Laboratorio de cultivos celulares y nociones de seguridad

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El Laboratorio 
de 
Cultivos Celulares
https://www.youtube.com/watch?v=deTa5xntBuw&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=53s7_VxYleA&feature=youtu.be
 Virología 2020
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir y multiplicarse si se las hace crecer en medios de cultivos adecuados y en lugares aptos para este tipo de tareas.
Cultivo celular: Proceso mediante el cual podemos crecer células eucariotas bajo condiciones controladas.
Usos actuales de los cultivos celulares 
- Sistemas modelo para estudiar: biología básica, interacciones entre agentes que causan enfermedades y las células, efecto de drogas, proceso de envejecimiento y estudios nutricionales.
- Pruebas de toxicidad.
- Investigación en cáncer.
- Virología.
- Ingeniería genética.
- Terapia génica.
Básicamente, siete espacios deben considerarse para que un laboratorio de cultivos celulares sea funcional:
1- Área de acondicionamiento y esterilización de materiales.
2- Área de almacenaje del material acondicionado.
3- Área de preparación de los medios de cultivo.
4- Área estéril o de cultivo celular propiamente dicho.
5- Área de incubación de los cultivos celulares.
6- Área de preservación de reactivos, medios de cultivo y líneas celulares.
7- Área de lavado del material de trabajo (Programa de gestión de residuos).
	 Zona, preferentemente, separada y alejada del área de cultivos celulares.
	 Hornos destinados al secado del material, antes de su acondicionamiento o luego de su autoclavado.
- Dependiendo del material a acondicionar se podrá utilizar papel de aluminio, papel de madera, algodón o nada.
	 El proceso de esterilización se llevará a cabo en:
1- Área de acondicionamiento y esterilización de materiales
 Estufa de esterilización Autoclave
 (calor seco) (calor húmedo)
2- Área de almacenaje del material acondicionado 
 - El material acondicionado debe ser almacenado especificando el elemento de trabajo del cual se trata y la fecha de esterilización.
	 Los elementos (vidrio o plástico) deben ser guardados en forma ordenada y en lugares limpios al resguardo de la tierra. De esta manera, cualquier trabajador del laboratorio podrá acceder al material que necesite en forma rápida.
	 En general, se utilizan los bajo mesada como lugar de almacenaje del material. 
- La caducidad del material estéril se refiere al período de tiempo durante el cual se puede garantizar la conservación de la esterilidad. Durante este lapso de tiempo, la temperatura del lugar debe oscilar entre los 15 ºC y los 25 ºC y se deben registrar bajos valores de humedad relativa. (40% - 60%).
3- Área de preparación de los medios de cultivos
Balanza analítica digital
Agitador magnético
Magnetos
pHmetro
Cabina de seguridad 
biológica
Cápsulas y equipo de filtración 
4- Área de cultivo celular propiamente dicho 
- El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 
- La función del área de cultivo es la de contar con un lugar de condiciones asépticas adecuadas para el manejo y desarrollo celular.
	 El sitio debe corresponderse con el volumen de equipamientos y cantidad de personal.
	 El sentido de apertura de las puertas debe ser el de evacuación en caso de emergencia.
	 Los equipos deben estar situados en espacios que permitan abrir sus puertas sin causar obstrucción. 
Equipos y materiales de trabajo en el área de cultivos celulares
Cabinas de seguridad biológica (CSB)
Las cabinas de seguridad biológica son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos. 
La protección se logra mediante la combinación de elementos electromecánicos/electrónicos (motor, ventilador, filtro, ductos, iluminación, etc.), y procesos físicos (flujo laminar, diferencias de presiones) que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie (filtros HEPA) estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del 99,99%, cuando el tamaño de las mismas es en promedio de 0,3 μm . 
Filtros HEPA (Hihg Efficiency Particulate Air)
Requisitos para el buen funcionamiento de una CSB
	 Debe estar ubicada dentro de un área protegida de las corrientes de aire (ventanas, aire acondicionados) y alejada de la zona de paso de las personas.
