Espectrometría Molecular por Luminiscência

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CAPÍTULOQUINCE
Espectrometría
molecular por
luminiscencia
E
n este capítulo se consideran tres tipos 
de métodos ópticos relacionados entre sí:
fluorescencia, fosforescencia y quimio-
luminiscencia moleculares. En todos ellos, las
moléculas del analito se excitan para generar una
especie cuyo espectro de emisión suministra infor-
mación para el análisis cualitativo y cuantitativo.
Los métodos se conocen en conjunto como proce-
dimientos luminiscentes moleculares.
399
En todo el capítulo, este símbolo indica una 
oportunidad para estudiar en línea. En el sitio
http:// latinoamerica.cengage.com /skoog, encontrará
clases interactivas, simulaciones guiadas y ejercicios.
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que
la excitación se consigue mediante la absorción de fo-
tones. Como consecuencia, se alude a menudo a los
dos fenómenos con el término más general de fotolu-
miniscencia. Como se verá más adelante en este mis-
mo capítulo, las transiciones energéticas electrónicas
que causan la fluorescencia no cambian el espín del elec-
trón. Por esta razón, los estados excitados en los que
hay fluorescencia presentan vida corta (�10�5 s). En
cambio, las emisiones de fosforescencia están acom-
pañadas por un cambio en el espín del electrón, y los
tiempos de vida de los estados excitados son mucho
más largos, con frecuencia del orden de segundos o
hasta de minutos. En la mayoría de los casos, la fotolu-
miniscencia, tanto si es de fluorescencia como de fosfo-
rescencia, se presenta a longitudes de onda más largas
que las de la radiación que se utiliza para la excitación.
El tercer tipo de luminiscencia, la quimioluminiscen-
cia, se basa en la radiación que emite una especie exci-
tada que se forma en el curso de una reacción química.
En algunos casos, la especie excitada es el producto de
una reacción entre el analito y un reactivo adecuado,
casi siempre un oxidante fuerte como el ozono o el
peróxido de hidrógeno. El resultado es el espectro de
emisión característico del producto de oxidación del
analito o del reactivo, en lugar del espectro del analito.
En otros casos, el analito no participa directamente 
en la reacción quimioluminiscente, más bien inhibe o
ejerce un efecto catalítico en una reacción quimiolu-
miniscente.
La medición de la intensidad de la fotoluminiscencia
o de la quimioluminiscencia facilita la determinación
cuantitativa de un conjunto de especies inorgánicas y
orgánicas importantes cuando están presentes en canti-
dades de trazas. En la actualidad, el número de métodos
fluorométricos es mucho más grande que la cantidad
de aplicaciones de los procedimientos fosforescentes y
quimioluminiscentes.
Uno de los aspectos más interesantes de los méto-
dos luminiscentes es su inherente sensibilidad, con lí-
mites de detección que son casi siempre de uno a tres
órdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la
espectroscopía por absorción. En efecto, en el caso 
de especies seleccionadas en condiciones controladas,
se han detectado moléculas únicas mediante espectros-
copia por fluorescencia. Otra ventaja de los métodos
fotoluminiscentes radica en sus amplios intervalos de
linealidad, que también son a menudo significativa-
mente mayores que los de los métodos de absorción.
Puesto que los estados excitados son muy susceptibles
de ser inactivados por colisiones u otros procesos, mu-
chas moléculas no manifiestan fluorescencia o fosfo-
rescencia. Debido a tales procesos de desactivación, los
métodos luminiscentes cuantitativos están sometidos a
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400 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia
1Si desea estudiar más sobre la teoría y las aplicaciones de la fluorescen-
cia, fosforescencia y luminiscencia, véase J. R. Lakowicz, Principles of
Fluorescence Spectroscopy, 2a. ed., Nueva York: Kluwer Academic Pu-
blishing/Plenum Press, 1999; Molecular Luminescence Spectroscopy, S.
Schulman, ed., Nueva York: Wiley, parte I, 1985; parte 2, 1988, parte 3,
1993; E. L. Wehry en Physical Methods of Chemistry, 2a. ed., volumen 
VIII, capítulo 3, B. W. Rossiter y R. C. Baetzold, eds., Nueva York: Wiley,
1993; G. G. Guilbault, Practical Fluorescence, 2a. ed., Nueva York: Marcel
Dekker, 1990.
graves efectos de interferencia. Por esta razón, las me-
diciones de luminiscencia se combinan con técnicas de
separación como cromatografía y electroforesis. Los
detectores de fluorescencia son en particular valio-
sos como detectores para cromatografía de líquidos
(capítulo 28) y electroforesis capilar (capítulo 30).
