Oxidaciones Biológicas e Espécies Reativas de Oxigênio

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Química Biológica 
Tec. De Lab. Lic. Bromatología 
 Fac. C.S. UNaF 
 
Trabajo Práctico Nº 6 
OXIDACIONES BIOLOGICAS 
 
 
Introducción 
 
Es todo el oxígeno saludable para los seres vivos? 
José M Matés Sánchez 
Profesor del Departamento de Biología molecular y Bioquímica 
Faculatad de Ciencias, Universidad de Málaga 
 
1. ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y ESTRÉS OXIDATIVO 
Del mismo modo que el oxigeno del aire es esencial para la vida, también puede 
formar parte de una gran variedad de las llamadas especies reactivas de oxígeno (ROS), que 
son, inevitablemente, producto del metabolismo normal aerobio. Está calculado que por cada 
100 toneladas de O2 consumido, 2 toneladas formarán parte de las ROS. Nuestro organismo 
está equipado con una gran cantidad de mecanismos que nos defienden del ataque de esas 
ROS, inactivándolas. Cuando los niveles de ROS son tan altos, por irradiación o factores 
ambientales, que superan la capacidad de los mecanismos protectores de nuestro organismo, 
o bien porque estos mecanismos no están presentes (fallos genéticos), las ROS pueden causar 
una gran cantidad de daños al organismo como cáncer, enfermedades neurodegenerativas, e 
incluso la muerte. 
 
Entre las ROS están los radicales hidroxilo ( OH), que es la especie más reactiva, aniones 
superóxido (O2 ) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Estas mínimas concentraciones de ROS 
pueden ser indispensables en muchos procesos, como el sistema de señales intracelulares -
que está relacionado con otros procesos como la proliferación celular y el suicidio celular o 
apoptosis-, la inmunidad, y la defensa contra microorganismos. Sin embargo, altas dosis o 
una eliminación inadecuada de ROS dan lugar a estrés oxidativo, que puede causar graves 
disfunciones metabólicas y daño a macromoléculas biológicas, provocando procesos 
inflamatorios y daños en los tejidos circundantes. 
 
2. MECANISMOS DEL DAÑO CELULAR CAUSADO POR LAS ROS 
 
En los últimos años han sido numerosos los estudios dedicados a las especies 
reactivas de oxígeno y a tratar de averiguar cual es su relación con un gran número de 
enfermedades. Todo parece indicar que son tres componentes celulares, los que en mayor 
medida se ven afectados por este tipo de radicales libres. Se trata de lípidos insaturados, 
proteínas y ácido desoxirribonucíeico (DNA). 
 
Los lípidos están constituidos por una gran cantidad de componentes hidrofóbicos que 
incluyen fosfolípidos, esteroides, ácidos grasos, ceras y derivados terpénicos. Los ácidos 
grasos no actúan sólo como uno de los mayores metabolitos energéticos del organismo, sino 
que también están integrados en las membranas, donde formando parte de los fosfolípidos, 
regulan la fluidez de la misma. Los ácidos grasos insaturados son particularmente 
susceptibles al ataque de los radicales libres hidroxilos generando lípidos peroxidados. La 
peroxidación de los ácidos insaturados los hace más hidrofílicos y, como resultado, se 
produce una clara alteración de la estructura de la membrana, afectando a muchas de sus 
funciones y a proteínas ancladas a ella, como es el caso de transportadores y receptores. Un 
ácido graso altamente insaturado como el ácido araquidónico es el precursor de las 
prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, que actúan como hormonas locales que afectan 
al flujo sanguíneo, el transporte de iones y la transmisión sináptica. Una peroxidación 
incontrolada del ácido araquidónico puede repercutir en la producción excesiva de estas 
hormonas y del mismo modo llegar a inhibir algunas enzimas afectando a procesos que 
tienen lugar en las propias membranas y en el interior celular. Por ejemplo, los eritrocitos 
pueden ser dañados por la peroxidación y ser de ese modo degradados más rápidamente de lo 
habitual, causando anemia. Este efecto se hace más patente y peligroso aún en el caso de la 
oxidación del hierro de la hemoglobina, produciendo metahemoglobina, una molécula 
incapaz de transportar oxígeno. 
 
lnteresantemente, el cerebro, uno de los órganos más activos y que consume más de un 20% 
del oxigeno ingerido por el organismo, es uno de los menos protegidos de las ROS, siendo 
extremadamente susceptible al daño oxidativo. El cerebro tiene una alta concentración de 
ácidos grasos insaturados, un gran almacén de hierro, baja capacidad de unión o captación de 
metales, baja capacidad antioxidante y sus células (neuronas) son incapaces de regenerarse. 
La oxidación de proteínas puede producir ataques a residuos de ciertos aminoácidos, como la 
formación de 2 oxohistidina a partir de la histidina o de sulfóxido de metionina a partir de la 
metionina, y ataque a otros aminoácidos como el triptófano, cisteína, prolina, arginina, 
lisina, etc. El daño oxidativo de muchos de esos residuos aminoacídicos y de algunos enlaces 
peptídicos, pueden provocar la aparición de grupos carbonilos. Por último, cabe señalar otro 
efecto importante en la oxidación de las proteínas como es la oxidación de grupos 
sulfhidrílicos dando lugar a puentes disulfuro, que cambian la conformación y por tanto la 
función de las proteínas. 
 
