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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Ecología, Genética y Evolución Interacción a nivel genético-molecular entre el parasitoide Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae) y sus hospedadores Ceratitis capitata y Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas Claudia Alejandra Conte Directora de tesis: Dra. Silvia Beatriz Lanzavecchia Consejero de Estudios: Dr. Juan César Vilardi Lugar de trabajo: Lab. de Insectos de Importancia Agronómica. Instituto de Genética “Ewald A. Favret”, INTA Castelar. Buenos Aires, 2021 Fecha de defensa: 21-05-2021 conte.claudia Cuadro de texto Interacción a nivel genético-molecular entre el parasitoide Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae) y sus hospedadores Ceratitis capitata y Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) es un endoparasitoide de estadios larvales de moscas de la fruta. Actualmente en Argentina, se encuentra en evaluación su aplicación en estrategias de control biológico contra dos especies plagas de importancia económica: Ceratitis capitata (Wiedemann) y Anastrepha fraterculus (Wied.). El presente trabajo de tesis propone abordar el estudio de factores asociados a la interacción entre especies en el sistema parasitoide: moscas de la fruta. Los resultados obtenidos a nivel citológico evidenciaron la presencia de una respuesta inmune celular débil en A. fraterculus ante el ataque del parasitoide, siendo la misma ausente en el caso de C. capitata. Mediante el análisis del transcriptoma de A. fraterculus y evaluación de patrones de expresión de genes asociados a la respuesta inmune, se halló una disminución en la expresión del gen Pro-fenoloxidasa en larvas parasitadas, mostrando una posible respuesta de la larva ante la parasitación. Asimismo, se identificó la presencia de secuencias del virus DLEPV en el parasitoide y dos cepas de Wolbachia en A. fraterculus. Una de estas cepas bacterianas otorga un potencial efecto protector frente al ataque por el parasitoide. Los resultados obtenidos aportan información sobre la interacción hospedador-parasitoide, útil en la implementación de técnicas sustentables de control de plagas. Palabras claves: Parasitoide, moscas de la fruta, parasitismo, interacción hospedador- parasitoide, respuesta inmune, simbiontes. Interaction at the molecular and genetic level between the parasitoid Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae) and its hosts Ceratitis capitata and Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) is an endoparasitoid of larval stages of fruit flies. Currently, in Argentina, its application in biological control strategies against two economically important pest species (Ceratitis capitata and Anastrepha fraterculus) is being evaluated. This thesis proposes to address the study of factors associated with the interaction between species in the system parasitoid: fruit flies. The results obtained at the cytological level evidenced the presence of a weak cellular immune response in A. fraterculus to the attack of the parasitoid, being the same absent in the case of C. capitata. The analysis of the A. fraterculus transcriptome and the evaluation of expression profiles of genes involved in immune response evidenced a decrease in the expression of Pro-phenoloxidase gene in parasitized larvae, showing a possible inhibition of the larval response to parasitization. In addition, the presence of DLEPV virus sequences was identified in the parasitoid and two Wolbachia strains in A. fraterculus. One of these strains provides a potential protective effect against the parasitoid attack. The results obtained provide information on the host-parasitoid interaction to support the implementation of sustainable pest control techniques. Keywords: Parasitoid, fruit flies, parasitism, host-parasitoid interaction, immune response, symbionts. Agradecimientos A la FCEyN, a sus docentes, no docentes, a su personal administrativo, por brindarme el acceso a tan fascinante carrera. Al INTA, por recibirme y brindarme un lugar de trabajo. Al Dr. Jorge Cladera, por ser una de las primeras personas que creyó en mí y por dejarme formar parte de su equipo. A la Dra. Mariana Viscarret, por abrirme la puerta del laboratorio, y darme bola cuando le fui con esta idea loca. A la Dra. Silvia Lanzavecchia por hacerme llegar al laboratorio molecular, un viaje sin retorno para mí. Por guiarme en este laaaargo camino del doctorado, que quizás sin su empuje y apoyo hubiese quedado trunco, por ahí, a mitad de camino. Gracias, sé que fui muy cabeza dura. Al Dr. Diego Segura y la Dra. Alejandra Scannapieco, por siempre darme una mano en el planteo de ensayos y ayuda estadística... bendita estadística! Al Dr. Kostas Bourtzis y al Dr. Antonious Augustinos, súper grosos que me abrieron las puertas del IPCL, en Viena. Aprendí un montón y fue una experiencia que nunca olvidaré. A mis primeras compañeras del labo, Marianela y Euge, fue muy lindo aprender al lado de ustedes… como nos reímos! A las de ahora, Iri, Ceci, Juli gracias por la compañía. A Guille, Juan, Fran, Silvi, Ana, Clara. A Leonela y Costi, grandes compañeras de las cuales y con las cuales aprendí mucho. A Fabi, quien mima mis moscas. Gracias por mantenerlas con vida, a pesar de mis cuidados. Gracias por mimar también a mi hija. A Romi, gracias por estar siempre con una palabra de apoyo y consejo ó con una tostada grasosa. A las seños del ACRI, por cuidar mi más preciado tesoro mientras yo trabajaba en los ensayos de esta tesis. A las abus, Asun y Gladys, y a la tía Dai, por cuidarla también cuando no había jardín. A la biblioteca del IGEAF, Liliana y Daniel, y a Sci-Hub, por el acceso a la bibliografía. A Gisela y Natalia, las elegidas. A mi abuela Lucía por ser la persona y el abrazo para enfrentar cada año. A mis cuñadas Gri y Pau, mis cuñados Dami y Ardile, porque sé que también van a estar tan felices como yo por esta etapa. A Asun y Venan, mis suegros, gracias por el apoyo y el asado y el vino con los cuales vamos a festejar. A mi mamá y mi papá, gracias por todo. Por darme todo, por permitirme elegir mí camino, a pesar de que significó grandes esfuerzos para ustedes. Por decirme que puedo, que va a ser difícil pero que si te gusta se puede. Pude, al final. A mis hermanos, por estar siempre. Por festejar estos logros como si fueran suyos, por ponerme siempre el hombro para ayudarme a avanzar. A Gonza, Palo, Emma, Lauty, Josce y Leyla, mis sobris, por siempre tener una sonrisa y un abrazo para darme, sin importar lo bien o mal que hayan salido las cosas. Ojala ustedes también puedan estudiar o trabajar de lo que les apasiona, es lo más lindo que te puede pasar en la vida. A Lucía y Milciades, por ser todo para mí. Por entender lo importante que esto era para mí. Gracias, infinitas gracias! Porque uno es esclavo de sus hazañas pero dueño de sus intentos. J. D. A partir de acá… mis intentos INDICE GENERAL INTRODUCCIÓN 12 1.1 Diachasmimorpha longicaudata, parasitoide de moscas de la fruta 13 1.1.1 Generalidades 13 1.1.2 Ciclo de vida 13 1.2 Moscas plagas de la fruta en Argentina 15 1.2.1. Origen y distribución 15 1.2.2 Ciclo de vida de moscas de la fruta 17 1.3 Medidas de control de moscas de la fruta en Argentina 19 1.3.1 La técnica del insecto estéril (TIE) 20 1.3.2 Control biológico 21 1.3.3 El parasitoide como controlador biológico 22 1.4 Interacciones entre insectos24 1.5 Respuesta inmune en insectos 24 1.5.1 Generalidades 24 1.5.2 Reconocimiento del patógeno 26 1.5.3 Vías de señalización y amplificación de la respuesta inmune 27 1.5.4 La respuesta celular 29 1.6 Estrategias de evasión de la respuesta inmune del hospedador por parte del parasitoide 33 1.6.1 Estrategias activas de evasión 34 1.6.2 Estrategias pasivas de evasión 35 1.7 Simbiontes que participan en la interacción hospedador-parasitoide 36 1.7.1 Virus 36 1.7.2 Wolbachia 37 1.7.3 Spiroplasma 40 1.8 Antecedentes de estudios de interacción en A. fraterculus y C. capitata 40 2. OBJETIVOS 42 2.1 Objetivo general 43 2.2 Objetivos específicos 43 2.3 Hipótesis de trabajo 44 3. MATERIALES Y MÉTODOS 45 3.1 Insectos utilizados en los ensayos 46 3.1.1 Diachasmimorpha longicaudata 46 3.1.2 Anastrepha fraterculus 47 3.1.3 Ceratitis capitata 49 3.2 Ensayos citológicos 50 3.2.1 Encapsulación del huevo de D. longicaudata en larvas de C. capitata 50 3.2.2 Encapsulación del huevo de D. longicaudata en larvas de A. fraterculus 51 3.2.3 Parasitismo de D. longicaudata en cepas mutantes de C. capitata 52 3.3 Análisis genéticos y genómicos en A. fraterculus 55 3.3.1 Búsqueda de genes relacionados con la respuesta inmune en A. fraterculus 55 3.3.1.1 Análisis de la presencia de genes de inmunidad en el transcriptoma de A. fraterculus 55 3.3.1.2 Elección de genes candidatos a participar en la respuesta inmune en A. fraterculus 56 3.3.1.3 Diseño de oligonucleótidos para qPCR 57 3.3.1.4 Expresión de genes relacionados con la respuesta inmune en A. fraterculus 58 3.3.1.4.1 Generación de larvas de A. fraterculus parasitadas… 59 3.3.1.4.2 Extracción de ARN y síntesis de ADN copia 59 3.3.1.4.3 PCR de punto final para la prueba de oligos diseñados 60 3.3.1.4.4 qPCR en genes relacionados con la respuesta al parasitismo 61 3.4 Detección molecular y caracterización de agentes simbiontes en D. longicaudata, C. capitata y A. fraterculus 63 3.4.1 Detección del Diachasmimorpha longicaudata Entomopoxvirus (DLEPV) 63 3.4.1.1 Extracción de ADN de insectos 63 3.4.1.2 Diseño de oligos para detección específica del DLEPV por PCR 65 3.4.1.3 Detección del DLEPV por PCR 65 3.4.1.4 Purificación de las bandas de PCR por el método de precipitación por sales 66 3.4.1.5 Análisis