Lección 4 hormonas y estrategias de propagación clonal - canvas - José Alejandro Del Campo Vázquez

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Hormonas y estrategias de propagación clonal
Imagen: http://ipmb.sinica.edu.tw/IPMB_site1/?q=node/154&language=en
Plant rejuvenation is a prerequisite for clonal propagation of mature trees, and plant maturation is frequently accompanied by a decline in vigor and loss of organogenetic competence. But rejuvenation or phase reversal of woody plants can be achieved by repeated grafting of adult shoot apical meristems onto juvenile rootstocks in test tubes.
Fitorreguladores, fitohormonas o factores de crecimiento vegetal
Reguladores del crecimiento, son hormonas que regulan de manera predominante los fenómenos fisiológicos de las plantas
Moléculas pequeñas que modifican los diferentes procesos de crecimiento, desarrollo y diferenciación vegetal: 
crecimiento de las plantas 
caída de las hojas (abscisión) 
floración
formación del fruto 
germinación
Pueden ser transportadas por tejidos vasculares, de célula a célula o liberadas en el aire.
Fitorreguladores
Regulación:
– Regulan procesos de correlación, es decir que, recibido el estímulo en un órgano, lo amplifican, traducen y generan una respuesta en otra parte de la planta.
Mecanismos:
– Sinergismo: la acción de una determinada sustancia se ve favorecida por la presencia de otra.
– Antagonismo: la presencia de una sustancia evita la acción de otra.
– Balance cuantitativo: la acción de una determinada sustancia depende de la concentración de otra (feedback).
Importante saber:
– Ejercen efectos pleiotrópicos, actuando en numerosos procesos fisiológicos.
– Su síntesis no se relaciona con una glándula, sino que están presentes en casi todas las células y existe una variación cualitativa y cuantitativa según los órganos.
Resumen de los diferentes factores que influyen en la respuesta de un tejido cultivado in vitro a la adición de RCV exógenos
Tipos de fitohormonas/fitoreguladores
1. Auxinas
2. Citocininas
3. Giberelinas
4. Ácido abscísico
5. Etileno
6. Ácido jasmónico
7. Brasinoesteroides
Auxinas
Funciones
– Se producen en el meristemo apical del tallo y de ahí se distribuyen. Síntesis a partir del triptófano.
– Altos niveles de auxinas se presentan debajo de esta zona para mantener el alto grado de elongación celular
– Están involucradas en el fototropismo
– División celular y generación de raíz.
Ejemplos
Natural:
– Ácido indolacético (IAA - AIA)
Sintéticas:
– Ácido naftalenacético (NAA - ANA)
– Ácido indolbutírico (IBA)
– Ácido 2,4-diclorofenoxi acético (2,4-D) - Herbicida
Estructura IAA
Auxinas más utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales
Citocininas
Funciones
– Provienen de la modificación de adenina. Fue descubierta en maíz en 1961 y es conocida como zeatina (natural).
– Estimulan la división celular, retardan la senescencia
– Rompen la latencia de las yemas axilares haciéndolas brotar
Ejemplos
- Zeatina (natural)
– Isopentiladenina (2iP) (natural)
– 6-benzil-aminopurina (BA) Benciladenina (sintética)
– Cinetina o Kinetina (sintética)
– Tidiazurón (TDZ) (herbicida sintético)
Zeatina
Citocininas más utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales
Junto con las auxinas, las citocininas regulan la división celular
El balance entre auxinas y citocininas en un cultivo in vitro suele ser determinante para el patrón de desarrollo que siga el tejido
Giberelinas
Funciones
– Elongación de estructuras como brotes
- Aceleran la brotación de ciertos tipos de yemas y meristemos
– Involucradas en procesos de floración, latencia y germinación de semillas
Identificadas en Japón en 1935, subproducto metabólico del fitopatógeno Gibberella fujikuroi, que enferma al arroz
Las plantas infectadas presentan un exagerado crecimiento, mueren por no soportar su propio peso.
Ácido abscísico
Funciones
– Sintetizados en cloroplastos.
– La producción de ABA es por situaciones de estrés como la falta de agua y las temperaturas bajas.
– Involucrado en la latencia en semillas y yemas, y en el cierre de estomas
- Se utiliza en raras ocasiones para inhibir la germinación de embriones somáticos o para completar el proceso de maduración de los mismos.
Fitoreguladores
Brasinoesteroides
– Se necesitan en muy baja concentración
– Elongación del tallo, elongación y división celular, inhibidor de crecimiento de raíz.
• Etileno
– Es un gas liberado por tejidos como los frutos durante su maduración.
– Regula la floración y senescencia, proceso de maduración.
• Ácido jasmónico
– Se convierte en el derivado volátil metil-jasmonato cuando las plantas son atacadas por insectos. Defensa de la plantas hacia los insectos.
Otros reguladores del crecimiento y sustancias afines utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales
Micropropagación: reproducción asexual
Ventajas
Facilita la propagación clonal
Cultivos sanos, libres de microorganismos
Tasa de multiplicación alta
Producción todo el año
Etapas de la micropropagación
1. Selección del material vegetal
2. Establecimiento de un cultivo aséptico
3. Multiplicación
4. Crecimiento de tallo (brotes)
5. Inducción/formación de raíz
6. Aclimatación
Etapas de la micropropagación
Fase 0: Banco de plantas. Esta fase tiene como objetivo asegurar mediante un buen control fitosanitario, las plantas sanas en crecimiento activo y vigoroso para la obtención de explantes sanos al iniciar.
