Detección HCV

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Método de ELISA para la detección de anticuerpos contra el virus de la Hepatitis C
T.P. nº 3. Virología
2020
La hepatitis C es la forma más común de hepatitis post-transfusional.
Su transmisión se produce fundamentalmente por vía parenteral.
El 80% de las personas infectadas con HCV desarrollan infección crónica. En el 30% de estos pacientes, la enfermedad progresa hasta la cirrosis o cáncer de hígado.
La mayoría de las personas con hepatitis C no presenta síntomas; en consecuencia, esta enfermedad raramente es diagnosticada antes de la aparición de sus complicaciones crónicas. 
Los pocillos de la policubeta están recubiertos con antígenos recombinantes derivados de la región estructural (core) y de la no estructural (NS3, NS4 y NS5) del virus de la hepatitis C. 
La muestra diluida se incuba en los pocillos. Si los anticuerpos contra el virus están presentes en la muestra, éstos se unen a los antígenos del pocillo. 
El material no unido es removido por lavado. 
En el paso siguiente se agrega el conjugado, que consiste en un anticuerpo monoclonal anti IgG humana conjugado con peroxidasa. Este se une a los complejos antígeno-anticuerpo, formados previamente. 
El conjugado no unido se remueve por lavado. 
Posteriormente, se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. 
Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico.
Fundamentos del método
Presentación del kits de trabajo
Conservar a 4 ºC
Todos los reactivos tienen que estar a temperatura ambiente al momento de su utilización
Protocolo de trabajo
Muestra del paciente
20 ul
Control (-) suero humano no reactivo inactivado y Control (+) suero humano inactivado conteniendo anticuerpos contra HCV.
20 ul de cada uno por duplicado
Placa para ELISA recubierta con antígenos recombinantes del HCV
Incubar la placa 1 hora a 37º C
Buffer salino con tensioactivo. Color violeta
100 ul
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Buffer de lavado concentrado: buffer salino con tensioactivo (25X). 
La dilución se prepara utilizando haciendo una dilución 1/25 en agua desionizada. La solución de lavado preparada es estable en heladera durante 3 meses. 
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Conjugado concentrado: anticuerpo monoclonal anti IgG humana conjugado con peroxidasa 10X.
Diluyente de conjugado: buffer salino con proteínas.
Para preparar la solución de trabajo (1X) diluir 1 parte del conjugado concentrado 10X con 9 partes de diluyente de conjugado. Solución estable 6 horas. Preparar al momento de llevar a cabo el ensayo. 
Dispensar 100 ul del conjugado diluido en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos en estufa a 37º C 
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Revelador TMB: solución de tetrametilbencidina y peróxido de hidrogeno (listo para usar.
Dispensar 100 ul del revelador en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Tapar la placa con papel de aluminio. 
Stopper: ácido sulfúrico 2N
Dispensar 100 ul del stopper por pocillo. 
Leer la placa (color estable: 10 minutos).
Resultados
Control Positivo: se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con el ácido sulfúrico.
Control negativo: no se observa desarrollo de color. 
Para el caso de la muestra del paciente no se observa desarrollo de color.