Presentación científica microbiología elegante minimalista fondo blanco - Dariel Isai Soria Cordova

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Células Animales
SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN
Alfonso Bravo García
Rúben Alexis Juárez Solís
Dariel Isaí Soria Cordova
Alan Arturo Arroyo Díaz
Construcción del vector
Transfección
Traducción
Extracción y purificación
Se conforman por un organismo hospedero y un vector de
expresión que cuenta con los elementos necesarios para
realizar la transcripción y traducción de un gen de interés.
Sistemas de Expresión
Células HEK-293 (human embrionary kidney)
Se aislaron en la década de los 70, por Alex Van der
Eb, quien transformó la línea celular con adenovirus
5 (Ad5) cortado.
 
Son células epiteliales , aunque se desconoce cual
fue el tipo de célula aislado del riñón fetal, se
especula que realmente sean células neuronales.
HEK-293
https://doi.org/10.1099/0022-1317-36-1-59
Linea celular Tratamiento
HEK293
Medio comercial SFM4Transfex (Medio libre de suero bovino.)
Concentración de glucosa de 4g/L
HEK-N1D8
HEK/N-T103F7
HEK/N-I2D7
Resistentes a
antibiótico G418
 
900mL de medio de cultivo SFM4Transfex estéril
20mL de solución de GlutaMAX estéril(35050061, Gibco)
100mL de una solución de CellBoost 5 (SH30865, Hyclone) al 60% (p/v), filtrada estérilmente mediante filtro Sterivex de
0,22mm (10411741, Millipore)
2mL de una solución estéril de puromicina (P8833, Sigma) al 0,1% (p/v) para la selección de células resistentes a
puromicina o 20mL de solución comercialde G418 (G418-RO, Sigma)
La concentración final de G418 en el medio es de 1g/L.
HEK-2C10
 Auxotróficas para
la timidina 
900mL de medio de cultivo SFM4Transfex estéril.
20mL de GlutaMAX estéril (35050061, Gibco)
100mL de una solución de CellBoost 5 (SH30865, Hyclone) al 60% (p/v), filtradaestérilmente mediante filtro Sterivex de
0,22mm (10411741, Millipore)
1mL de solución de timidina (T9250,Sigma) 16mM, filtradaestérilmente mediante filtro Sterivex de 0,22mm (10411741,
Millipore)
HEK-4C3
Auxotróficas para
la glutamina
900mL de medio de cultivo SFM4Transfex estéril.
60mL de soluciónGSEM estéril (G9785, Sigma)
100mL de una solución de CellBoost 5 (SH30865, Hyclone) al 60% (p/v), filtradaestérilmente mediante filtro Sterivex de
0,22mm (10411741, Millipore)
Células estudidas 
Se cultivaron a 37°C.
95% de humedad 
5% de CO2
Un periodo no superior a 3
meses. 
inóculo de 2*10^5 celulas/ml
Resembrar los cultivos 2 o 3 días. 
10 ml de medio de cultivo
correspondiente.
Se cultivaron durante 1 semana
en matraces agitados (Shake
flaks) de 100 mL
Agitación orbital 110 rpm.
Se llevo acabo en una cámara de
flujo laminar vertical. 
Condiciones de cultivo
Placas de cultivo de
poliestireno (Orange
Scientífic, 2030400)
Placas de cultivo de 6(2mL),
12(1mL) y 96 (200mL) pozos.
Transfecciones de las líneas
celulares y como controles.
 pH controladoBiorreactor 2L
Mantener el pH 7.1 +- 0.05.
Adición automatizada de
NaOH (0.5 M)
 
pH Libre
Se desconectó el control del pH
 
pH libre
Corriente de CO 2 al 1%
Biorreactor 2L
Adición automatizada de
NaOH (0.5 M)
 
Cinética de crecimiento
Metodos de Transfección
Vectores virales 
Transfección de lipidos (lipofeccion)
CRISPR/cas9
CRISPR/Cas9
 Diseño del RNA guía
 Introducción del sistema
CRISPR/Cas9
Corte del DNA
Reparación del DNA
1.
2.
3.
4.
Auxotrofías generadas artificialmente mediante
CRISPR/Cas9.
Con el fin de aumentar los
posibles marcadores de
seleccion a utilizar se ultizo la
edicion genomica para obtener
lineas celulares de HEK293
deficientes en un determinado
gen, que luego pueda ser usado
como marcador de selección 
Consideraciones y eficiencia
Especificidad de la guía del
RNA
Efectos fuera del objetivo
Etica y seguridad
1.
2.
3.
Su eficiencia depende de varios
factores, incluyendo la eficacia de
la guía del ARN en dirigir el
complejo Cas9 a la ubicación
deseada, la eficacia de la
actividad endonucleasa del Cas9
en cortar el ADN en el sitio
objetivo, y la capacidad de la
célula para reparar el ADN
cortado mediante los
mecanismos de reparación de
doble cadena de rotura.
Transfección de lipidos 
Utiliza un complejo de lipidos
para llevar el DNA a las celulas.
La lipofeccion utiliza diminutas
estructuras vesiculares llamadas
liposomas que tienen la misma
composicion que la membrana
celular.
Carter, M., & Shieh, J. (2015). Gene Delivery Strategies. Guide to Research Techniques in
Neuroscience, 239–252. doi:10.1016/b978-0-12-800511-8.00011-3 
Consideraciones y eficiencia
Elección del liposoma
Concentración de liposomas
Tamaño de particula
Toxicidad
Selección de células
La eficiencia puede variar
dependiendo de varios factores,
ncluyendo la calidad y pureza de
los lípidos utilizados, la
concentración y cantidad de ADN
o ARN que se transfieren, el tipo
de células utilizadas y las
condiciones de cultivo de células,
entre otros. En general suele ser
menor que la de otros metodos. 
Vectores virales 
La transfeccion mediada por
virus es altamente eficiente y es
facil lograr una expresion
transgenica sostenible in vivo
debido a la naturaleza viral de la
integracion en el genoma del
huesped.
Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum
Genet 2:177–211
Consideraciones y eficacia 
Aspectos de seguridad
Expresion transgénica sostenida y
regulada
Infeccion de celulas en division y que
no se dividen
 
