D Teoría inmunidad humoral

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BIOQUÍMICA CLÍNICA Y CUANTITATIVA I
	2018
INMUNIDAD HUMORAL
Las proteínas son macromoléculas presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales, como suero o plasma (66-83 g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL).
Algunas de sus funciones son:
· Formación y conservación estructural: Colágeno, histonas.
· Transporte: Hemoglobina, prealbúmina, canales iónicos.
· Control y regulación: Hormonas (insulina), factores de transcripción.
· Catálisis: Enzimas (actúan degradando otras proteínas).
· Movimiento: Proteínas de la contracción muscular (actina, miosina).
· Almacenamiento: Ferritina.
· Protección y defensa: Inmunoglobulinas, complemento, sistema HLA.
En caso de enfermedad, tanto la concentración total de proteínas como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas.
	Síntesis disminuida
	Síntesis aumentada
	Baja disponibilidad de aminoácidos (por malnutrición, caquexia, síndromes de malabsorción, ayuno, etc.).
Disminución de células sintetizadoras de proteínas (por defectos congénitos, tóxicos como fármacos o radiaciones, por inflamación y/o necrosis como en hepatitis, cirrosis, metástasis hepáticas o medulares, inmunodeficiencias, etc.).
	Causas fisiológicas (embarazo).
Neoplasias (mieloma).
Causas reactivas (inflamación, cirrosis, enfermedades del colágeno).
Causa reactiva con fin compensador (déficits de Fe con aumento de transferrina).
	Catabolismo aumentado
	Aumento de pérdidas externas (hemorragia, proteinuria, gastroenteropatías, quemaduras).
Aumento de consumo de proteínas con función biológica concreta (fibrinógeno, haptoglobina, complemento, etc.).
Aumento del catabolismo celular en los tejidos como en casos de inflamación, neoplasias, etc.
	
	
Métodos para el análisis de proteínas
· Cuantificación de proteínas totales y albúmina.
· Técnicas de separación de proteínas y análisis de proteínas específicas.
Tras separar los componentes por electroforesis, se puede hacer determinación cualitativa (fijando proteínas con determinadas sustancias y luego identificando con colorantes o métodos inmunológicos) o determinación cuantitativa (inmunodifusión, espectrofotometría de absorción molecular). La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades, lo que conlleva a que la cuantificación de las mismas sea de considerable valor en el diagnóstico clínico.
Procedimientos más utilizados en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas:
	Separación
	Identificación
	Cuantificación
	Electroforesis.
	Inmunoelectroforesis.
Inmunofijación.
	Inmunodifusión.
Turbidimetría y nefelometría.
Inmunoelectroforesis en cohete.
Cromatografía.
	
	
	
Técnicas electroforéticas
La electroforesis es una técnica de separación que se basa en el transporte de iones a través de una disolución por la acción de un campo eléctrico. 
Las proteínas son sustancias anfóteras o anfolitos, es decir, que su carga eléctrica puede ser positiva, negativa o cero, dependiendo del pH del medio en el que estén. Hay un valor de pH en el cual la carga eléctrica neta es cero, y ese valor de pH se denomina punto isoeléctrico (pI). La resolución de un sistema electroforético va a depender de diferentes factores como el gradiente de potencial, la temperatura, el pH, etc.
Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE)
Es una de las técnicas más usadas para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.
La matriz de poliacrilamida es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas (electroforesis nativa). Una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato (SDS).
Electroforesis capilar
La separación se lleva a cabo en un tubo hueco de diámetro muy pequeño, de ahí que reciba el nombre de capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolución que contiene los analitos o las moléculas a separar y el tampón o medio electrolítico que es el encargado de conducir la corriente. La separación se lleva a cabo según la relación masa/carga de las distintas moléculas.
Inmunodifusión
Se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente agarosa). La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como pH, temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac como afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac.
La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (por ejemplo negro amido o azul brillante de Coomassie).
Clasificación de las técnicas de inmunodifusión:
· Inmunodifusión radial: En este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas (Ag). El Ag difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación.
· Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: Se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el Ac y el Ag alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda se determinan según la concentración del Ag y del Ac, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al Ac es directamente proporcional a la cantidad de Ag presente.
Métodos de transferencia a filtros
La transferencia de proteínas o “blotting” supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas especialmente diseñados para la tinción de “blots”. El método más potente es el denominado “western blot” en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel a una membrana.
Ventajas de trabajar con proteínas sobre membranas y no en el gel:
· Son más rápidas de teñir y desteñir.
· Se detectan cantidades menores de proteínas pues se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel.
· El blot es un registro conveniente y las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel.
TÉCNICAS TURBIDIMÉTRICAS Y NEFELOMÉTRICAS
La turbidimetría mide la radiación transmitida. Se puede llevar a cabo en un espectrofotómetro convencional, aunque requiere ser aplicada a soluciones suficientemente concentradas que originen disminuciones importantes en la potencia de la radiación transmitida. 
La nefelometría consiste en evaluar la dispersión de la radiación por las partículas de una disolución o suspensión, midiéndose la potencia de la radiación dispersada en un ángulo diferente al de la radiación incidente, por lo general, en un ángulo igual o menor a 90° respecto al eje horizontal. 
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de la longitud de onda de la luz, del tamaño de la partícula y del índice derefracción de la partícula en relación con el medio que la rodea. La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.
Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se utilizan Ac que reaccionan con dichas proteínas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetría e inmunonefelometría.
Proteinograma
Es una representación gráfica de la distribución de las distintas fracciones de las proteínas plasmáticas o séricas. Se basa en la separación de las proteínas en función de su masa y su carga, tras someterlas a un campo eléctrico. Es una representación densitométrica de las bandas obtenidas tras someter al suero a electroforesis y es complementario a la determinación de proteínas totales en suero.
 
Fracciones del proteinograma
Fracción albumina: 
· Albúmina sérica: Es la banda mayoritaria del proteinograma (53-66%). Sus valores normales oscilan desde 2,7 g/100 mL en mujeres o 2,9 g/100 mL en neonatos, hasta 6,1 g/100 mL en varones adultos. Su función es de transporte y de mantenimiento de la presión oncótica del plasma, siendo también marcador del estado nutricional.
· Prealbúmina: Compuesta a su vez por prealbúmina, llamada también transtiretina, que transporta tiroxina y triyodotironina, y por la proteína ligada al retinol (RBP), que transporta vitamina A mediante la formación de complejos con la prealbúmina. Ambas son indicadoras de malnutrición y patología hepática.
Fracción α-1:
· α-1-antitripsina: Es reactante de fase aguda. Tiene función antiproteasa. Es el 90% del total de la región α-1.
· α-1-glicoproteína ácida: Llamada también factor orosomucoide. Tiene papel en el proceso inflamatorio.
· α-1-fetoproteína: Presente mayoritariamente en la circulación fetal. Es útil en adultos como marcador de cáncer hepato-celular y tumores testiculares de células germinales.
· α-1-lipoproteína: Corresponde a la fracción HDL colesterol. Es transportadora de lípidos.
· Transcortina.
· Globulina fijadora de tiroxina (TBG).
En general, la fracción α-1, aumenta en procesos inflamatorios agudos, neoplasias, y cuadros de infarto y de necrosis.
Fracción α-2:
· Haptoglobina: Transporta oxihemoglobina en el plasma. Es reactante de fase aguda.
· α-2-macroglobulina: Forma complejos con proteasas e inhibe la lisis de compuestos proteicos de gran tamaño. Tiene relación con el síndrome nefrótico.
· Ceruloplasmina: Transportadora de cobre. Es una catalizadora de procesos oxidativos y reactante de fase aguda.
· α-2-lipoproteína: Corresponde a la fracción VLDL colesterol. Tiene relación con el metabolismo de triglicéridos, sobre todo los de síntesis endógena.
En ocasiones, la PCR migra a esta fracción aunque otras veces migra a la fracción β. La fracción α-2 aumenta en el síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, inflamación crónica, tuberculosis (TBC), etc.