de secuencias nucleotídicas obtenidas 66 3.4.2 Detección del D. longicaudata rhabdovirus (DlRhV) 67 3.4.3 Detección y caracterización de Wolbachia sp en D. longicaudata, C. capitata y A. fraterculus 68 3.4.3.1 Detección de Wolbachia 68 3.4.3.2 Caracterización de Wolbachia en A. fraterculus mediante MLST 70 3.4.3.3 Caracterización adicional de Wolbachia mediante groEl, gltA, dnaA, sucB, aspC, atpD y pdhB 72 3.4.3.4 Uso de reacción de HRM para caracterización de cepas 73 3.4.3.4.1 Puesta a punto de la reacción de HRM para la detección de variantes de Wolbachia 74 3.4.3.4.2 Análisis de muestras de A. fraterculus para genotipificación de líneas de Wolbachia mediante HRM 74 3.4.3.5 Purificación de líneas de A. fraterculus infectadas con las cepas WAfraCast1_A, WAfraCast2_A de Wolbachia 75 3.4.3.5.1 Caracterización genética de las líneas Af-Cast-1 y Af-Cast-2 a través de marcadores mitocondriales 76 3.4.3.5.2 Puesta a punto del método de PCR-RFLP de la región ND4-5 77 3.4.3.6 Obtención de líneas de A. fraterculus libres de Wolbachia 78 3.4.3.7 Ensayo de incompatibilidad citoplasmática entre líneas de A. fraterculus infectadas con AfraCast1_A y AfraCast2_A 80 3.4.3.7.1 Test de aislamiento pre-cigótico 80 3.4.3.7.2 Test de aislamiento post-cigótico 81 3.4.3.7.3 Análisis citológico 82 3.5 Interacción de Wolbachia en el parasitismo de D. longicaudata en larvas de A. fraterculus infectadas 84 3.5.1 Ensayo de parasitismo en larvas de A. fraterculus infectadas y curadas de Wolbachia 84 3.6 Detección de otros simbiontes reproductivos en D. longicaudata, C. capitata y A. fraterculus 86 3.7 Análisis de los transcriptomas de A. fraterculus y D. longicaudata para la detección in silico de simbiontes y proteínas asociadas a la parasitación 88 3.7.1 Búsqueda in silico de virus de las familias Iflavirus y Noravirus en el transcriptoma de A. fraterculus 88 3.7.2 Búsqueda in silico de simbiontes en el transcriptoma de D. longicaudata 89 3.7.3 Búsqueda de secuencias relacionadas con la parasitación 90 4. RESULTADOS 92 4.1. Ensayos citológicos 93 4.1.1 Encapsulación del huevo de D. longicaudata en larvas de C. capitata 93 4.1.2 Encapsulación del huevo de D. longicaudata en A. fraterculus 94 4.1.3 Parasitismo en cepas mutantes de C. capitata 97 4.2 Análisis genéticos y genómicos en A. fraterculus 99 4.2.1 Búsqueda de genes relacionados con la respuesta inmune en A. fraterculus 99 4.2.1.1 Análisis de la presencia de genes de inmunidad en el transcriptoma de A. fraterculus 99 4.2.1.2 Elección de genes candidatos a participar en la respuesta inmune en A. fraterculus 101 4.2.1.3 Diseño de oligos para qPCR 106 4.2.1.4 Expresión de genes relacionados con la respuesta inmune en A. fraterculus 107 4.2.1.4.1 Generación de larvas de A. fraterculus parasitadas 108 4.2.1.4.2 Extracción de ARN y síntesis de ADN copia de larvas de A. fraterculus 109 4.2.1.4.3 PCR de punto final para la prueba de oligos diseñados 110 4.2.1.5.3 qPCR en genes relacionados con la respuesta al parasitimo 112 4.3. Detección molecular y caracterización de microorganismos simbiontes en D. longicaudata C. capitata y A. fraterculus 116 4.3.1 Detección del Diachasmimorpha longicaudata Entomopoxvirus (DLEPV) 116 4.3.1.1 Extracción de ADN de insectos 116 4.3.1.2 Diseño de oligos para detección específica del DLEPV por PCR 117 4.3.1.3 PCR específica para la detección del DLEPV 118 4.3.1.4 Purificación de las bandas de PCR por el método de precipitación por sales 120 4.3.1.5 Análisis de las secuencias obtenidas 122 4.3.2 Detección del D. longicaudata rhabdovirus (DlRhV) 125 4.3.3 Detección y caracterización de Wolbachia en D. longicaudata, C. capitata y A. fraterculus 126 4.3.3.1 Detección de Wolbachia a través del gen 16S rRNA 126 4.3.3.2 Detección de Wolbachia utilizando wsp 129 4.3.3.3 Caracterización de Wolbachia mediante MLST 134 4.3.3.4 Caracterización adicional de Wolbachia mediante secuenciación de groEl, gltA, dnaA, sucB, aspC, atpD y pdhB 138 4.3.3.5 Uso de la reacción de HRM para identificación de variantes de Wolbachia 140 4.3.3.5.1 Puesta a punto de la reacción de HRM 140 4.3.3.5.2 Análisis de muestras de A. fraterculus para genotipificación de líneas de Wolbachia mediante HRM 141 4.3.3.6 Purificación de líneas de A. fraterculus infectadas con las cepas WAfraCast1_A, WAfraCast2_A de Wolbachia 143 4.3.3.6.1 Caracterización genética de A. fraterculus infectada por Wolbachia 144 4.3.3.6.2 Puesta a punto del método de PCR-RFLP de la región ND4-5 y análisis poblacional 148 4.3.3.7 Obtención de líneas de A. fraterculus libres de Wolbachia 150 4.3.3.8 Ensayo de incompatibilidad citoplasmática entre líneas de A. fraterculus infectadas con AfraCast1_A y AfraCast2_A 153 4.3.3.8.1 Test de aislamiento pre-cigotico 153 4.3.3.8 2. Test de aislamiento post-cigótico 154 4.4 Interacción de Wolbachia en el parasitismo de D. longicaudata en larvas de A. fraterculus infectadas 159 4.4.1 Ensayo de parasitismo en larvas de A. fraterculus portadoras de diferente cepa de Wolbachia y diferente estado de infección 159 4.5 Detección molecular de otros simbiontes reproductivos en D. longicaudata, C. capitata y A. fraterculus 161 4.5.1 Detección de Spiroplasma sp., Cardinium sp., Rickettsia sp., Arsenophonus sp. y Hamiltonella sp 161 4.6 Detección in silico de simbiontes de A. fraterculus y D. longicaudata y proteínas asociadas a la parasitación 165 4.6.1 Búsqueda in silico de virus de las familias Iflavirus y Noravirus en el transcriptoma de A. fraterculus 164 4.6.2 Búsqueda in silico de virusen el transcriptoma de D. longicaudata 166 4.6.3 Búsqueda de secuencias relacionadas con la parasitación 167 5. DISCUSIÓN 169 5.1 Ensayos citológicos de encapsulación y de parasitismo 171 5.2 Análisis del transcriptoma de A. fraterculus y expresión diferencial de genes de respuesta inmune 175 5.3 Detección de simbiontes en el parasitoide y sus hospedadores 179 189 6. CONCLUSIONES GENERALES 195 7. BIBLIOGRAFÍA 218 8. ANEXO TABLAS 233 9. ANEXO FIGURAS 1. INTRODUCCIÓN 13 INTRODUCCIÓN 1.1 Diachasmimorpha longicaudata, parasitoide de moscas de la fruta 1.1.1 Generalidades Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead, 1905) (Hymenoptera, Braconidae, Opiinae) es un endoparasitoide obligado de estadios larvales avanzados de moscas de los frutos pertenecientes a la familia Tephritidae (Diptera). Es un parasitoide koinobionte (cenobionte), es decir que, la larva del parasitoide se alimenta del hospedador aún en desarrollo, hasta que ocasiona su muerte. Es una especie nativa de la región Indo- Australiana (Bess 1961; Clausen et al., 1965), que posee una amplia distribución natural desde el sudoeste asiático hasta Australia (Wharton y Gilstrap, 1983). Actualmente, se encuentra establecida en Guatemala (Eskafi, 1990), México (Montoya et al., 2016), Brasil (Matrangolo et al., 1998; Malavasi et al 2007), Argentina (Schliserman et al., 2003 y Oroño y Ovruski, 2007), EE.UU (Baranowski et al., 1993), El Salvador (Ovruski et al., 1996), Tahití (Vargas et al., 2012), y Costa Rica (Jiron y Mexzon, 1989), países en donde fue introducido como agente de control de moscas de la fruta. 1.1.2 Ciclo de vida El ciclo de vida de D. longicaudata corresponde al tipo holometábolo e incluye cuatro estados de desarrollo: huevo, larva (tres estadios), pupa y adulto (Figura 1) (Carabajal Paladino et al., 2010). Los tres primeros estados se desarrollan dentro del hospedero, mientras que los individuos adultos son de vida libre (Pemberton y Willard, 1918, Greany et al., 1976). La emergencia de los individuos adultos machos se produce alrededor de 15 días después de la oviposición, mientras que las hembras emergen 24 a 48 horas después (Carabajal Paladino et al., 2010). Es un parasitoide solitario, es decir, de cada larva parasitada emerge un solo parasitoide adulto originado de un único huevo depositado. Existen evidencias de superparasitismo en condiciones de laboratorio (presencia de más de un estadio inmaduro del parasitoide por hospedador) con emergencia de un único parasitoide adulto (Greany et al., 1976; Devescovi, 2015). Luego de la emergencia de los adultos, de manera inmediata se produce el apareamiento con una duración de escasos segundos, la hembra puede copular con más de un macho a lo largo de su vida (Hagen, 1953). Si bien la oviposición puede 14 INTRODUCCIÓN ocurrir inmediatamente después de la emergencia de los parasitoides adultos, es más frecuente que ocurra a partir de los nueve días posterior a la misma (Vargas et al., 2002; Viscarret et al., 2006). D. longicaudata, al igual que demás especies del orden Hymenoptera, es haplodiploide. A partir de huevos fecundados emergen las hembras (organismos diploides) y a partir de huevos sin fecundar, los machos (individuos haploides) (Carabajal Paladino et al., 2015) (revisado por Leather y Hardie, 1995 y Heimpel y de Boer, 2008). Existen no obstante, machos diploides de manera poco frecuente (Carabajal Paladino et al., 2015) Figura 1: Ciclo de vida del parasitoide Diachasmimorpha longicaudata. Fotos de estadios inmaduros del parasitoide de Leonela Carabajal Paladino. 