Extracción de ADN genómico de células procariotas

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Laboratorio 4. 
Extracción ADN genómico de células procariotas 
(Adaptado de: Rache Cardenal, Leidy Yanira y Manjarres Hernandez, Elsa Helena. 2017. Manual de prácticas de biología molecular. Ediciones Universidad de Boyacá. ISBN: 978-958-8642-70-3
Resultados
Figura 1. Pellet obtenido de los cultivos de PS (Pseudomonas fluorescens) y LS (Lacticaseibacillus rhamnosus). 
Figura 2. Resuspensión del pellet en Buffer TE 1X. 
1. Observe y describa los cambios físicos sucedidos a la muestra durante todo el proceso de extracción y purificación.
Durante todo el proceso las muestras sufrieron diferentes cambios físicos. Al centrifugar la muestra por 5 min a 13 mil gravedades hay una separación entre las bacterias (pellet) y el medio de cultivo (sobrenadante). Posteriormente se añaden diferentes buffers y se incuba la muestra varias veces, durante estos pasos las muestras sufren varios cambios (rompimiento de las células, destrucción de proteínas, regulación de pH), se hace una segunda centrifugación en la cual se precipita el ADN y finalmente se le añade buffer TE al pellet obtenido.
2. Escriba ¿cuál es el fundamento de cada paso del protocolo de extracción de ADN? 
En el primer paso se debe centrifugar la muestra a 13 mil gravedades por 5 minutos para que haya una separación entre las bacterias y medio de cultivo en el que se encuentran. Al pellet se le agrega el buffer de lisis TE 1X más 2 mg/ml de lisozima, el buffer TE es una solución amortiguadora y es usado porque protege al ADN durante el procedimiento, la lisozima es una enzima que es usada porque aumenta la eficacia de la extracción del ADN al descomponer la pared celular [1][2]. Se añade 1% (p/v) de SDS para el rompimiento de enlaces no covalentes en las proteínas, se usa porque las desnaturaliza y provoca que pierdan su conformación nativa, además de agregar proteinasa K, la cual se usa para la destrucción de proteínas y para la liberación de ácidos nucleicos, inactivando las DNasas con gran eficacia [3]. Se añade 5 M de NaCl más 60 µl de CTAB (10% p/v) disuelto en 0.7 M de NaCl con el fin de eliminar glicoproteínas y obtener un ADN más puro. Para prevenir la producción de espuma y facilitar la separación de las fases acuosas y orgánicas, se añade fenol-cloroformo en una proporción 24:1, así quedan las proteínas desnaturalizadas en la interfase y el ADN en la fase acuosa [4]. Posteriormente, se añade isopropanol para la precipitación del ADN, además de concentrar y desalinizar el ADN que se encuentra en la fase acuosa. Se añade etanol con el propósito de precipitar el ADN ya que es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol, así se forman una hebras blancas finas en el límite de separación de la fase de alcohol y las demás sustancias quedan disueltas [5][6]. Finalmente se añade tampón TE 1X con el fin de resuspender el sedimento de plásmido purificado obtenido, este contiene bajos niveles de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) siendo así compatible con la secuenciación y demás aplicaciones enzimáticas [7]. 
Preguntas
1. ¿Qué enzimas se pueden utilizar para romper la pared de bacterias y cuáles son sus modos de acción?
· Endolisinas: generan inestabilidad en la pared y esto provoca que se rompa por las diferencias de presión osmótica entre el interior y el exterior de la célula. 
· Peptidoglicano hidrolasas: degrada el peptidoglicano y posteriormente se da una lisis osmótica, muerte de la bacteria. 
· Polisacárido depolimerasas: son hidrolasas que degradan carbohidratos macromoleculares dentro de los polisacáridos extracelulares y los lipopolisacáridos que recubren la pared celular.
· Holinas: proteínas responsables de permeabilizar la membrana celular, permitiendo que las endolisinas ataquen el peptidoglicano [8]. 
2. ¿De acuerdo con la literatura, que diferencias existen en los protocolos para extraer ADN plasmídico?
Las diferencias entre los protocolos que existen actualmente son principalmente el uso de procesamientos químicos (cloruro de cesio o fenol cloroformo), físicos (temperaturas en determinados intervalos de tiempo) y del detergente para la lisis celular (Triton o docedil sulfato sódico, SDS), dependiendo el objetivo de la extracción de ADN [9].
3. Busque un artículo científico en el que realicen extracción de ADN de bacterias, léalo y responda:
- ¿Para qué hacen la extracción de ADN?: se usó para la identificación de Ehrlichia y Anaplasma. 
- ¿De dónde provienen las bacterias? provienen del vector Rhipicephalus sanguineus (garrapata hematofaga). 
