tiene algunas GMOs, con células cúbicas y abundantes fibras de
colágeno (Fig. 17C). En A. gargola, la almohadilla nupcial y las espinas pectorales
tienen la misma estructura, que se corresponde con las papilas en forma de espinas.
Presentan unas pocas GMEs, abundantes fibras de colágeno (Figuras 17F, G) y
vascularización extensa. Las espinas pectorales de L. rhodonotus son grupos de espinas
compactas y cornificadas (Fig. 17H); tienen una estructura papilar, pero difieren de las
papilas en forma de espina en que el estrato córneo tiene múltiples capas celulares. La
dermis tiene pocos GMEs, es rica en fibras de colágeno y está ampliamente
vascularizada (Figuras 17I, J).
Espinas del pulgar en Heleioporus y Leptodactylus. Estas "espinas del pulgar" son
capas cornificadas de color oscuro que cubren un núcleo esquelético y se proyectan
desde el metacarpiano II, el elemento distal del prepólex o ambos. Estudiamos estas
espinas en el dedo II en Leptodactylus chaquensis, L. leptodactyloides (Fig. 18A) y
Heleioporus albopunctatus (Limnodynastidae). El estrato córneo de las espinas tiene
múltiples capas cornificadas no continuas (Figuras 18B, C); solo la capa más interna es
continua con el epitelio de la piel adyacente. En estas especies, la capa cornificada está
soportada internamente por un elemento esquelético (hueso o cartílago). El estrato
Capítulo 1

compacto de la dermis está muy vascularizado y es continuo con el pericondrio (o
periostio, cuando está presente la osificación). El componente dérmico de las espinas
carecen de GSDs; en cambio, se encuentran múltiples GMOs en la piel adyacente de la
espina del pulgar (Fig. 18D). Debido a que no hay características epidérmicas o de
componentes dérmicos de las almohadillas nupciales, no consideramos que estas
estructuras sean homólogas.
3.1.6. Distribución de almohadillas nupciales
Cuando las almohadillas nupciales están presentes, siempre cubren una porción del
dedo II (figuras 19 A, B); su extensión varía de forma interespecífica y, a veces,
intraespecíficamente. Las almohadillas nupciales también pueden ocurrir en los dedos
III y IV (figuras 19C, D, E, F) como una estructura continua que cubre el margen
medial de los dedos y se fusiona dorsalmente en la mano, o como elementos
discontinuos que cubren cada uno dedo por separado.
Reconocemos un componente proximal que cubre las superficies dorsal y medial y
algunas veces alcanza los elementos prepólicos; ventralmente, alcanzan o cubren el
tubérculo metacarpiano interno. Este elemento a veces ocurre únicamente en el dedo II,
o algunas veces está junto con un segundo elemento distal. Este elemento distal es
adyacente e incluso a veces se fusiona con el elemento proximal, pero en casi todos los
casos hay una separación clara de los dos elementos (Figuras 19G, H). Tanto los
elementos proximales como los distales muestran una diversidad extrema en su
extensión. En algunas especies (Fig. 19I), la almohadilla nupcial se restringe al
tubérculo metacarpiano interno o al prepólex agrandado, y no es continua con el
elemento que cubre la superficie proximal del dedo II. Las homologías de este y el
elemento proximal aún no se han estudiado.
Las estructuras que son histológicamente similares a la almohadilla nupcial también
pueden estar presentes en la parte inferior del brazo (Fig. 19I), brazo superior y región
pectoral (Fig. 19J), y más raramente en los pies (Fig. 19K). En las especies de Xenopus
se produce un patrón espacial poco común de almohadillas nupciales, en donde la AN
cubre toda la palma y se extiende ventralmente hasta la parte superior del brazo (Fig.
19L).
Capítulo 1