15 INTRODUCCIÓN 1.2 Moscas plagas de la fruta en Argentina 1.2.1. Origen y distribución En nuestro país se han descripto dos especies de moscas de la fruta de importancia económica pertenecientes a la familia Tephritidae (Figura 2): la mosca sudamericana de la fruta, Anastrepha fraterculus (Wiedemann, 1830) y la mosca del mediterráneo Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Aruani et al., 1996). C. capitata, es una plaga polífaga nativa del África subsahariana (White y Elson-Harris 1992; Headrick y Goeden, 1996) de gran importancia a nivel mundial debido fundamentalmente a su amplia distribución geográfica, que abarca todas las regiones templadas y cálidas del mundo, su alta capacidad destructiva y, a la gran diversidad de especies vegetales que puede utilizar como hospedadores. Se han descripto más de 350 especies de 65 grupos taxonómicos como plantas hospederas de C. capitata incluyendo especies comerciales y silvestres (Liquido et al., 1990). Específicamente en nuestro país, esta plaga posee una amplia distribución geográfica desde la región norte del territorio, incluyendo las provincias de Formosa, Jujuy y Salta hasta el paralelo 40° de latitud sur. Se ha registrado su presencia en la región patagónica, principalmente en Alto Valle del Río Negro, infectando comúnmente frutas comerciales exóticas (Sánchez et al., 2001; CABI 2020). A. fraterculus es una plaga polífaga endémica del continente americano, con un amplio rango de especies vegetales hospederas (Ovruski et al, 2003; Oroño et al., 2006), muchas de ellas compartidas con C. capitata. A. fraterculus constituye un complejo de especies cripticas con al menos ocho morfotipos descriptos (Steck, 1991; Hernández- Ortiz et al., 2004; 2012; 2015). Se distribuye a lo largo del continente americano desde el sur de Estados Unidos y México hasta la región central de Argentina, siendo registrada preferentemente en áreas de clima tropical y subtropical (Hernández-Ortiz y Pérez-Alonso, 1993; Aluja y Norrbom, 1999). En Argentina, se ha registrado su presencia en la región norte entre los paralelos 22° y 31° de latitud sur, donde crecen mayormente especies frutales nativas y exóticas (Ovruski et al., 2003) y si bien es una especie altamente polífaga, el número de especies vegetales hospederas citadas es 16 INTRODUCCIÓN menor que las conocidas para C. capitata (alrededor de 139 especies afectadas; Norrbom, 2004, CABI 2020). En Argentina ambas especies coexisten especialmente en el noroeste (NOA), noreste (NEA) y ciertas regiones de Cuyo (Aruani et al., 1996, Segura et al., 2006; Oroño et al., 2006). Figura 2: Ejemplares de C. capitata (A) y A. fraterculus (B). Hembras, a la derecha, machos a la izquierda. Aumento 4x. 17 INTRODUCCIÓN 1.2.2 Ciclo de vida de moscas de la fruta El ciclo de vida de C. capitata y A. fraterculus es similar y corresponde a un tipo de desarrollo holometábolo (huevo-larva-pupa-adulto) (Figura 3). La duración de cada una de las fases depende la temperatura y de la especie. El ciclo inicia cuando la hembra fecundada pone sus huevos dentro del fruto aún no maduro (Christenson y Foote, 1960). El desarrollo embrionario ocurre en la pulpa del fruto y luego eclosiona. Las larvas se alimentan del fruto atravesando tres estadios, al finalizar el estadio larval III, abandona el fruto (que en este momento ya se encuentra en avanzado estado de descomposición y caído al piso) y se entierra. Su cutícula se endurece para formar un pupario dentro del cual se completa el desarrollo del adulto a través de la metamorfosis. La duración de los estados inmaduros es muy variada entre especies y dentro de la misma especie, existe variación principalmente asociada a la temperatura, la humedad y a las especies hospederas (Aluja et al., 1993; Putruele, 1996). Por último, emerge el adulto que adquiere madurez sexual luego de algunos días, dependiendo de la especie y de su alimentación con fuentes proteicas. Teniendo en cuenta las necesidades nutricionales y ambientales, los ciclos de vida de estos insectos pueden ser reproducidos bajo condiciones de cría en el laboratorio (Figura 3). 18 INTRODUCCIÓN Figura 3: Reproducción del ciclo de vida de las moscasplaga de la fruta en condiciones de laboratorio. Fotos del proceso de cría de insectos de Fabián Milla. 19 INTRODUCCIÓN 1.3 Medidas de control de moscas de la fruta en Argentina En el año 1994 en Argentina se crea el Programa Nacional de Control y Erradicación de Mosca de los Frutos (PROCEM) perteneciente al Servicio Nacional de Calidad Agroalimentaria (SENASA), mediante la Resolución ex - IASCAV Nº 134. De esta manera, nuestro país adhiere a la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria desde 1999 (Ley Nacional 25218). El objetivo principal del Programa consiste en la reducción del impacto socio-económico ocasionado por estas plagas en las cadenas de producción frutihortícola a través de sus dos principales efectos: primero, el daño ocasionado por las pérdidas directas (merma en la producción frutícola obtenida en el área con presencia de la plaga y disminución de la calidad en los frutos infestados) y segundo, las pérdidas indirectas, fundamentalmente debidas a las restricciones a la exportación y/o necesidad de aplicar tratamientos cuarentenarios u otras medidas, que representan incrementos significativos en los costos de comercialización. El daño ocasionado por ambas especies se estima entre 15 a 20% de la producción frutícola anual sin considerar la pérdida de mercados (Aruani et al., 1996; Guillén y Sánchez, 2007). Para la obtención y actualización del estado de las plagas, se cuenta con herramientas como la implementación de convenios de cooperación interinstitucional, la recepción de informes de intercepciones fitosanitarias, la recepción y procesamiento de denuncias, etc. Una vez verificada, la información es incorporada y publicada en el Sistema Nacional Argentino de Vigilancia y Monitoreo de Plagas (SINAVIMO), a través de su página web: www.sinavimo.gov.ar. Los datos son generados por el SENASA así como por distintas instituciones, organizaciones y entidades que tienen intervención en el campo fitosanitario (Institutos de investigación, universidades, gobiernos locales, sociedades científicas, laboratorios, consultores, etc.). Históricamente, el control de C. capitata y A. fraterculus en Argentina se intentó casi exclusivamente mediante el uso de una mezcla de insecticidas (generalmente malatión) y atrayentes alimenticios (como proteína de maíz hidrolizada, melaza de caña de azúcar o proteína de soja hidrolizada) comúnmente conocida como cebo (Aruani et al., 1996). Más recientemente, a partir del trabajo del PROCEM, se 20 INTRODUCCIÓN establecieron medidas de manejo integrado de plagas (MIP) que incluyeron prácticas culturales, como la comunicación social, medidas preventivas como remoción de fruta infestada y cuarentena, manejo del control químico y técnicas específicas o complementarias dependiendo la especie a controlar (Guillén y Sánchez, 2007) como son la técnica del insecto estéril (TIE) y el control biológico (CB). 1.3.1 La técnica del insecto estéril (TIE) La técnica del insecto estéril (TIE) se basa en la cría masiva artificial, esterilización por irradiación y liberación de insectos estériles de la misma especie plaga, de manera tal que los individuos silvestres se apareen con los estériles y de esa manera, disminuir la producción de descendencia viable y el tamaño poblacional en sucesivas repeticiones del proceso (Knipling, 1955). Sin embargo, esta técnica tiene sus puntos débiles, en aquellos casos en los que se utilizan cepas bisexuales, es decir que se liberan hembras y machos, los individuos estériles prefieren aparearse entre sí, con lo que se reduce la probabilidad de apareamientos efectivos entre macho estéril-hembra silvestre, disminuyendo así la introducción de esterilidad a las poblaciones de campo (McInnis et al., 1994). Además las hembras estériles también producen daños en los frutos, al depositar sus huevos aunque estos no sean viables. Es por esto que es necesario el uso de cepas unisexuales o cepas de sexado genético (CSG) con las cuales sea posible criar y liberar exclusivamente machos, ya que se ha demostrado que el macho es el que realmente contribuye a la supresión de la plaga introduciendo esterilidad en la población silvestre. Para el desarrollo de una CSG son necesarios dos componentes principales: 1- contar con una característica diferenciable y hereditaria útil para separar los sexos (marcador genético), y 2- inducir y obtener una translocación que involucre al cromosoma Y, lo cual originará que la transmisión del marcador genético siga el patrón de una herencia ligada al sexo (solo machos), ya que en estas especies de moscas de la fruta la diferenciación y desarrollo del macho se halla asociado al cromosoma Y (Willhoeft y Franz, 1996). En C. capitata se han utilizado como marcadores genéticos dos mutaciones en diferentes genes: 1- sensibilidad letal a la temperatura (mutación del gen tsl) para eliminar a las hembras (Franz et al., 1994) y 2- 21 INTRODUCCIÓN pupa blanca (mutación en el gen wp) ambos localizados en el cromosoma 5 (Robinson, 1999), funcionando como un control visible para la detección de recombinantes. Estas mutaciones permiten una separación eficiente de los sexos en etapas tempranas del desarrollo, mediante la aplicación de condiciones selectivas de temperatura durante el desarrollo. Para C. capitata ha sido posible llevar esta CSG a niveles de cría masiva, los que se requieren para la aplicación de la TIE (Franz, 2005), siendo el programa de Sexado Genético de la Mosca del Mediterráneo uno de los más exitosos a nivel mundial, ya que ha sido lo suficientemente mejorado para permitir su aplicación en áreas de gran extensión y durante un periodo de tiempo prolongado (Cáceres et al., 2002, Pérez-Staples et al., 2020). Para el caso de A. fraterculus es una técnica en vías de desarrollo (Cladera et al., 2014). 