En general, los métodos luminiscentes se aplican
menos en el análisis cuantitativo que los métodos por
absorción porque la cantidad de especies que absor-
ben radiación ultravioleta/visible es mucho mayor que
la de especies que manifiestan fotoluminiscencia tras la
absorción de radiación en esta región del espectro.1
15A TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA 
Y LA FOSFORESCENCIA
La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos ga-
seosos, líquidos y sólidos, tanto sencillos como com-
plejos. El tipo más sencillo de fluorescencia es el que
manifiestan los vapores atómicos diluidos, tema que se
trata en el capítulo 9. Por ejemplo, los electrones 3s
de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excita-
dos para pasar al estado 3p cuando absorben radiación
de longitudes de onda de 589.6 y 589.0 nm. Después de
10�8 s, los electrones vuelven al estado fundamental
emitiendo radiación de estas dos mismas longitudes de
onda en todas las direcciones. Este tipo de fluorescen-
cia, en la cual la radiación absorbida se vuelve a emitir
sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de
resonancia o fluorescencia de resonancia.
Muchas especies moleculares también presentan
fluorescencia de resonancia, pero lo más frecuente es
encontrar bandas de fluorescencia o de fosforescencia
molecular centradas en longitudes de onda más largas
que la línea de resonancia. Este desplazamiento hacia
longitudes de onda más largas, o menores energías, se
denomina desplazamiento Stokes (véase sección 6C.6).
15A.1 Estados excitados que producen
fluorescencia y fosforescencia
Las características de los espectros de fluorescencia y
fosforescencia se pueden explicar mediante las consi-
deraciones que se explican en la sección 14B.1 sobre
orbitales moleculares. Sin embargo, para comprender la
diferencia entre los dos fenómenos fotoluminiscentes
se requiere un repaso sobre el espín del electrón y las
diferencias entre los estados excitados sencillo/triple.
Espín del electrón
El principio de exclusión de Pauli establece que no
puede haber dos electrones en un átomo cuyos cuatro
números cuánticos sean iguales. Esta restricción re-
quiere que no haya más de dos electrones en un orbital
y, además, el espín de cada uno debe ser opuesto al del
otro. En estas condiciones, se dice que los espines es-
tán apareados o emparejados. Debido al empareja-
miento de los espines, la mayoría de las moléculas no
presenta un campo magnético neto, por eso se dice 
que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni re-
pelidas por campos magnéticos estáticos. Por el con-
trario, los radicales libres, que contienen electrones
desemparejados, poseen un momento magnético y, por
consiguiente, los atrae un campo magnético. Por eso 
se dice que los radicales libres son paramagnéticos.
Estados excitados sencillo/triple
Un estado electrónico de una molécula en el cual to-
dos los espines de los electrones están emparejados se
llama estado sencillo y cuando la molécula se expone a
un campo magnético no se produce una división de ni-
veles energéticos. Por otro lado, el estado fundamen-
tal de un radical libre es un estado doble, porque hay
dos orientaciones posibles que puede tomar el elec-
trón impar en un campo magnético, lo cual propor-
ciona ligeras diferencias de energía al sistema.
Cuando uno de un par de electrones de una mo-
lécula es excitado y pasa a un nivel de energía superior,
se forma un estado sencillo o triple. En el estado sen-
cillo excitado, el espíndel electrón promocionado 
continúa emparejado con el electrón del estado funda-
mental. Pero en el estado triple, los espines de los dos
electrones ya no forman una pareja y, por tanto, son
paralelos, es decir, tienen la misma dirección. Estos es-
tados se pueden representar como se observa en la
figura 15.1, donde las flechas representan la dirección
del espín. La nomenclatura de sencillo, doble y triple
procede de consideraciones espectroscópicas de mul-
tiplicidad, que en este caso no interesan. Observe que
el estado triple excitado es menos energético que el
correspondiente estado sencillo excitado.
Las propiedades de una molécula en el estado triple
excitado difieren de manera significativa de las del es-
tado sencillo excitado. Por ejemplo, una molécula es
paramagnética en el estado triple y diamagnética en el
sencillo. Lo más importante es el hecho de que una
transición sencillo a triple, o viceversa, que también su-
pone un cambio en el estado electrónico, es un suceso
significativamente menos probable que la correspon-
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15A Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia 401
triple excitado, y las bandas de absorción debidas a
este proceso son varios órdenes de magnitud menos 
intensos que los correspondientes a las transiciones
análogas sencillo a sencillo. Más adelante se verá que,
en ciertas moléculas, un estado triple excitado puede
poblarse a partir de un estado sencillo excitado. Con
frecuencia, la emisión de fosforescencia es el resul-
tado de dicho proceso.
Diagramas de nivel de energía para 
las moléculas fotoluminiscentes
La figura 15.2 es un diagrama parcial de niveles de ener-
gía, llamado diagrama de Jablonski, para una molécula
fotoluminiscente típica. La línea horizontal gruesa que
se encuentra en la parte inferior de la figura representa
la energía del estado fundamental de la molécula, que
normalmente está en estado sencillo y se designa S0. A
temperatura ambiente, este estado representa la ener-
gía de la mayor parte de las moléculas en una solución.