Fracción β-1:
· Transferrina o siderofilina: Transporta hierro y es capaz de unir otros iones metálicos. Aumenta en anemias. Se relaciona con el síndrome nefrótico y hepatitis agudas.
· Hemopexina: Actúa ligando grupos hemo.
· β-lipoproteína: Corresponde con la fracción LDL colesterol. Transporta lípidos y se relaciona con el síndrome nefrótico y el hipotiroidismo.
· C4: Factor del complemento. Reactante de fase aguda. Relacionado con dermatopatías y disminuido en procesos autoinmunes.
A veces aparece migrando a esta fracción la PCR y también, en ocasiones, la ceruloplasmina. La fracción β, en general, está aumentada en el síndrome nefrótico, ictericias obstructivas, cirrosis, TBC, procesos inflamatorios crónicos y agudos, dermatopatías, hipotiroidismo, etc.
Fracción β-2:
· Fibrinógeno: Reactante de fase aguda que es un precursor de la formación del coágulo de fibrina. Su aparición en el proteinograma se evita, en gran medida, con el uso de suero en lugar de plasma, como muestra.
· β-2-microglobulina: Constituyente de cadena ligera de los Ag HLA. Es un marcador de insuficiencia renal y se relaciona con cuadros de amiloidosis.
· C3: Factor del complemento y reactante de fase aguda.
· Fibronectina: Aumentada en síndrome nefrótico, colestasis, neoplasias y disminuida en politraumatismos, quemaduras, sepsis, etc.
· β-2-glicoproteína: Cofactor con papel desencadenante en el síndrome antifosfolípido.
· Lactógeno placentario: Hormona placentaria con papel estimulador en la resistencia insulínica y la intolerancia a hidratos de carbono.
· SP-1-glicoproteína: Glicoproteína específica del embarazo. Utilidad como marcador de tumores testiculares de células germinales.
Fracción -1 (gamma rápida):
· IgA: Predomina en las secreciones mucosas. A veces migra a la fracción β, cerca del fibrinógeno, al igual que éste puede migrar a la fracción -1. La IgA aumenta en procesos inflamatorios, cirrosis alcohólica, hepatitis, artritis, lupus, TBC y otras infecciones crónicas, fibrosis quística (FQ), celiaquía, cáncer gastrointestinal, gammapatía monoclonal IgA, etc. Disminuye en el déficit de IgA, en SCID ataxia telangiectasia, en inmunodeficiencias adquiridas, neoplasias malignas, fármacos como quimioterapia o corticoides, gastroenteropatía pierde-proteínas, etc.
· IgA secretora: Tipo especial de IgA que aumenta en fumadores, alcoholismo, cánceres orofaríngeos y de pulmón, procesos inflamatorios orales, infecciones bacterianas, etc. Disminuye en enfermedades sinopulmonares, procesos gastrointestinales, enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide o lupus, fármacos, síndromes malabsortivos, ataxiatelangiectasia, etc.
· IgD: Aumenta en el mieloma múltiple.
Fracción -2 (gamma lenta):
· IgM: Se ve aumentada en la macroglobulinemia de Waldestrom, artritis reumatoide y lupus, en la brucelosis, en el linfosarcoma, en CBP, enfermedades autoinmunes, mononucleosis y otras enfermedades virales, paludismo, infecciones micóticas, etc. Está disminuida en el déficit IgM, hipergammaglobulinemia ligada al sexo, SCID, leucemias, amiloidosis,etc.
· IgG: Aumenta en infecciones crónicas, hiperinmunización, sarcoidosis, fiebre reumática, artritis reumatoide, hepatitis crónica activa, cirrosis, mieloma múltiple IgG, SIDA, etc. Disminuye en hipogammaglobulinemia ligada al sexo, en SCID, en síndrome nefrótico, en gastroenteropatía perdedora de proteínas, en pérdidas cutáneas, amiloidosis, preeclampsia, leucemias, etc. En múltiples ocasiones, es útil la determinación de subclases de IgG (IgG1, 2, 3, 4).