4. DISCUSION
4.1. El componente dérmico de la almohadilla nupcial
Se han descrito tres tipos principales de glándulas en la piel de anfibios: glándulas
mucosas, glándulas serosas y glándulas mixtas (por ejemplo, Noble & Noble, 1944,
Toledo & Jared, 1995). Las glándulas mucosas son pequeñas, se distribuyen en todo el
cuerpo y se caracterizan por la presencia de carbohidratos neutros (Noble, 1931; Quay,
1972; Brizzi et al, 2003a). La porción secretora de estas glándulas presenta una sola
capa de células cuboidalesy un gran lumen (Toledo & Jared, 1995). Las glándulas
mucosas generalmente están involucradas en la respiración cutánea y la homeostasis
(Toledo & Jared, 1995; Brizzi et al., 2003a). Las glándulas serosas (también llamadas
glándulas granulares) son más grandes que las glándulas mucosas y se caracterizan por
su contenido proteico. Sus células secretoras forman un verdadero sincicio con
múltiples gránulos secretores (Neuwirth et al., 1979). Estas glándulas almacenan
diversos componentes, incluidos compuestos involucrados en la defensa (Toledo &
Jared, 1995). Las glándulas mixtas se distribuyen a lo largo del cuerpo de la mayoría de
los caudados, y están formadas por una gran porción granular y una pequeña porción
mucosa (ver Dawson, 1920 y Delfino et al., 1986 para revisiones). Además de estos
tipos generalizados de glándulas, se han descrito otras incluyendo glándulas lipídicas,
glándulas seromucosas y diferentes tipos de glándulas granulares (p.ej., Blaylock,
Ruibal & Platt-Aloia, 1976; Mills & Prum, 1984; Delfino, 1998; Brizzi et al., 2002).
Thomas et al. (1993) demostraron que en 12 especies de anuros algunas glándulas
comparten propiedades histoquímicas y estructurales que las hacen diferentes de las
glándulas serosas y mucosas del resto de la piel. Estos hallazgos respaldaron el
reconocimiento de un tipo diferente de glándula que era independiente de su ubicación y
función; las glándulas sexualmente dimórficas de las piel (GSDs). Los GSDs en anuros
incluyen glándulas abdominales, glándulas femorales, glándulas humerales, glándulas
pectorales, glándulas nupciales (las que se encuentran en las ANs), glándulas post
axilares y algunas glándulas especializadas sin una región específicamente definida en
la piel (Thomas et al., 1993; Houck & Sever, 1994; Brizzi et al., 2003). Brizzi et al.
(2002) introdujeron el término glándulas mucosas especializadas (GMEs) como un tipo
de GSD. Estas glándulas son más grandes que las GMOs y presentan células
columnares en su porción secretora. Brunetti et al. (2012, 2015) introdujeron el término
Capítulo 1

de glándulas serosas especializadas (GSEs) como un nuevo tipo de GSD (mencionadas
pero no definidas en Thomas et al., 1993; Vences et al., 2007; Gonçalves & Brito-
Gitirana, 2008). Las glándulas serosas especializadas (GSEs) tienen una capa secretora
interna sincicial y un lumen lleno de gránulos. Los productos de secreción están
embebidos en una matriz de componentes celulares amorfos. El sincicio contiene
núcleos redondeados y una delgada capa mioepitelial que rodea la porción secretora
(Brunetti et al., 2012). Las glándulas serosas ordinarias (GSO) y las GSEs son
sinciciales y presentan tamaño similar. Las principales diferencias se atribuyen a sus
propiedades histoquímicas, el tamaño y la apariencia de los gránulos secretores y los
poros glandulares (Brunetti et al., 2002). Tanto los GMEs como las GSEs ocurren al
menos en las glándulas mentonianas y laterales de varios grupos en los anuros (Brunetti
et al., 2015).
Las GSDs secretan sus productos a la superficie del componente epidérmico de la
almohadilla nupcial a través de los poros. Aunque se conocen desde hace al menos 140
años a partir de estudios histológicos (por ejemplo, Lataste, 1876), los poros glandulares
se estudiaron por primera vez a través de MEB por Wray (2000) en su tesis inédita
sobre algunas especies de Ptychohyla y de Luna et al. (2012) en algunos
phyllomedusines. Estos últimos autores mostraron que existen diferencias histológicas
entre las células del conducto de los diferentes tipos de poros en las almohadillas
nupciales. También proporcionaron micrografías de MEB que mostraron la misma
estructura cornificada en los conductos y en el estrato córneo de las papilas.
Los estudios histoquímicos de la almohadilla nupcial conducen a la caracterización
estándar de la secreción de GSDs durante la temporada reproductiva (Thomas et al.,
1993, Epstein & Blackburn, 1997). Las GMEs contienen glicoconjugados neutros
(tinción positiva para PAS) y proteínas como su principal producto secretor (tinción
positividad para azul de Coomassie y ninhidrina Schiff). Las respuestas negativas para
Sudán Black (SB) y AB indican la falta de lípidos y glicoconjugados ácidos o
sulfatados, respectivamente. Sin embargo, se informó la reacción positiva para AB para
las GMEs de la piel dorsal de Rana dalmatina (Ranidae, Brizzi et al., 2002) y en las
GMEs de almohadillas nupciales de Pelophylax kl. esculentus y Pelophylax perezi
(Ranidae, Brizzi et al., 2003b). Las GSEs contienen gránulos acidófilos (PAS negativo,
AB negativo, PAAB negativo) y proteínas (azul de Coomassie positivo). Thomas et al.
Capítulo 1