Las líneas gruesas superiores son los niveles de ener-
gía de los estados vibracionales fundamentales de tres
estados electrónicos excitados. Las dos líneas situa-
das a la izquierda representan los estados electróni-
cos sencillo primero (S1) y segundo (S2). La línea de la
derecha (T1) representa la energía del primer estado
electrónico triple. Como suele ocurrir, la energía del
primer estado triple excitado es menor que la energía
del correspondiente estado sencillo.
Estado sencillo
excitado
b)
Estado
excitado triple
c)
Estado sencillo
fundamental
a)
FIGURA 15.1 Estados electrónicos del espín de moléculas.
En a) se ilustra el estado electrónico fundamental. En 
el estado energético más bajo, es decir, el fundamental, los
espines siempre están emparejados, por lo que se dice que
el estado es sencillo. En b) y c) se muestran los estados
electrónicos excitados. b) Si los espines siguen formando
pareja en el estado excitado, la molécula está en un estado
excitado sencillo. c) Si los espines ya no están empare-
jados, la molécula está en un estado excitado triple.
Estados excitados sencillos Estado excitado triple
2 l �r r 3 4
E
ne
rg
ía
Relajaciones
vibracionales
Conversión
interna
Cruce
intersistemas
T1
S0
S1
S2
Estado
fundamental
Conversión
interna
y externa
Absorción Fluorescencia Fosforescencia
Relajación
vibracional
l l l l l l
FIGURA 15.2 Diagrama parcial de los niveles de energía para un sistema fotoluminiscente.
diente transición sencillo a sencillo. Por tanto, el tiempo
de vida medio de un estado triple excitado dura a ve-
ces desde 10�4 hasta varios segundos, mientras que el
tiempo de vida medio para un estado sencillo excitado
es de �10�8. Además, es baja la probabilidad de que
tenga lugar la excitación inducida por radiación de 
una molécula en el estado fundamental a un estado
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Tal como lo sugieren las rectas horizontales finas,
con cada uno de los cuatro estados electrónicos están
asociados numerosos niveles de energía vibracionales.
Como muestra la figura 15.2, las transiciones de absor-
ción ocurren desde el estado fundamental electrónico
sencillo (S0) hacia varios niveles vibracionales de esta-
dos electrónicos sencillos excitados (S1 y S2). Observe
que no se muestra la excitación directa hacia el estado
triple. Puesto que en esta transición hay un cambio en
la multiplicidad, tiene una baja probabilidad de suce-
der. Una transición de probabilidad baja de este tipo 
se llama transición prohibida.
Las moléculas excitadas hacia los estados electró-
nicos S1 y S2 pierden con rapidez el exceso de energía
vibracional y se relajan, con lo que adquieren el ni-
vel vibracional fundamental de ese estado electrónico.
Este proceso en el que no hay radiación se denomina
relajación vibracional.
15A.2 Velocidades de absorción y de emisión
La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación
es enorme, y su valor es del orden de 10�14 a 10�15 s.
Por otro lado, la emisión fluorescente tiene lugar a una
velocidad significativamente más baja. Por lo regular,
la fluorescencia se presenta en 10�5 a 10�10 s. Como ya
se señaló, la velocidad promedio de una transición triple
a sencillo es menor que la correspondiente transición
sencillo a sencillo. Entonces, para que haya emisión fos-
forescente se requieren tiempos comprendidos entre
10�4 y 10 s o más.
15A.3 Procesos de desactivación
Una molécula excitada puede volver a su estado fun-
damental mediante una combinación de varias etapas
mecánicas. Como lo muestran las flechas verticales
rectas con punta hacia abajo de la figura 15.2, dos de
estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, requieren
la emisión de un fotón de radiación. Las otras etapas
de desactivación, indicadas por flechas onduladas, son
procesos no radiantes. El camino más propicio hacia el
estado fundamental es aquel que reduce al mínimo 
el tiempo de vida del estado excitado. Por consiguien-
te, si la desactivación por fluorescencia es más rápida
que los procesos no radiantes, se observa tal emisión.
En cambio, si una trayectoria no radiante tiene una
constante de velocidad más favorable, no hay fluores-
cencia o es menos intensa.
La fotoluminiscencia está limitada a sistemas con
características estructurales y ambientales que hacen
que la velocidad de los procesos de relajación o desac-
tivación no radiantes disminuya hasta el punto en el que
el proceso de emisión pueda competir cinéticamente 
con ellos. Respecto a la cuestión cuantitativa, se entien-
den bien los procesos de emisión, pero apenas se em-
piezan a comprender los procesos de desactivación.
