Elucion

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ELUCIÓN 
Definición 
 
Es una técnica que consiste en separar los anticuerpos 
unidos o fijados a la membrana de los hematíes (GR 
sensibilizados por un anticuerpo) permitiendo su estudio e 
identificación. Son útiles en muchas investigaciones 
inmunohematológicas. Las técnicas de elución se utilizan 
para liberar, concentrar y purificar los anticuerpos. 
Un eluído/eluato es una solución de anticuerpos que 
previamente estaban pegados a la membrana del GR. Para 
que se defina como eluído esos anticuerpos tiene que 
haber estado pegados, esta es la diferencia entre ese 
mismo anticuerpo que puedo encontrar en un plasma del 
que voy a encontrar en un eluído. El eluído lleva implícito 
ese concepto de que ese anticuerpo que tengo presente en ese eluato estuvo previamente pegado. 
Lo que obtenemos finalizada la técnica es una solución pura (el eluato) con el anticuerpo que 
previamente estaba pegado al GR y un producto secundario de desecho que es la masa eritrocitaria 
lisada. Una vez que obtengo el eluato con el anticuerpo, puedo investigarlo con las técnicas que utilizo 
para estudiar normalmente el plasma/suero y presentarle paneles celulares para ver cuál es la 
identidad/especificidad de ese anticuerpo (estudio el eluato de la misma forma que estudio un 
plasma/suero). 
 
Objetivos 
 
1. ESTUDIAR ANTICUERPO: recuperar y aislar un anticuerpo y así poder estudiarlo con diferentes 
métodos. Obtengo un eluato con el anticuerpo y el GR queda destruido. 
2. ESTUDIAR HEMATÍES: son GR sensibilizados por un anticuerpo que interfiere en su estudio, entonces 
sacamos el anticuerpo que tiene pegado y estudiamos el GR. Obtenemos el GR intacto para estudiarlo 
y el anticuerpo desaparece. 
 
Aplicaciones Generales 
 
Los resultados de estas técnicas son importantes para el diagnóstico de laboratorio de la destrucción 
eritrocitaria como consecuencia de la interacción con un anticuerpo, es decir de causa inmune. Cuando 
decimos que algo es de causa inmune es porque estamos involucrando necesariamente la intervención de 
un anticuerpo. Cuando la lisis inmune, la hemólisis, la destrucción eritrocitaria es como consecuencia de 
una interacción ag-ac decimos que esa destrucción es de causa inmune. 
Las técnicas de elución las vamos a emplear para determinar cuál es la especificidad del anticuerpo que 
causa la destrucción de GR en las siguientes patologías: 
-EHRN: estudio un anticuerpo que este pegado en los hematíes de un niño por nacer o ya nacido y que 
esté hemolizando los GR del niño. En esta circunstancia clínica es necesario hacer un eluído de 
anticuerpos sobre los hematíes del feto/RN aun cuando esta enfermedad hemolítica sospechada sea 
ocasionada por el sistema ABO. (Este anticuerpo actúa clínicamente como un autoanticuerpo porque todos 
los GR se ven afectados). 
-AHAI: Reconocimiento de la especificidad de un anticuerpo de naturaleza autoinmune y los GR que este 
lisando sean los del propio sujeto que produce ese anticuerpo. Incluyendo las AHAI producidas por 
fármacos. (Todos los GR del paciente se ven afectados, es un autoanticuerpo, destruye los GR propios). 
-RHPT: Estudiamos el anticuerpo que puede estar causando las reacciones postransfusionales, eluímos el 
anticuerpo de los GR transfundidos y luego lo identificamos. (Los GR afectados son los transfundidos, se 
trata de un aloanticuerpo, los GR destruidos son ajenos al paciente). 
Lo que tienen en común estas patologías es que tienen una fisio-patogenia basada en la reacción ag-ac. 
También aplico las técnicas de elución para poder despegar el anticuerpo que me causa una PCD+ para 
poder estudiar al GR. Aplico un método de elución que no me destruya la membrana eritrocitaria, despego 
el anticuerpo que me genera esa PCD+. Así pasa ese GR de tener PCD+ a tener PCD- y ahí voy a poder 
estudiar los GR. Voy a poder negativizar la PCD+ si no es muy intensa, por ejemplo, si la PCD es positiva 
por 1+ o 2+. Si la reacción es muy fuerte, por ejemplo, 4+ o 3+ difícilmente la voy a negativizar con una 
elución porque tengo muchísimo anticuerpo en ese GR. 
 