· IgE: Glicoproteína sintetizada en amígdalas, adenoides, ganglios linfáticos bronquiales y peritoneales, mucosa nasal, respiratoria y gastrointestinal. Se eleva en el síndrome hiper-IgE, parasitosis, lepra, aspergilosis broncopulmonar alérgica, SIDA, etc. Disminuye en ataxia telangiectasia, déficit de IgE, hipogammaglobulinemia, etc.
proteinogramas alterados en inmunopatologías
Inflamación cónica
Caracterizada por aumentos a nivel de α-1 y α -2 y de .
Reacción de fase aguda
Caracterizada por aumento extremo de PCR y proteína S amiloide del suero (SAA) con aumento moderado de α-1-antitripsina, α-1-glicoproteína ácida, ferritina, IgG, C3 y C4 y ceruloplasmina y disminución de albúmina y transferrina, lo que se traduce en aumento a nivel de α-1 y α-2, diferenciándose de la inflamación crónica en que en la fase aguda no hay aumento de la fracción .
Gammapatía monoclonal (GM)
Los desórdenes proliferativos de células plasmáticas productoras de una Ig monoclonal (proteína M) se clasifican, por tal razón, como GM. Éstas se reflejan como bandas estrechas o densas en la zona , β o α, ya que la proteína anormal es una Ig homogénea, formada por dos cadenas pesadas de una misma clase (G, A, M, D o E) y dos cadenas ligeras de una única clase (κ o λ). Incluyen neoplasias malignas (mieloma múltiple, plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom), enfermedades premalignas (gammapatía de significado desconocido) y enfermedadesde baja carga proteica o tumoral (amiloidosis primaria, enfermedad de depósito de cadenas livianas y síndrome POEMS caracterizado por polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, proteína M y alteración cutánea).
Debido a las grandes variaciones biológicas y de presentación de cada enfermedad, la identificación de la Ig monoclonal generalmente es clave para la orientación al diagnóstico y requiere un preciso estudio de laboratorio. La enfermedad maligna, mieloma múltiple por ejemplo, frecuentemente se presenta con importante concentración de proteína M. Sin embargo, aún con diagnóstico de malignidad, hay una subclasificación de mieloma múltiple no secretorio caracterizado por no secretar proteína M o secretarla en muy baja cantidad. Los paneles para el screening diagnóstico de estas patologías tradicionalmente incluyeron la realización de proteinograma electroforético sérico y urinario y la inmunoelectroforesis/inmunofijación. Recientemente se introdujo el ensayo de cuantificación de cadena liviana libre en suero (método nefelométrico), que incrementó la sensibilidad de test de laboratorio para la identificación de proteínas M.
Características de algunos de estos desórdenes:
· Gammapatía de significado desconocido: Es la más frecuente de las GM que se detectan en el laboratorio. Tiene origen desconocido y su prevalencia aumenta con la edad. Suele ser secundaria a hepatopatías víricas, enfermedades autoinmunes, etc. Tiene un pronóstico y evolución inciertos. 
Si se produce la muerte, suele deberse a otras causas ajenas a la GM. En algunas ocasiones, aunque limitadas, evolucionan a enfermedades malignas como mieloma múltiple, Waldestrom o amiloidosis. En otra serie de casos, desaparece espontáneamente. No presenta células plasmáticas en MO, ni anemia, hipercalcemia, ni lesiones óseas, a diferencia del mieloma múltiple.
· Mieloma múltiple: Se caracteriza porque en MO proliferan células plasmáticas y hay sobreproducción de Ig monoclonal completa, que puede ser de tipo IgG, IgA, IgD o IgE o de cadenas ligeras. Su edad media de aparición es a partir de 69 años más o menos. En el proteinograma se presenta como una banda compacta, estrecha, de migración , β, o, menos frecuentemente, α-2. Clínicamente hay dolor óseo y fracturas patológicas, en sangre hay anemia, hipercalcemia e hiperproteinemia, en orina se da proteinuria de Bence-Jones y en MO se encuentra más de un 10% de células plasmáticas.