Relajación vibracional
Como se muestra en la figura 15.2, una molécula puede
ser promovida para llegar a cualquiera de los diversos
niveles vibracionales durante el proceso de excitación
electrónico. Las colisiones entre moléculas de las espe-
cies excitadas y las del solvente ocasionan una trans-
ferencia de energía rápida y un incremento minúsculo
de la temperatura del solvente. La relajación vibra-
cional es tan eficaz que el tiempo de vida medio de una
molécula excitada en forma vibracional es 10�12 s o
menos, un periodo significativamente más corto que el
tiempo de vida medio de un estado excitado con me-
dios electrónicos. Como consecuencia, la fluorescencia
de una solución siempre involucra una transición
desde el nivel vibracional más bajo de un estado electró-
nico excitado. Sin embargo, se producen varias líneas
de emisión muy próximas, y la transición puede fina-
lizar en cualquiera de los niveles vibracionales del es-
tado fundamental (figura 15.2).
Una consecuencia de la eficacia de la relajación vi-
bracional es que la banda de fluorescencia para una
transición electrónica dada se desplaza hacia menores
frecuencias o longitudes de onda más largas respecto 
a la banda de absorción (el desplazamiento Stokes). El
traslape sólo tiene lugar en el pico de resonancia re-
lacionadocon transiciones entre el nivel vibracional
más bajo del estado fundamental y el nivel corres-
pondiente de un estado excitado. En la figura 15.2 la
longitud de onda de la radiación absorbida que pro-
duce el pico de resonancia lr se representa como lr� .
Conversión interna
Con esta expresión se describen los procesos intermo-
leculares por los cuales la molécula pasa a un estado
electrónico de más baja energía sin emitir radiación.
Estos procesos ni están bien definidos ni se entienden
bien, pero es evidente que son muy eficaces.
La conversión interna es un cruce entre dos estados
de la misma multiplicidad (sencillo-sencillo o triple-
triple). Es eficaz en particular cuando dos niveles de
energía electrónicos están lo suficientemente próxi-
mos como para que haya traslape de los niveles de ener-
gía vibracional. Esta situación es la que se ilustra en la
figura 15.2 para los dos estados sencillos excitados S2 y
S1. En los traslapes que se muestran, las energías po-
tenciales de los dos estados excitados son idénticas, lo
cual facilita un cruce eficaz desde S2 y S1. Asimismo, la
conversión interna ocurre entre el estado S1 y el esta-
do electrónico fundamental S0. Por lo regular, es más
probable la conversión interna a través de niveles vi-
bracionales traslapados que la pérdida de energía por
fluorescencia a partir de un estado excitado superior.
Por consiguiente, en referencia de nuevo a la figura
15.2, la excitación producida por la banda de radiación
402 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia
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llamada l2 produce casi siempre una banda de fluores-
cencia centrada en una longitud de onda l3 con ex-
clusión de una banda que resultaría de una transición
ente S2 y S0. En este caso, la molécula excitada pasa del
estado electrónico superior al estado vibracional más
bajo del estado electrónico excitado más bajo mediante
una serie de relajaciones vibracionales, una conversión
interna y relajaciones posteriores. En estas circunstan-
cias, la fluorescencia tiene lugar sólo en l3 sin importar
que las radiaciones de longitud de onda l1 o l2 sean las
responsables de la excitación. La quinina proporciona
un ejemplo clásico de este tipo de comportamiento
(véase problema 15.13). Esta sustancia, presente en 
la naturaleza, posee dos bandas de excitación analíti-
camente útiles, una centrada en 250 nm y la otra en 
350 nm. Sin importar qué longitud de onda se utilice
para excitar la molécula, la longitud de onda del máxi-
mo de emisión es 450 nm (véase figura 15.3).
Los mecanismos del proceso de conversión interna
S1 S S0 que se muestran en la figura 15.2 aún no se
comprenden del todo. En el caso de algunas molécu-
las, los niveles vibracionales del estado fundamental se
superponen con los del primer estado electrónico exci-
tado, y la desactivación ocurre con rapidez por el me-
canismo antes descrito. Esta situación prevalece en los
compuestos alifáticos, por ejemplo, y explica el hecho
de que estas especies rara vez emitan fluorescencia. En
esta clase de compuestos, la desactivación por trans-
ferencia de energía a través de los niveles vibracionales
superpuestos tiene lugar tan rápido que no hay tiempo
para que ocurra la fluorescencia.
Asimismo, la conversión interna podría ocasionar
el fenómeno de la predisociación. En este caso, el elec-
trón se mueve desde un estado electrónico superior a
un nivel vibracional superior de un estado electrónico
más bajo, en el que la energía vibracional es lo sufi-
cientemente grande como para provocar la rotura de
un enlace. Las moléculas grandes tienen mayor proba-
bilidad de contener enlaces con fuerzas menores a la
energía de excitación electrónica de los cromóforos.