1.3.2 Control biológico El Control Biológico se basa en la liberación de enemigos naturales que incluyen parasitoides, predadores, patógenos, antagonistas o competidores de la plaga, con el objetivo de suprimirla y/o disminuir su tamaño poblacional a densidades por debajo del umbral de daño económico (DeBach, 1964; van Driesche y Bellows, 1993). Existen 3 tipos de CB (Greathead y Waage, 1983): -- Control biológico clásico: consiste en la introducción de una especie exótica para el control de una plaga. El objetivo es que se establezca de forma permanente, pasando a formar parte de la fauna de la zona. - Control biológico aumentativo: consiste en incrementar la población de enemigos naturales mediante crías en laboratorio, para luego liberarlos en gran cantidad varias veces al año. No se tiene como objetivo el establecimiento del agente de control. - Control biológico por conservación: se basa en la modificación del entorno y de las prácticas existentes con el fin de proteger y aumentar la población de enemigos naturales ya presentes en el entorno. 22 INTRODUCCIÓN Los diferentes tipos de control anteriormente descriptos, son implementados mediante programas de manejo integrado de plagas (MIP) que combinan métodos complementarios ya sea, físicos, mecánicos, químicos, biológicos, genéticos, legales y culturales para lograr el control de plagas agrícolas. El MIP es una estrategia ecológica que aspira a reducir o eliminar el uso de plaguicidas y de minimizar el impacto al medio ambiente. Estos pueden incluir trampas, insecticidas con toxicidad selectiva o atrayentes sexuales o alimenticios para las plagas objetivo, uso de paraferomonas, la técnica de insectos estériles, control biológico y saneamiento en el campo (Ehler, 2006). 1.3.3 El parasitoide como controlador biológico D. longicaudata fue seleccionado para su uso como agente de control biológico de moscas de la fruta debido a la amplia variedad de hospedadores que parasita y a su alta capacidad de adaptarse a los diferentes ambientes enlos que ha sido introducido (Aluja et al., 1990, México) (Baranoski et al., 1993 EEUU) (Schliserman et al., 2003 Argentina) que ha facilitado su establecimiento en ambientes silvestres y en laboratorio (Wong y Ramadan, 1992; Cancino y Yoc, 1993, Cancino y Montoya, 2008). Este parasitoide ha sido utilizado en liberaciones aumentativas como parte del Manejo Integrado de Plagas en México (Cancino et al., 2019); y en Argentina (Ovruski et al., 1999). 1.4 Interacciones entre insectos El uso de las técnicas de control biológico plantea el manejo de las interacciones existentes en el agroecosistema donde es necesario controlar una plaga. Por lo cual es necesario conocer las características de los ambientes, cultivos e interacciones biológicas y comprender los ciclos productivos. Dado el riesgo que implica la liberación de un organismo como agente de control biológico, se deberá analizar la introducción 23 INTRODUCCIÓN y la competencia de los controladores con los organismos nativos a fin de asegurar la eficacia de la estrategia de control. En la naturaleza existen relaciones entre organismos de la misma especie (intraespecíficas) y organismos de diferentes especies (interespecíficas). Estas se pueden clasificar en dos modelos: -- Facultativas: Las especies aisladas no se influyen, sin embargo, cuando están en contacto siguen indiferentes o se perjudican mutuamente. -- Obligatorias: Cuando dos especies de forma de vida diferente, al estar en contacto, una de ellas obtiene un beneficio no recíproco de su asociación con la otra, o ambas se benefician mutuamente. El término “simbiosis” fue definido por primera vez por De Bary en 1879 y fue utilizado para describir dos o más especies diferentes viviendo en una asociación intima entre sí. Típicamente el hospedador es de mayor tamaño que el simbionte. Dependiendo del efecto que tiene el simbionte en el hospedador, se puede categorizar las formas de simbiosis observadas en: -- Mutualismo: Consiste en una asociación en la que ambas especies obtienen un beneficio mutuo. Este tipo de asociación, es tan positiva para algunas especies que no podrían sobrevivir de forma independiente. -- Comensalismo: Es una interacción en la que una especie se beneficia y la otra no se ve afectada. El animal comensal se aprovecha de los restos de comida no utilizados, así como de mudas, descamaciones o secreciones de otra especie sin causarle perjuicio. -- Parasitismo: Las especies parásitas son aquellas que viven a expensas de otras especies denominadas hospedadores. El parásito perjudica al hospedador, aunque no suele causarle la muerte inmediata ya que su objetivo principal es alimentarse de él. Los parásitos pueden ser ecto o endoparásitos, dependiendo si viven fuera o dentro del hospedador, respectivamente. Otros tipos de interacciones que podemos encontrar entre especies: 24 INTRODUCCIÓN -- Competencia: Dos especies desempeñan una función semejante dentro del ecosistema, luchando ambas por mantener el nicho ecológico y dejar más descendencia que desplace la otra especie. . -- Depredación: Es la forma de relación por la cual el depredador se alimenta de la presa, capturándola y provocándole la muerte. -- Parasitoidismo: Es una relación interespecífica intermedia entre la depredación y el parasitismo. Los parasitoides son por lo general más específicos que los depredadores dado que han evolucionado sofisticados ovipositores que se encuentran especialmente en las familias Ichneumonidae y Braconidae, y en especies que parasitan larvas protegidas en lugares de difícil acceso, como troncos de árboles y túneles en el suelo. En asociaciones del tipo hospedador-parasitoide, ambos organismos pueden influenciar recíprocamente al otro en cuanto a su crecimiento y desarrollo (Lawrence y Lanzein, 1993). La compatibilidad hospedador-parasitoide resulta del balance entre dos situaciones que dependen de la habilidad de las especies involucradas (Strand y Pech, 1995): a) la habilidad del parasitoide de invadir (o suprimir la defensa del hospedador) y satisfacer sus requerimientos para su propio desarrollo. b) la habilidad del hospedador de reaccionar contra el parasitoide manifestando una respuesta inmune innata e impidiendo el desarrollo del invasor. 1.5 Respuesta inmune en insectos 1.5.1 Generalidades Los organismos multicelulares están continuamente expuestos a microorganismos patógenos y han generado diversos mecanismos de defensa que los protegen de la infección (Hoffmann et al., 1999). Los animales pueden defenderse de las infecciones causadas por organismos patógenos a través de dos tipos de respuesta inmune: inmunidad innata e inmunidad adquirida (o adaptativa). Estas dos respuestas se 25 INTRODUCCIÓN distinguen por su origen, la manera de reconocer al invasor y el mecanismo por el cual cura o previene la propagación de la infección (Iwasaki y Medzhitov, 2015). La respuesta inmune innata es general, no especifica y responde de manera similar a un desafío repetido (Medzhitov y Janeway, 2000). Estudios recientes han demostrado que la respuesta inmune innata de insectos es más robusta y específica de lo previamente pensado, desde que se incluyeron estudios que demuestran efectos protectores del priming del sistema inmune en insectos (Cooper y Eleftherianos, 2017). La respuesta inmune adaptativa, por su parte, se caracteriza por dos rasgos claves: 1- habilidad de “recordar” al invasor, lo que permite una respuesta más rápida en una subsecuente infección, y 2- capacidad de generar una respuesta fuerte dirigida a un invasor particular, lo cual sugiere que la defensa es especifica de ese inductor (Litman et al., 2010). La cutícula es considerada la primera línea de defensa en insectos, está constituida por capas de quitina, agua, proteínas, catecol, lípidos y ocasionalmente metales y minerales, secretada por una sola capa de células epidérmicas (Vincent y Wegst, 2004). Esta estructura otorga rigidez al organismo y constituye una barrera que previene la entrada de contaminantes y organismos invasores (Dunn, 1991). Asimismo, existen evidencias sobre la ocurrencia de reacciones de defensa en la cutícula, como la síntesis de compuestos antibacteriales que además poseen otras funciones importantes en la curación de heridas y en la muda (Brey et al., 1993). Otro compuesto de defensa hallado en la cutícula es la tirosinasa cuticular aislada de C. capitata, la cual es capaz de reconocer e inmovilizar bacterias (Marmaras et al., 1993; Charalambidis et al., 1995). Los insectos poseen tres tejidos que participan de la respuesta inmune innata: el cuerpo graso, el intestino, y las glándulas salivales (Figura 4). El cuerpo graso, es el principal tejido encargado del almacenamiento de energía, síntesis de vitelogenina, metabolitos y hormonas (Arrese y Soulages, 2010), y además produce y secreta componentes antimicrobianos y polipéptidos con actividad lítica que luego serán secretados a la hemolinfa como parte de la respuesta inmune innata (Charroux y Royet, 2010). El intestino, posee la función principal de digestión y absorción de nutrientes y también participa en la defensa contra patógenos mediante la producción de la enzima óxido nítrico sintetasa y otros factores líticos con acción en el lumen del 26 INTRODUCCIÓN intestino (Buchon et al., 2009). Por otro lado, las glándulas salivales, un órgano involucrado principalmente en las etapas iniciales de la alimentación, producen enzimas del tipo inhibidores de serina-proteasas que dificultan la viabilidad de los esporozoitos de Plasmodium, impactando en la viabilidad del microorganismo en Anophele gambiae (Pinto et al., 2008). También la hemolinfa juega un papel preponderante en la respuesta inmune, ocupando la totalidad de la cavidad interna del insecto. Este sistema se halla constituido por células (hemocitos) y compuestosorgánicos e inorgánicos disueltos (Lawrence, 2008). Figura 4: Anatomía del sistema inmune de un insecto (Hillyer, 2016). El sistema de inmunidad innata de insectos está compuesto por dos componentes interactivos, el componente humoral que involucra la síntesis y liberación de moléculas efectoras solubles, tales como péptidos antimicrobianos, y el componente celular que se caracteriza por la diferenciación de células especializadas para llevar a cabo reacciones de fagocitosis, nodulación y encapsulación (Strand, 2008). El inicio de la respuesta inmune requiere que el insecto reconozca al agente invasor. 