· Macroglobulinemia (Waldestrom): Se caracteriza por proliferación de células linfoides anormales que invaden médula ósea, ganglios linfáticos y bazo. Hay sobreproducción de Ig monoclonal completa tipo IgM, kappa o lambda. Cursa con hiperviscosidad sanguínea y puede afectar a jóvenes, aunque suele darse más en varones de más de 65 años. No presenta lesiones óseas y cursa con hepatomegalia, adenopatías, fenómenos hemorrágicos, neuropatías y trastornos visuales. En el laboratorio, da anemia normocítica y normocrómica con hiperviscosidad sanguínea.
Gammapatía policlonal
Las gammapatías policlonales aparecen como bandas anchas y difusas que se localizan en la región del proteinograma y se originan en enfermedades inflamatorias, infecciosas o reactivas, procesos inflamatorios crónicos, cirrosis, infecciones, enfermedades autoinmunes, etc.
Inmunodeficiencias combinadas
Son las alteraciones hereditarias de células T y B. Con la terapia correctora adecuada, es posible la supervivencia. 
Entre ellas:
· Inmunodeficiencia combinada grave: Hay ausencia total de Igs séricas con linfopenia T y B y grave alteración de la inmunidad celular. Requiere un diagnóstico precoz y trasplante de MO o bien Igs y antibióticos o terapia génica.
· Déficit de adenosina desaminasa (ADA): Es otro trastorno clínicamente similar al anterior que en ausencia de tratamiento produce la muerte en edad inferior a los 2 años.
· Inmunodeficiencias por defecto de Ac: Son las más numerosas. Producen alteraciones de las células B con no producción de Ac. Cursan con infecciones bacterianas de repetición, sobre todo pulmonares, óticas y sinusales, gastrointestinales, etc.
· Agammaglobulinemia ligada al sexo (Síndrome de Bruton): La herencia es recesiva ligada al X y hay pérdida de órganos linfoides secundarios (ganglios, amigdalas) con respuesta normal a bacterias intracelulares y a virus.
· Déficit de IgA: Es la más frecuente de las inmunodeficiencias primarias. Puede asociarse a déficit de subclases de IgG. Suelen ser sanos o presentar infecciones respiratorias, asma, infecciones gastrointestinales, alergias alimentarias, atopia cutánea o enfermedades autoinmunes.
INMUNOGLOBULINAS
Las Igs son proteínas únicas en su heterogeneidad, sitios de síntesis y en el hecho de que su síntesis es una respuesta adaptativa al estímulo antigénico. Tienen dos funciones, reconocimiento de Ag e iniciación de mecanismos efectores para destruir Ag.
Están presentes en suero y fluidos tisulares, y pueden encontrarse en forma soluble (Ac) o ancladas a membrana del LB (BCR). Mientras que la mayoría de las proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado, las Igs se sintetizan y secretan por células plasmáticas. Así, las Igs son moléculas de la inmunidad humoral específica y una de sus principales funciones fisiológicas es la defensa contra los microorganismos extracelulares y las toxinas producidas por los distintos agentes microbianos. La unidad estructural básica de estas Igs es una glicoproteína de PM 150000 Da, compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, las cuales están asociadas por cuatro puentes disulfuro.
	IgM
	IgG
	IgA
	Comprende 5-10% de las Igs séricas (1,5 mg/mL aprox.), se secreta como pentámero que contiene la cadena J. Las IgM predominan en la respuesta inmunitaria temprana y responden a la mayor parte de los Ag.
La IgM se expresa también en la superficie de LB y es la Ig más eficiente para activar el complemento.
	Es la clase más abundante en suero (8-16 mg/mL), constituyendo el 80% de las Igs totales. Existen cuatro subclases en humanos (IgG1, 2, 3 y 4), que se diferencian estructuralmente entre sí por el tamaño de la región bisagra y el número de puentes disulfuro entre las cadenas pesadas.
Es el Ac más abundante durante la respuesta inmunitaria secundaria de tipo humoral. Es la única clase de Ig que puede atravesar la barrera placentaria y es la responsable, mediante esta inmunidad pasiva natural, de proteger a los recién nacidos durante los primeros meses de vida. La IgG enlazada al Ag también puede fijar complemento.
