Efectos de Mutagénicos por exposición al Sulfato de vincristina por medio de un cultivo a la Drosophila melanogaster (1) - Adelfo Morales Gonzalez

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Universidad de La Guajira Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas – Programa de Biología Curso de genética 1
Efectos Mutagénicos por exposición al Sulfato de vincristina por medio de un cultivo de Drosophila melanogaster
Introducción
Uno del rasgo más importante en la vida de todo organismo, es la capacidad de transmitir su información genética a las generaciones posteriores, debido a esto es uno de los procesos más controlados a nivel celular, es la replicación del ADN pero existen factores internos y externos, que pueden causar cambios en la estructura de la duplicación de esta Molécula sin poder ser reparados, llegando a ser expresado fenotípicamente (Calzada, bueno & Sánchez, 2000).
Drosophila melanogaster, o mosca de la fruta es uno de los organismo más utilizado en la investigación científica a nivel genético y molecular, este insecto de 3 mm de largo que normalmente se acumula alrededor de la fruta estropeada, fue descubierta como modelo animal. Thomas Hunt Morgan, que la utilizó para demostrar que los cromosomas portan la información genética, (Lindsley, et al., 2012). En la actualidad existen diferentes estudios relacionados con Drosophila, debido a que este insecto, tiene un ciclo de vida corto desarrollándose completamente, en un tiempo aproximado de nueve a diez días en condiciones ambientales óptimas, a su facilidad de cultivo, grandes cantidades de descendencia, tamaño pequeño, bajo costo en su manejo y mantenimiento ((Mora et al., 2000), entre la investigaciones en la que se ha utilizado este organismo están en el desarrollo de fármacos para combatir patógenos responsables de diversas enfermedades, desde infecciones de la piel hasta la neumonía y meningitis, enfermedades degenerativas como el Alzheimer, enfermedades hereditarias y de tipo mutaciones, como el estudio en diferentes tipo de cáncer, debido a que primero simplifica los estudios. En segundo lugar, la mosca permite sacar de un lugar concreto y en un momento específico cualquier proteína y tercero porque a pesar de que las moscas tienen un cerebro muy simple disponen de nervios y músculos altamente desarrollados (Bayona et al., 2017).
Las técnicas de transgénesis han permitido el desarrollo de innumerables líneas con genes sobreexpresados, modificados, silenciados o anulados. La disponibilidad de moscas transgénicas en reservorios públicos en países como Austria, Japón y Estados Unidos permite que investigadores de todo el mundo puedan trabajar con estos organismos modificados genéticamente a un costo mucho menor que otro tipos de organismos transgénicos, el genoma, el transcriptoma y el proteoma de Drosophila melanogaster en diferentes etapas de su ciclo de vida han sido estudiados y caracterizados (Santalla et al., 2016). Esta investigación tiene como objetivo general conocer la reacción a nivel molecular producidas en el proceso de replicación del ADN por el medicamento que se utiliza para el control de tumor que es el de Sulfato de vincristina en Drosophila melanogaster, esto se realizó diluyendo el medicamento en el medio de cultivo, observando los cambios que este organismo sufre en sus características morfológicas externas y cómo los genes intervienen en este proceso y una gran variedad de mecanismo moleculares que regulan la respuesta celular al estímulo del medio promoviendo a que la células difieran, proliferen muten, o mueran; esto quiere decir que Con el objeto de estudiar 1a interacción de gen-mutagen, para así poder tener una observación de mutaciones visibles.