1.5.2 Reconocimiento del patógeno Durante una infección, el reconocimiento del patógeno generalmente ocurre cuando los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, pathogen-associated 27 INTRODUCCIÓN molecular patterns) se unen a receptores de reconocimiento de patrones ubicados en el hospedador (PRR, pattern recognition receptors). Los PRR reconocen motivos conservados que están presentes en los microorganismos, pero están ausentes en los insectos. Ejemplos de PAMP son glucanos β-1,3 fúngicos, lipopolisacáridos (LPS) y peptidoglicanos (PGN) bacterianos (Medzhitov y Janeway, 2002). Moléculas asociadas a la herida y daño físico o enzimático de la cutícula producido por el insecto atacante (DAMPs, damage associated moleculars patterns) también pueden comportarse como inductores de la respuesta inmune (Krautz et al., 2014). Las DAMPs pueden ser diferentes tipos de moléculas, por ejemplo, H2O2 (Moreira et al., 2010), o ácidos nucleicos liberados por el daño al tejido (Altincicek et al., 2008), entre otros. 1.5.3 Vías de señalización y amplificación de la respuesta inmune El reconocimiento del patógeno induce la activación de vías de transducción de señales que amplifican la respuesta inmune, induce la producción de factores con actividad microbiana y potencia los mecanismos efectores. En insectos, las vías más caracterizadas son la vía Toll, la vía Imd y la vía Jak/Stat (Tsakas y Marmaras, 2010). La vía Toll es responsable de la detección de bacterias Gram-positivas y hongos, mientras que la ruta Imd es necesaria para las respuestas a las bacterias Gram- negativas y DAMP (Lindsay y Wasserman, 2014; Myllymaki et al., 2014). La vía Jak/Stat se activa por infecciones fúngicas y virales (Agaisse y Perrimon, 2004). Una tercera vía de señalización, RNAi, la cual es dirigida contra la infección por virus (Karlikow et al., 2014). El reconocimiento de patógenos activa las señales que amplifican las respuestas del sistema inmune, inducen la producción de péptidos y otros factores con actividad antimicrobiana y potencian los mecanismos efectores (Figura 5). Estos procesos constituyen complejos mecanismos que incluyen un amplio rango de reacciones inmunes humorales y celulares (Carton et al., 2008; Dubovskiy et al., 2016). 28 INTRODUCCIÓN En Drosophila, hay descriptas 7 familias génicas de péptidos antimicrobianos, que tienen además sus isoformas: Drosomicina, que tiene actividad antifúngica (Zhang y Zhu, 2009); Cecropina (Kylsten et al., 1990; Tryselius et al., 1992), Defensina y Drosocina (Bulet et al., 1993) son antibacteriales. La familia de las Metchnikowinas, cumplen ambas funciones antifúngica y antibacterial (Levashina et al., 1995), y Diptericina (Wicker et al., 1990) y Attacina (Asling et al., 1995) son antibacteriales. Otros genes antimicrobianos, tales como la óxido nítrico sintetasa, (NOS) son activados por alguna de las vías de señalización antes citadas (Foley y O’Farrell, 2003). Figura 5: Esquema de las vías de señalización Toll, Imd y Jak/Stat en mosquito (Hillyer, 2016.) En comparación con los microparásitos, el mecanismo por el cual el insecto hospedador reconoce a nematodos y parasitoides es menos conocido. Se piensa que un factor potencialmente involucrado en el reconocimiento de estos objetivos es la integridad de la membrana basal (BM), una matriz extracelular que rodea la mayoría de los tejidos. La BM de los insectos consta de muchos componentes que incluyen colágeno IV, laminina y algunos proteoglicanos (Yurchenco, 2011). El reconocimiento 29 INTRODUCCIÓN de la arquitectura molecular de la BM está mediado por lectinas a través de motivos específicos de unión a carbohidratos. Las lectinas son proteínas de unión a carbohidratos dependientes de calcio que pueden unir azúcares terminales en la superficie de los microorganismos (Ao et al., 2007). En especial, las lectinas de tipo C (CTL, C-type lectin) funcionan extracelularmente y son secretadas o permanecen unidas a la membrana. En los insectos, las CTL juegan un papel clave en la inmunidad innata, funcionando como PRR, para promover respuestas celulares y humorales (Schnitger et al., 2009). 1.5.4 La respuesta celular Este tipo de respuesta inmune está fundamentalmente asociada a la actividad de los hemocitos, células presentes en el hemocele de los insectos. Los hemocitos han sido caracterizados y clasificados utilizando características morfológicas, histoquímicas y funcionales (Gupta, 1985; Lawrence, 2008). Las poblaciones de hemocitos se pueden dividir utilizando dos criterios: su estado espacial y sus propiedades funcionales. Desde una perspectiva espacial, los hemocitos circulan con la hemolinfa, en cuyo caso se denominan hemocitos circulantes, o se hallan adheridos a los tejidos, en cuyo caso se denominan hemocitos sésiles (Strand, 2008; Hillyer y Strand, 2014). El número de hemocitos en circulación puede aumentar rápidamente en respuesta al estrés, heridas o infección (Ratcliffe et al., 1985). En cuanto a la funcionalidad, la mayoría de los insectos tienen varias subpoblaciones de hemocitos que son morfológica y funcionalmente distintas, pero la nomenclatura para estas poblaciones de células no está normalizada en la clase Insecta. Por ejemplo, larvas de lepidópteros contienen cuatro tipos distintos de hemocitos: plasmatocitos que participan en la formación de la cápsula, granulocitos que impulsan la fagocitosis, enocitoides que producen enzimas involucradas en la cascada de melanización (ej., fenoloxidasa) y células esféricas cuya función inmunitaria sigue sin estar clara (Lavine y Strand, 2002; Strand, 2008). Los mosquitos, por otro lado, tienen granulocitos fagocíticos, enocitoides productores de fenoloxidasa y prohemocitos (Castillo et al., 2006). Como ejemplo final, Drosophila 30 INTRODUCCIÓN melanogaster tiene plasmatocitos fagocíticos, células cristal productoras de fenoloxidasa (PO) y lamelocitos encapsulantes (Honti et al., 2014). En Figura 6 se muestran los diferentes tipos de hemocitos diferenciados en circulación en larvas de Drosophila. Los plasmatocitos representan el 90%-95% de todos los hemocitos maduros, son de adherencia fuerte in vitro, su función es la fagocitosis de patógenos y células muertas. Las células cristal son no adhesivas, comprenden el 5% de los hemocitos circulantes y expresan y almacenan los componentes de la cascada fenoloxidasa (PO) tales como la enzima profenoloxidasa 1 (PP01); cuya activación desencadena la formación de melanina (Strand, 2008). Los lamelocitos están ausentes en larvas sanas, pero se diferencian rápidamente desde pro-hemocitos cuando son invadidos por grandes intrusos como huevos de parasitoides o durante la metamorfosis. Son grandes, chatos, adhesivos y su principal función es la encapsulación de parasitoides y otros invasores grandes (Lanot et al., 2001. Honti et al., 2014). Los órganos hematopoyéticos en artrópodos son las glándulas linfáticas que se forman bilateralmente a lo largo de la parte anterior del vaso dorsal durante la embriogénesis. Los hemocitos se diferencian durante el estadio embrionario temprano y continúan dividiéndose durante toda la vida del insecto (Grigorian y Hartenstein, 2013). Figura 6: Tipos de hemocitosdiferenciados en circulación en larvas de Drosophila (Strand, 2008). 31 INTRODUCCIÓN Los procesos celulares de defensa a patógenos pueden clasificarse siguiendo las descripciones de Strand (2008) en: - Fagocitosis - Nodulación - Encapsulación La fagocitosis es el mecanismo celular por el cual se produce el reconocimiento, recubrimiento y destrucción intracelular de patógenos invasores por medio de hemocitos fagocíticos individuales (Rosales, 2011). La unión del PRR, presente en el agente invasor o generado luego del daño al tejido del hospedador, a su receptor en la membrana del hemocito induce a la célula inmune a la formación de un fagosoma. Esto resulta en el invasor envuelto mediante un mecanismo dependiente de polimerización de actina, seguido de la maduración del fagosoma a fagolisosoma por una serie de eventos de fusión con endosomas y lisosomas (Stuart y Ezekowitz, 2008; Melcarne et al., 2019). La nodulación se caracteriza por ser una respuesta multicelular de defensa a un gran número de bacterias. Esta reacción puede culminar, o no, con la melanización. Por otro lado, la coagulación de la hemolinfa ocurre en sitios externos donde ha ocurrido una herida comenzando por la formación de un coagulo que atrapa microorganismos y sella la herida (Theopold et al., 2004; Bidla et al., 2005). En respuesta a grandes invasores, los insectos utilizan el mecanismo de encapsulación, el cual se refiere a la unión múltiple de hemocitos a patógenos tales como huevos de parasitoides, protozoos y nematodes. El proceso de encapsulación se inicia dentro de los primeros minutos luego de la penetración a la hemolinfa del organismo invasor (Dubovskii et al., 2010), dependiendo de las especies de insectos hospedador y las propiedades del invasor, las cápsulas pueden formarse continuamente durante 2-24 hs (Carton et al., 2008). En la mayoría de los casos al día siguiente de la penetración por el invasor, la cápsula es claramente visible, pero es considerada completa solo luego de las 72 hs (Ratcliffe y Gagen, 1977). Las cápsulas formadas por hemocitos a menudo melanizan (Strand y Pech, 1995). La melanización es una respuesta efectora inmune que se