Técnicas de Adsorción + Elución 
 
Lo que hago es IN VITRO, tomo un GR con un antígeno específico del anticuerpo que estoy tratando de 
estudiar y uso como “carnada” para “pescar” el anticuerpo que deseo y luego lo eluyo para saber de qué 
anticuerpo se trata. 
Los anticuerpos pueden ser removidos del suero mediante la adición del antígeno diana, lo que permite 
que el anticuerpo pueda unirse al antígeno. Una vez completada la adsorción, el complejo ag-ac precipita y 
se elimina del sistema de ensayo por centrifugación. El suero adsorbido se prueba con el panel 
identificador. 
¿CUÁNDO LO UTILIZAMOS? 
-CONFIRMAR PRESENCIA O AUSENCIA DE UN ANTÍGENO DEBILMENTE EXPRESADO EN EL GR 
(SUBGRUPOS DE A O B): Lo utilizo cuando hay muy poco antígeno expresado en los GR y con mis reactivos 
de rutina no llego a ver aglutinación porque no hay tanto antígeno para que pueda aglutinarse. Las 
técnicas de elución tienen un efecto concentrador en los anticuerpos. Cuando tomo el GR problema que 
tiene variante débil de A, hacemos adsorción, tomamos ese GR problema, lo enfrentamos a anticuerpo 
anti-A a temperatura fría en este caso, lo pego y después del tiempo de incubación lo eluímos. Si tengo el 
antígeno en los GR el eluído lo va a concentrar al antígeno A y voy a ver el anticuerpo anti-A. Y ese 
anticuerpo puede producir aglutinación porque el eluído lo concentró. 
-CONCENTRAR SOLUCIONES QUE CONTIENEN ANTICUERPOS. 
-SEPARAR UN ANTICUERPO EN SU FORMA VIRTUALMENTE PURA A PARTIR DE UN SUERO QUE CONTIENE 
UNA MEZCLA DE MÚLTIPLES ALOANTICUERPOS: empleando células que poseen/carecen antígenos 
conocidos hacia los anticuerpos sospechados. Me sirve para separar mezclas de anticuerpos: puede ser 
auto+aloac o varios aloanticuerpos. Lo que voy a adsorber es el anticuerpo que yo le presente el antígeno. 
Por ejemplo: Tengo un paciente que sospecho que tiene un anti-Fya + un anti-Jka. Primero quiero ver si el 
paciente posee el anti-Fya, para eso tomo un GR que tenga el antígeno Fya pero que no tenga antígeno 
Jka, y lo enfrento al suero del paciente que sospecho que tiene esos dos anticuerpos. Lo mezclamos y si 
el paciente tiene en el suero el anti-Fya, éste se va a pegar al GR que tiene el antígeno Fya. Luego voy a 
eluír ese GR y ver si en el eluído voy a tener o no el anticuerpo Fya. La confirmación de si tengo o no el 
anticuerpo Fya lo hago con el eluído. 
 
Técnicas de Elución 
 
Para una elución eficaz las fuerzas de unión entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos que los 
recubren deben revertirse o neutralizarse. Para eliminar el anticuerpo de la membrana del GR se puede 
cambiar la termodinámica del medio ambiente, cambiar las fuerzas de atracción entre ag-ac, o cambiar la 
estructura de la superficie del GR. 
 