La rotura de estos enlaces puede ser consecuencia de
la absorción por un cromóforo, seguida de la conver-
sión interna de la energía electrónica en energía vibra-
cional asociada con el enlace débil.
La predisociación debe distinguirse de la disociación,
ya que en esta última la radiación absorbida excita de
manera directa al electrón de un cromóforo para que
llegue a un nivel vibracional suficientemente alto para
producir la rotura del enlace del cromóforo. En este
caso, no interviene la conversión interna. Los procesos
de disociación también compiten con el proceso de fluo-
rescencia.
Conversión externa
La desactivación de un estado electrónico excitado
puede comprender la interacción y la transferencia de
energía entre la molécula excitada y el solvente u otros
solutos. Estos procesos se llaman conversión externa.
Entre la evidencia de la conversión externa se encuentra
el marcado efecto que ejerce el solvente en la inten-
sidad de la fluorescencia de la mayor parte de las es-
pecies. Además, aquellas condiciones que tienden a
reducir la cantidad de colisiones entre partículas (baja
temperatura y elevada viscosidad) tienden por lo ge-
neral a aumentar la fluorescencia. Los detalles de los
procesos de conversión externa se desconocen aún.
15A Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia 403
200 250 300 350 400
Excitación
In
te
ns
id
ad
 r
el
at
iv
a
Emisión
Longitud de onda, nm
450 500 550 600
FIGURA 15.3 Excitación de fluorescencia y
espectros de emisión de una solución de
quinina.
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Es probable que las transiciones sin radiación al es-
tado fundamental desde los estados excitados sencillo
y triple más bajos (figura 15.2) requieran tanto conver-
siones externas como internas.
Cruce entre sistemas
El cruce entre sistemas es un proceso en el cual hay un
cruce entre estados electrónicos de multiplicidad dis-
tinta. El proceso más común es del estado sencillo al
estado triple (S1 S T1) como se muestra en la figura
15.2. Como con la conversión interna, la probabilidad
del cruce entre sistemas aumenta si los niveles vibra-
cionales de los dos estados se superponen. Observe que
en el cruce sencillo-triple que se muestra en la figura
15.2 el nivel vibracional sencillo más bajo se superpone
a uno de los niveles vibracionales triples más elevados,
por lo que es más probable un cambio de espín.
El cruce entre sistemas es más común en moléculas
que contienen átomos pesados, como el yodo o el bro-
mo (efecto del átomo pesado). Las interacciones espín-
orbital aumentan en presencia de tales átomos y, de ese
modo, se favorece un cambio en el espín. La presencia
de especies paramagnéticas, como el oxígeno molecu-
lar, en la solución también favorece el cruce entre sis-
temas y, por consiguiente, disminuye la fluorescencia.
Fosforescencia
La desactivación de estados electrónicos excitados tam-
bién puede ser causada por la fosforescencia. Después
del cruce entre sistemas para lograr un estado triple
excitado, la desactivación posterior puede tener lugar
por conversión interna o externa o por fosforescencia.
Una transición triple S sencilla es mucho menos pro-
bable que una conversión sencilla-sencilla. La proba-
bilidad de la transición y el tiempo de vida del estado
excitado son inversamente proporcionales. Por tanto,
el tiempo de vida promedio de un estado triple exci-
tado respecto a la emisión es grande y varía desde 10�4
a 10 s o más. La emisión causada por una transición de
este tipo podría persistir durante algún tiempo des-
pués de que la irradiación se haya interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con
tanto éxito con la fosforescencia que este tipo de emi-
sión se observa en forma común sólo a temperaturas
bajas en medios altamente viscosos o al aplicar técni-
cas especiales para proteger el estado triple.
15A.4 Variables que afectan la fluorescencia y
la fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno químico
determinan que una sustancia sea o no luminiscente.
Estos factores también determinan la intensidad de
emisión cuando tiene lugar la luminiscencia. En esta
sección se tratan brevemente los efectos de algunas de
estas variables.
Rendimiento cuántico 
El rendimiento cuántico o la eficaciacuántica de la fluo-
rescencia o la fosforescencia es simplemente la rela-
ción entre la cantidad de moléculas que manifiestan 
luminiscencia y el número total de moléculas excitadas.
En el caso de una molécula muy fluorescente como la
fluoresceína, la eficacia cuántica, en determinadas con-
diciones, se aproxima a la unidad. Las especies quími-
cas que no presentan fluorescencia apreciable tienen
eficacias que se aproximan a cero.
