TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

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INFORME PRÁCTICA No. 7
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS.
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
1. OBJETIVO
Reconocer diferentes técnicas de cromatografía como válidas para separar
aminoácidos y reconocer la presencia de compuestos con el uso de patrones.
MARCO TEÓRICO
● Cromatografía: La cromatografía es un método físico de separación en el
que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases,
una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la
otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.
● Propiedad fisicoquímica: Son las que nos informan sobre el
comportamiento del material ante diferentes acciones externas, como el
calentamiento, las deformaciones o el ataque de productos químicos.
Estas propiedades son debidas a la estructura microscópica del material; es
la configuración electrónica de un átomo la que determina los tipos de
enlaces atómicos y son éstos los que contribuyen a forjar las propiedades de
cada material
● Solubilidad: Solubilidad es la mayor cantidad de soluto (gramos de
sustancia) que se puede disolver en 100 gr. de disolvente a una temperatura
fija, para formar una disolución saturada en cierta cantidad de disolvente.
Las sustancias no se disuelven en igual medida en un mismo disolvente. Con
el fin de poder comparar la capacidad que tiene un disolvente para disolver
un producto dado, se utiliza una magnitud que recibe el nombre de
solubilidad. La capacidad de una determinada cantidad de líquido para
disolver una sustancia sólida no es ilimitada. Añadiendo Soluto a un volumen
dado de disolvente se llega a un punto a partir del cual la disolución no
admite más soluto (un exceso de soluto se depositaría en el fondo del
recipiente). Se dice entonces que está saturada. Pues bien, la solubilidad de
una sustancia respecto de un disolvente determinado es la concentración
que corresponde al estado de saturación a una temperatura dada.
● Equilibrio: es la denominación que se hace a cualquier reacción reversible
cuando se observa que las cantidades relativas de dos o más sustancias
permanecen constantes, es decir, el equilibrio químico se da cuando la
concentración de las especies participantes no cambia, de igual manera, en
estado de equilibrio no se observan cambios físicos a medida que transcurre
el tiempo; siempre es necesario que exista una reacción química para que
exista un equilibrio químico, sin reacción no sería posible.
● Fosfolípidos; Los Fosfolípidos son lípidos anfipáticos, que se encuentran en
todas las membranas celulares, disponiéndose como bicapas lipídicas.
Pertenecen al grupo de lípidos derivados del glicerol, presentando una
estructura similar a la de los triglicéridos.
● Fase estacionaria: La fase estacionaria es una de las dos fases que forman
un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel, o un líquido. Si es un
líquido, puede estar adherido sobre un sólido. Este sólido puede o no
contribuir al proceso de separación. El líquido también se puede unir
químicamente al sólido (fase unida químicamente) o inmovilizarse sobre él
(fase inmovilizada). La expresión lecho cromatográfico o sorbente, se puede
emplear como término general para denominar cualquiera de las diferentes
formas en las que se presenta la fase estacionaria.
● Concentración: cantidad de soluto disuelta en una cantidad dada de
disolvente o de solución. Entre mayor sea la cantidad de soluto disuelta, más
concentrada estará la solución. pueden ser:
● Diluidas: la cantidad de soluto es pequeña (por ejemplo una solución de 1
gramo de sal en 100 gramos de agua)
● Concentradas: si la proporción de soluto con respecto del solvente es grande
(por ejemplo una disolución de 25 gramos de sal en 100 gramos de agua)
● Saturadas: a una determinada temperatura no admite más cantidad de soluto
disuelto.
● Sobresaturadas: contiene mayor cantidad de soluto que la permitida a una
temperatura determinada. Se produce por enfriamientos rápidos o por
descompresiones bruscas.
● Presión atmosférica: El peso por unidad de superficie que ejerce el aire
sobre los cuerpos situados en la atmósfera se llama presión atmosférica.
Esta presión se detecta en los fenómenos cotidianos de la naturaleza. Así,
por ejemplo, al pegar una ventosa sobre una superficie lisa sin que quede
aire encerrado en su interior, la presión atmosférica la mantiene firmemente
adherida, de manera que no cae por su peso.
