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Metodologías y técnicas de laboratorio para el estudio de virus, infecciones virales y enfermedades de etiología viral
Sistemas de multiplicación de virus animales en el laboratorio
	Animales de experimentación
	Huevos embrionados
	Cultivos de células animales
Animales de laboratorio
La selección de un modelo animal como huésped para un virus en el laboratorio dependerá de:
	Susceptibilidad a la infección
	A su vez, la susceptibilidad puede variar con la vía de infección, la edad y el sexo
	Utilizados fundamentalmente para estudios de patogénesis viral, repuesta inmune a las infecciones y desarrollo de vacunas y terapeúticos antivirales.
	Modelos más utilizados: primates no humanos, monos, cobayos, conejos, ratas y ratones.
Huevos embrionados
Utilizado para el aislamiento y la propagación de virus influenza, principalmente en la preparación de vacunas.
Cultivos de células animales
Cultivos primarios: células aisladas, obtenidas a partir de órganos o tejidos animales, mediante disgregación mecánica, física, química y enzimática, cultivadas en un medio líquido apropiado. 
Línea celular: cultivo obtenido a partir del repique de un cultivo primario. Están constituidas por células euploides (diploides).
Líneas celulares establecidas: obtenidas a partir de tumores, o por evolución de líneas diploides. Están constituidas por una única población de células, frecuentemente aneuploides, y en ocasiones con propiedades tumorigénicas (células transformadas). 
EFECTOS CITOPÁTICOS
Multiplicación viral en cultivos de células animales: efectos citopáticos
La infección de un cultivo celular por un virus se reconoce generalmente por la aparición de un efecto citopático. Se denomina efecto citopático a todo cambio celular provocado por la infección viral. Los efectos citopáticos pueden ser:
	 visibles por microscopía de bajo aumento;
	 visibles mediante el uso de microscopios de mayor poder;
	 no manifestarse en forma de cambios visibles.
Efectos citopáticos visibles por microscopía de bajo aumento
	Redondeamiento
	Despegamiento de la monocapa
	Lisis
	Engrosamiento nuclear
	Formación de sincicios
	Cuerpos de inclusión
Células infectadas con Adenovirus y teñidas con
Hematoxilina eosina
Células infectadas con Virus respiratorio sincicial,
donde se observa la formación de un sincicio
Células A549 infectadas con virus Herpes simplex,
donde se observan células redondeadas
                                                                  
Definición: Multiplicidad de Infección (MOI) 
En la infección viral de un cultivo celular, se define la multiplicidad de infección (MOI, m) como el cociente entre el número de viriones infectantes (Nv) y el número de células expuestas a la infección (Nc) .
MOI = Nv / Nc
La distribución de partículas virales por célula puede ser descripta por la distribución de Poisson:
P(k) = e-mmk / k!
Donde P(k) es la fracción de células infectadas por k partículas virales, y m es la multiplicidad de infección.
CUANTIFICACIÓN VIRAL
- Métodos indirectos
		*Inhibición de la proliferación celular.
	 *Lisis celular.
- Métodos directos
Cuantificación viral: métodos directos
	Métodos de cuantificación de partículas: basados en la detección de viriones, alguno de sus componentes o alguna actividad asociada.
	Métodos de cuantificación de actividad infecciosa: basados en la medición de una respuesta, expresada como unidades infecciosas por unidad de volumen. Una unidad infecciosa se define como la menor cantidad de virus capaz de provocar un efecto biológico detectable.
Métodos de cuantificación de partículas
	Microscopía electrónica: cuantificación relativa de partículas virales, respecto a una suspensión de partículas de látex, de tamaño similar al virión y de concentración conocida.
	Cuantificación de un componente de la partícula viral: ácido nucleico, polipéptido. 
Métodos de cuantificación de actividad infecciosa
	Métodos enumerativos: basados en el recuento de focos discretos de infección.
	Métodos “cuantales”: basados en la medición de una respuesta de tipo “todo o nada” (ECP o no ECP; muerte o sobrevida; enfermedad o no enfermedad).
Métodos enumerativos: titulación por formación de placas de lisis
Una placa de lisis es el producto de la amplificación, bajo condiciones de diseminación viral limitada, de la infección original de una célula. La limitación de la diseminación impone que la progenie viral producto de la infección original sólo infectará en forma secundaria las células vecinas. La repetición sucesiva de esta diseminación limitada a células vecinas termina generando un foco, que en el caso de una infección lítica, se puede revelar como una zona de lisis definida.
Diseminación no limitada
Célula infectada
Célula no infectada
Diseminación no limitada
Diseminación no limitada
Cuando la infección se lleva a cabo bajo condiciones de diseminación no limitada, la respuesta final no es proporcional a la cantidad de células infectadas originalmente, y tampoco a la cantidad de virus inoculado en el cultivo.
Diseminación limitada
Diseminación limitada
PLACA
PLACA
Cuando la diseminación de la infección es limitada, la respuesta final (número de placas de lisis) es igual a la cantidad de células infectadas originalmente. Si la infección se realizó en condiciones de MOI bajo las cuales cada célula fue infectada por una única partícula viral (ver distribución de Poisson), la cantidad de placas de lisis será también igual a la cantidad de partículas virales infectivas inoculadas en el cultivo. 
Definición: Unidad Formadora de Placa (UFP) 
Se define como unidad formadora de placa a la mínima cantidad de virus que es capaz de generar una placa de lisis en un cultivo celular.
Procedimiento de titulación viral por recuento de UFP
	Realizar diluciones decimales sucesivas de la muestra a titular: 100, 10-1, 10-2...
	Infectar una serie de cultivos celulares en monocapa con un reducido volumen de cada dilución de muestra de virus.
	Dejar adsorber, eliminar el volumen sobrante y cubrir los cultivos infectados con medio de cultivo semisólido (limitación de la diseminación).
	Incubar hasta que se tornen visibles las placas de lisis.
	Revelar por coloración y contar las placas correspondientes a cada dilución.
	Cada dilución se debe procesar por duplicado, y siempre se deben incluir controles no infectados. 
Cálculo del título viral en una cuantificación por formación de placas: ejemplo
	Volumen de inóculo (V): 0,1 ml
	Recuento de placas (n):
Dilución (d)	Recuento Recuento Promedio
100 Lisis total Lisis total -----------
10-1 Lisis total Lisis total -----------
10-2 455 492 473,5 
10-3 44 50 47
10-4 7 4 5,5
10-5 0 0 0
Control 0 0 0
	Título = n / (V x d) = 47 / (0,1 ml x 10-3) = 
 = 4,7 x 105 UFP/ml 
Métodos “cuantales”: titulación por dilución límite y punto final
El objetivo de estos métodos es hallar el valor de la dilución de la muestra de virus que, en un determinado volumen, es capaz de producir un efecto verificable en un porcentaje determinado, usualmente el 50 %, de todas las unidades de prueba infectadas en la titulación. Estas unidades de prueba pueden ser animales, y en este caso el efecto verificable puede ser la muerte, y la dilución de la muestra capaz de producirla en el 50% de los infectados contendrá 1dosis letal 50% (DL50). Si las unidades de prueba son cultivos celulares, el efecto verificable será un ECP, y la dilución de la muestra capaz de producir ECP en el 50 % de los cultivosinoculados contendrá una dosis infectiva para cultivos celulares 50% (DICC50 o TCID50). 
Procedimiento de titulación viral por dilución límite en cultivos celulares
	Realizar diluciones decimales sucesivas de la muestra a titular: 100, 10-1, 10-2...
	Infectar, con un volumen determinado y fijo de cada dilución (en el ejemplo que se presentará: 0,05 ml), un número determinado y fijo de cultivos celulares similares. Inocular un número similar de cultivos con solución diluyente (control).
	Incubar, observando periódicamente la aparición de ECP, y hasta que el número de cultivos (+) se estabilice.
	Determinar en cada cultivo, por observación microscópica, la presencia de ECP, y registrar los resultados, para cada cultivo en forma individual, como ECP positivo (+), independientemente de la magnitud del efecto, o ECP negativo (-). 
Tabla de observación
Dilución
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
Réplica 4
Réplica 5
100
+
+
+
+
+
10-1
+
-
+
+
+
10-2
-
+
-
-
+
10--3
-
-
-
+
-
10-4
-
-
-
-
-
control
-
-
-
-
-
Tabla de procesamiento de resultados
Log dilución viral
Cultivos (+)
Cultivos (-)
Cultivos acumulados (+) (A)
Cultivos acumulados (-)
 (B)
A/(A+B)
Porcentaje acumulado de cultivos infectados
0
5
0
12
0
12/12
100 %
-1
4
1
7
1
7/8
87,5 %
-2
2
3
3
4
3/7
42,9 %
-3
1
4
1
8
1/9
11 %
-4
0
5
0
13
0/13
0 %
Cálculo de la DICC50% de acuerdo al procedimiento de Reed-Muench (1)
	Ninguna de las diluciones ensayadas en el ejemplo provoca exactamente una respuesta positiva acumulada en el 50% de todas las unidades de ensayo. 