activa localmente en respuesta a la lesión de la cutícula o sistémicamente 32 INTRODUCCIÓN después de la invasión ocurrida en el hemocele. La melanina tiene al menos 2 características que la relacionan con un aumento en la inmuno-competencia, 1- debido a que se trata de un polímero, es posible que contribuya al endurecimiento del exoesqueleto del insecto durante la esclerotización, dificultando la entrada de invasores incluidos los parasitoides, y 2- es tóxica para microorganismos con potencial acción microbiana (Andersen, 2010). Una enzima clave en la biosíntesis de melanina es la fenoloxidasa (PO) que media la oxidación de la tirosina a dihidroxifenilalanina y la oxidación de la dihidroxifenilalanina y la dopamina a sus quinonas respectivas que son precursoras de la formación de melanina (revisado en Vavricka et al., 2010). La PO se produce como zimógeno de profenoloxidasa (PPO) que es activada por las proteasas CLIP. Estas enzimas son serina proteasas no digestivas presentes en la hemolinfa de insectos y otros artrópodos (Kanost y Jiang, 2015). Las CLIP actúan en cascadas para modular varias respuestas inmunes, incluida la coagulación, melanización y síntesis de péptidos antimicrobianos (AMP). Las cascadas CLIP que controlan la activación de PPO están estrechamente reguladas por sus inhibidoras, las enzimas llamadas serpinas (Kanost y Jiang, 2015). Las serpinas son la familia más grande de inhibidores de serina proteasas que regulan varios procesos fisiológicos en los insectos, incluido el desarrollo embrionario, la coagulación de heridas y la defensa del hospedador (Gulley et al., 2013). Durante la melanización también se producen especies reactivas de Oxigeno (ROS) y de Nitrógeno (RNS) (Nappi et al., 2000). Estas pueden favorecer la melanización o intervenir en la muerte del invasor. Los cambios en la cantidad de células en circulación pueden estar dados por una rápida producción de lamelocitos después del ataque de un parasitoide (Sorrentino et al., 2002; Wertheim et al., 2005) o porque muchos de los hemocitos son sésiles y pueden entrar rápidamente en circulación en el momento requerido (Castillo et al., 2006). 33 INTRODUCCIÓN Figura 7: Reconocimiento de invasores por PRRs en la hemolinfa de insectos (Dubovskiy et al., 2016). 1.6 Estrategias de evasión de la respuesta inmune del hospedador por parte de parasitoides Los parasitoides han co-evolucionado junto a sus especies hospedadoras y han demostrado una importante cantidad de mecanismos que les permiten manipular la fisiología y bioquímica de su hospedador, de forma tal de crear un ambiente propicio para su propio desarrollo (Beckage, 1997). Entre estos mecanismos se pueden citar aquellos parasitoides que no matan a su objetivo al instante, sino que los mantienen con vida, y así poder utilizarlos como un suministro de alimentos frescos para sus crías (parasitoide koinobionte). Evitar y limitar la inmunidad, la fisiología, la movilidad, la capacidad reproductiva e incluso el comportamiento del hospedador son factores que favorecen el desarrollo del parasitoide. Estos mecanismos de evasión fueron descriptos por primera vez en el sistema D. melanogaster-Leptopilina heterotoma (Schneider, 1950). 34 INTRODUCCIÓN 1.6.1 Estrategias activas de evasión Como resultado de la co-evolución, algunos parasitoides himenópteros poseen factores activos maternos y embrionarios que inhiben las defensas de sus hospedadores (Asgari y Rivers, 2011). Estos factores activos incluyen proteínas parecidas a virus (VLP, virus-like particles) contenidas en el fluido ovárico, sintetizadas y secretadas por las glándulas de veneno (Rizki y Rizki, 1990). El veneno inyectado junto con el huevo del parasitoide puede contener factores inmunosupresores que difieren según el grupo de parasitoides. El veneno de los ectoparasitoides está involucrado en gran medida en la parálisis del hospedador (a corto o largo plazo) para asegurar la alimentación de la larva ectoparasitaria fuera de la cavidad corporal del hospedador. En el caso de los endoparasitoides, el veneno depositado junto con el huevo del parasitoide rara vez causa parálisis, pero facilita la parasitación al interferir con el sistema inmunitario del hospedador (Asgari, 2012). En endoparasitoides, se conocen componentes del veneno inmunosupresor que afectan a los hemocitos del hospedador, causando una reducción en el recuento total y en su capacidad para encapsular. Estos incluyen P4 (que contiene un dominio RhoGAP, proteína activadora de Rac GTPasa), por lo que afecta la propagación y agregación de lamelocitos en Leptopilina boulardi (Hymenoptera: Figitidae) (Labrosse et al., 2005), calreticulina (CRT) de Cotesia rubecula (Hymenoptera: Braconidae) (Zhang et al., 2006), VPr1, VPr3 de Pimpla hypochondriaca (Richards et al., 2013), Vn.11 de Pteromalus puparum (Hymenoptera: Pteromalidae) (Hymenoptera: Ichneumonidae) (Wu et al., 2008), y ATPasa cálcica del retículo endoplásmico / sarco (SERCA) de Ganaspis sp.1 (Hymenoptera: Figitidae) (Mortimer et al., 2013). Otras proteínas y péptidos del veneno, como por ejemplo Vn4.6 (Asgari et al., 2003) y Vn50 (Asgari et al., 2003b) de C. rubecula, LbSPNy (Colinet et al., 2009) y Zn-superóxido dismutasa (Colinet et al., 2011) de especies de Leptopilina inhiben la melanización. Los teratocitos también forman parte de las estrategias para la supervivencia del huevo dentro del hemocele del hospedador (Pennacchio y Strand, 2006). Estas células fueron descriptas en las familias Braconidae, Platygasteridae y Scelionidae y son derivadas de tejidos extraembrionarios. Tienen funciones tróficas, inmunosupresoras y secretoras, dependiendode las especies, de la etapa de vida del hospedador en la que 35 INTRODUCCIÓN es parasitado, y el tiempo que pasa el parasitoide dentro. Son liberados dentro del hospedador cuando el huevo eclosiona (Dahlman, 1991). En resumen, la forma más directa de prevenir la encapsulación es la destrucción de los hemocitos que median la formación de la cápsula, o bien la alteración de su comportamiento. 1.6.2 Estrategias pasivas de evasión Las estrategias de evasión de la respuesta inmune del hospedador por parte del parasitoide también pueden darse de manera pasiva (Davies, 1986; Asgari et al., 1994). Entre las mismas, podemos citar algunas: -- Evitación por completo de la defensa inmune: Por ejemplo, los ectoparasitoides oviponen por fuera del hospedador, fuera del alcance de la hemolinfa (Godfray, 1994). Otro mecanismo de evitación ha sido descripto en parasitoides del género Trichogramma que infectan el estado de huevo de su hospedador, el cual no presenta ninguna defensa inmunológica, es decir, oviponen en hospedadores inmuno- incompetentes (Parra et al., 1987). Esta estrategia también ha sido utilizada de manera eficiente por parasitoides de Drosophila subobscura, hospedador deficiente de lamelocitos, los cuales son necesarios para el proceso de encapsulación (Eslin y Doury, 2006). -- Evitación local del sistema inmune: El desarrollo del parasitoide en órganos del hospedador la hace inaccesible a factores inmunes. Por ejemplo, Asobara tabida, parasitoide de especies del género Drosophila, deposita sus huevos y estos se adhieren a tejidos del hospedador gracias a propiedades adhesivas del corion o presentan moléculas que previenen que los hemocitos se adhieran en su superficie (Eslin et al., 1996). -- Caracteres de la superficie: Se pueden producir epitopes compartidos por el hospedador (molecular mimicry), es decir, factores de superficie que carezcan de la acción de desencadenar/estimular una respuesta inmune, o adquisición de factores de reconocimiento desde el hospedador mismo (Vinson, 1990). 36 INTRODUCCIÓN 1.7 Simbiontes que participan en la interacción hospedador-parasitoide La simbiosis, la convivencia de organismos diferentes, ha sido reconocida por su importancia fundamental en la historia de la vida (Douglas, 2010). La endosimbiosis se relaciona con la situación en la que los simbiontes, generalmente microbios, residen dentro de las células de sus hospedadores. Los endosimbiontes bacterianos son extremadamente abundantes entre los invertebrados, particularmente entre los artrópodos (Zchori-Fein y Bourtzis, 2011). En el estudio de interacciones consideramos importante la determinación de la presencia y caracterización de microorganismos simbiontes ya que estos podrían estar representando una ventaja para alguno de los integrantes de la relación hospedador/parasitoide. 