	 Se debe instalar sobre una mesa firme y bien nivelada, diseñada para soportar el peso de la cabina y permitir al operador trabajar con comodidad (espacio libre para colocar los pies y altura adecuada).
	 El piso del lugar debe ser plano y estar bien nivelado.
	Se respetarán las áreas libres que el fabricante recomienda alrededor de la cabina.
- La cabina debe certificarse anualmente para cumplir los requerimientos establecidos.
Tipos de CSB
Clase I
	 Protegen al personal y al ambiente.
	 No mantienen la esterilidad de las muestras.
	 Manipulación de agentes biológicos de riesgo bajo o moderado.
	 El aire fluyendo de la sala al interior de la cabina minimiza el escape de aerosoles que se puedan formar en la cámara de trabajo.
- El aire extraído de la cabina es descontaminado antes de su vertido a la atmósfera a través de los filtros HEPA. 
Clase II
	 Suministra protección al personal, al ambiente y al producto (agentes de bajo o moderado riesgo biológico)
	 El área de trabajo es recorrida por un flujo descendente de aire estéril (flujo laminar vertical).
- La protección del trabajador se debe a la presencia de una barrera de aire formada por la entrada de aire desde el laboratorio, a través de la abertura frontal, y por el flujo descendente de aire filtrado estéril.
- El 70% del aire que ingresa al gabinete se re-circula en forma de flujo laminar filtrado para proteger las muestras de contaminaciones externas, previa filtración HEPA.
Clase III
	 Diseñada para trabajar con agentes microbiológicos clasificados en el nivel de bioseguridad 4.
	La cabina está completamente sellada, separando completamente al trabajador de la tarea que está realizando mediante barreras físicas (panel frontal completamente cerrado, manipulación a través de guantes de goma).
- El aire es tomado del local o del exterior y filtrado. En su extracción, suele haber dos filtros HEPA en serie para la completa purificación del aire extraído.
	En el interior de la cabina, hay circulación de aire en régimen turbulento por lo tanto, la protección de la muestra no es tan completa como en el caso de CSB II.
Plenum: espacio cerrado en donde existen aire a bajas velocidades y presiones ligeramente superiores a la atmosférica.
F
Antes de usar: encender la luz UV 15 minutos, apagarla; encender la turbina y los tubos fluorescentes y dejar estabilizar durante al menos 15 minutos; desinfectar la superficie del gabinete (solución de alcohol al 70%); desinfectar los elementos de trabajo y colocarlos en el interior.
	Trabajar, al menos, entre 5 y 10 cm por detrás de la rejilla de entrada de aire.
- Realizar movimientos lentos de brazos y manos en el interior de la cabina. En caso contrario, se crean corrientes de aire que rompen la laminaridad del flujo de aire.
	Colocar los elementos contaminados o que no requieren protección hacia el fondo del gabinete.
	 No obstruir las rejillas de extracción o ingreso de aire.
	 Limpiar las salpicaduras tan pronto como se producen.
Al finalizar: dejar encendida la turbina al menos 5 minutos luego de terminar; remover los elementos de trabajo; desinfectar la superficie del gabinete; apagar la turbina y los fluorescentes y encender durante 15 minutos la luz UV.
Procedimiento de trabajo en una CSB
¿Qué podemos encontrar dentro de una CSB? 2942
Propipetas automáticas
Pipeteros
Micropipetas automáticas
Caja para puntas de micropipetas
Frascos para cultivos
celulares
 Microscopio óptico invertido
	 La luz y el condensador están orientados hacia abajo.Los objetivos están ubicados debajo de la platina.
- Su diseño permite la observación de los cultivos celulares estáticos y la evaluación de su evolución.
Centrífugas y microcentrífugas
Centrífuga de mesa
Microcentrífuga
Centrífuga refrigerada
5- Área de incubación de los cultivos celulares
	 Las incubadoras son parte del equipo esencial para el cultivo de células. 
- La finalidad de las incubadoras es mantener un ambiente propicio de aire (presión de CO2), humedad, pH y esterilidad para permitir un óptimo desarrollo de los cultivos celulares.
