Histología tema VI VII - Monserrat Hernandez

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MÉTODOS E INSTRUMENTOS BÁSICOS PARA EL ESTUDIO DE HISTOLOGÍA.
INTEGRANTES:
Lesli Hernández
MONSERRATHERNÁNDEZ
Ariel Villalobos
TÉCNICA HISTOLOGÍA
Al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano. 
OBTENCIÓN DEL TEJIDO. 
En la obtención del material histológico hay que cumplir con varias reglas como:
Realizar la toma del tejido del lugar correcto. 
Es preciso tener obrar con cuidado y precaución, a fin de evitar las destrucción de los tejidos. 
Cortar la pieza en trozos pequeños (entre 1 y 3 cm X 0,5 cm).
Realizar este proceso con la mayor rapidez, para evitar la autodestrucción del tejido ( AUTÓLISIS ).
Biopsia excisional: En la que se extrae por completo una masa de tejido.
b) Biopsia incisional: Cuando solo una parte de un tumor es retirado quirúrgicamente.
¿Que es un fijador?
Los fijadores son moléculas o mezclas de moléculas en solución.
Ejemplo: Glutaraldehido.
TIPOS DE FIJADORES 
FIJACIÓN
Lo que se debe hacer inmediatamente después de tener la muestra es tener ya listo lo que va hacer un frasco limpio que va tener un fijador.
El objetivo es conservar la composición, estructura y el estado del tejido en la medida de lo posible. 
Además, evita otros procesos tales como la autolisis y la descomposición. 
 .
DESHIDRATACIÓN 
Tiene como finalidad la extracción del agua del tejido. 
 se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. 
su duración 1 a 12 horas dependiendo el tamaño de la muestra. 
ACLARAMIENTO.
Una vez obtenida la deshidratación el tejido se debe sumergir en un líquido. 
El líquido comúnmente utilizado es xilol, cloroformo, toluol, y benzol.
Esta etapa se le llama aclaramiento debido a que el tejido se vuelve transparente.
1 a 6 horas dependiendo su tamaño. 
INFILTRADO E INCLUSIÓN
Consiste en sustituir el agua de los tejidos por otra sustancia líquido que penetra en el tejido y los rodea. Así, los tejidos se endurecen para formar un bloque sólido que pueda ser cortado
previa congelación del material de estudio
Previa inclusión del material en una suatenciá llamada parafina
La inclusión consta de los siguientes pasos:
Deshidratación 
Diafanizacion 
Infiltracion 
Confección bloque
DESHIDRATACION 
Como el tejido fijado se halla en solución acuosa y el medio de inclusión no es soluble en agua, no puede ser infiltrado directamente con el agente de inclusiónPor ello se deshidrata en una serie de alcoholes crecientes desde el alcohol de 70% al de 100% en que se elimina totalmente el agua del tejido. Con ella se endurecen las piezas.
Diafanización o aclaramiento
Consiste en la eliminación del agente de deshidratación con una sustancia miscible en el
agente de inclusión
Infiltración
La filtración consiste en la penetración del medio de inclusión en el interior de los tejidos y las células de la plaza estudiada, disolviendose en el agente diafanizador hasta sustituirlo.
Confección del taco o bloque:
Después de los pasos arriba mencionados, viene la inclusión definitiva del 
trozo de tejido, que nos dará no-solo la solidificación de la parafina interna de la pieza, sino también una envoltura que facilitará su ulterior manejo y corte, utilizándose para cumplir con lo cometido, un molde especial de metal denominado “barras de Leuckart”, dentro del cual se vierte parafina líquida a 60º C. Allí se deposita la pieza que se saca del baño de parafina en que se encontraba, cuidando de orientarla convenientemente para saber después la dirección en que debe ser cortada. Se deja a enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos o más, y una vez solidificada se retira del molde obteniéndose de éste modo el taco que queda listo para ser cortado por el micrótomo.
a) Previa congelación del material de estudio: Este procedimiento confiere a los 
tejidos un endurecimiento uniforme y permite realizar diagnósticos inmediatos de piezas operatorias y estudios histoquímicos
b) Previa inclusión del material en una sustancia denominada Parafina: Elmaterial congelado no reúne de manera suficiente las condiciones óptimas, ya que los cortes 
obtenidos por congelación son siempre más gruesos que los obtenidos por inclusión. Por lo dicho y si se cuenta con el tiempo necesario, es preferible impregnar los tejidos con una sustancia líquida que luego pasa a una fase sólida y homogénea. Este procedimiento se denomina “Inclusión”. En su transcurso, se deposita el medio de inclusión en todos aquellos lugares en donde se encuentra el 
agua, o donde ésta ha sido extraída. Los medios o sustancias de inclusión pueden ser: Solubles en el agua: Como ser la “Celoidina, Gelatina, Plexiglas, o bien Insolubles en el agua: Como por 
ejemplo la “Parafina” y otros.