TEMPERATURA: ELUCIÓN POR CALOR 
 
PRINCIPIO: implica cambiar la temperatura del medio ambiente donde se produjo la reacción ag-ac. La 
reacción exotérmica que ocurre durante la formación de complejos ag-ac puede ser representada por la 
ecuación: 
Ag + ac {ag-ac} + Calorías 
Por lo tanto, un incremento de la temperatura derivará en el desplazamiento de la ecuación hacia la 
izquierda o disociación de la {ag-ac} 
MÉTODOS: 
1) Calor 56ºC: El GR sensibilizado (que tiene pegado un anticuerpo) lo incubo por 5 minutos a 56ºC. Luego 
lo centrifugo y me va a quedar un sobrenadante de los anticuerpos y el GR va a quedar destruido. 
2) Calor Suave 45ºC: El GR sensibilizado lo incubo por 15 minutos a 45ºC. Luego centrifugamos y 
obtenemos los anticuerpos por un lado y el GR por el otro. A esta temperatura conservamos el GR 
para poder estudiarlo también. 
3) Microondas: Son unos aparatos para eluir anticuerpos lisando los GR. 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO? 
-Calor suave 45ºC: Tengo GR con PCD+ hago una elución y quito los anticuerpos pegados a los GR y luego 
con ese GR que me quedo libre de anticuerpos lo fenotípifico. (Conservadora de la membrana).-Calor 56ºC: Es útil para la elución de anticuerpos IgM de los GR, recuperar anticuerpos ABO de los GR de 
cordón umbilical, detección de variantes antigénicas débiles de ABO (subgrupos de A o B) y para 
investigar la EHFN por incompatibilidad ABO. (No conservadora de la membrana). 
NO USAR PARA INVESTIGAR AUTO O ALOANTICUERPOS IgG. 
PROCEDIMIENTO Calor 56ºC: 
-Muestra: Eritrocitos problema con PAD+ lavados 4-6 veces con solución salina (guardar el sobrenadante 
del último lavado). 
-Reactivo: Albúmina bovina al 6% 
-Pasos: 
1)Mezclar volúmenes iguales de eritrocitos y albúmina bovina al 6% en tubo de 13x100 mm. 
2)Incubar 10 minutos a 56ºC agitando de forma periódica. 
3)Centrifugar 2 a 3 minutos a 900-1000 x g. 
4)Transferir el eluído sobrenadante a un tubo limpio y evaluar en paralelo con el sobrenadante salino del 
último lavado realizado. 
PROCEDIMIENTO Calor 45ºC: 
-Muestra: Eritrocitos problema con PAD+ 
-Reactivo: Antiglobulina Humana (AGH) 
-Pasos: 
1)Colocar 1 volumen de GR recubiertos con anticuerpos, lavados y concentrados, y 3 volúmenes de 
solución salina normal en un tubo. 
2)En otro tubo colocar los mismos volúmenes de GR antígeno positivo lavados para el antígeno que se 
está investigando y de solución salina. 
3)Incubar los tubos 10-15 minutos a 45ºC agitándolos con frecuencia. 
3)Centrifugar los tubos y descartar el sobrenadante salino. 
4)Evaluar el grado de extracción de los anticuerpos por comparación de los resultados de la PAD en los 
GR tratados y no tratados. Si el recubrimiento disminuye, pero no desaparece repetir pasos 1 a 3 en los 2 
tubos, los GR control deben someterse a un segundo tratamiento. 
5)Evaluar los antígenos pertinentes en las células tratadas. 
 
TEMPERATURA: ELUCIÓN POR CONGELACIÓN-DESCONGELACIÓN 
 
PRINCIPIO: En los GR Congelados, se forman cristales de hielo extracelulares que atraen agua pura a 
partir de su entorno, lo que resulta en un incremento de la osmolaridad del líquido extracelular que atrae 
a continuación, las moléculas de agua intracelular. Los hematíes se contraen y luego se hemolizan (lisis 
osmótica). Las membranas eritrocitarias se rompen, con la consiguiente pérdida de la complementariedad 
estructural entre el Ag y el Ac. 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO? 
Recomendado para recuperar anticuerpos ABO de los GR de cordón y Detección de variantes antigénicas 
débiles de ABO en GR. Se usa principalmente para la investigación de la EHFN por incompatibilidad ABO. 
PROCEDIMIENTO: 
-Muestra: GR concentrados lavados entre 4-6 veces con grandes volúmenes de solución salina 
(conservamos el sobrenadante del último lavado de los GR). 
-Pasos: 
1)Mezclar 0,5 ml de GR con 3 gotas de solución salina en un tubo de ensayo. 
2)Tapar el tubo y rotarlo para recubrir las paredes con las células. 
3)Colocar el tubo en posición horizontal en la congeladora durante 10 minutos de -6ºC a -70ºC. 
4)Retirar el tubo de la congeladora y calentar con agua corriente caliente. 
5)Centrifugar durante 2 minutos a 900-1000 x g. 
6)Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y evaluar en paralelo con el sobrenadante salino del último 
lavado. 
 