	 El tamaño, de las generalmente llamadas estufas, es variable; esta característica responde a las necesidades de cada laboratorio (cantidad de personal, volumen de trabajo y de líneas de investigación).
	 Deben estar ubicadas en una zona de bajo tránsito y cercana al área de cultivos celulares.
- La temperatura del cuarto debe estar regulada ya que la mayoría de los equipos pierden la capacidad de mantener la temperatura de cultivo establecida, cuando esta variable aumenta significativamente. Especial cuidado se debe tener cuando se trabaja con líneas celulares de lepidópteros (temperatura de incubación 27 ºC) que requieren incubadoras con refrigeración ubicadas en zonas con aire acondicionado para mantener una adecuada temperatura.
Incubadora apta para el cultivo de células de mamíferos
6- Área de preservación de reactivos, medios de cultivo y líneas celulares
- La función general de las heladeras (4 ºC) y congeladoras (-18 ºC y – 80 ºC) es preservar de la degradación diferentes materiales, reactivos y soluciones de trabajo. 
- Los tanques de nitrógeno líquido (- 190 ºC) permiten almacenar en criotubos líneas celulares por largos períodos de tiempo (años).
 Congeladora (-80º C) Tanques de nitrógeno líquido (-190º C) 
*
7- Área de lavado del material de trabajo.
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- En un laboratorio de cultivos celulares la adecuada limpieza del material es fundamental para alcanzar buenos resultados.
- El área de lavado debe estar, en lo posible, separada y alejada del área de cultivo celular. Es recomendable que, el lavado del material de trabajo se realice en el mismo sitio donde posteriormente se llevará a cabo su acondicionamiento y tratamiento de esterilización. 
	 Las piletas de lavado del material deben tener una profundidad adecuada de manera de impedir las salpicaduras fuera de las bachas.
	 Las soluciones de detergente no iónico biodegradable son utilizadas para la limpieza del material de vidrio o plástico que ha estado en contacto con células. Este tipo de detergente se caracteriza por la ausencia de cloro y fosfatos entre sus componentes. Se deja een remojo durante 24 hs 
- Luego del tratamiento de los objetos con un detergente no iónico es fundamental el proceso de enjuague. Por lo general, los primeros enjuagues se realizan con agua de red para finalizar el proceso con agua desionizada.
	 La FBCB cuenta con un programa de gestión de residuos el cual contempla un conjunto de indicaciones destinadas a lograr la correcta manipulación y eliminación de los residuos generados (clasificación, recolección en los envases adecuados, almacenamiento, transporte y eliminación).
	 El programa tiene como objetivo optimizar la gestión de residuos con el fin de proteger la salud de los estudiantes, del personal y de la comunidad en general, promoviendo el cuidado del medio ambiente.
	 Los residuos se dividirán en cuatro categorías: 
1- Residuos comunes no contaminados (no infecciosos): se pueden eliminar como si fueran basura en general (bolsas negras). 
2- Residuos patogénicos: se descartará en bolsas de color rojo. Los objetos cortantes o punzantes se recogerán en descartadores con tapas y, posteriormente, se eliminarán en bolsas rojas. 
3- Residuos químicos: los líquidos deberán desecharse en bidones de polietileno de alta densidad y los sólidos en recipientes del mismo material.
4- Residuos radiactivos: depende del tipo de actividad del reactivo.
Programa de Gestión de Residuos
Bioseguridad
Conjunto de protocolos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manipuleo de los microorganismos, mediante la protección de operadores, personas del entorno, animales y el medio ambiente. Involucra técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseño de las instalaciones. 
- La Organización Mundial de la Salud clasifica los microorganismos infecciosos en 4 grupos en función del riesgo intrínseco que suponen.
- Para que se produzca un accidente causado por un agente biológico deben concurrir básicamente cuatro elementos: un huésped susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión apropiada.