- Protocolo que utilizan para realizar el proceso de extracción: Para el método de maceración y conservación se usaron 26 réplicas de 10 garrapatas por réplica. En el primer método se usó nitrógeno líquido, en el segundo congelación a –80 °C y en el tercero se disecó y maceró a temperatura ambiente. Luego se usó un kit de extracción de ADN comercial (DNeasy Blood and Tissue kit de Qiagen) donde se midió la cantidad, calidad y pureza del ADN mediante espectrofotometría y gel de agarosa. En la amplificación por PCR se analizaron todas las muestras para detectar la presencia de agentes rickettsiales por duplicado mediante un ensayo de PCR, dirigido primeramente a un fragmento de 478 pb del gen ARN ribosomal (ARNr) 16s para el género Ehrlichia y Anaplasma, utilizando los cebadores ECC y ECB. 
- Imprima la primera página del artículo y adjúntela en el informe.
4. ¿En qué casos se utilizan los paquetes comerciales de extracción de ADN para bacterias? 
Suelen utilizarse para la investigación del microbioma con ADN y ARN; el microbioma humano es un factor clave para identificar y diagnosticar enfermedades, sin embargo, cuantificar e identificar a los microorganismos que lo componen es un desafío. En este caso paquetes como el kit de aislamiento de ácido ultra nucleico MagMAX Microbiome permite al investigador obtener una muestra adecuada de ADN y ARN puro y de alta calidad. 
Estos paquetes comerciales también se utilizan para la identificación y cuantificación de ADN y ARN de bacterias y virus en aguas residuales y lodos. Esto con el fin de vigilar enfermedades causadas por estos [11].
Conclusión
Se realizó una exitosa extracción de ADN (Figura 1) de las muestras Pseudomonas fluorescens y Lacticaseibacillus rhamnosus, además se reconoció la importancia de las enzimas para el procedimiento de extracción de ADN dado que estas permiten la lisis y posterior liberación del material genético. 
Dependiendo del objetivo de extracción se suelen usar diferentes protocolos, bien sean físicos o químicos. Además el método de lisis varía en función del objetivo de la extracción de ADN.
Los paquetes comerciales de extracción de ADN son una alternativa para los investigadores que ahorra tiempo, ya que la solución buffer viene preparada con la enzima específica que se requiere. Estas permiten la identificación y cuantificación de las bacterias en el microbioma y en aguas contaminadas. Estos análisis permiten el control de enfermedades mediante la identificación de microorganismos patógenos. 
Referencias bibliográficas
[1]. KEY STANDARD OPERATING PROCEDURES (SOPs). (2001). En Pharmaceutical Master Validation Plan (pp. 119–120). CRC Press.
[2]. (S/f). Fishersci.es. Recuperado el 13 de junio de 2022, de https://www.fishersci.es/shop/products/pierce-lysozyme/10249843#:~:text=Aumente%20la%20eficacia%20de%20extracci%C3%B3n,descomponer%20la%20pared%20celular%20bacteriana
[3]. Proteinasa K solución 20 mg/ml. (s/f). Itwreagents.com. Recuperado el 13 de junio de 2022, de https://www.itwreagents.com/iberia/es/product/proteinasa+k+soluci%C3%B3n+20+mgml/A4392
[4]. (S/f-b). Researchgate.net. Recuperado el 13 de junio de 2022, de https://www.researchgate.net/profile/Edith-Burbano-Rosero/publication/326905291_Manual_de_Biologia_Molecular-Procedimientos_Basicos/links/5b7de35292851c1e12291a22/Manual-de-Biologia-Molecular-Procedimientos-Basicos.pdf
[5]. Precipitación de DNA con Etanol vs. Isopropanol. (2017, junio 29). Abyntek Biopharma. https://www.abyntek.com/precipitacion-de-dna-con-etanol-vs-isopropanol/[6]. (S/f-c). Bio-rad.com. Recuperado el 13 de junio de 2022, de https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4110034ES.pdf
[7]. (S/f-d). Fishersci.es. Recuperado el 13 de junio de 2022, de https://www.fishersci.es/shop/products/invitrogen-te-buffer/11568846
[8]. Aplicaciones de los Fagos en Terapia antimicrobiana. (2021, febrero 12). Microbiología. https://microbiologia.net/virus/aplicaciones-fagos-terapia-antimicrobiana/
[9]. Sandoval Rodríguez A, & Martínez Rizo A, & de la Mora D (2013). Extracción de ácidos nucleicos. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743658
[10]. Aragón-López, C. E., Luna-Nevárez, P., Ortiz-Encinas, V., Leyva-Corona, J. C., Rojas-Arzaluz, M., & Reyna-Granados, J. R. (2021). Uso de diferentes métodos de conservación de garrapatas Rhipicephalus sanguineus para mejorar la extracción de ADN de bacterias rickettsiales. Revista Latinoamericana de Recursos Naturales, 17(1).
[11]. Kits, reactivos y protocolos. Thermo Fisher sample purification system kits & reagents. https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/automated-purification-extraction/kingfisher-systems/kits-reagents.html