MARCO TEÓRICO
Drosophila melanogaster se considera una de las especies existentes más importantes para la investigación biológica. Esto se debe principalmente a su fácil cultivo, tiempo de generación corto, gran número de descendientes, tamaño pequeño.. Se ha evidenciado que los factores ambientales probados como temperatura, humedad relativa y tipo de medio de cultivo. El impacto en la productividad y desarrollo de D. melanogaster de La influencia del medio se debe principalmente a sus características Química física y microbiología, como porcentaje de nutrientes, pH e Interacciones entre microorganismos como bacterias y levaduras (Díaz – González, et al., 2008). Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, es un organismo genético modelo que en años recientes se ha usado exitosamente para estudiar el control del metabolismo y el crecimiento. A pesar de poseer algunas diferencias con las vías de señalización homólogas a las de los vertebrados, las semejanzas son profundas y claras. En D. melanogaster, la vía de la insulina, homóloga a la de los vertebrados, regula tanto el metabolismo como el crecimiento del organismo a través de un único receptor membranal (Deyannira Otero-Moreno, 2016). Como la gran mayoría de las moscas, los miembros de esta especie son inofensivos, aunque su costumbre de intimar con la materia en descomposición les ha dado mala reputación, Se encuentran especies de Drosophila en todo el planeta, aún en las regiones antárticas y árticas, estas especies son muy abundantes en desiertos, bosques de casi toda índole desde los secos hasta los bien húmedos, en todas las zonas templadas y tropicales. Los enemigos de estas especies son los ácaros, hongos y las bacterias, se han generado algunos estudios del Drosophila melanogaster en 1909- Thomas H. Morgan fue el primero en utilizar D. melanogaster como organismo experimental. 1933- Recibe premio nobel Genes están en los cromosomas; el ciclo de la vida y el desarrollo de esta especie son pequeños insectos díptero, de unos 3 mm de longitud en su forma adulta, que experimenta el desarrollo embrionario dentro de un huevo y eclosiona como una larva. Luego atraviesa dos estadios larvales más, aumenta progresivamente de tamaño y llega a convertirse en una pulpa, que por último de origen por metamorfosis al adulto, las hembras ponen huevos al segundo día luego de salir de la pupa (Wolpert, 2010 ). Descripción del macho, holotipo y paratipos (Especímenes muertos y secos); Morfología externa: Longitud total (cuerpo + alas) 4.3 mm. Cuerpo amarillo. Cabeza: Primer y segundo segmento de las antenas color marrón claro; arista plumosa con cinco ramas dorsales y tres ventrales. La placa orbital ligeramente más oscura; cerda orbital media más cerca a la cerda orbital anterior. Triángulo ocelar y triángulo frontal de color marrón oscuro. Frontal vitta ligeramente más claro. Una cerda oral larga. Carina prominente ligeramente surcada de color marrón claro, Ojos de color rojo vinoso. Palpos amarillentos (Rafael, 2012). Las investigaciones sobre mutagénesis indican diferencias en los resultados observados, que dependen fundamentalmente del agente; En las mutaciones de Drosophila son herramientas esenciales para el análisis funcional de los genes, de los que en vertebrados sólo se tiene clones usualmente se emplean sondas de los vertebrados para obtener secuencias similares en este organismo de modo tal que al mapear las secuencias de Drosophila es posible correlacionar el gen con una mutación existente o bien seleccionar una nueva mutación con la secuencia para demostrar su función (Jimenez, 2003). también una gran ventaja de Drosophila se basa en su fácil introducción Y combina las mutaciones en su genoma. De esta forma, el fenotipo mutante puede inferir las posibles funciones de los genes durante el desarrollo. El Genoma Drosophila contiene muy poco ADN repetitivo y la mayoría de los genes son de copias únicas. Único, evitando así los inconvenientes de la redundancia funcional. Éste Particularidad e inserción de nuevo material genético Genoma de Drosophila, Permite generar varios mutantes Los mutantes son una poderosa herramienta para analizar procesos biológicos complejos (González García, I. 2007).
 El ciclo vital de Drosophila melanogaster, es un insecto completamente holometábolo, a saber, La etapa larvariay la etapa adulta están separadas por la etapa superior, durante este período Se ha producido una metamorfosis completa. Continúa el ciclo de vida de las moscas de la fruta 25ºc unos 10 días. Los huevos de Drosophila se forman durante un período de tiempo. Aproximadamente tres días y medio. Después de la fertilización, la madre lo puso en Externamente, comienza la embriogénesis. Y es en esta etapa Polaridad anteroposterior, luego polaridad abdominal posterior. Después de unas 24 horas, La eclosión del embrión producirá una larva de vida libre, que pasará por tres etapas Larvas (LI, LII y LIII). Durante este período, las células larvarias básicamente no son Hiperplasia; sin embargo, debido a su replicación intranuclear, su volumen aumenta material genético. Al quinto día, la larva entró purulenta y comenzó a metamorfosearse. En esta etapa, la mayoría de los tejidos larvarios están organizados. estructura Los adultos estarán formados principalmente por la reorganización del disco. Ficticio (causa cabeza, pecho y Genitales externos adultos) y fibroblastos (que formarán la epidermis) Abdomen adulto). A las pocas horas de vida, las moscas adultas son fértiles y comienzan el Ciclo de vida de nuevo (González García, I. 2007). 