GRUPOS DE RIESGO DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS 
SARS-CoV 2
	
Grupo de riesgo	
Nivel de bioseguridad	
Riesgo infeccioso	Riesgo de propagación a la colectividad	Tipo de 
laboratorio
	1
Baculovirus	
Básico	Poco probable que cause enfermedad en el hombre	
No	
Enseñanza
Investigación
	
2
Hepatitis B Hepatitis C	
Básico	Pueden causar una enfermedad y constituir un peligro para los trabajadores	
Poco probable	
Diagnóstico
Investigación
	
3
Hanta
Flavivirus	
Contención	Pueden causar una enfermedad grave y constituir un serio peligro para los trabajadores
	
Probable	
Diagnóstico
Investigación
	
4
FHA
Ebola	
Contención máxima	Provocan una enfermedad grave y constituyen un serio peligro para los trabajadores
	
Elevado	
Patógenos peligrosos
*
Niveles de seguridad biológica en los laboratorios
	Se han definido cuatro niveles de contención para agentes biológicos BSLs (BioSafety Levels) que recogen los protocolos apropiados según los trabajos a realizar y las rutas de transmisión conocidas o sospechadas de los agentes biológicos y la función o actividad del laboratorio. 
	El término “contención” se utiliza para describir los protocolos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados.
	El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.
Contención
 
 Primaria Secundaria
 - protección del personal - medio ambiente externo al 
 - medio ambiente del laboratorio laboratorio
Protocolos adecuados de trabajo Diseño y construcción de las
Uso de equipos de seguridad instalaciones
Inmunización del personal por aplicación
de vacunas específicas
Contención Primaria. Elementos de protección personal
	 Dependiendo del nivel de bioseguridad del laboratorio, el personal de trabajo contará con un equipo de protección específico.
	 Nivel de bioseguridad 1 y 2: guardapolvo; guantes de látex; protección para los ojos o máscara para el rostro; calzado cerrado; cabello recogido; cofia para el cabello, (si fuese necesario).
Otras normas de protección, válidas para todos los niveles de bioseguridad, son:
 - la prohibición de comer, beber, fumar, aplicar cosméticos o manipular lentes de contacto.
 - la negativa de almacenar alimentos o bebidas para el consumo humano en las zonas de trabajo.
Protección personal en nivel de bioseguridad 4
	 El personal está completamente cubierto y aislado del exterior.
- Los trajes presentan un sistema de respiración individual y una leve sobrepresión interna para evitar la entrada de partículas infecciosas.
	 En general, los trabajadores, están conectados a fuentes de aire limpio para evitar que respiren el que se encuentra en el laboratorio.
Contención Primaria
Medio ambiente del laboratorio
 CSB Clase II CSB Clase IIIContención secundaria
Protección del ambiente externo al laboratorio 
Protege a las personas, animales y al medio ambiente de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio
- sistema de ventilación especializados para asegurar el flujo de aire direccional.
 - sistema de aire para descontaminar o eliminar agentes del aire de escape.
- zonas accesos controladas.
- esclusas de aire en las puertas de acceso al laboratorio.
- edificios o módulos separados alejados de las áreas públicas.
Además:
	 Los gabinetes para guardar la ropa de calle y los objetos personales se encontrarán fuera de las zonas de trabajo del laboratorio.
	 Los sistemas de seguridad deben comprender medios de protección contra incendios y emergencias eléctricas, así como duchas para los casos de urgencias y medios para el lavado de ojos.
- Hay que prever salas de primeros auxilio.
Grupo de riesgo 1
Nivel 1 de Bioseguridad
Sin riesgo o riesgo muy bajo para el individuo y la comunidad (Ejemplo: Baculovirus)
- Escasa posibilidad de causar enfermedades en humanos o en animales.
	 Nivel de bioseguridad: básico.
	 Tipo de laboratorio: enseñanza e investigación.
	Prácticas de laboratorio: técnicas microbiológicas adecuadas (TMA)
- Equipos de seguridad: ninguno en especial, trabajo en mesa de trabajo al descubierto.
Laboratorio Básico. Nivel de Bioseguridad 1
	 Acceso no restringido.
- El trabajo se realiza en mesa estándar de laboratorio. 
	 No requiere diseño específico de las instalaciones.