pH: ELUCIÓN ÁCIDA 
 
PRINCIPIO: los ácidos influyen en la elución de anticuerpos que cubren los hematíes de manera tal que al 
descender ↓ el pH, las proteínas -tanto los antígenos como los anticuerpos-, se tornen protonadas (con 
carga +). Los antígenos y anticuerpos pierden así su capacidad de atraerse uno al otro a través de uniones 
electrostáticas y pueden distanciarse por la fuerza de repulsión de cargas similares (tanto el ag como el 
ac tienen cargas + y se repelen). La estructura terciaria de las proteínas puede ser afectada; los iones 
hidrógeno (H+) son atraídos por los grupos hidroxilo (OH–) de los ácidos aspártico y glutámico, resultando 
en un desdoblamiento molecular con la consecuente pérdida de la complementariedad estructural entre 
el antígeno y el anticuerpo (el ag cambia su forma y el ac deja de reconocerlo). Una vez acabada la técnica 
de elución para estudiar el anticuerpo debo llevarlo en un medio isotónico para que no se destruya. 
MÉTODOS: 
1)Ácida fría con glicina 
2)Ácido cítrico 
3)EDTA-Glicina-Ácida 
4)Ácida (modif. de Kochwa-Rosenfield) 
5)Glicina ácida/digitonina 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO? 
-Ácida fría con glicina, Ácido cítrico y EDTA-glicina-ácido: las utilizamos cuando se necesitan los GR 
intactos para fenotipificación y auto-adsorción. La EDTA-glicina-ácida se usa de manera rutinaria para las 
pruebas de tipificación sanguínea o procedimientos de adsorción, todos los antígenos eritrocitarios 
comunes pueden detectarse después del tratamiento. Ácida en frío adecuado para la recuperación de 
autoanticuerpos y aloanticuerpos calientes. 
-Ácida Modif. De Kochwa-Rosenfield: se usa para el estudio de aloanticuerpos o autoanticuerpos IgG 
pegados in vivo o in vitro. 
-Glicina ácida/Digitonina: se utiliza cuando se requieran eluído libres de hemoglobina. Cuando hago un 
eluído, rompo el GR liberando la hemoglobina y ésta me va a estorbar a la hora de hacer alguna prueba en 
tarjeta ya que se tiñe de color rojo el eluído. Por lo tanto, lo que hago con la técnica es usar primero la 
digitonina, que es un detergente, que me lisa el GR sin romper la unión ag-ac. Luego hago lavados para 
quitar la hemoglobina libre, y por último aplico el ácido para disolver la unión ag-ac. 
DESVENTAJAS: los antígenos del sistema Kell, Bg y Er son debilitados por efecto del ácido cítrico y 
también por la técnica EDTA-Glicina-Ácida. Además, la digitonina es irritante y puede ser letal si se 
adsorbe a través de la piel. 
PROCEDIMIENTO EDTA-Glicina-Ácida: 
-Muestra: Eritrocitos problema con PAD+ 
-Reactivo: EDTA al 10%, buffer glicina-HCl 0,1 M (pH 1,5) y tris-ClNa 1 M 
-Pasos: 
1)Lavar los GR a tratar 6 veces con solución salina isotónica. 
2)Mezclar en un tubo de ensayo 20 volúmenes de glicina ácida-HCl 0,1 M (pH 1,5) con 5 volúmenes de EDTA 
al 10%. ESTE ES EL REACTIVO DE EDTA-GLICINA-ÁCIDA. 
3)Colocar 10 volúmenes de GR concentrados en un tubo limpio. 
4)Agregar 20 volúmenes de EDTA-glicina-ácida. 
5)Mezclar contenido del tubo completamente. 
6)Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. 
7)Agregar 1 volumen de tris-ClNa 1,0 M y mezclar. 
8)Centrifugar 900-1000 x g durante 1-2 minutos, aspirar y descartar el sobrenadante. 
9)Lavar los GR cuatro veces con solución salina. 
10)Evaluar las células lavadas con anti-IgG. Si no reaccionan pueden emplearse para la tipificación o 
adsorción. Si la PAD es todavía positiva se puede realizar un tratamiento adicional. 
PROCEDIMIENTO Ácida en frío: 
-Muestra: Eritrocitos problema lavados de 4 a 6 veces con grandes volúmenes de solución salina 
(conservar el sobrenadante del último lavado). 
-Reactivo: Glicina-HCl (0,1 M - pH 3,0), buffer fosfato (0,8 M – pH 8,2) y NaCl 0,9% a 4ºC. 
-Pasos: 
1)Colocar glicina HCl y solución salina en un baño con hielo. 
2)Colocar 1 ml de GR en un tubo 13x100 mm y enfriar en un baño con hielo durante 5 minutos antes de 
agregar la glicina-HCl. 
3)Agregar 1 ml de salina refrigerada y 2 ml de glicina-HCl refrigerada a los GR. 
4)Mezclar e incubar el tubo en un baño con hielo a 0ºC durante 1 minuto. 
5)Rápidamente centrifugar el tubo a 900-1000 x g durante 2-3 minutos. 
6)Transferir el sobrenadante de la elución a un tubo limpio y agregar 0,1 ml de buffer fosfato a pH 8,2 por 
cada ml de eluído. 
7)Mezclar y centrifugar durante 2-3 minutos a 900-1000 x g. 
8)Transferir el eluído a un tubo limpio y evaluar en paralelo con el sobrenadante salino del último lavado. 
 