La figura 15.2 y el análisis sobre los procesos de de-
sactivación sugieren que el rendimiento cuántico de
fluorescencia f de un compuesto se puede calcular a
partir de las constantes de velocidad relativas kx para
los procesos por los cuales queda inactivo el estado
sencillo excitado más bajo. Estos procesos son fluores-
cencia (kf), cruce entre sistemas (ki), conversión exter-
na (kec), conversión interna (kic), predisociación (kpd),
y disociación (kd). Es posible expresar estas relaciones
mediante la ecuación
(15.1)
donde los términos k son las constantes de velocidad
respectivas para los diversos procesos de desactivación.
La ecuación 15.1 facilita una interpretación cuali-
tativa de muchos de los factores estructurales y del 
entorno que influyen en la intensidad de la fluorescen-
cia. Aquellas variables que originan valores altos para
la constante de velocidad de la fluorescencia kf y va-
lores bajos para los otros términos kx intensifican la
fluorescencia. La magnitud de kf, la constante de velo-
cidad de la predisociación kpd, y la constante de veloci-
dad de la disociación kd dependen principalmente de
la estructura química; el resto de las constantes están
fuertemente influenciadas por el entorno y, en menor
medida, por la estructura.
Tipos de transiciones en fluorescencia
Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es
consecuencia de la absorción de radiación ultraviole-
ta de longitud de onda menor a 250 nm, porque tal 
radiación es suficientemente energética como para 
desactivar los estados excitados por predisociación o
disociación. Por ejemplo, una radiación de 200 nm co-
rresponde a alrededor de 140 kcal/mol. La mayor par-
te de las moléculas tiene por lo menos algunos enlaces
que se pueden romper con energías de esta magnitud.
Por consiguiente, rara vez se observa fluorescencia 
debida a transiciones . En cambio, este tipo de
emisión está confinada a los procesos menos energéti-
cosp* Sp yp* S n.
s* S s
f �
kf
kf � ki � kec � kic � kpd � kd
404 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia
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Como ya se hizo notar, una molécula excitada elec-
trónicamente regresa a su estado excitado más bajo me-
diante una serie de relajaciones vibracionales rápidas y
conversiones internas que no producen emisión de ra-
diación. Por tanto, la fluorescencia más común surge a
partir de una transición desde el nivel vibracional más
bajo del primer estado electrónico excitado a uno de
los niveles vibracionales del estado electrónico funda-
mental. Por lo que se refiere a la mayoría de los com-
puestos fluorescentes, la radiación se produce por una
transición p* S n o p* S p dependiendo de cuál de
ellas es la menos energética.
Eficacia cuántica y tipo de transición
Se observó empíricamente que la fluorescencia se en-
cuentra con más frecuencia en los compuestos en los
que la transición de más baja energía es del tipo pSp*
(p, estado sencillo excitado p*) que en compuestos 
en los que la transición de menor energía es del tipo 
n S p* (n, estado sencillo excitado p*); es decir, la efi-
cacia cuántica es mayor para las transiciones p* S p.
La mayor eficacia cuántica asociada con el estado p,
p* se puede explicar de dos maneras. Primero, la 
absortividad molar de una transición p S p* es nor-
malmente de 100 a 1000 veces superior que la de un
proceso n S p* y este valor representa una medida de
la probabilidad de la transición. Por consiguiente, el
tiempo de vida inherente asociado con el estado p, p*
es más corto (10�7 a 10�9 s comparado con 10�5 a 10�7 s
para un estado n, p*) y es mayor kf en la ecuación 15.1.
Con frecuencia, la fosforescencia más eficaz ocurre
a partir del estado excitado n, p* el cual tiende a ser
más corto en cuanto a vida y, por tanto, menos suscep-
tible a la desactivación que un estado triple p, p*.
Asimismo, el cruce entre sistemas es menos probable
para estados excitados p, p* que para estados n, p*
porque la diferencia en energía entre los estados sen-
cillo y triple es mayor y el acoplamiento espín-órbita es
menos probable.
En resumen, la fluorescencia se relaciona más con
el estado p, p* porque tales estados excitados mani-
fiestan tiempos de vida relativamente cortos (kf es
mayor) y porque es menos probable que tengan lugar
los procesos de desactivación que compiten con la 
fluorescencia.
Fluorescencia y estructura
La fluorescencia más intensa y la más útil es la de los
compuestos que contienen grupos funcionales aromáti-
cos con transicionespSp* de baja energía. Los com-
puestos que contienen grupos carbonilo en estructuras
alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces
altamente conjugados también presentan fluorescen-
cia, pero la cantidad de estos compuestos es pequeña
comparada con el número de sistemas aromáticos.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no
sustituidos son fluorescentes en solución; la eficacia
cuántica aumenta de ordinario en relación con la can-
tidad de anillos y con su grado de condensación. Los
heterocíclicos sencillos, como la piridina, el furano, el
tiofeno y el pirrol,
no presentan fluorescencia. Por otro lado, las estructu-
ras de anillo condensado por lo regular sí son fluores-
centes. En los heterocíclicos con nitrógeno, se supone
que la transición electrónica de más baja energía 
requiere un sistema n S p* que rápidamente se trans-
forma en un estado triple e impide la fluorescencia. La
condensación de anillos bencénicos para dar núcleos
heterocíclicos, da como resultado un aumento en la ab-
sortividad molar de la banda de absorción. En estas es-
tructuras el tiempo de vida del estado excitado es más
corto, y la fluorescencia se observa en compuestos co-
mo quinolina, isoquinolina e indol.