1.7.1 Virus Como se mencionó anteriormente, una de las estrategias de evitación de la respuesta inmune del hospedador es la asociación del parasitoide con PDV. Los PDV son virus de insectos distinguibles por sus múltiples segmentos de ADN bicatenario superhelicoidal. Los PDV están simbióticamente asociados a las avispas de los órdenes Ichneumonidae y Braconidae, y se integran a su genoma (Fleming y Summers, 1991). La replicación viral está restringida a células que residen en los ovarios de las hembras, las células del calix. Allí se replican y empacan los virus que luego serán inyectados junto con el huevo del parasitoide. En el hospedador no replican, pero a través de la expresión de genes virales, ejercen una variedad de cambios fisiológicos que afectan las defensas del hospedador y otros procesos que son esenciales para la supervivencia del parasitoide (Strand, 2012). Por ejemplo, se observó apoptosis de granulocitos asociada a la expresión de genes virales del Microplitis demolitor PDV (Strand y Pech, 1995). En el parasitoide bracónido D. longicaudata se ha caracterizado la presencia del Entomopoxvirus Diachasmimorpha longicaudata (DLEPV) (Lawrence y Akin, 1990). Este EPV es inusual por el hecho que replica en ambos insectos, la avispa y el díptero 37 INTRODUCCIÓN hospedador, pero solo es patogénico en el díptero (Lawrence, 2005). El DLEPV no expresa un cuerpo de oclusión (esferoidina) como si lo hacen todos los demás EPV (Moyer y Hall, 1995). Además del DLEPV, en D. longicaudata también se ha determinado la presencia de un rhabdovirus a ARN simple cadena, el DlRhV. Este virus, a pesar de codificar la proteína psp24 (parasitism-specific protein 24), no es crucial para un parasitismo exitoso y es transmitido transováricamente en forma de viriones y / o de ARN no encapsidado (Lawrence y Matos, 2005). Otros órdenes de virus también pueden manipular el comportamiento del parasitoide hospedador, como por ejemplo el virus Leptopilina boulardi Filamentous Virus (LbFV) infectando hembras del parasitoide Leptopilina boulardi, donde la infección por este virus hace que las hembras se vean mucho más inclinadas hacia el superparasitismo (Varaldi et al., 2006). Esta modificación en el comportamiento aparentemente tiene sentido para el virus porque, dentro de las larvas de Drosophila superparasitadas, las partículas virales pueden transmitirse horizontalmente (aproximadamente el 55% de la transmisión es exitosa) de los embriones infectados a los no infectados (Varaldi y Lepetit, 2018). 1.7.2 Wolbachia Wolbachia es una bacteria Gram-negativa endosimbionte de células de artrópodos y nematodes filariales. Se estima que el 40% de los artrópodos está infectado por Wolbachia (Zug y Hammerstein, 2012) siendo este porcentaje mayor si se tiene en cuenta artrópodos acuáticos (Sazama et al., 2017) por lo que, probablemente, sea el simbionte intracelular más abundante de la Tierra. El éxito evolutivo de Wolbachia es generalmente atribuido a los mecanismos de parasitismo reproductivo que posee, los cuales aseguran su transmisión vertical a la descendencia (Stouthamer et al., 1999). Se ha detectado esta bacteria en diversos tejidos de insectos, incluyendo gónadas, sistema nervioso e intestino (Dobson et al., 1999). Estas manipulaciones reproductivas incluyen feminización de machos genéticos, inducción de partenogénesis, matanza del macho e incompatibilidad citoplasmática (Werren et al., 2008), (Figura 8). Siendo este último fenotipo el más frecuente y ocurre cuando machos infectados con Wolbachia se 38 INTRODUCCIÓN aparean con hembras no infectadas, este tipo de apareamiento resulta de una gran mortalidad de la descendencia. Mientras que una hembra infectada puede aparearse con éxito tanto con machos infectados y no infectados. La presencia del endosimbionte Wolbachia en insectos ha sido el disparador de numerosos estudios sobre la posibilidad de generar una estrategia alternativa de control de plagas basándose en el fenotipo de la esterilidad inducida, a través de la técnica del insecto incompatible (TII) propuesta desde la década del ´70 (Yen y Barr, 1971; Boller et al., 1976). Esta técnica se basa en la esterilidad condicional en cruzas entre machos infectados con Wolbachia, criados en masa y posteriormente liberados; y hembras salvajes, que no están infectadas o están infectados con una cepa diferente de Wolbachia. Ya se han reportado avances en la investigación y aplicación de esta técnica, en combinación con la TIE, para el control de plagas (en Drosophila suzukii, Nikolouli et al., 2018; en C. capitata, Zabalou et al., 2009; en Bactrocera oleae, Apostolaki et al., 2011) y en insectos de importancia sanitaria (en Aedes albopictus, Zheng et al., 2019; en A. aegypti, Carvalho et al., 2020). Figura 8: Mecanismos de parasitismo reproductivo provocados por la infección de Wolbachia. Werren et al., 2008. 39 INTRODUCCIÓN Otro aspecto de la biología de Wolbachia al que también puede asociarse su distribuciónpandémica es la transmisión horizontal entre diferentes especies hospedadoras, particularmente si esta ocurre a través de grandes distancias filogenéticas (Zug y Hammerstein, 2012). Además, la distribución global de Wolbachia podría estar facilitada por efectos mutualísticos tales como, aumentar la fecundidad de su hospedador (Hosokawa et al., 2010; Miller et al., 2010), aumentar la longevidad (Aleksandrov et al., 2007) o proveyendo protección contra patógenos (Wong et al., 2011; Zug y Hammerstein, 2015). En el caso de protección contra patógenos, se puede citar la resistencia a la infección por virus (Hedges et al., 2008; Teixeira et al., 2008; Moreira et al., 2009). Por ejemplo, en el caso de D. simulans al estar infectada con Wolbachia se observó que las partículas virales se acumulan más lentamente y que la mortalidad inducida por virus se encuentra sustancialmente retrasada (Osborne et al., 2009). También se han reportado efectos negativos de la infección por Wolbachia sobre rasgos relacionados con la inmunidad en el sistema D. simulans / L. heterotoma, donde se observó que la presencia de Wolbachia en el hospedador disminuye la capacidad de éste de encapsular y defenderse de la parasitación por parte del parasitoide (Fytrou et al., 2005). Entre los mecanismos propuestos por los cuales Wolbachia articula la supervivencia y fisiología de su hospedador se encuentra la manipulación sobre la sintesis de los microARN (miARN) de éste, al controlar la expresión de genes del hospedador y facilitar su propia supervivencia y transmisión a la vez que afecta la permanencia y transmisión de otros simbiontes (Hussain et al., 2011). La presencia de Wolbachia en el parasitoide D. longicaudata solo ha sido reportada en una única oportunidad (Sintupachee et al., 2006) sin estudios posteriores ni detalles de los efectos de esta infección en el parasitoide. Sin embargo, esta bacteria se encuentra ampliamente distribuida entre avispas parasitoides de los órdenes Braconidae (Kremer et al., 2009, Mascarenhas et al., 2016, Mohammed et al., 2017) e Ichneumonidae (Cook et al., 1999). Siendo en algunos casos un simbionte obligatorio para la ovogénesis, lo que hace que las hembras aposimbióticas sean estériles (Dedeine et al., 2001). 40 INTRODUCCIÓN La única ocurrencia de Wolbachia en Ceratitis capitata ha sido reportada en 2005 en 3 muestras provenientes de una población natural de Brasil y de colonias de laboratorio (Rocha et al., 2005). Mientras que en A. fraterculus su incidencia es mucho mayor (Selivon et al., 2002, Coscrato et al., 2009, Marcon et al., 2011, Prezotto et al., 2017. Conte et al., 2019, Devescovi et al., 2019). En cuanto a la infección de Wolbachia en tefrítidos ha sido recientemente revisada donde aproximadamente un 66% de 87 especies de moscas tefrítidas examinadas tienen al menos un registro de infección por Wolbachia positivo (Mateos et al., 2020). 1.7.3 Spiroplasma Spiroplasma (Spiroplasmataceae, Entomoplasmatales) es un género de bacterias Gram+, sin pared celular y bajo contenido de GC en su genoma, distinguidos por su morfología helicoidal. La mayoría se encuentran en asociación comensalista en plantas e insectos, mientras que una baja proporción son mutualistas y patogénicos (Gasparich, 2010). Se ha detectado en diferentes tejidos de insectos, incluyendo glándulas salivares, intestino, cuerpo graso, ovarios y hemolinfa. Algunas cepas pueden provocar el desvío de la tasa sexual hacia hembras mediante el mecanismo de matanza selectiva de la descendencia masculina (Regassa y Gasparich, 2006). En cuanto a la participación de este simbionte en la interacción hospedador-parasitoide se han reportado casos en los que la infección por Spiroplasma mejora la supervivencia y fecundidad del hospedador; Drosophila hydei; al ser atacado por parasitoides del género Leptopilina (Xie et al., 2011; 2014) 1.8 Antecedentes de estudios de interacción en A. fraterculus y C. capitata La idoneidad y capacidad del parasitoide D. longicaudata como controlador biológico de A. fraterculus y C. capitata ha sido ampliamente estudiada (Viscarret et al., 2006; Sánchez et al., 2016; Montoya et al., 2017; Cancino et al., 2019; de Pedro et al., 2019) aunque poco se conoce en cuanto a la interacción entre ellos a nivel molecular y la 41 INTRODUCCIÓN presencia de simbiontes y si estos pueden interferir en dicha interacción y como lo hacen. A nivel molecular, la respuesta de encapsulación en C. capitata evocada por parasitoides ha sido evaluada y aún no evidenciada, aunque la aceptabilidad de los hospedadores e idoneidad de los parasitoides frente a la parasitación ha sido ampliamente estudiada en el género Ceratitis, particularmente para las especies parasitoides Psyttalia concolor y D. longicaudata (Mohamed et al., 2003; Mohamed et al., 2008; revisado por Sorrentino, 2016). Por otro lado, un estudio, realizado en C. capitata con el parasitoide pupal Coptera occidentalis permitió identificar un 80% de parasitación, sin evidencias de encapsulación (Kazimírová y Vallo, 1992; Sorrentino, 2016). Se ha evidenciado melanización de D. longicaudata en estadio larval 1 cuando se utilizaron como sustrato de oviposición larvas de C. capitata irradiadas (Suarez et al., 2020). En el caso de A. fraterculus no hay ensayos que evidencien el tipo de interacción con parasitoides en el momento de la parasitación. Se han caracterizado las células sanguíneas que participan de la respuesta inmune específica ante la parasitación en A. oblicua, registrando la clasificación y morfología de las mismas en los estados de larva parasitada y no parasitada a partir de individuos colectados a campo (Silva et al., 2002), encontrándose diferencias significativas solo al final del tercer estadio larval entre larvas parasitadas y no parasitadas en el conteo diferencial de pro-hemocitos. 