	Para estimar la dilución de la muestra que contiene, en el volumen ensayado, 1 DICC50, se debe suponer que la respuesta porcentual acumulada varía linealmente con el logaritmo de la dilución, en el entorno comprendido entre la dilución que genera la respuesta inmediata superior al 50% (en el ejemplo, 87,5% para la dilución 10-1 ) y la dilución que genera la respuesta inmediata inferior al 50% (en el ejemplo, 42,9% para la dilución 10-2).
	Como la dilución que contiene 1 DICC50% se encuentra en el entorno donde la respuesta se supone lineal, entonces la distancia proporcional desde la dilución ensayada inmediata superior hasta la dilución que contiene 1 DICC50, se puede calcular mediante la siguiente ecuación de la recta:
(% positivo arriba de 50%) – 50%
(% positivo arriba de 50%) – (% positivo debajo de 50%) 
Cálculo de la DICC50% de acuerdo al procedimiento de Reed-Muench (2)
	En el ejemplo propuesto:
 87,5 – 50 = 0,84
 87,5 – 42,9 
	Luego, el logaritmo de la dilución que contiene 1 DICC50% será igual a:
-1 – 0,84 = -1,84
 Donde –1 es el logaritmo de la dilución ubicada inmediatamente por arriba de la que contiene 1 DICC50%, y 
 –0,84 es la distancia proporcional a la dilución correspondiente al 50%. 
	Por lo tanto, la dilución que contiene 1 DICC50% es igual a: 
Dil50% = 10-1,84 o 1,44 x 10-2
Cálculo de la DICC50% de acuerdo al procedimiento de Reed-Muench (3)
	El cálculo del título (concentración de virus en la muestra sin diluir, expresada en DICC50% / ml) se realizará con la siguiente fórmula:
1
Dil50% x V
 Donde Dil50% es la dilución calculada en el paso anterior, y V es el volumen de dilución de muestra de virus con que se infectó cada cultivo (0,05 ml en este ejemplo).
	Luego, el título de la muestra será:
 1 / 1,44 x 10-2 x 0,05 ml = 1,4 x 103 DICC50/ml 
 
Métodos de detección, caracterización y cuantificación de antigenos virales y anticuerpos específicos
Métodos
	Fijación de complemento
	ELISA
	Western-blot
	Inmunofluorescencia
	Inhibición de la hemoaglutinación
	Neutralización
Enzimoinmunoensayos (EIE)
Se pueden aplicar a la detección y cuantificación de antígenos virales o anticuerpos antivirales. 
Metodologías
	Competitivo
	Directo
	Indirecto
Sandwich
+
+
Señal (-)
Antígeno (+)
Muestra con
antígeno
Antígeno
marcado
Anticuerpos
inmovilizados
Muestra sin
antígeno
+
+
Señal (+)
Antígeno (-)
EIE competitivo para detección de antígeno
(esquema simplificado)
+
Muestra con
antígeno
Anticuerpos
inmovilizados
Muestra sin
antígeno
+
Señal (-)
Antígeno (-)
EIE “sandwich” directo para detección de antígeno
(esquema simplificado)
+
+
Señal (+)
Antígeno (+)
Western Blot
Western blot permite determinar la presencia de anticuerpos reactivos contra proteínas virales antigénicas, previamente fraccionadas por SDS-PAGE y transferidas a un soporte de membrana (nylon o nitrocelulosa). Los anticuerpos que detectan bandas antigénicas quedan ligados a la fase sólida y son puestos en evidencia mediante el agregado de anticuerpos anti-especie marcados radiactiva- o enzimáticamente. 
SDS-PAGE
transferencia
Muestra
con Ac
revelado
+
IF Directa
+
+
IF Indirecta
Detección de antígenos de VRS en células de aspirado
nasofaríngeo por inmunofluorescencia indirecta.