La sustitución en el anillo bencénico provoca des-
plazamientos en la longitud de onda de los máximos de
absorción y cambios correspondientes en la emisión 
de fluorescencia. Además, la sustitución afecta con fre-
cuencia la eficacia cuántica. Algunos de estos efectos
se ilustran con los datos de los derivados del benceno
que se proporcionan en la tabla 15.1.
La influencia de la sustitución de halógenos es sor-
prendente. La disminución de la fluorescencia con el
aumento de la masa molar del halógeno es un ejemplo
del efecto del átomo pesado (que ya se mencionó en 
la sección “Cruce entre sistemas”), el cual aumenta la
probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el es-
tado triple. Se supone que la predisociación desem-
N
H
indol
N
isoquinolina
N
quinolina
H
O
S
piridina furano
N
N
tiofeno pirrol
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peña un papel importante tanto en el yodobenceno
como en los nitroderivados, porque estos compuestos
tienen enlaces que se rompen con facilidad y que son
capaces de absorber la energía de excitación que si-
gue a la conversión interna.
Por lo general, la sustitución de un ácido carboxíli-
co o de un grupo carbonilo en un anillo aromático in-
hibe la fluorescencia. En estos compuestos, la energía
de la transición n Sp* es menor que la de la transición
pSp* y como ya se señaló antes, el rendimiento de 
la fluorescencia procedente de los sistemas n Sp* es
normalmente bajo.
Efecto de la rigidez estructural
Desde el punto de vista empírico, se tiene que la fluo-
rescencia se ve favorecida sobre todo en moléculas que
poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias
cuánticas para el fluoreno y el bifenilo son de casi 1.0 
y 0.2, respectivamente, en condiciones de mediciónsimilares. La diferencia en el comportamiento se debe
en gran medida a un aumento en la rigidez gracias al
puente que forma el grupo metileno en el fluoreno. Se
pueden citar muchos ejemplos similares.
También se ha recurrido a la influencia de la rigidez
estructural para explicar el aumento de la fluorescen-
bifenilo
C
H2
fluoreno
cia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando for-
man un complejo con un ion metálico. Por ejemplo, la
intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es
mucho menor que la de su complejo con cinc:
La falta de rigidez de una molécula tal vez cause un
aumento de la velocidad de conversión interna (kic de
la ecuación 15.1), y el correspondiente aumento en la
probabilidad de desactivación sin radiación. Una par-
te de una molécula no rígida puede sufrir vibraciones
de baja frecuencia respecto a sus otras partes. Dichos
movimientos explican sin duda ciertas pérdidas de 
energía.
Efectos de la temperatura y del solvente
La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en la
mayoría de las moléculas al subir la temperatura, por-
que al aumentar la frecuencia de las colisiones cuan-
do la temperatura es elevada aumenta la probabilidad
de desactivación por conversión externa. Una dismi-
nución en la viscosidad del solvente aumenta también
la probabilidad de conversión externa y ocasiona el
mismo resultado.
O
Zn
2
N
406 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia
TABLA 15.1 Efecto de la sustitución en la fluorescencia del benceno.
Longitud de onda de Intensidad de 
Compuesto Fórmula la fluorescencia, nm fluorescencia relativa
Benceno C6H6 270 –310 10
Tolueno C6H5CH3 270 –320 17
Propilbenceno C6H5C3H7 270 –320 17
Fluorobenceno C6H5F 270 –320 10
Clorobenceno C6H5Cl 275–345 7
Bromobenceno C6H5Br 290 –380 5
Yodobenceno C6H5I — 0
Fenol C6H5OH 285–365 18
Ion fenolato C6H5O
� 310 – 400 10
Anisol C6H5OCH3 285–345 20
Anilina C6H5NH2 310 – 405 20
Ion anilinio C6H5NH3
� — 0
Ácido benzoico C6H5COOH 310 –390 3
Benzonitrilo C6H5CN 280 –360 20
Nitrobenceno C6H5NO2 — 0
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N
H H
N
H H
+
N
H H
+
N+
H H
H
–
–
formas resonantes de la anilina ion anilinio
La fluorescencia de una molécula disminuye en pre-
sencia de solventes que contienen átomos pesados o de
solutos con dichos átomos en su estructura; algunos
ejemplos son el tetrabromuro de carbono y el yoduro
de etilo. El efecto es similar al que se observa cuando
se introducen por sustitución átomos pesados en com-
puestos fluorescentes; las interacciones espín-orbital
dan como resultado un aumento en la velocidad de for-
mación del triplete y en la correspondiente disminución
de la fluorescencia. Con frecuencia, cuando se desea
resaltar la fosforescencia, se incorporan a los disol-
ventes compuestos que contienen átomos pesados.