2. INTRODUCCIÓN.
Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes individuales
de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su
comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como
patrón o alguna propiedad fisicoquímica del compuesto. La base de la técnica es
que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases, una de ellas llamada
fase estacionaria (habitualmente sólida o líquida) y la otra llamada fase móvil
(habitualmente líquida o gas), el soluto experimenta una serie de procesos
(adsorción en la fase estacionaria, solubilización en cada fase, arrastre por la fase
móvil, etc.) que, en último extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas
fases. En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto entre ambas
fases es constante, y se denomina, a este tipo de experiencia Cromatografía de
reparto. En una mezcla, cada componente tendrá una distribución diferente,
característica y reproducible en condiciones experimentales iguales. En este caso la
separación se considera buena. Este reparto depende de la naturaleza de las fases,
así como de las condiciones de la cromatografía.
2.1. Cromatografía en papel
Una de las técnicas cromatográficas más sencillas es la que se realiza sobre papel.
Se basa el método en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles,
aunque en magnitud diferente, en dos o más solventes que son inmiscibles entre sí y
que se hallan en contacto. Cuando se permite que pase un tiempo suficiente para
alcanzar el equilibrio, el compuesto se encontrara distribuido entre las dos fases
liquidas (fase estacionaria y fase móvil), de un modo característico. El reparto (o
distribución), que se define como la relación que existe entre la concentración A del
compuesto en el solvente A y su concentración B en el solvente B, se expresaría así:
K = [A] / [B]
Como puede deducirse, K resulta característica para un determinado compuesto
químico, un sistema de solvente y todo otro conjunto de condiciones, dentro de las
cuales se incluyen las ambientales, ya que su valor quedara influenciado por
cualquier factor que afecte la solubilidad en cada uno de los solventes utilizados.
Algunos de estos factores más importantes serían: la temperatura, la presión
atmosférica y la presencia de otros solutos. La cromatografía en papel puede
realizarse en forma ascendente o descendente y en forma circular (cromatografía
circular), en la que un papel de filtro se coloca horizontalmente y así se evita que la
fase móvil corra en contra de la gravedad, la fase estacionaria o fija, es agua
adsorbida superficialmente, en este caso de naturaleza polar (iones OH- y H+), se
localizan sobre el papel de filtro, así, las sustancias polares correrán menos, pues
se adsorben más fuertemente a los iones del papel. Luego se coloca el papel de
filtro sobre una caja de Petri que contenga el solvente o mezcla de solventes de
naturaleza apolar o menos polar que el agua, se le adiciona un sistema capilar que
posibilite que el solvente alcance el papel de filtro, se tapa y se deja que la fase
móvil alcance el borde del papel.
Este procedimiento es muy simple y no requiere de equipos especiales, por lo que
resulta ideal para que personas poco expertas obtengan resultados demostrativos.
Otra ventaja es que si se mantienen las condiciones estables, es decir si se emplea
el mismo tipo de papel, los mismos solventes y las mismas condiciones ambientales,
la movilidad de una mancha correspondiente a una sustancia pura es constante y
por lo tanto es posible identificar esamancha por comparación directa con una
mancha patrón. De otra forma, en ausencia de patrones, es posible la identificación
de la sustancia con base en las propiedades fisicoquímicas (de la sustancia) y a
partir del llamado Rf (factor de retención. El Rf es la relación que existe entre la
distancia recorrida por la mancha respecto de la recorrida por el solvente.
Rf = Distancia de la mancha / Distancia del solvente
2.2. Cromatografía en capa fina
Otra de las técnicas cromatográficas sencillas es la que se realiza en capa fina,
llamada así porque la fase estacionaria es un solvente polar, normalmente H2O
adsorbido en una capa fina de un material poroso inerte (gel de sílice, alúmina, etc.)
por tanto la naturaleza de la fase es polar (similar a la fase inerte en Cromatografía
en papel). La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones
menos polar que el agua adsorbido en el material poroso, que emigra por la fase
estacionaria debido al fenómeno de capilaridad. En su movimiento, arrastra en
mayor o menor proporción al componente o mezcla de componentes de una mezcla
en función de sus mayores o menores coeficientes de reparto. De manera similar a
la Cromatografía en papel, se puede determinar el denominado Rf. Las sustancias
más insolubles en la fase móvil tendrán, un Rf próximo a cero, mientras las más
solubles en esta fase se acercarán a uno. La cromatografía en capa fina se puede
emplear para separar distintos grupos de biomoléculas. En esta práctica,
emplearemos aminoácidos, pero podrían emplearse los distintos fosfolípidos
obtenidos de la yema de huevo, o azucares presentes en un alimento, componente
de la clorofila, entre otros. Lógicamente, en cada caso cambiaría la fase móvil
empleada. Finalmente para reconocer las sustancias separadas, se emplean
compuestos reveladores. Para el reconocimiento de aminoácidos, la placa se
revelará mediante la acción de la ninhidrina.