CORTE (MICROTOMO)
Con el objeto de realizar los cortes adecuados para el estudio al microscopio, se utilizan distintos métodos y variados aparatos de gran precisión, a los que se denominan “Micrótomos”. Su empleo está condicionado al estudio que se desee realizar en los diversos tejidos. 
Micrótomos de deslizamiento
Estos micrótomos se componen de un sujeta-muestras fijo y una cuchilla que está fijada sobre una corredera. Para garantizar un corte estable, normalmente las correderas de los micrótomos suelen pesar bastante. Durante el corte se presiona la cuchilla a través de la muestra. Los micrótomos de deslizamiento permite cortes con un espesor de 1 a 60 µm.
Micrótomos de rotación
Estos micrótomos, también conocidos como micrótomos Minot, disponen de una cuchilla fija y un sujeta-muestras móvil. El nombre del microtomo de rotación se da porque el sujeta-muestras es accionado mediante un volante. El movimiento de rotación del volante se transforma en un movimiento recto.Los micrótomos de rotación permiten preparar muestras entre 1 y 60 µm
Micrótomos de congelación
Los microtomos de congelación son una subcategoría de los micrótomos de rotación. La prueba se encuentra en un recipiente congelador que se enfría por ejemplo con nitrógeno. Las baja temperatura aumenta la dureza de la prueba.
Ultramicrótomos
Con los ultramicrótomos se preparan muestras para los microscopios electrónicos de transmisión. Debido a que los preparados deben ser extremadamente finos, estos microtomos disponen de cuchillas especiales y de un avance muy fino, que frecuentemente es accionado por dilatación térmica. El uso de estos micrótomos permite un grosor de 10 a 500 nm.
Micrótomos láser
Los microtomos láser usan un láser especial para el corte. Destacan por su fuerte enfoque y su muy cortas duraciones de impulso. Esto permite cortar de forma muy fina las pruebas sin causar daño térmico al material de prueba. Estos micrótomos permiten preparar muestras con un grosor de entre 10 y 100 µm.
TINCION RUTINARIA H/E
Para lograr contraste suficiente entre los distintos componentes de las células y poderlos diferenciar con el microscopio óptico, se emplean diversos colorantes.
Cuando un componente absorbe abundante colorante, aumenta la densidad óptica y disminuye la amplitud de las ondas luminosas que lo atraviesan. Tiene aspecto más oscuro que los componentes que absorben poco colorante. El colorante absorbido imparte su color a la luz que sale del componente que lo absorbió.
CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES 
MÉTODOS DE COLORACION 
* Coloración directa o sustantiva: Cuando existe una verdadera afinidad 
entre el objeto y la sustancia colorante. 
* Coloración indirecta o adjetiva: Cuando requiere la intervención de 
intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar. El mordiente puede actuar antes del 
baño con el colorante o formar parte de él. En éste último caso, la combinación formada recibe el 
nombre de “Laca”. Ejemplo: Alumbre de Potasio o de Sodio. 
* Coloración progresiva: Se hace actuar al colorante hastaque llegue 
hasta su punto óptimo. 
* Coloración regresiva: Se realiza primero una sobrecoloración y luego se 
elimina el exceso de colorante por medio de diferenciadores. Este proceso se denomina 
“diferenciación” y se lleva a cabo con agua, alcoholes, bases o soluciones metálicas.
HEMATOXILINA
un colorante nuclear, está cargado positivamente y es por lo tanto un colorante básico. Se deposita en los grupos fosfatos del ADN y ARN que tienen carga negativa. Es el colorante nuclear más utilizado. Se lo obtiene a partir de la extracción del palo de campeche (hematoxilon campechianum). La sustancia es incolora y ha de ser transformada primero por oxidación en hemateína que es el auténtico colorante. La hemateína es un colorante indirecto, por lo que requiere el uso de un mordiente, que en la práctica el más usado es el Hemalumbre de Mayer, que forma parte de la coloración hematoxilina – eosina, y que está compuesto por hemateína, alu
EOSINA
: Es un colorante artificial, débilmente 
ácido que pertenece al grupo de las fluoresceínas. Es fácilmente soluble en agua. Colorea al 
citoplasma, tejido conjuntivo, fibras colágenas de rosado intenso. Químicamente es un eosinato de 
potasio, siendo el ácido eosínico el que actúa en la coloración. Es una coloración regresiva y 
direct
PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION 
Procedimientos para colorear la muestra: 
a) Desparafinización e hidratación del corte: 
Dado que los colorantes se hallan en soluciones acuosas, la parafina impedirá su entrada. Como solvente de la parafina se utiliza Benzol o Xilol, completando con el pasaje por alcoholes en orden decreciente 100º, 96º, 80º, 70º, finalizando con agua destilada. 