 Sulfato de vincristina (VCR), droga antineoplásica que, adicionalmente a su efecto citostático sobre la masa tumoral, ha demostrado presentar características anti vasculares directas; estos agentes antineoplásicos, debido a sus efectos citotóxicos, aumentan la cantidad de radicales libres en las células causando su muerte. Los objetivos de este estudio fueron evaluar los posibles efectos tóxicos de la VCR en el número de descendientes y la tasa de supervivencia de las moscas y si presentaban mutación con este tipos de agente (Contreras Yelpi, 2007).
MATERIALES Y MÉTODOS
Parte I. Obtención de las moscas Drosophila melanogaster con un medio de cultivo silvestre para su cría.
Inicialmente se tomaron seis vasos plásticos con las medidas de 45 mm, base de 82mm altura, con una boca de 70mm de diámetro como se observa (la figura 1). Luego se procedió a preparar un medio de cultivo, el cual se elabora macerando un banano y/o plátano maduro, hasta obtener una consistencia viscosa, donde posteriormente se añadió a los seis frascos una cuarta parte de la sustancia macerada. Se procedió a dejar los vasos destapados encima de un plato con poca agua, para evitar que las hormigas entren en contacto con el medio de cultivo. Luego, se revisó de manera constantemente por ocho días, para comprobar que la presencia de pupas de la mosca D. melanogaster Luego de cerciorarnos que las pupas estuvieran en el medio de cultivo, procedimos a cerrar los vasos con gasas o papel aluminio agujereado, para que así, la D. melanogaster obtuviera oxígeno. 
Figura #1 ( muestras de inicial) 
Parte II. Preparación del nuevo medio cultivo de la Drosophila melanogaster capturadas.
Inicialmente se tomó aproximadamente 2 cucharadas de avena y harina, se mezclaron hasta obtener una sustancia homogénea, luego se tomaron 5ml de agua caliente y se le agrego una cucharada de miel y azúcar para luego hacer una pasta con todos lo ingredientes. Se llevó al fuego por unos minutos hasta homogeneizar la sustancia, luego se repartió entre los 20 frascos de vidrio (compota para bebes) (1/8 de su tamaño) y se dejó en reposo. hasta Adquirir una consistencia semi sólida. Luego, con las moscas desarrolladas en el medio de cultivo inicial, se llevó al congelador para así adormecerlas y pasarlas al nuevo medio de cultivo según su morfología, (teniendo en cuenta el menor tamaño, el extremo redondeado del abdomen y el peine sexual en el primer par de patas de los macho que el de la hembra donde el abdomen es alargado y es de mayor tamaño) es decir, machos y hembras divididos en los seis frascos del nuevo cultivo como se observa en la figura 2. 
 
Figura #2 ( muestra de preparación de medio de cultivo
Parte III. Preparación del medicamento mutagénico en el nuevo medio de cultivo.
Para el cálculo de las dosis necesarias para aplicar al medio de cultivo con los moscas, se utilizó el siguiente método: 
Para una concentración de 0,04% 
 1mg ------- 100ml
0,00093 ≈ 0,001mg ------- X
X = 0,001mg x 100ml / 1mg X = 0,1 ml
Para una concentración de 0,06% 
 1mg ------- 100ml
0,0015 mg ------- X
X = 0,0015mg x 100ml / 1mg X = 0,15 ml
Para una concentración de 0,08% 
 1mg ------- 100ml
0,002 mg ------- X
X = 0,002mg x 100ml / 1mg X = 0,2 ml
Para una concentración de 0,10% 
 1mg ------- 100ml
0,0025 mg ------- X
X = 0,0025mg x 100ml / 1mg X = 0,25 ml
Para una concentración de 0,12% 
 1mg ------- 100ml
0,003 mg ------- X
X = 0,003mg x 100ml / 1mg X = 0,3 ml
Se repitió nuevamente el medio de cultivo con los mismos ingredientes, con las mismas proporciones agregando el agente mutagénico de la siguiente manera:
Frascos de control. Se depositó 25ml del medio de cultivo en 2 frascos sin adicionar ningún agente para ser utilizadas como muestra de control. (Estos 2 frascos se prepararon 5 veces para ser comparados con los dos frascos de cada una de las concentraciones).