3. PRELABORATORIO
1. Qué se entiende por cromatografía
R: Keulemans (1959) definió cromatografía como “Método físico de separación en el
que los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales
constituye un lecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que
pasa a través o a lo largo del lecho estacionario (fase móvil)” (Sgariglia, Soberón,
Sampietro, & Vattuone, 2010).
2. Cuántas clases de cromatografía hay.
R: se pueden considerar los siguientes tipos de cromatografía:
● Cromatografía en papel: Su fase estacionaria consta de una tira de papel
filtro. La muestra a analizar es colocada en forma de gota sobre un extremo
del papel. Luego se sumerge la tira de papel en un recipiente donde está la
fase móvil, teniendo en cuenta que el extremo donde está colocada la
muestra quede en la parte de abajo del papel. La fase móvil asciende por
capilaridad arrastrando consigo la muestra y separando cada componente
según su afinidad por la fase estacionaria. Se emplea principalmente cuando
cada componente de la muestra tiene un color diferente, entonces se puede
ver el despliegue de colores sobre el papel para identificarlos.
● Cromatografía en capa fina: Funciona de manera similar a la cromatografía
en papel, sin embargo, en esta la fase estacionaria está constituida por una
resina polar sobre una placa de vidrio o aluminio. Se agrega cierta cantidad
de la muestra a 1 cm del borde inferior de la placa y luego se sumerge,
teniendo en cuenta que el extremo con la muestra quede hacia abajo, en un
recipiente con la fase móvil y esta asciende por capilaridad separando los
componentes de la muestra.
● Cromatografía en columna: Se coloca la fase estacionaria dentro de una
columna de vidrio o acero inoxidable. La fase móvil suele ser liquida o
gaseosa. La muestra va en el extremo superior de la columna y se deja
descender con la fase móvil utilizando la gravedad.
3. ¿Qué es el factor de retención?
R: es la relación que existe entre la distancia recorrida por la mancha respecto de la
recorrida por el solvente.
4. En cromatografía cuál es la fase estacionaria y cuál es la fase móvil
R: La fase estacionaria está constituida por una sustancia que se mantiene inmóvil
mientras se ejecuta la cromatografía. La fase móvil es la sustancia que se mueve
durante la cromatografía, puede ser un líquido o un gas, la muestra que contiene el
analito se administra en la fase móvil.
5. ¿Qué se entiende por cromatografía en placa fina bidimensional?
R: En la técnica de cromatografía en capa fina bidimensional (TLC 2D) la separación
se realiza en una superficie extendida a lo largo de toda el área de la placa. El poder
de resolución del método de TLC en 2D tiene una gran aplicación, especialmente en
las áreas de la bioquímica, la biología, los productos naturales, los productos
farmacéuticos y el análisis medioambiental.
4. MATERIALES Y REACTIVOS
4.1. Cromatografía en papel
Estufa eléctrica, capilares de vidrio, lápiz Nº 2, papel Whatman N° 1, vasos de precipitados,
pipeta, frasco revelador (ninhidrina), regla, caja de Petri. Muestras de aminoácidos al 1%,
ninhidrina (1mg/ml en acetona), fase móvil: fenol saturado en agua.
4.2. Cromatografía en capa fina
Placa fina de celulosa, micropipeta de hasta 10 ml, frasco revelador (ninhidrina), cubeta
cromatográfica, pinzas de madera, lápiz nº 2, regla de 20 cm. Muestras de aminoácidos al
1%, ninhidrina (1mg/ml en acetona), fase móvil: n-butanol-acetona- acético-agua
(35/35/20/10).
NINHIDRINA:
Densidad: 862 kg/m3
Masa molar: 178 ,027 g/mol
Peso molecular: 130.13
Punto de fusión: 250 ºCGeneralmente en cristales de color naranja
Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una
coloración que varía de azul a violeta intenso
se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de
la coloración original del aminoácido
ligeramente soluble en éter y cloroformo
Los indano 2,3 - triona reaccionan fácilmente con nucleófilos, tales como agua
Reacciona con aminas secundarias para producir sal imida
ACETONA
Estado: Líquido
Aspecto: Incoloro y transparente
Olor: Característico
PH (sol. 1 %, v/v): Neutro
Temperatura de ebullición (°C): 56
Flash-point (°C): < 21 (Inflamable a temperatura ambiente)
Densidad (a 20°C): 0.791
Solubilidad en agua (% en peso): Completamente soluble
Solubilidad en disolventes orgánicos: Miscible con la mayor parte de disolventes orgánicos
Modificaciones posibles con el tiempo,
bajo la acción de agentes exteriores:
Ligeras variaciones en composición por evaporación parcial de los
componentes mas volátiles.