b) Coloración propiamente dicha: 
comienza con la hematoxilina, virado con agua corriente (débilmente alcalina) o agregando carbonato de litio. Se pasa luego a la eosina, con la cual se sobrecolorea, para luego eliminar el exceso. 
COLORACION VITAL
Coloración vital: 
Consiste en el empleo de soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no 
tóxicas, para estudiar a una muestra de células o tejidos. Los colorantes utilizados son el Verde 
Jano, Azul tripán, Rojo congo, Rojo neutro, Azul pirrol, etc. La coloración vital se clasifica en: 
a) Coloración intravital: Se basa en la introducción de colorantes no tóxicos en 
el organismo vivo por vías digestiva, subcutánea, al torrente sanguíneo o linfático. Luego se mata al animal y se sigue los pasos de la Técnica Histológica corriente. En la observación microscópica se verán determinadas estructuras que contienen el colorante. 
b) Coloración supravital: Se realiza sobre células libres, extraídas del organismo, 
como el caso de células sanguíneas, células de raspado de la mucosa bucal o vaginal, cortes finos de tejido cartilaginoso que conserva su vitalidad. Hay que proceder a la observación rápida antes de que comiencen los procesos de post – mortem.
MONTAJE 
Tiene por objeto mejorar la observación, facilitar el manejo y aumentar la 
duración de los preparados histológicos. La coloración deja totalmente embebido en agua al 
preparado y debe ser eliminada. Esta técnica histología consta de los siguientes pasos: 
a) Deshidratación: A través de alcoholes en forma creciente 70º, 80º, 96º, 
100º. 
b) Homogenización (aclaración o diafanización): Con benzol o xilol, 
adicionando ácido carbónico o fénico, muy ávidos de agua. 
c) Colocación del cubreobjeto: Para proteger la preparación, se recubre 
con una laminilla de vidrio muy fina y de diversos tamaños. Para adherir el cubreobjeto al porta, 
quedando entre ambos el corte, se utiliza Bálsamo de Canadá, sustancia soluble en benzol o xilol, de modo que difunde bien en el corte aclarado. Además su índice de refracción es semejante al del vidrio, lo cual evita la desviación de los rayos luminosos. 
PREPARACION DE LOS CORTES POR LAS TÉCNICAS DE CONGELAMIENTO
 se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm de grosor, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C (Figura 3). La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C.
Antes de la congelación, la muestra se encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y sólido a la de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido, encastrada pero no incluida. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describió para el microtomo de rotación para parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas (Figura 4). Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las técnicas que deseemos.
PASOS DEL PROCEDIMIENTO.
1:Obtención del tejido
2: Fijación.
3:Deshidración idratación.
4: Aclaración.
5: Infiltrado e inclusión.
6: Corte (microtonal)
7: Tintación rutinaria.
8:Montaje.
9: Preparación de los cortes.
¿PARA QUE ES SU USO?
Su uso nos permite acercarnos a un mundo microscópico, en el cual podemos estudiar las características propias de cada órgano.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS.
 VENTAJAS
1: Reducción de tienpo de procesamiento.
2: La eliminación del estanol absoluto de xilol etanol. 
 DESVENTAJAS 
1: Puede de morar un poco.
2 Puede que no se eliminen del todo las sustancias anteriores. 
UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA.
Para determinarla se emplea se emplea el sistema internacional de unidades. 
Este sistema se originó a partir del antiguo sistema métrico.
Micrometro
(um) es la unidad de longitud equivalente a una milésima de parte de un metro.
EL MANÓMETRO.
(BM) es la cantidad de medida de longitud que equivale a una millonésima parte de un metro.
EL ANGSTROM. 
Es la unidad que se usa para expresar longitud en onda, distancias moleculares y atómicas. 
EQUIVALENCIAS.
1 mm= 1000um
1 um= 1000 nm 
1 um= 10 Å
1Å= 0.1nm
1Å= 0.0001um