(1993) y Brunetti et al. (2012) reportaron la tinción positiva para lípidos (SB) en las
GSEs. Nuestros hallazgos son congruentes con resultados previos (Thomas et al., 1993;
Esptein & Blackburn, 1997; Luna et al., 2012). La principal diferencia encontrada
fueron los resultados positivos para la tinción AB en varias especies (Tabla 2), lo que
indica que las GMEs también pueden contener glicoconjugados ácidos como parte de
sus productos secretores (como lo muestran Brizzi et al., 2002 en Rana dalmatina).
También encontramos que el 86% de las especies estudiadas poseen GMEs como las
únicas GSDs en el componente dérmico de la almohadilla nupcial. En solo un caso
(Xenopus epitropicalis) se encontraron GSEs, pero co-ocurrieron con una mayor
densidad de GMEs. Fujikura et al., (1988) informaron dos glándulas serosas diferentes
en la almohadilla de X. laevis. Muy probablemente, uno de estas (sus "glándulas
granuladas pequeñas") corresponden a GSEs.
Nuestro estudio muestra la presencia de GMOs y GSOs junto con las GMEs en las
almohadillas nupciales de algunas especies (Figuras 2C, 16H, Tabla 2). Dado que la
mayoría de las almohadillas nupciales tienen exclusivamente GME, sería interesante
analizar si estas GMOs y GSOs desempeñan el mismo papel funcional en la almohadilla
nupcial que en otras partes del cuerpo.
Nuestra definición de almohadillas nupciales se basa en la presencia de GMEs en la
dermis, mientras que la epidermis puede o no estar modificada con respecto a la piel
adyacente. La razón de esta definición es que las GMEs son las únicas estructuras en
común entre todas las almohadillas nupciales que hemos estudiado. Asociado a esto, se
encuentra la observación de que la modificación del componente epidérmico, si está
presente en otras áreas del cuerpo, puede no estar asociado con las GMEs, ni
necesariamente constituye un carácter sexualmente dimórfico.
Además de distinguir las GMEs, Kaptan & Murathanoğlu (2008) fueron los primeros
en abordar la presencia de glándulas mixtas y GSOs en la almohadilla nupcial de
Pelophylax ridibundus. Informaron que estas glándulas mixtas tenían características
tanto de glándulas serosas como de GMEs y eran similares a las descritas en los
caudados (Delfino et al., 1986). Estas glándulas estructuralmente parecen diferentes de
las GSDs llamadas glándulas "seromucosas" en el dorso de algunos ranidos (Mills &
Prum, 1984; Thomas & Licht, 1993). Kaptan & Murathanoğlu (2008) también
sugirieron que las glándulas mixtas son posiblemente una etapa intermedia en la
Capítulo 1

transformación de un tipo en otro tipo de glándula, aunque no dieron detalles al
respecto. Hasta la fecha, ningún autor ha sugerido que las GSOs puedan ser precursores
ontogénicos de los GMEs. De todos modos, estos resultados son curiosos porque las
especies de Pelophylax han sido objeto de varios estudios sobre la estructura de las
almohadillas nupciales, ninguna de las cuales se refirió a la presencia de glándulas
mixtas o GSOs (Ecker y Wiedersheim, 1882; Gaupp, 1904; Kändler, 1924; Aron, 1926;
Brizzi et al., 2002, 2003b), por lo que tal vez su presencia se limiten a unas pocas
especies. No se encontraron