Frasco #1 y Frasco #2. Se depositó 25ml del medio de cultivo y se adicionaron 0,1 ml del agente mutagénico en cada uno.
Frasco #3 y Frasco #4. Se depositó 25ml del medio de cultivo y se adicionaron 0,15 ml del agente mutagénico en cada uno.
Frasco #5 y Frasco #6. Se depositó 25ml del medio de cultivo y se adicionaron 0,2 ml del agente mutagénico en cada uno.
Frasco #7 y Frasco #8. Se depositó 25ml del medio de cultivo y se adicionaron 0,25 ml del agente mutagénico en cada uno.
Frasco #9 y Frasco #10. Se depositó 25ml del medio de cultivo y se adicionaron 0,3 ml del agente mutagénico en cada uno.
	N° de frasco
	Contenido
	Control
	25 ml MC
	Control
	25 ml MC
	1
	25 ml MC + 0,1 ml AM
	2
	25 ml MC + 0,1 ml AM
	3
	25 ml MC + 0,15 ml AM
	4
	25 ml MC + 0,15 ml AM
	5
	25 ml MC + 0,2 ml AM
	6
	25 ml MC + 0,2 ml AM
	7
	25 ml MC + 0,25 ml AM
	8
	25 ml MC + 0,25 ml AM
	9
	25 ml MC + 0,3 ml AM
	10
	25 ml MC + 0,3 ml AM
Tabla 1. Preparación de los frascos con el medio de cultivo (MC) y el agente mutagénico (AM)
RESULTADOS 
Adelfo Morales
Maria Fernanda 
Fig 6. Frascos de control para la concentración de 0,06%
Fig 7. Frascos con 0,15 ml del agente mutagénico para la concentración de 0,06%
 
fig 8: aquí podemos observar que el cultivo con un agente mutagénico al 0.03% presenta un crecimiento en su estado larvario esto gracias a al agente mutagénico
fig: 9 podemos ver el crecimiento de la drosofila podemos observar que contiene un gran tamaño este agente mutagénico causa el cambio de tamaño podemos observar que las alas presentan mayor tamaño las drosófilas no sobreviven solo se presenta un cambio en su fenotipo y luego la muerte.
fig: 10 podemos observar el control miremos que las larvas son mucho más pequeñas que en la f6 gracias que este cultivo no contienen ningún agente mutagénico y se espera un crecimiento normal.
Luz Marina Villero. 
 fig: 11 Como se puede observar las drosophilas con el medicamento para la mutación se murieron al 3 día de nacer. 
Discusión de resultados 
Adelfo Morales 
En la figura 1 y 2 observamos mutaciones en las alas en la que la figura 1 las alas son más delgadas que las alas normales de estos organismo y la figura 2 la alas tienen un menor tamaño en proporción del cuerpo, está mutaciones se pueden deber alteraciones del cromosoma 2 de la Drosophila melanogaster, aunque también puede darse en el cromosoma número 3, ya que este se encarga de regular la apoptosis y morfogénesis de las alas y es que en el cromosoma 3 se encuentra el gen ash-2 que es un regulador de la diferenciación celular y es que un estudio realizado por Amorros 2001, pueden haber sustancia farmacotoxicas, que pueden afectar los disco imaginales, de Drosophila melanogaster, que son un conjunto de células, como invaginacionesde la epidermis, y que crecen por mitosis justo antes de la metamorfosis y que estos grupos de células contienen la información genética del desarrollo de los nuevos órganos, en los discos imaginales de las alas, durante la embriogénesis está constituido por 40 células, que empiezan a dividirse en la primera etapa larvaria, y seguirán así durante los sucesivas etapas, hasta obtener unas 5.000 células en promedio, sin embargo esta proliferación no ocurre a la misma velocidad en todo el disco por lo que sustancias mutagénicas pueden inducir a cambios en el patrón hereditario, entre los que están afectando unos de los alelos de las carteristas heterogéneas induciendo a la homogeneidad por un alelo, por lo que la generación de la forma y el tamaño del ala adulta puede verse alterada, (Amorós, 2001) y (Martín, 2016).