La eficiencia de la transfección
mediante virus puede ser alta, con
algunas cepas virales capaces de
transfectar casi el 100% de las
células objetivo. Esto se debe a
que los virus han evolucionado
para infectar y replicarse en células
de huéspedes específicas, y
utilizan mecanismos altamente
eficientes para entrar en las células
y liberar su material genético en el
interior
Cromatografía de afinidad
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de afinidad multimodal
Cromatografía de inmunoabsorción
Cromatografía hidrofóbica
Cromatografía de afinidad basada en péptidos.
 
Cromatografía
 
 
Purificación
Centrifugación
Precipitación
Diálisis
Electroforesis
 
 
 
Purificación
 
Banderas
Son secuencias peptídicas que se fusionan con la
proteína de interés 
Las más utilizadas son la etiqueta de histidina (His-
tag), la etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST-tag), 
(MBP-tag) y la etiqueta de la proteína de unión a la
calmodulina (CBP-tag). 
Se fusionan a la proteína de interés en la región N-
terminal o C-terminal.
 
downstream:
1. etapa sólida. 
2. una etapa de diálisis 
3. etapa de cromatografía de afinidad 
4. filtraciones/cromatografías 
Analisis en SDS-page
Rendimiento
Naturaleza de la proteína
Las condiciones de la muestra
La elección de la matriz de - cromatografía
El diseño experimental
El tipo de cromatografía utilizado.
 
Depende de muchos factores como: 
 
 
 
 
Purificación de la proteína 
recombinante N- 
acetilglucosaminiltransferasa (GnT- 
V) utilizando cromatografía de 
afinidad, se obtuvo un rendimiento 
del 21% y una pureza de 99%).
Purificación de la proteína 
recombinante Factor H utilizando 
cromatografía de intercambio 
iónico, se obtuvo un rendimiento 
del 30% y una pureza de 95%.
Ejemplos en rendimiento
 
 
el rendimiento final oscila entre 40 a 60% y presenta una 
pureza mayor a 90% debido al conjunto de técnicas 
empleadas
 
 
Promotor CMV (citomegalovirus)
Modificaciones postraduccionales
Fosforilación: la fosforilación puede ser 
utilizada para mejorar la actividad enzimática
Glicosilación: es importante para la estabilidad 
y la solubilidad, puede afectar su actividad y su 
interacción con otras proteínas
Acetilación: puede afectar la estructura y la 
actividad de las proteínas,
 
 
 
Metilación: es importante en la regulación 
de la expresión génica y la función celular
Ubiquitinación: es importante en la 
regulación de la degradación proteasomal
 
Modificaciones postraduccionales
HEK293 tiene la capacaidad de glicosilar 
proteínas con relativa facilidad
útiles para producir proteínas complejas 
que requieren glicosilación para su 
correcta estructura y función.
idealespara producir proteínas 
terapéuticas como anticuerpos, 
enzimas y factores de crecimiento, 
Ventajas y desventajas del sistema.
El medio de cultivo es muy caro y complejo.
Mayor tiempo de producción.
Rendimiento relativamente bajo.
Desventajas
Ofrecen todas las modificaciones
postraduccionales.
Correcto plegamiento de las proteínas.
Libres de endotoxinas.
Ventajas 
Ventajas y desventajas del sistema.
Kim, T. K., & Eberwine, J. H. (2010). Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical 
Chemistry, 397(8), 3173–3178. doi:10.1007/s00216-010-3821-6 
 
 
Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2:177–211
 
Carter, M., & Shieh, J. (2015). Gene Delivery Strategies. Guide to Research Techniques in Neuroscience, 239–252. 
doi:10.1016/b978-0-12-800511-8.00011-3 
 
Lee, H., Yoon, D. E., & Kim, K. (2020). Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems, 24(1), 8–16. 
doi:10.1080/19768354.2020.1726462 
10.1080/19768354.2020.1726462
 
"Purificación de proteínas recombinantes" de Francisco G. Herrera, publicado en la revista Biotecnología Aplicada 
(2003).
"Métodos de purificación de proteínas recombinantes" de Yves Boulanger, publicado en la revista Med Clin (2005).
 
"Purificación de proteínas recombinantes" de Sonia Aurora Pérez Villanueva, publicado en la revista Investigación y 
Ciencia de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (2008).
 
 
Referencias