Efecto del pH en la fluorescencia
Por lo regular, la fluorescencia de un compuesto aro-
mático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo
depende del pH. Es probable que tanto la longitud de
onda como la intensidad de emisión sean diferentes en
las formas protonadas y no protonadas del compuesto.
En la tabla 15.1 se ilustra este efecto con datos para el
fenol y la anilina. Los cambios en la emisión de com-
puestos de este tipo se producen por el distinto núme-
ro de especies resonantes que están relacionadas con
las formas ácidas y básicas de las moléculas. Por ejem-
plo, la anilina tiene varias formas resonantes, pero el
ion anilinio sólo tiene una. Es decir,
de la constante de la misma especie en el estado funda-
mental. Los cambios en las constantes de disociación
de ácidos y bases con la excitación son comunes, y al-
gunas veces son mayores hasta en cuatro o cinco ór-
denes de magnitud. Estas observaciones sugieren que
los procedimientos analíticos basados en la fluorescen-
cia requieren a menudo un control minucioso del pH.
Con frecuencia, la presencia de oxígeno disuelto re-
duce la intensidad de la fluorescencia de una solución.
Este efecto podría ser el resultado de una oxidación,
inducida fotoquímicamente, de las especies fluorescen-
tes. Pero lo más común es que la supresión (quenching)
se presente como una consecuencia de las propiedades
paramagnéticas del oxígeno molecular, lo cual impulsa
el cruce entre sistemas y la conversión de moléculas
excitadas en el estado triple. Otras especies paramag-
néticas tienden también a atenuar la fluorescencia.
Efecto de la concentración en la intensidad 
de fluorescencia
La potencia de la emisión fluorescente F es proporcio-
nal a la potencia radiante del haz de excitación absor-
bido por el sistema. Es decir,
(15.2)
donde P0 es la potencia del haz que incide sobre la
solución, P es su potencia después de atravesar una
longitud b del medio, ff es la eficacia cuántica del pro-
ceso de fluorescencia y K� es una constante que de-
pende de las características geométricas y otros fac-
tores. La eficacia cuántica de la fluorescencia es una
constante de un sistema dado, y de este modo el pro-
ducto se agrupa en una nueva constante en el
segundo miembro de la ecuación 15.2. Con el objeto de
relacionar F con la concentración c de la especie fluo-
rescente, se escribe la ley de Beer en la forma
(15.3)
donde e es la absortividad molar de las moléculas fluo-
rescentes y ebc es la absorbancia A. Si se sustituye la
ecuación 15.3 en la ecuación 15.2, se obtiene
(15.4)
El término exponencial de la ecuación 15.4 se puede
desarrollar como una serie de Maclaurin en
(15.5)
Siempre que 2.303ebc � A � 0.05, todos los términos
posteriores entre corchetes son pequeños respecto al
�
12.303ebc 2 3
3!
� p d
F � K¿P0 c 2.303ebc � 12.303ebc 2 22!
F � K¿P011 � 10�ebc 2
P
P0
� 10�ebc
K¿ffK–
F � ffK–1P0 � P 2 � K¿1P0 � P 2
15A Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia 407
Las formas resonantes adicionales ocasionan un pri-
mer estado excitado más estable; la consecuencia es
una fluorescencia en la región ultravioleta.
La fluorescencia de ciertos compuestos en función
del pH se ha utilizado para detectar puntos finales en
titulaciones ácido-base. Por ejemplo, la fluorescencia
de la forma fenólica del ácido 1-naftol-4-sulfónico no
es detectable por el ojo humano, ya que se origina en
la región ultravioleta. Sin embargo, cuando el com-
puesto se transforma en ion fenolato con la adición de
una base, la banda de emisión se desplaza hacia longi-
tudes de onda de la región visible donde puede verse
con claridad. Es interesante resaltar que este cambio
ocurre a un pH diferente del pronosticado a partir de
la constante de disociación ácida del compuesto. La
explicación de esta discrepancia es que la constante de
disociación ácida para la molécula excitada difiere 
Simulación: aprenda más acerca de la espectros-
copia por luminiscencia.
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	Principios de análisis instrumental 
	Sección Tres. Espectroscopía molecular 
	Capítulo Quince. Espectrometría molecular por luminiscencia 
	15A Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia