Técnicas de PCR para Virologia

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2/11/2020
TP n2 
VIROLOGIA
los primers son generico, lo que hacen es amplificar flavivirus, no es especifico para un virus en especial!. Lo que sucede es que al ser generico, vamos a encontrar que no todos los nucleotidos del primers van a hibridar. 
Trabajar con RNA es mas dificil porque hay muchas RNAsas dando vueltas, por ejemplo en las manos, y estas pueden degradar el RNA y ademas son muy dificil de inhibir. 
En total se colocan 6 tubos. Ver que son !!.
el buffer es para daarle el medio adecuado a la enzima. Y el clMg es el coofactor de la enzima. Los dNTPs son los sustratos de la enzima, es lo que la enzima va a ir incorporando para elongar la cadena de ADN.
El fordwar se une a la hebra 3→ 5 y el revers a la 5→ 3 
como cualquier medio agarisado, hay que fundir la agarosa. Esto se hace en el mcroondas, luego se deja enfriar, y se le agrega el colorante SYBR.
10 microslitros de cada dNTP y completar con 60 microlitros. 
El poveedor nos da los primers lioofilizados, entoces a partir de estos tengo que preparar una concentración de 100 micromolar (100 micromol por litro de solución). Hay que pasar los nnomol a micromol.
c) det la conc final de cada componente:
en el caso de los primers usas la concentración de 10 micromolars.
Tener en cuenta que para la retrotranscripcion el vol final es 12 mirolitros
la preparacion de la mastermix y sus cantidades son por PCR, nosotros realizamos 6 pero preparamos para 7; multiplicamos todo por 7 !!!, y el ADN lo dejamos tal cual, no lo ultiplicamos por 7.
Si existieran fragmentos especificos, lo solucionamos trabajando con otros primers. Si me lebanta mas de un fragmento es porque el primers se unio a otras partes del genoma.
Las bandas qque se ven al final son los dNTPs y los primers que no se unieron, o que etan en exeso sin utilizarse, ademas los primers pueden hibridar con los nucleotidos.
5)
- un paso en la retrotranscripcion , la enzima estaba desnaturalizada.
- que los primers no se hayan hibridado o no sean los adecuados.
- no se uso una temperatura adecuada.
- si hay algún problema en el termociclador , no va a haber nada, lo unico que vamos a ver es el marcador de peso molecular.
- puede haber fallado también la extraccion del ARN.
- que la tac polimerasa no haya funciionado