Fase 1: Es la de iniciación que incluye la selección y aplicación de un esquema de desinfección y la inoculación de los explantes en un medio de iniciación con el objetivo de lograr una elevada tasa de supervivencia y la respuesta deseada.
Etapas de la micropropagación
Fase 2: Producción de brotes. Etapa en la que se promueve y estimula la producción de brotes para incrementar y mantener los genotipos. Su objetivo es la obtención del mayor número de brotes con alta fidelidad genética en un corto período de tiempo.
Fase 3: Es la etapa de enraizamiento y elongación, que tiene como objetivo el alargamiento de los brotes, y la inducción y desarrollo de las raíces.
Etapas de la micropropagación
Fase 4: Es la etapa de transferencia de condiciones in vitro a ex vitro. Esta fase consiste en el trasplante de las plantas a condiciones naturales. Ello implica la aclimatación bajo condiciones controladas
para garantizar la supervivencia.
a. Cámara de cultivo
b. Invernadero
c. Vivero
d. Campo
Ejemplos de micropropagación
Tao, H., Jing, X., Lina, Y., & Haitao, W. (2012). An efficient method for plant regeneration from calli of Swertia mussotii, an endangered medicinal herb. American Journal of Plant Sciences, 2012.
Bakhtiar, Z., Mirjalili, M. H., & Sonboli, A. (2016). In vitro callus induction and micropropagation of Thymus persicus (Lamiaceae), an endangered medicinal plant. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 16(1), 48-54.
METODOLOGÍA
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METODOLOGÍA
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METODOLOGÍA
3 mg/L BA
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Medio para transformación: 0.2 mg/L 2,4-D y 0.1 mg/L Kin
Medio de regeneración: 2 mg/L Zea
Medio de enraizamiento: 0.18 mg/L IAA
Técnicas de micropropagación
Organogénesis
Embriogénesis
Protoplastos
Androgénesis (anteras)
Yemas axilares (meristemos)
Organogénesis
La formación de raíces, tallos o yemas a partir de células en cultivo así como la formación de raíces y tallo a partir de explantes
Sucede en dos etapas, la caulogénesis o iniciación de tallo y la rizogénesis o iniciación de raíz
Dos tipos de organogenesis, dependen de la proporción de auxinas/citocininas
Organogénesis directa
Organogénesis indirecta
Auxina/citocinina 10:1-100:1
Inducción de raíz
Auxina/citocinina 1:10-1:100
Inducción de tallo
Auxina/citocinina 1:1
Inducción de callo
Organogénesis directa
En muchas plantas, subcultivar a partir de callo resulta en variaciones indeseables de clonas (variación somaclonal)
Para evitarlo, se puede llevar a cabo una regeneración de explantes hacia plántulas
Esto se hace para muchas especies de plantas alterando la composición hormonal en el medio
Explante
Crecimiento meristemático
Primordio
Explante: tejido vivo separado de su órgano propio
Células meristemáticas: células no diferenciadas que se dividenactivamente
Primordio: un órgano o tejido en su etapa de desarrollo más temprana 
http://ibbiologyhelp.com/PlantBiology/growth.html
Meristemos
http://ibbiologyhelp.com/PlantBiology/growth.html
Las plantas tienen un patrón de crecimiento llamado crecimiento indeterminado 
Las plantas crecen durante toda su vida porque retienen células no diferenciadas en ciertas zonas llamadas MERISTEMOS
Meristemos apicales y laterales
https://www.youtube.com/watch?v=HPyL0ruEiYY
Organogénesis indirecta
Explante
Crecimiento meristemático
Primordio
Callo
En organogénesis indirecta, primero se produce un callo a partir del explante.
Después se pueden formar órganos a partir del callo o a partir de una suspensión de células generada a partir del callo
https://www.youtube.com/watch?v=uzuZF2pnXbs
Benítez-García, I., Vanegas-Espinoza, P. E., Meléndez-Martínez, A. J., Heredia, F. J., Paredes-López, O., & Del Villar-Martínez, A. A. (2014). Callus culture development of two varieties of Tagetes erecta and carotenoid production. Electronic Journal of Biotechnology, 17(3), 107-113.
cauliflower organogenesis 2
Aubrey Cahoon
20130307
Lavf57.83.100
Cauliflower curd was incubated in plant tissue culture medium with hormones to induce shoot development. In this attempt there is no agar in the culture medium. Notice that shoots only formed above the meniscus and that the one successful culture happened to fortuitously swell such that it held itself against the sides of the tube, allowing aerial growth.
A. Bruce Cahoon, PhD
Department of Biology
Middle Tennessee State University
Cauliflower curd was incubated in plant tissue culture medium with hormones to induce shoot development. In this attempt there is no agar in the culture medium. Notice that shoots only formed above the meniscus and that the one successful culture happened to fortuitously swell such that it held itself against the sides of the tube, allowing aerial growth.
A. Bruce Cahoon, PhD
Department of Biology
Middle Tennessee State University
callus initiation from stem sections - time lapse
Aubrey Cahoon
20120726
Lavf57.83.100
Lab: ABCahoon, PhD
Department of Biology
Middle Tennessee State University
Tissue Culturist: Sirin Baser
Lab: ABCahoon, PhD
Department of Biology
Middle Tennessee State University
Tissue Culturist: Sirin Baser