2. OBJETIVOS 43 OBJETIVOS 2.1 Objetivo general En este marco teórico, la presente Tesis Doctoral propone como objetivo general estudiar los factores genético-moleculares involucrados en la interacción entre el parasitoide D. longicaudata y sus hospedadores, C. capitata y A. fraterculus. Dentro de los factores asociados a este sistema, nos propusimos evaluar el efecto fisiológico de la parasitación por parte de D. longicaudata sobre sus hospedadores y comenzar a explorar las bases moleculares de la respuesta inmune en el hospedador, como así también identificar y caracterizar simbiontes posiblemente asociados a los efectos encontrados. Estos estudios permitirán aportar información para mejorar la producción masiva de parasitoides, plantear la técnica del Insecto Estéril para A. fraterculus y proyectar a la implementación de técnicas innovadoras de control biológico, contribuyendo así al control no contaminante de moscas plaga de los frutos. 2.2 Objetivos específicos 1. Caracterizar la reacción inmune de C. capitata y A. fraterculus ante el ataque del parasitoide D. longicaudata y medir su impacto sobre la tasa de parasitismo en cepas de laboratorio. 2. Analizar la expresión de genes candidatos en C. capitata y A. fraterculus a participar en la respuesta a la parasitación por D. longicaudata. 3. Detectar y caracterizar agentes simbiontes en C. capitata, D. longicaudata y A. fraterculus y medir su impacto directo sobre la respuesta inmune, e indirecto sobre la tasa de parasitismo. Para desarrollar las actividades asociadas a cada objetivo, utilizamos las siguientes hipótesis de trabajo para planificar los ensayos y experimentos: 44 OBJETIVOS 2.3 Hipótesis de trabajo 1. Durante la parasitación de larvas de C. capitata y A. fraterculus por D. longicaudata se desencadena una respuesta inmune en el hospedador que se manifiesta por la encapsulación y melanización del huevo del parasitoide.2. La respuesta inmune del hospedador, ante el ataque del parasitoide, se manifiesta por la expresión diferencial de determinados genes del hospedador. 3. La presencia de agentes simbiontes en asociación con el parasitoide y/o el hospedador tiene un efecto sobre la respuesta inmune del hospedador y por lo tanto sobre el porcentaje de parasitismo alcanzado por el parasitoide. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 46 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Insectos utilizados en los ensayos 3.1.1 Diachasmimorpha longicaudata Los individuos de D. longicaudata utilizados en los experimentos de esta tesis provienen de la cría mantenida en el Laboratorio de Insectos de Importancia Agronómica del IGEAF-INTA-Castelar. La colonia fue iniciada con individuos provenientes del CIRPON, San Miguel de Tucumán (Ovruski et al., 2003) hace 18 años, por lo que se estima que posee aproximadamente 200 generaciones en el laboratorio hasta la actualidad. La misma, se mantiene en un nivel de cría experimental utilizando como sustrato de oviposición larvas de C. capitata. Para el mantenimiento de la cría de D. longicaudata se utilizó un procedimiento de rutina establecido en nuestro laboratorio por Viscarret et al. (2006). Brevemente, los adultos de ambos sexos se disponen en una jaula de 40x40x40cm3 con miel y agua ad libitum y se mantienen en condiciones controladas de temperatura (25±2ºC), humedad relativa (60±2%) y fotoperíodo (12:12 Luz: Oscuridad). Para la obtención de la siguiente generación, quincenalmente se realiza la exposición de larvas de C. capitata en estadio 2 tardío / 3 temprano (detalles de cría de C. capitata en la sección 3.1.3), aproximadamente siete días después de la colecta de huevos del hospedador, a hembras maduras del parasitoide, las cuales se encuentran es ese estado aproximadamente siete días desde la emergencia del adulto parasitoide. Las unidades de oviposición se arman con larvas de C. capitata en presencia de dieta larval, dispuestas en la base de una caja de Petri de 9 cm y recubiertas con una tela voile. Estas unidades se exponen a los parasitoides al disponerlas en el interior de la jaula o en la parte superior de la misma durante aproximadamente una hora. Se realizan aproximadamente 15 unidades por jaula en cada fecha de exposición. Las larvas parasitadas se transfieren a bandejas con dieta larval fresca para que completen su desarrollo. Esta bandeja se dispone dentro de otra que contiene vermiculita como sustrato de pupación (Figura 9). A los siete días se colectan las pupas y se procede a construir otra jaula para la emergencia de parasitoides de la próxima generación. 47 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 9: Exposición de larvas de C. capitata a D. longicaudata. A- Jaula de parasitoides adultos con unidades de ovoposición ubicadas sobre la jaula: B- vista externa; C- vista interna. D- Detalle de las unidades de oviposición colocadas en el interior de la jaula. 3.1.2 Anastrepha fraterculus La colonia de A. fraterculus usada en los experimentos en esta tesis deriva de un pie de cría de la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC, Tucumán), originalmente establecida con pupas recuperadas de frutos infestados de guayaba (Psidiun guajava L.) procedentes de la localidad Horco-Molle (Tucumán) en el año 1997, por lo que se estima unas 180 generaciones aproximadamente de mantenimiento en el Laboratorio. Las pupas de la cepa mantenida en la EEAOC fueron trasladadas al IGEAF y fueron utilizadas para establecer una nueva colonia en el Laboratorio de Insectos de Importancia Agronómica (IGEAF, INTA-Castelar), utilizando los mismos procedimientos de cría que en la EEAOC (Jaldo, 2007; Vera et al., 2007). La 48 MATERIALES Y MÉTODOS colonia actualmente se mantiene en condiciones de cría experimental en jaulas de metal con maya plástica 50x40x20 cm3 (25±2ºC), en condiciones controladas de temperatura humedad (60±2%) y fotoperíodo (12:12 Luz: Oscuridad) donde quincenalmente se realiza la colecta de huevos para la nueva generación. Siguiendo el protocolo descripto en EEAOC, los huevos se colectan a través de una de las caras de la jaula que posee una tela de voile siliconada y se disponen sobre una bandeja de dieta larval que a su vez se coloca sobre una bandeja de mayor tamaño con vermiculita como sustrato de pupación. Aproximadamente a los veinte días desde la postura de huevos, se colectan las pupas que constituirán la siguiente generación. Las líneas purificadas de A. fraterculus infectadas con distintas cepas de Wolbachia (Af- Af-Cast-1 y Af-Cast-2, detalles de la purificación en Sección 3.4.3.2), fueron mantenidas utilizando un protocolo similar al anteriormente descripto incluyendo cambios respecto del tamaño de la colonia. En este caso, se utilizaron frascos de vidrio de 5 litros tapados con tela voile y con presencia de agua y comida. Quincenalmente se realizó la colecta de huevos utilizando como dispositivo de postura un vial de acrílico cilíndrico de 30 ml con agua coloreada con colorante comestible rojo. Se mantuvieron dos frascos de cada línea, por cada generación trascurrida en los cuales se colocaron aproximadamente 25 machos y 25 hembras (Figura 10). Figura 10: Líneas de A. fraterculus infectadas con distintas cepas de Wolbachia. A- Frascos de mantenimiento de adultos con agua y comida. B- dispositivos para la postura de huevos. 49 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.3 Ceratitis capitata Para la realización de los experimentos de encapsulación y detección de simbiontes, como así también para la cría de rutina del parasitoide D. longicaudata, se utilizó la línea de C. capitata mantenida en el Laboratorio de Insectos de Importancia Agronómica (IGEAF), INTA-Castelar. Dicha colonia se inició en 1994 con pupas provenientes de una cría experimental del Instituto de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Mendoza (ISCAMEN), Mendoza, Argentina. Inicialmente, esta colonia se estableció con moscas salvajes recuperadas de duraznos infestados (Prunus persica L.). Desde ese momento, la colonia de C. capitata es mantenida según condiciones descriptas por Terán (1977). El protocolo de cría y mantenimiento de C. capitata fue similar al detallado para el caso de A. fraterculus, difiriendo solamente en los tiempos de desarrollo de los estadios inmaduros y la formulación de las dietas de larvas y adultos. Para esta tesis se utilizaron larvas provenientes de líneas mutantes para el color de pupa Pupa Blanca (PB) y Pupa Negra (PN), las cuales se aislaron a partir de mutantes naturales (surgidas espontáneamente) en la cría artificial de C. capitata. Las mismas se mantuvieron en las mismas condiciones de cría antes descriptas. 50 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2 Ensayos citológicos En esta sección se describirán los métodos utilizados en los experimentos considerando el Objetivo 1 propuesto. Principalmente, los ensayos involucraron el estudio del comportamiento del parasitoide asociado a la oviposición frente a sus distintos hospedadores y la reacción fisiológica visible a nivel citológico de las dos especies de hospedadores (C. capitata y A. fraterculus). 3.2.1 Encapsulación del huevo de D. longicaudata en larvas de C. capitata Para realizar este ensayo se sembraron en dieta larval (Terán, 1977) huevos de C. capitata provenientes de la cría del IGEAF-INTA y se mantuvieron a temperatura y humedad controladas (T: 25°C, HR 60%). Los huevos eclosionaron en esas condiciones y aproximadamente a los siete días, cuando las larvas se encontraban en estadio 2 tardío / 3 temprano se armaron unidades de oviposición y en las mismas condiciones que las descriptas en la sección 3.1.1 se realizó la exposición a parasitoides. Los parasitoides se encontraban sexualmente maduros (4-7 días post emergencia) y las hembras utilizadas tenían experiencia previa en oviposición.
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