Antígenos del virus de la hepatitis C en células CE
revelados por inmunofluorescencia indirecta
Células RD infectadas con coronavirus. Revelado
de antígenos por inmunoperoxidasa indirecta
Inmunoperoxidasa
Neutralización: principios
Las reacciones de neutralización pueden ser utilizadas con cualquier virus, siempre que se disponga de un sistema de detección de su actividad infecciosa. El virus y un antisuero son mezclados, y se los deja reaccionar durante un tiempo apropiado. La mezcla es luego inoculada sobre un hospedero (p. ej. un animal de laboratorio o un huevo embrionado) o sistema de detección (un cultivo celular), el cual es observado para detectar signos de infección. Si el antisuero neutraliza al virus, no se observarán efectos de infección, y la neutralización será positiva. Si el antisuero no neutraliza al virus, se observarán signos de infección y la neutralización será negativa.
Neutralización: aplicaciones
	Identificación serológica de virus desconocidos.
	Detección de anticuerpos virales específicos en suero utilizando un virus conocido.
	Comparación antigénica entre dos o más virus y sus respectivos antisueros utilizando ensayos de neutralización cruzada.
Neutralización: tipos
	“Virus constante – suero variable”: una dosis constante predeterminada de virus se hace reaccionar con diluciones seriadas de suero. Permite determinar el nivel de anticuerpos específicos en un suero, expresándolo como un título.
	“Suero constante – virus variable”: diluciones seriadas de virus se mezclan y se dejan reaccionar con una dilución constante de suero. El virus es titulado, por un lado, en presencia de un suero control no inmune, y, por otro, de un suero específico para el virus. La diferencia entre estos títulos es el índice de neutralización, usualmente expresado como el log10 del índice de neutralización (IN). 
Suero sin
Ac
+
+
células
ECP (+)
Suero con
Ac
+
+
células
ECP (-)
Neutralización (-)
Neutralización (+)
virus
virus
neutralizado
Neutralización para detección de anticuerpos
antivirales (esquema simplificado)
Métodos de detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos virales
Hibridación de ácidos nucleicos: parámetros que afectan la velocidad y fidelidad de la reacción.
	Concentración de sales 
	Solvente
	Temperatura
	Complejidad del ácido nucleico
	Concentración de la sonda
	Condiciones de exigencia de lavado
Técnicas de detección e identificación de ácidos nucleicos por hibridación
	Hibridación en fase líquida
	Hibridación en fase sólida
	Hibridación “in situ”
SOUTHERN-BLOTTING (fase sólida)
1- Electroforesis en gel de agarosa del DNA
 restringido.
2- Transferencia de los fragmentos de DNA a 
soporte papel por arrastre con buffer alcalino.
3- Separación del soporte con los fragmentos
De DNA transferido.
4- Hibridación del soporte con sondas de DNA
Marcadas.
5- Revelado.
12
3
4
5
Amplificación de ácidos nucleicos
	Amplificación de señal
		b-DNA
		Captura de híbrido
	Amplificación de blanco
		PCR
		NASBA
		SDA
3. Amplificación de sonda
		LCR
b-DNA (DNA ramificado)
+
DNA blanco desnaturalizado
Sondas de captura
ligadas a superficie
+
Sondas de
preamplificación
+
Sondas de 
amplificación
+
sonda
marcada
Señal cuantificable
Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)
Desnaturalización
+
3´
5´
5´
3´
primers
Annealing 
5´
5´
+
DNA
polimerasa
Extensión
dNTPs
desnaturalización
Variantes de PCR
	RT- PCR: permite amplificar RNA, a través de la inclusión previa de una reacción de retrotranscripción.
	“Nested” PCR: utiliza dos series de PCR, utilizando dos pares de “primers” diferentes para un mismo blanco, siendo los segundos internos respecto a los primeros. Permite aumentar la especificidad de la amplificación.
	Multiplex PCR: incluye dos o más pares de “primers” para blancos diferentes en la misma reacción, permitiendo coamplificar más de una secuencia en una misma muestra.
	Real Time PCR: permite hacer cuantitativa la reacción de PCR a través de la incorporación de colorantes fluorescentes que se unen preferentemente a DNA de doble cadena.
Secuenciamiento de ácidos nucleicos
- Método químico de Maxam y Gilbert
- Método del dideoxinucleótido de Sanger
- Técnicas de alto rendimiento: NGS (“Next Generation Sequencing”).