	Producida principalmente por las LB en placas de Peyer, amígdalas y otros tejidos linfoides asociados a mucosas. En humanos existen dos subclases, IgA1 e IgA2, en suero predomina IgA1, constituyendo del 10 al 15% de las Igs totales (1,4-4 mg/mL), y allí aparecen como monómeros, pero en las secreciones seromucosas es muy abundante la IgA2, que es dimérica.
Ésta es la responsable de la respuesta inmunitaria humoral de las mucosas, por tanto constituye la primera línea de defensa específica para la mayoría de las infecciones. La deficiencia de IgA tiene lugar en aproximadamente 1:1000 de la población y está frecuentemente asociada con la deficiencia de IgG.
	
	
	
Significado clínico de las Igs
 (
La imagen 
densitométrica
 izquierda
 muestra 
una zona 
 heterog
énea, ancha, producto de varios 
clones de células plasmáticas
.
La imagen 
densitométrica
 
derecha
 muestra 
la 
zona 
 
homogéne
a, angosta, producto de un solo 
clon de células plasmáticas
.
)El estudio de las principales clases de Igs A, G y M, específicas o totales, es de especial interés en el laboratorio inmunoquímico moderno. Sus cifras séricas dependen de diversos factores del desarrollo, genéticos y ambientales. Cuando estimamos la concentración de una sola clase de Ig estamos evaluando una mezcla policlonal de Ac que son idiotipos, o sea, el producto de muchos clones distintos de células plasmáticas, cada clon productor de una molécula de Ig, con distintas regiones variables. Una proliferación benigna o maligna de tal clon produceuna alta concentración de un solo idiotipo (Ac monoclonal), que puede aparecer como una banda homogénea, angosta, compacta, en el proteinograma electroforético. Si pocos clones proliferan hay tantas bandas compactas, homogéneas, como clones proliferantes.
Las disglobulinemias, reducción de algunos tipos, no todos, de -globulinas, pueden ser una disminución o un aumento en la mezcla normal policlonal de Igs séricas, o un aumento de uno o más idiotipos monoclonales (generalmente uno, raramente dos). 
Hipergamma policlonal es la respuesta a infecciones. IgG predomina en procesos autoinmunes, IgA en infecciones de piel, respiratorias y urinarias, IgM en infecciones virales primarias e infecciones del torrente sanguíneo. En infecciones bacterianas crónicas aumentan todas las Igs.
Separación, identificación y cuantificación de Igs
El estudio de las tres principales clases de Igs involucra, al menos, tres técnicas de laboratorio, las mismas son electroforesis sérica (separación), inmunoelectroforesis y variantes (identificación) y cuantificación por inmunodifusión radial o turbidimetría/nefelometría.
Electroforesis
En la electroforesis, las alteraciones a nivel de la fracción se caracterizan por:
a) La aparición de bandas compactas, estrechas (que guardan relación con el componente monoclonal que las origina) en las GM. Aparecen en diferente subzonas o subfracciones de la región según la estirpe a que corresponda la paraproteína que se presente alterada. No obstante, puede existir un componente monoclonal (IgD, IgE) sin que lo refleje el proteinograma electroforético (no logra visualizarse por la sensibilidad del método).
b) La aparición de bandas difusas, anchas y poco definidas, en las gammapatías policlonales, entre las que pueden incluirse procesos inflamatorios crónicos, cirrosis, infecciones, enfermedades autoinmunes, etc. 
c) La desaparición o disminución de la zona , lo cual ocurre en la agammaglobulinemia o hipogammaglobulinemia, respectivamente. Puede existir hipogammaglobulinemia sin que lo refleje la imagen electroforética.
Inmunoelectroforesis de Igs en fluidos biológicos
La inmunoelectroforesis (IEF) permite la identificación de las principales clases de Igs. Es el método de elección para la identificación de las Igs monoclonales ya que detecta simultáneamente su homogeneidad electroforética y antigénica. No es una técnica cuantitativa, sólo semicuantitativa. No debe ser usada para el screening sistemático de proteínas séricas. 
Consideraciones metodológicas: La IEF es un método útil para el estudio de Igs en otros fluídos biológicos además del suero, tales como orina, LCR, saliva, jugo intestinal. En estas últimas muestras generalmente es necesario concentrar las proteínas antes de hacer la IEF y correr una muestra sérica del paciente simultáneamente. El medio de elección para la IEF es agarosa, usando en lo posible el mismo tipo de gel que para el proteinograma. 
La inmunofijación se prefiere actualmente para la identificación de las Igs, particularmente en el caso de monoclonalidad.
Desventajas:
· En cualquier procedimiento IEF el exceso de Ag puede impedir la visualización del arco de precipitado.
· Cuando hay presencia de crioglobulinas, la IEF sérica debe realizarse luego de calentar el suero a 37°C.
· Para identificar algunas IgM y poder definir la naturaleza monoclonal de las mismas, en base al tipo de cadena liviana, muchas veces se requiere agregar a la muestra un agente reductor que convierta IgM pentamérica en IgM monomérica. Otras veces se requiere separación previa de IgM/IgG por técnicas fisicoquímicas. 
Para estas instancias, la inmunofijación es más fiable. En la interpretación de los arcos IEF debe tenerse en cuenta una posible asociación de las Igs monoclonales con otras proteínas, como albúmina y lipoproteínas.
Cuándo usar IEF:
· Cuando los hallazgos clínicos y/o hematológicos sugieren diagnóstico o sospecha de mieloma, macroglobulinemia, enfermedad de cadenas pesadas, amiloidosis, enfermedad de cadenas livianas.
· En presencia de ciertas anomalías biológicas: 
1) Una banda angosta anómala en el proteinograma (aunque la IEF permite la detección de componentes monoclonales en situaciones no advertidas electroforéticamente).
2) Presencia de crioglobulinas: La IEF identifica las proteínas del crioprecipitado y distingue crioprecipitados homogéneos, de una sola clase de Igs, de crioglobulinas mixtas, con o sin componente monoclonal.
3) Proteinuria Bence Jones.
· En desórdenes inmunoproliferativos, como LLC (detección de componente monoclonal), enfermedad por aglutininas frías, enfermedades con componente monoclonal (Gaucher, por ejemplo), enfermedades con componente IgM policlonal elevado (tripanosomiasis).
· En inmunodeficiencias primarias, enfermedades autoinmunes, anomalías hematológicas, infecciones y otras.
Para efectuar la valoración semicuantitativa de las fracciones separadas se cuenta con los siguientes parámetros:
· Longitud del arco de inmunoprecipitación.
· Espesor del arco de inmunoprecipitación.
· Posición del arco de inmunoprecipitación con respecto al surco central.
Una determinada fracción estará aumentada, siempre en relación a la correspondiente del suero humano normal, cuando:
a- La longitud del arco es mayor.
b- El espesor del arco es mayor.
c- La posición del arco es más próximo al surco central.
Aplicaciones:
· Esta técnica se utiliza principalmente para evaluar las características electroforéticas e inmunológicas de proteínas y glucoproteínas en suero, orina o LCR con fines cualitativos (identificación específica) y semicuantitativos.
· Es el método más comúnmente utilizado en los laboratorios clínicos para la identificación y caracterización de proteínas monoclonales a través del empleo de antisueros monoespecíficos.
· Ayuda a distinguir aumentos policlonales de los monoclonales en las gammaglobulinas.
· Permite el análisis de Igs disminuidas o ausentes en diversos trastornos por inmunodeficiencia.
· Permite identificar cadenas livianas en la orina de enfermos con discrasias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios. La proteína de Bence-Jones es una cadena liviana libre de Ig monoclonal sintetizada por un clon de células plasmáticas. Por lo tanto, con los antisueros anti-κ y anti-λ específicos, se puede confirmar la naturaleza monoclonal de la proteinuria de B-J en el mieloma.