Los radicales de oxígeno pueden afectar a ácidos nucleicos como el DNA, oxidando y 
modificando químicamente las bases que componen el mismo. Así pueden llegar a producirse 
mutaciones puntuales que, si son transcritas a ácido ribonucleico (RNA) y posteriormente 
traducidas a proteína, da lugar a modificaciones en la estructura de las mismas, produciendo 
su alteración funcional y, como consecuencia, provocando diferentes patologías. 
 
3. EFECTOS DE ROS EN LA GÉNESIS BEL CÁNCER 
Los radicales libres inducen cambios en la secuencia del DNA en forma de 
mutaciones puntuales dentro del genoma, que pueden ocasionar cambios muy importantes en 
algunos genes. Estos cambios pueden dar lugar a la activación de algunos protooncogenes y/o 
la inactivación de genes supresores de tumores. 
Por una parte, se ha relacionado el daño oxidativo del DNA, causado por las ROS, con la 
inducción de la carcinogénesis, demostrándose que la cantidad del producto de oxidación del 
DNA (8-oxo-2’-desoxiguanosina) es altamente mutagénico. Incluso, la generación de estas 
especies in vivo puede contribuir a la capacidad de algunos tumores para mutar y dañar 
tejidos locales, promoviendo así la heterogeneidad, invasión y metástasis del tumor. También 
se ha observado una relación entre el descenso de las actividades enzimáticas antioxidantes y 
el incremento de los niveles de lesión del DNA debido al daño oxidativo en varios tipos de 
cánceres. Como ejemplo se ha observado que los niveles de las enzimas antioxidantes en 
linfocitos de pacientes con leucemias linfoblásticas agudas son menores que en los sujetos 
sanos. Esta observación implica que las reacciones en que se involucran radicales libres 
podrían darse en mayor proporción en las células malignas. Otros hechos sugieren que existe 
una disminución del control de la reparación del DNA en células tumorales. Así, se han 
encontrado diferencias significativas en la cinética de reparación del DNA entre pacientes 
con leucemia linfática crónica y los controles. 
Entre los otros muchos tipos de cáncer que han sido relacionados con las ROS citaremos los 
tumores de vejiga, intestino, mama, colon, esófago, riñón, hígado, pulmón, próstata y piel. 
 
 
4. MAS ENFERMEDADES RELACIONADAS CON ROS 
 Hay otras muchas enfermedades asociadas con la producción de radicales libres, que 
incluyen infecciones (helicobacter pylori, hepatitis, HIV, pneumonia, artritis reumática,...), 
alcoholismo, enfermedades cardiovasculares (isquemia, arteriosclerosis), síndrome de shock 
séptico, diabetes, síndrome de Down, desarreglos en hemoglobina, daños en el riñón, fibrosís 
cistica, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Crohn, enfermedad granulomatosa 
crónica, enfermedades neurodegenerativas (encefalomielitis alérgica, Alzheimer, Parkinson, 
enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica), alergia (intolerancia a fármacos y 
a alimentos, asma bronquial), problemasópticos (cataratas, glaucoma)... Muchas de ellas 
provocan una clara respuesta de las llamadas enzimas antioxidantes, con el fin de disminuir 
la cantidad de ROS en el organismo y atenuar el daño oxidativo. 
 
 
5.DEFENSA CONTRA EL ESTRÉS OXIDATIVO: ANTIOXIDANTES 
Cuando se produce un aumento del nivel de ROS, las células ponen en marcha diferentes 
sistemas de defensa entre los que se encuentran algunas enzimas y ciertos substratos que 
desempeñan el papel de antioxidantes. En los organismos aerobios existe una gran variedad 
de sistemas de defensa antioxidante tanto enzimáticos como no enzimáticos, que se 
coordinan cooperativamente y protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés 
oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas superóxído dismutasa, catalasa y 
glutatión peroxidasa, además de otros antioxidantes naturales y no enzimáticos como el ácido 
ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), tioles como el glutatión reducido (GSH) y 
la homocisteína, β-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos, ácido úrico, 
coenzima Q-10, y otro tipo de compuestos como quelantes (secuestradores de metales). 
Las enzimas antioxidantes atacan a los radicales libres altamente perniciosos, convirtiéndolos 
en otros menos dañinos. Por otra parte, existe un gran número de compuestos antioxidantes 
naturales que tienen la capacidad de reaccionar con los radicales libres sin llegar a generar 
otro tipo de radicales. Entre ellos hay compuestos que reducen directamente las especies de 
oxígeno. En este proceso el antioxidante en cuestión resulta oxidado y debe ser regenerado 
para su posterior uso. 
 