ELUCIÓN CON ALTERACIÓN EN LA CONCENTRACIÓN DE SAL 
 
PRINCIPIO: son soluciones Salinas Hipertónicas como las de Cloruro de Cesio. 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO?: Particularmente útil en los casos donde falló la elución por calor o con solventes 
orgánicos. Efectivas para disociar complejos antígeno-anticuerpo sin disgregar la membrana eritrocitaria. 
DESVENTAJA: Demanda mucho tiempo (24 horas). 
 
ELUCIÓNPOR ULTRASONIDO 
 
PRINCIPIO: Las ondas de Sonido de Alta Frecuencia generan una rápida alternancia en la presión de los 
fluidos lo que forma diminutas burbujas de gas. Conforme esas burbujas crecen hasta alcanzar un tamaño 
crítico y explotar, generan ondas de choque que ejercen considerables Fuerzas de Corte. Así, las 
moléculas de anticuerpo son “sacudidas” y desprendidas del GR. 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO?: Particularmente recomendado para recuperar anticuerpos ABO de los GR de 
cordón y Detección de variantes antigénicas débiles de ABO en GR. 
 
ELUCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS 
 
PRINCIPIO: Los Solventes Orgánicos actúan sobre los lípidos de la membrana del GR y reducen la tensión 
superficial, lo cual revierte las fuerzas de Van der Waal que mantienen unidos los antígenos y anticuerpos. 
Afectan la asociación Antígeno-Anticuerpo por varios mecanismos, entre ellos: 
-La alteración de la estructura terciaria de las moléculas de anticuerpo. 
-La alteración de la capa bilipídica de la membrana del glóbulo rojo. 
-Inversión de las fuerzas de atracción entre el antígeno y el anticuerpo. 
Los primeros 2 mecanismos derivan en pérdida de la complementariedad estructural entre el antígeno y 
el anticuerpo. 
MÉTODOS: 
1)Éter DiEtílico (método de Rubin) 
2)Éter Dietílico / Calor (modific. de Marsh) 
3)Cloroformo 
4)Cloroformo + Tri-CloroEtileno 
5)Xileno 
6)D-Limoneno 
7)Congelación / Descongelación + Etanol 
(Método de Weiner) 
8)Cloruro de Metileno (DiCloroMetano) 
¿CUÁNDO LOS UTILIZO?: Para estudios de 
Aloanticuerpos o Autoanticuerpos IgG 
pegados In vivo o in vitro. 
DESVENTAJAS: Casi todos los Solventes 
Orgánicos pueden ser Carcinogénicos, 
Narcóticos, Inflamables y/o pueden tornarse Explosivos. También suelen ser Irritantes de la piel y Tóxicos. 
El método de Rubin (Éter) puede fallar para eluir anticuerpos Anti-S, Anti-s y Anti-Fya. 
PROCEDIMIENTO: una vez que centrifugo el tubo, me va a quedar, por encima el éter por tener menos peso 
molecular, seguido por los GR y debajo de todo los anticuerpos disociados. Por eso con una jeringa voy 
hasta el fondo del tubo aspiro los anticuerpos y los paso a un tubo limpio para estudiarlos. 
 
NEUTRALIZACIÓN DE GRUPOS QUÍMICOS CON CARGA: DIFOSFATO DE CLOROQUINA 
 
PRINCIPIO: El Difosfato de Cloroquina produce elución de anticuerpos IgG unidos Sin alteración de la 
membrana del GR. El mecanismo más probable involucra neutralización de grupos químicos con carga de 
los Aminoácidos que rigen la estructura terciaria de las moléculas de anticuerpo (p. ej., grupos radicales 
que están involucrados con las uniones intermoleculares). 
DESVENTAJA: La incubación excesivamente prolongada puede producir desnaturalización de antígenos. 
En esos casos, no usar para pruebas de aglutinación directa, especialmente Rh.