En la figura 2 y 3 se observan deformaciones en el cuerpo y las patas además en la figura 2 se observa deformaciones en las alas, en la figura 3 ausencia de estas en Drosophila estas mutaciones suelen suceder en el cromosomas 1 y 3 y es que estos cromosomas se encuentra la información del desarrollo de las características corporales del organismos y es el que el cromosoma 1, controla algunos aspectos de la morfología del cuerpo del organismo y el cromosoma 3 como se vio en el párrafo anterior se encuentra localizado un gen regulador en la división de la células en su procesos de diferenciación, y en la figura 4 y 5 se ve un mayor tamaño de las larvas y pupas de Drosophila y es que el medicamento Sulfato de vincristin, puede actuar como agente genotóxico por lo que tiene la capacidad de dañar el ADN dentro de las lesiones que puede sufrir esta macromolécula estas las roturas de cadena simple o de doble cadena, modificaciones químicas en las bases nitrogenadas por mecanismos como oxidación, alquilación vemos que aunque el daño del ADN no se considera una mutación, pero esta incrementa la aparición de mutaciones, algunas se pueden dar por la pérdida de heterocigosidad, llevando a la expresión de la enfermedad, estas mutaciones se pueden presentar en el estado larvario en lo que las células que componen los disco imaginales, sufren una alteración en los genes, expresándose fenotípicamente en la edad adulta del organismo y esto se debe a que la células hijas portarán la misma modificaciones, del gen de la células imaginales larvarias (Atici, 2018). 
Maria Fernanda 
En la Figura 6 podemos evidenciar las muestras de control puestas para comparar los medios de cultivo a concentración de 0,06% donde las moscas de Drosophila melanogaster se continuaron reproduciendo y poniendo las pupas.
En la Figura 7 se presentan los frascos que contienen 0,15 ml de agente mutagénico para ser expuestos a una concentración de 0,06% donde al cabo de los días, se pudo concluir que las moscas de Drosophila melanogaster no se reproducen, aunque ellas se mantienen vivas, no logran reproducirse. También es evidente un cambio en el tamaño de estas, donde puede verse un aumento de tamaño, mayormente en la parte trasera del cuerpo de la mosca.
Luz marina Villero 
En la Figura 11; la mutación que se genera con el medicamento de Sulfato de vincristina se observa que estas mutaciones son recesivas. En heterocigosidad, Drosophila están bien desarrollados y no tienen ningún fenotipo relacionado. Homocigosidad La mutación no afecta el desarrollo de larvas, larvas homocigotas no tuvieron cambios serios, Su tamaño y forma son equivalentes a discos imaginarios. salvaje. Vuela homocigoto 2 días después de la mutación Heterocigotos, viven de 1 a 2 días, son estériles, exhiben una serie de fenotipos relacionados se encuentran principalmente en las alas, levantamiento de pesas y pata. Fenotipo en el ala del mutante La aparición de venas transversales ectópicas. -En comparación con el campo, el tamaño del ala se reduce. -En el 16,7% de los casos (10/60) hay una pérdida de margen parcial El alerón trasero produce un fenotipo similar al del mutante. Gen Notch (es un sistema de señalización celular altamente conservado en los animales).Cuando el tamaño de la drosophila es grande, aumenta la longitud y el ancho de las extremidades. Una característica importante para recordar son estas venas transversales. ya después de el 3 dia las mutaciones de las drosophilas mueren al 3 dia, salen de la pupa y hay larvas que mueren antes de nacer ya que no soportan el medicamento (González, 2007).
Bibliografía
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ANEXOS