 
Objetivo del Trabajo Práctico 
 
Estudiar la actividad de la catalasa de los glóbulos rojos y el efecto del cianuro sobre la 
misma. 
 
Las catalasas son hemoproteínas que catalizan la descomposición del peróxido de hidrógeno: 
 
 2 H2O2 2 H2O + O2
 
La enzima está ampliamente distribuída en la naturaleza. 
Los cianuros actúan como inhibidores no competitivos de la catalasa uniéndose al hierro de 
esta hemoproteína, lo que resulta en un complejo inactivo. 
 
El método que se utilizará en este Trabajo para la determinación de actividad catalásica en 
sangre tiene el siguiente fundamento: 
 Se deja actuar la catalasa en presencia de un exceso de H2O2 durante 
cierto tiempo; se detiene la reacción mediante el agregado de un ácido fuerte, se mide el 
peróxido de hidrógeno que no ha sido transformado por la enzima, mediante titulación con 
permanganato de potasio. La ecuación de titulación es: 
 2 KMnO4 + 5 H2O2 + 3 H2SO4 2 MnSO4 + K2SO4 + 5 O2 + 8 
H2O 
 
Conociendo la cantidad inicial de sustrato (en µM) y la cantidad remanente después de cierto 
período de acción de la enzima, es posible calcular cuántos µM de H2O2 (sustrato) fueron 
descompuestos por la enzima en la unindad de tiempo (minuto) y por ml de preparación. De 
este modo, teniendo en cuenta la dilución de enzima utilizada, se puede expresar 
cuantitativamente la actividad de la catalasa contenida en la muestra analizada. 
 
Técnica 
Enzima: se extrae sangre por punción del pulpejo del dedo con una lanceta estéril. Aspire la 
sangre que mana con una micropipeta de 20 µl, enrase perfectamente y vierta el contenido en 
un probeta de 10 ml conteniendo unos 8 ml de agua destilada. Lave la pipeta aspirando 
repetidamente el líquido de la probeta. Agregue agua destilada para llevar el volumen final a 
10 ml. La dilución operada por la sangre será 1/500 
 
Reactivos 
Sustrato: peróxido de hidrógeno 0,05M. Tome 1,2 ml de H2O2 al 30% y lleve a 200 ml 
agregando buffer Na HPO / NaH PO 0,02M de pH 7 . 2 4 2 4
 Para detener la acción enzimática se usa H2SO4 6N. La titulación del H2O2 se realiza con 
KMnO4 0,005 M. Simultáneamente con la determinación de actividad enzimática se estudiará 
el efecto inhibidor de cianuros. Prepare la solución de cianuro de sodio 5 x 10-5 M. 
 
 En tres erlenmeyer de 50 ml coloque los siguientes reactivos: 
 
Erlenmeyer Buffer H2O2 dil H2O Catalasa 
 1 10 ml 2 ml 1 ml H2SO4 2ml 0,5 ml 
 1 10 ml 2 ml 1 ml 0,5 ml 
 1 10 ml 2 ml 0,5 ml NaCN 0,5 ml 0,5 ml 
 
Deje 5 minutos a temperatura ambiente, luego agregue 2 ml de ácido sulfúrico a los frascos 2 
y 3. El H2SO4, además de interrumpir la reacción, es necesario porque la permanganimetría 
se realiza en medio ácido. 
Titule el H O presente en cada erlenmeyer con KMnO . 2 2 4
En el erlenmeyer 1 se mide el total de peróxido de hidrógeno que se colocó. En el 2 se 
desarrolla acción enzimática, de modo que en él se mide el resto de H2O2 no atacada por la 
catalasa. El 3 contiene el resto de H2O2 no atacada por la enzima inhibida con cianuro. 
 
Cálculos 
De la ecuación de la permanganimetría se deduce que existe una relación de dos moles de 
KMnO4 que reaccionan con 5 moles de H2O2 . Por lo tanto, 2 micromoles de KMnO4 
corresponden o reaccionan con 5 micromoles de H O . 2 2
Si, por ejemplo, se gastan 8 ml de KMnO4 0,005M en el blanco, ello representa 40 
micromoles de H O . 2 2
Siendo la relación: 2 µmoles de KMnO4 equivalen a 5 µmoles de H2O2, entonces 40 µmoles 
de KMnO4 equivalen a 100 µmoles de peróxido. 
Supongamos que en el frasco 2 se titulan 62,5 µmoles de H2O2. Ello indica que 37,5 µmoles 
(100 - 62,5) fueron consumidos por la enzima. El mismo cálculo aplicado al erlemneyer 3 
permitirá determinar la magnitud de la inhibición provocada por el cianuro sobre la catalasa. 
 
 
 
 
 
	Trabajo Práctico Nº 6
	OXIDACIONES BIOLOGICAS