H225: Líquido y vapores muy inflamables. H319: Provoca irritación ocular grave. H336:
Puede provocar somnolencia o vértigo. EUH066: La exposición repetida puede provocar
sequedad o formación de grietas en la piel.
FENOL
Estado físico: sólido (cristalinas)
Color: incoloro
Olor: característico
Umbral olfativo: No existen datos disponibles
pH (valor): 4 – 5 (agua: 10 g/l, 20 °C)
Punto de fusión/punto de congelación: 40 – 42 °C
Punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición: 180 – 182 °C
Punto de inflamación: 81 °C a 1.013 hPa
Tasa de evaporación: no existen datos disponibles
Inflamabilidad (sólido, gas): Estas informaciones no están disponibles
H301+H311+H331 Tóxico en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación
H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves
H341 Se sospecha que provoca defectos genéticos
H373 Puede provocar daños en los órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas
H411 Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos
BUTANOL
Estado físico: líquido (fluído)
Color: incoloro
Olor como: alcohol
Umbral olfativo: 0,004 – 48,7 ppm
pH (valor): 7 (agua: 70 g/l, 20 °C)
Punto de fusión/punto de congelación: <-90 °C
Punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición: 119 °C a 1.013 hPa
Punto de inflamación: 35 °C a 1.013 hPa
Tasa de evaporación: no existen datos disponibles
Inflamabilidad (sólido, gas): no relevantes (fluído)
H226 Líquidos y vapores inflamables
H302 Nocivo en caso de ingestiónH315 Provoca irritación cutánea
H318 Provoca lesiones oculares graves
H335 Puede irritar las vías respiratorias
H336 Puede provocar somnolencia o vértigo
ÁCIDO ACÉTICO
Estado físico Líquido
Color Sin color
Olor olor muy picante (vinagre)
Umbral olfativo 0,037 a 0,15 ppm
pH 1 M = 2,4
0,01 M = 3,4
Punto de fusión 16.6 ºC
Punto de ebullición 118 ºC
Presión de vapor a 20°C 11.4 mm Hg
Densidad relativa de vapor (aire=1) 2,07
Densidad relativa (agua=1) 1,05
Solubilidad en agua Miscible
Solubilidad en otros disolventes Soluble en alcohol, glicerina y éter. Insoluble en
sulfuro de carbono.
Viscosidad 1,22 cp
R 10-35
Inflamable.Provoca quemaduras graves.S 23-26-45
No respirar los vapores. En caso de contacto con los ojos, lávese abundantemente con
agua y acudase a un médico. En caso de accidente, acudase inmediatamente al médico.
FLUJOGRAMAS DE PROCEDIMIENTO
5.1
5.2
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Cromatografía en papel
Para la realización de esta experiencia Ud. debe utilizar guantes quirúrgicos o de laboratorio
de látex, porque en sus manos se encuentran presentes diversos aminoácidos y
contaminarían todo el material.
Capilar de Papel
Colóquese los guantes. En el papel Whatman N° 1 trazar dos líneas con lápiz tal como se
ilustra en la figura. Realizar un orificio central y proceda a aplicar lo más próximo a este
orificio y en forma de gota las soluciones de aminoácidos y la solución problema de acuerdo
a la distribución que orienta la figura o la que determine el docente.
Coloque el capilar de papel dentro del orificio y ubíquese junto con el papel circular sobre la
placa de Petri que contiene solvente apolar. Tape la placa de Petri, cuidando que el capilar
no quede doblado y deje correr el solvente hasta el borde del papel.
Extraiga el papel de filtro de la caja de Petri y sequelo por exposición al calor generado por
la estufa eléctrica. Tenga cuidado de no quemar el papel.
Rocíe el papel seco con ninhidrina y sequelo nuevamente en la estufa hasta que aparezcan
manchas.