· En la enfermedad de cadena pesada los fragmentos de la cadena H de las Igs se encuentran en cantidades mayores en el suero registrándose ausencia de precipitación con cadena liviana κ y λ.
Inmunofijación
Técnica muy usada actualmente para la caracterización de Igs, combina las técnicas de electroforesis e inmunoprecipitación. Luego de la separación de las proteínas séricas por electroforesis, se coloca sobre las fracciones separadas en investigación un trozo de papel secante de poro estrecho embebido con antisuero monoespecífico y se espera la formación de un precipitado cuando se formen los complejos Ag-Ac correspondientes. El antisuero debe ser usado en dilución óptima para asegurar que Ag y Ac estén en concentraciones equivalentes. Las proteínas no precipitadas se remueven mediante lavados sucesivos y enérgicos mientras que el precipitado inmune, que permanece, se colorea.
Este método tiene amplias aplicaciones en la identificación de proteínas M presentes en cantidades pequeñas, que son difíciles de identificar por otros métodos, aún la IEF convencional, a la que prácticamente ha sustituido en el laboratorio de inmunología clínica debido a su mayor versatilidad y poder de resolución, sobre todo cuando se aplica a muestras séricas o de otros líquidos biológicos en los que el nivel de la paraproteína está por debajo de 500 mg/dL.
Inmunodifusión radial simple
Es una técnica cuantitativa de inmunoprecipitación en gel en la cual uno de los reactantes (por lo común el Ac) es uniformemente distribuido en una capa de gel de agar o agarosa mientras que el otro de los reactantes (usualmente el Ag) se deposita en orificios practicados en el gel. El Ag difunde radialmentea través de la mezcla gel-Ac, formando un anillo visible de precipitado en un punto que depende de la estequiometría Ag-Ac. 
La reacción de precipitación no es estática sino dinámica. El anillo de precipitación se forma primero cerca de la concavidad en el punto inicial de equivalencia Ag-Ac. A medida que el Ag continúa difundiendo, su exceso produce la conversión del precipitado en complejos solubles, que se resolubilizan y siguen difundiendo hacia afuera. Un nuevo anillo se forma en un nuevo punto de equivalencia Ag-Ac.
Aplicaciones, ventajas y desventajas del método: Innumerables son las proteínas que hoy en día se pueden cuantificar por el método de IDR. Sin embargo, la aplicación clínica más importante consiste en la medición de las concentraciones de Igs séricas. Un antisuero monoespecífico dirigido al determinante Fc o a una determinada cadena H de la molécula de Ig, debe incorporarse en el agar con el fin de determinar las concentraciones de Igs. 
Esta técnica se emplea primordialmente para determinar tres clases de Igs (IgG, IgA e IgM). Debido a las concentraciones relativamente bajas de IgD e IgE en el suero humano éstas son valoradas comúnmente mediante otras técnicas (ELISA, RIA, etc).
La ventaja de la IDR radica en su simplicidad y en que permite cuantificar una proteína determinada en el contexto de una mezcla compleja, tal cual es el suero humano. Sin embargo, este método no siempre es confiable. Debido a que moléculas de alto peso molecular difunden más lentamente, pueden obtenerse valores falsamente bajos en presencia de Igs poliméricas, tales como las encontradas en asociación con ciertas discrasias de células plasmáticas, o en presencia de complejos inmunes de alto peso molecular, situación común de encontrar en pacientes con crioglobulinemia o artritis reumatoide. 
Por el contrario, concentraciones falsamente altas pueden obtenerse en presencia de moléculas IgM monoméricas, las cuales difunden más rápido que sus pentámeros normales, o en presencia de moléculas anti-Ig, como ocurre, por ejemplo, en pacientes que sufren déficit de IgA. Tales Ac causan la formación de complejos inmunes, lo cual implica que no exista relación entre las mediciones de la proteína por IDR y la concentración real de la misma. Tales inconvenientes puede resolverlos el empleo de otros métodos implicados en la cuantificación de Igs, tales como la nefelometría/turbidimetría.
Ejemplos de proteinogramas
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