- El personal utiliza indumentaria de protección adecuada.
Los trabajadores deben recibir una capacitación continua y supervisión de un profesional calificado.
Grupo de riesgo 2
Nivel 2 de Bioseguridad (Ejemplos: Hepatitis B; Hepatitis C)
Patógenos que pueden causar enfermedad en humanos y/o animales. Improbable que presenten un problema serio para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el medioambiente. Las exposiciones en el laboratorio pueden causar infecciones graves pero existen tratamientos eficaces. El riesgo de diseminación es limitado.
	Riesgo individual moderado. Riesgo comunitario bajo
	 Nivel de bioseguridad: básico.
	 Tipo de laboratorio: servicio de salud primario, diagnóstico e investigación
	Prácticas de laboratorio: TMA más: equipos de protección individual y señal de riesgo biológico.
- Equipos de seguridad: trabajo en mesa al descubierto: cabina de seguridad biológica (CSB) para posibles aerosoles.
Laboratorio Básico. Nivel de Bioseguridad 2
	 El acceso al lugar es restringido cuando se está realizando algún trabajo.
- Se toman precauciones extremas con instrumentos punzo-cortantes contaminado.
	 El personal debe tener entrenamiento en el manejo de agentes patógenos.
	Los procedimientos que pueden generar aerosoles se llevan a cabo en CSB.
- Se requiere supervisión y protección adecuada.
- Se pueden producir infecciones pero que pueden ser controladas eficazmente. Porque existe un tto.
Grupo de riesgo 3
Nivel 3 de Bioseguridad (Ejemplos: Hantavirus, Flavivirus)
Patógenos que usualmente causan enfermedades graves en humanos y en animales pero, normalmente, no se transmiten de un individuo infectado a otro directamente (en ciertas ocasiones, se transmiten a través de un vector ej dengue).
	Riesgo individual alto. Riesgo comunitario bajo
	 Nivel de bioseguridad: contención.
	 Tipo de laboratorio: diagnóstico e investigación
	Prácticas de laboratorio: Nivel 2 más: accesos y ventilación controlados
- Equipos de seguridad: CSB y otros dispositivos para todas las actividades.
Laboratorio de Contención. Nivel de Bioseguridad 3
	 Acceso al laboratorio restringido.
- Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipos de protección.
	 El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales.
	 Debe tener duchas y sistemas de tratamiento de efluentes líquidos.
- Todos los procesos se realizan en CSB.
- El aire del laboratorio se debe ventilar al exterior con flujo de aire direccional controlado, presión negativa y filtros HEPA.
Grupo de riesgo 4
Nivel 4 de Bioseguridad (Ejemplos: Fiebre Hemorrágica Argentina; Ébola)
Patógenos que habitualmente causan enfermedades graves en humanos y en animales y que pueden ser rápidamente transmitidos, directa o indirectamente, de un individuo infectado a otro. Normalmente, el tratamiento no está disponible.
	 Riesgo individual alto. Riesgo comunitario alto
	 Nivel de bioseguridad: contención máxima
	 Tipo de laboratorio: patógenos peligrosos
	Prácticas de laboratorio: Nivel 3 más cámara de entrada con cierre hermético, salida con ducha y eliminación especial de residuos.
- Equipos de seguridad: CSB clase III o trajes con presión positiva combinados con CSB clase II, autoclaves de doble puerta y filtración de aire.
Laboratorio de Contención Máxima. Nivel de Bioseguridad 4
- Laboratorios empleados para manipular agentes biológicos con alto riesgo de contagio, peligrosos para la vida o agentes nuevos potencialmente peligrosos. 
	 Los recintos se mantienen con una presión de aire negativa para impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente.
- El personal cuenta con entrenamiento específico para trabajar con agentes infecciosos en un ambiente estéril. 
Los trabajadores usan trajes especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos contando con una leve sobre-presión para evitar que entren partículas infecciosas en el caso de que el traje se desgarre.
Todo lo que sale del lab tiene que ser esteril y libre de patogenos, al igual que lo que entra