Suponga el siguiente resultado y que el solvente se desplazó hasta el borde del papel.
a. Represente en el dibujo siguiente el resultado obtenido y calcule el valor de Rf de cada
uno de los aminoácidos conocidos, así como el de o los que se encuentran en la solución
desconocida.
Suponga el siguiente resultado y que el solvente se desplazó hasta el borde del
papel.
Cromatografía circular en papel
Cálculo de los valores de Rf
b. Explique la razón por la cual se produce esta separación de los aminoácidos?
R: la separación entre estos aminoácidos se produce debido a su polaridad, ya que en el
caso del ácido glutámico el cual es un aminoácido con grupo R polar este no se va a alejar
demasiado del punto de partida o a moverse demasiado debido a la propiedad de adsorción
donde estos compuestos polares se adsorben más fuertemente a los iones del papel o
compuestos polares como los presentes en la fase estacionaria, por esta razón el ácido
glutámico se mueve en una corta distancia, en el caso de la leucina y alanina la distancia
varía debido a que estos son aminoácidos no polares; la leucina menos polar que la alanina,
por lo cual no se ven afectados por la propiedad de adsorción y recorren una mayor
distancia por lo cual poseen un menor factor de retención.
c. Qué conclusiones puede deducir Ud. sobre la solución desconocida?
R: que probablemente está compuesta de 3 aminoácidos conocidos como alanina, glicina y
ácido glutámico por lo cual al realizar la cromatografía en papel se muestran 3 distancias
distintas entre sí, donde podemos compararlas entre sí y decir que esto como podemos
deducir es debido a la polaridad que presenta cada aminoácido, el factor de retención y la
adsorción que se presenta con relación a la forma en la que reacciona cada aminoácido con
el papel y el solvente en este caso fenol saturado en agua. ya que, como ya lo
mencionamos recorren más distancia aquellos aminoácidos con cadenas R apolares como
la alanina y leucina y menor distancia aquellos aminoácidos con cadenas R polares como el
ácido glutámico.
5.2. Cromatografía en capa fina
Coloque aproximadamente 25 ml de fase móvil en la cubeta y ciérrela, para saturar su
atmósfera. La cromatografía se efectuará en esa cubeta cerrada.
Trace con un lápiz, sin apretar demasiado para no dañar la placa, una línea horizontal a 1,5
cm del borde inferior de la placa. Marcar, sobre ella, 4 puntos (3 puntos de muestras
conocidas: glicina, ácido aspártico e histidina y un punto de muestra problema) con igual
separación entre sí, Colocar las placas de sílice para cromatografía sobre una estufa para
que se sequen de la humedad ambiental. Marque con una línea el límite superior de
desplazamiento del solvente a 1 cm del borde. Aplicar sobre los puntos 0,5 mL de cada
aminoácido con la micropipeta. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible,
dejar secar las gotas. Volver a colocar la misma cantidad de muestra en cada uno de los
puntos para concentrar las muestras (repetirlo 5 veces). Anotar las posiciones en que se
han colocado las muestras de diferentes aminoácidos la muestra problema.
Coloque la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de
la línea de aplicación de las muestras. Cierre y espere entre 30 y 45 minutos. La fase móvil,
en todo caso, no debe llegar al extremo superior de la placa. En ese tiempo, realizar otros
apartados de la práctica.
Saque la placa, marque en un borde el nivel alcanzado por la fase móvil, séquela en la
estufa (si huele algo a disolvente orgánico, elimine los últimos residuos con aire caliente del
secador de cabello) y rocíela con el revelador (ninhidrina). Coloque la placa en la estufa
unos 3 min, a 105 ºC, o hasta la aparición de manchas.
a.Observe las manchas aparecidas. Represente en el dibujo siguiente el resultado obtenido
y calcule el valor de Rf de cada uno de los aminoácidos conocidos, así como el del
aminoácido que se encuentran en la solución desconocida.
Tenga en cuenta el siguiente ejemplo, válido también para la cromatografía circular en
papel:
El factor de Retención (Rf) = Distancia recorrida por cada muestra
Distancia recorrida por el disolvente
Suponga el siguiente resultado:
a b c d
b. Identifique el nombre de cada aminoácido y las características de cada uno de ellos.
● Glicina: actúa como neurotransmisor, inhibiendo el sistema nervioso central. Actúa
en la médula espinal y en el tallo cerebral, y contribuye en el control de movimientos
motores, en el sistema inmunológico, como hormona del crecimiento y cómo
almacenadora de glucógeno, entre otros. Es no esencial. está compuesta por un
átomo de carbono central, al que va unido un radical carboxilo(COOH) y uno amino
(NH2). Los otros dos radicales son de hidrógeno. Se trata por tanto del único
aminoácido con dos radicales iguales; no tiene isomería óptica. Es no polar o
alifático.
● Ácido aspártico: es polar con carga negativa, no esencial, tiene un grupo R con
un segundo grupo carboxilo. Entre sus funciones están la síntesis de purinas,
pirimidinas, asparagina y arginina. Participa en reacciones de transaminación,
en el ciclo de la úrea y en la síntesis de inositol.
● Histidina: es un aminoácido esencial, polar con carga positiva, tiene un grupo R
conocido como imidazolio, que tiene una estructura cíclica con dos átomos de
nitrógeno cuyas características le permiten participar en distintas reacciones
enzimáticas donde ocurren transferencias de protones.
c. Con una fase móvil más polar, la separación para cada aminoácido o la muestra
problema ¿sería mejor o peor? ¿Por qué?
No realmente, puesto que para obtener el grado de separación que permite identificar los
componentes es necesario que haya un grado de diferenciación notable entre las dos fases
para que los componentes de la muestra problema se puedan identificar, “ La fase
estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la
fase estacionaria, de forma que loscomponentes que se desplacen con mayor velocidad
serán los menos polares“.
d. Describa la reacción de la ninhidrina con los aminoácidos, y los colores que se presume
obtener.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Colombia-Córdoba, imagen tomada de:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20DE%20C
APA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo
amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción
del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el
amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que
presenta una coloración azul-púrpura. El derivado coloreado presenta un máximo de
absorción en torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH
comprendidos entre 4 y 8. La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar
concentraciones bajas de aminoácidos, La presencia de aldehídos resultantes de la
degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas
condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.
e. ¿Se podrían diferenciar, por una cromatografía de este tipo, los 20 aminoácidos
proteicos? ¿Qué ventajas tendría utilizar la Cromatografía bidimensional?
principalmente a aquellos con una polaridad marcada, puesto que sin esta condición
no podrían desplazarse tan eficientemente en la muestra,siendo la cromatografía en
capa fina una con los rangos más amplios a la hora de determinar gracias a su grado de
absorción el tipo de sustancia, y estando los 20 aminoácidos fundamentales subdivididos en
4 grupos como lo son (apolares, polares, catiónicos y aniónicos) hace que al ser tan
diferentes entre sí “ La presencia de grupos químicos ionizados en los aminoácidos permite
que las proteínas presenten características fisicoquímicas específicas en el microambiente
biológico” de lugar a que al realizar esta prueba y verificar el grado de absorción lumínica
con pruebas de luz ultravioleta permita identificarlos, si cuentan con la condición ya
manifestada.
5. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
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básicas, Tomado de:
https://www.secyta.es/es/node/10#:~:text=La%20fase%20estacionaria%20es%20un
a,contribuir%20al%20proceso%20de%20separaci%C3%B3n.
● Concentraciones químicas, Concentraciones, (s,a) (2015) Tomado de:
quimicas.net/2015/05/concentraciones-quimicas.html
● Ciencias y tecnología/Física/Estática y dinámica/La presión atmosférica, (s.f),
Tomado de: https://www.hiru.eus/es/fisica/la-presion-atmosferica
● Jesús V. Jorrín Novo, Mª Nieves Abril Díaz, José A. Bárcena Ruiz (s.f)Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Colombia-Córdoba-imagen tomada de:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20D
E%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
Grupo de trabajo N: 1°
Integrantes: laura moreno, dagler blanco, juan cotrino
Fecha de práctica: 19703/2021
Fecha de entrega de informe: 26/03/2021
Consulte el siguiente link: https:
//www.youtube.com/watch?v=3xHzSXkRslg
http://www.aulamedica.es/nh/pdf/7961.pdf
https://www.secyta.es/es/node/10#:~:text=La%20fase%20estacionaria%20es%20una,contribuir%20al%20proceso%20de%20separaci%C3%B3n
https://www.secyta.es/es/node/10#:~:text=La%20fase%20estacionaria%20es%20una,contribuir%20al%20proceso%20de%20separaci%C3%B3n
https://www.hiru.eus/es/fisica/la-presion-atmosferica
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf