Coloquio 1 - Automatizacion en hematología

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AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA
Los métodos más utilizados son impedancia (corriente directa), la focalización hidrodinámica, la dispersión lumínica (láser o polarizada), la fluorescencia y la radiofrecuencia. En función de su mayor o menor complejidad, los analizadores hematológicos modernos utilizan una combinación de los principios de análisis descriptos, lo que les permite ofrecer una información muy completa y precisa de un número variable de parámetros celulares sanguíneos.
La medida de la concentración de las células sanguíneas circulantes (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) suele realizarse simultáneamente con la del tamaño (volumen celular). Para ello, los analizadores hematológicos automatizados utilizan las variaciones que ejercen las células cuando atraviesan un campo electromagnético. Estas variaciones son captadas por detectores colocados estratégicamente y son procesados para obtener los correspondientes datos cuantitativos que luego se expresan en tablas, histogramas y dispersogramas.
Existen tres metodologías básicas para realizar estas mediciones, que pueden emplearse de forma individualizada o combinada, y son impedancia, dispersión lumínica y fluorescencia. Cada metodología aporta una ventaja a las demás y por ello suelen emplearse en forma combinada.
En general, la impedancia es el procedimiento más utilizado para la medida del volumen celular, y la dispersión lumínica constituye el método de elección para identificar las diferentes subpoblaciones leucocitarias. Esta metodología se ha combinado con otras como por ejemplo, la radiofrecuencia, la citoquímica (mieloperoxidasa y negro sudán principalmente), y la fluorescencia que aumenta enormemente la sensibilidad en la detección de las diferentes poblaciones leucocitarias.
MÉTODO DE LA IMPEDANCIA
Se basa en la resistencia que ofrecen las células (no conductoras) al paso de la corriente eléctrica cuando atraviesan un orificio de apertura que separa dos medios con diferente potencial. Así, cada vez que una célula atraviesa el orificio de apertura se produce un cambio de resistencia eléctrica (impulso) que es proporcional al volumen de electrolito desplazado. Los impulsos generados son, por lo tanto, directamente proporcionales al tamaño de la célula (volumen celular) y el número de células que atraviesa el orificio de apertura por unidad de tiempo es proporcional a su concentración en el medio electrolito. Por ende, es el método ideal para la medida del VCM.
Para conseguir un recuento correcto es necesario emplear siempre una diferencia de potencial continua (corriente directa) entre los dos electrodos situados a cada lado del orificio de apertura, y que las células sigan una trayectoria uniforme por el centro de la región sensible o detector. Para esto los analizadores hematológicos incorporan un sistema de enfoque hidrodinámico que obliga a las células a fluir hacia la región sensible con una trayectoria bien definida (en hilera) en el seno del electrolito. Con ello se evita que las células pasen por el borde del orificio de apertura o que, una vez atravesado retrocedan e interfieran en la lectura de las células que le siguen.
Dado que el volumen de la célula viene determinado por la amplitud del impulso que genera al pasar por la zona sensible, existen ciertos factores electrónicos que pueden influir en la medida, y que por ello, deben hallarse siempre bajo un estricto control.
· El diámetro del orificio de apertura, viene determinado por el propio analizador en función del tamaño de las células que deben analizarse. es fundamental que el orificio de apertura se halle siempre en un perfecto estado de permeabilidad. Este factor está muy bien controlado gracias a la incorporación de mecanismos que impiden el depósito de sustancias capaces de adherirse a los bordes del orificio y reducir su diámetro (resistencia eléctrica alrededor del orificio de apertura, sistemas de lavado automático).
· La intensidad de la corriente que existe entre ambos electrodos debe ser continua y suficientemente sensible, para detectar la resistencia que genera la célula cuando pasa por la región sensible del orificio de apertura. Si fuera excesiva podría llegar a dañar las células y producir interferencias.
· La dilución de las células objeto de análisis, siempre debe ser constante con el fin de evitar el error de coincidencia o defecto en el recuento, cuando varias células atraviesan el orificio de apertura al mismo tiempo.
RBC y Plaquetas se cuentan juntos y se separan por la altura de los pulsos.
MÉTODO DE LA DISPERSIÓN LUMÍNICA
La interacción de la luz con una célula modifica su dirección pero no su longitud de onda, produciendo una dispersión de la misma en todas las direcciones del espacio. la dispersión de la luz es algo más complejo que la impedancia ya que, además del tamaño y la concentración de las células, permite analizar la complejidad de la estructura celular (por ejemplo, granularidad, características del núcleo) y de esta forma diferenciarlas entre sí como si se tratara de un examen morfológico. Debido a ello, éste procedimiento es el de elección para la automatización de la fórmula leucocitaria, en el que las células deben diferenciarse por su diferente composición estructural, además de su tamaño. 
El método consiste en analizar el efecto que ejercen las células de la sangre sobre un haz de luz monocromática de alta intensidad (laser). Los emisores láser más empleados son los de helio-neón (atómicos), argón-kriptón (iónicos) y helio-cadmio (moleculares), aunque más recientemente se han empezado a introducir los basados en semiconductores (láser diodo). Los que se utilizan para el recuento celular utilizan una longitud de onda fija (casi siempre 488 nm). 
Al igual que en el método de la impedancia, la sensibilidad y la exactitud de la lectura depende de que las células en suspensión fluyan por un núcleo central sin mezclarse con el líquido de arrastre (flujo en hilera). El lugar donde se produce el encuentro entre las células y el haz de luz láser es la cámara de flujo. Una vez en su interior, mediante enfoque hidrodinámico son alineadas de manera que queden bien centradas en relación con el haz de láser para poder ser analizadas individualmente, lo cual resulta imprescindible para la correcta definición de cada población celular. Además, el punto en el que el láser incide sobre las células debe ser siempre el mismo.
Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz láser se produce una interrupción del paso de fotones o sombra que es proyectada sobre un detector de campo oscuro, y una dispersión del propio haz que se difracta (cambia de sentido por efecto de la superficie celular), refracta (cambia de velocidad por efecto de las estructuras celulares) y refleja (invierte el sentido por efecto de las estructuras opacas). La suma de todos estos efectos es la dispersión lumínica. 
Dos parámetros físicos de las células son cuantificados con base en la dispersión de la luz. La dispersión frontal (forward scattering), que correlaciona principalmente con su tamaño, y la dispersión lateral (side scattering), a 90°, que correlaciona mayormente con su granularidad, o complejidad de la superficie.
La combinación de dispersión lateral (complejidad celular), dispersión frontal (tamaño) de las células nucleadas proporciona una imagen precisa y concisa de cada célula sanguínea detectada. Este análisis tridimensional de las células sanguíneas proporciona una precisión y exactitud únicas.
Diferentes metodologías en función del equipo
1. Algunos equipos incorporan la tinción fluorescente de células en sangre periférica para la diferenciación de leucocitos en el análisis de rutina. La tecnología de fluorescencia permite diferenciar confiablemente las poblaciones normales de las poblaciones anormales de leucocitos. Además, la sensibilidad del uso de la citometría de flujo fluorescente proporciona al laboratorio un alto nivel de confianza en el reporte exacto de diferenciales de glóbulos blancos. Cuando se enfoca luz sobre un material fluorescente,por ejemplo células sanguíneas teñidas, se produce luz con una longitud de onda mayor que la de la luz original. La intensidad de la luz fluorescente aumenta con la concentración del agente de tinción. Estos equipos detectan la luz fluorescente emitida lateralmente en conjunto con la luz dispersa frontal y lateral.
2. Otros equipos incorporan luz polarizada (sistema MAPSS), que realiza la separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos. La muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular, por el que pasa una fuente de luz centrada, un láser de helio-neón polarizado en sentido vertical. La luz dispersa se mide en varios ángulos, la dispersión frontal de la luz de 0° se utiliza para determinar el tamaño celular, la dispersión ortogonal de 90° para determinar la lobularidad celular, la dispersión de la luz en ángulo estrecho de 10° se correlaciona con la complejidad celular, y la dispersión de la luz despolarizada de 90° (90°D) para evaluar la granularidad celular.
La dispersión ortogonal de la luz es dividida, con una porción dirigida a un tubo fotomultiplicador (TFM) de 90° y la otra dirigida a través de un polarizador a un TFM 90°D. Se utilizan varias combinaciones de estas cuatro mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitarias principales.
3. Otra metodología en uso es la utilización de enzimas como la peroxidasa, que producen diferentes tipos de reacciones citoquímicas, en los citoplasmas celulares. Debido a la actividad catalítica de la enzima mieloperoxidasa presente en los gránulos de los leucocitos se produce un precipitado de coloración oscura proporcional a la concentración de peroxidasa existente en cada subtipo de leucocito. Se utiliza un sistema óptico halógeno de campo oscuro con tungsteno para la medición de la absorbancia (proporcional al contenido de mieloperoxidasa de cada célula) y la dispersión frontal (proporcional al tamaño de cada célula).
Por este método se detectan neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos. Los basófilos se detectan al utilizar un reactivo que lisa las membranas celulares de todos, excepto la de ellos, así son detectadas como las células de mayor tamaño en esa dilución.
4. Existen equipos que poseen tecnología VCS, donde evalúan simultáneamente el volumen, la conductividad y la dispersión de luz de la célula. El volumen celular se determina por impedancia (corriente directa); la conductividad celular se determina por la corriente alterna (radiofrecuencia), que penetra en el interior celular a través de su bicapa lipídica y emite señales eléctricas compatibles con su composición interna (incluyendo la composición química y el volumen nuclear). La dispersión (scatter) de luz es la medida óptica de un haz de luz láser que al incidir sobre la célula dispersa luz a medios ángulos y representa la granulosidad de la célula.
· Volumen celular: Por impedancia (corriente directa).
· Conductividad celular: Por corriente alterna (radiofrecuencia).
· Dispersión de luz: Medida óptica de haz de luz láser dispersada a medios ángulos.
Transformación isovolumétrica
Reactivo específico que promueve la transformación isovolumétrica de eritrocitos y plaquetas en esferas. Determinación más cuidadosa y precisa de:
	BIOQUÍMICA CLÍNICA Y CUANTITATIVA I
	2018
· 
2
· Volumen.
· Concentración de Hb.
· Índice de refracción (PLT).
· CHCM directa por láser.
· HDW: SD de la concentración de Hb de una población de eritrocitos (g/dL).
· CH: Contenido en peso de Hb de cada eritrocito.
· CHDW (pg): SD de los CH de los eritrocitos.
Basándose en estos sistemas se creó un citograma para eritrocitos, cruzando valores del volumen vs. concentración de Hb que sirve de base para un sistema de alarmas (en cruces, basándose en el porcentaje de células) para células hipocrómicas, hipercrómicas, anisocromía, anisocitosis, microcitosis y macrocitosis.
FUNCIONAMIENTO DE LOS ANALIZADORES HEMATOLÓGICOS AUTOMATIZADOS
En general, todos los analizadores hematológicos aspiran un volumen exacto de sangre total (20-50 μL, según el equipo) que diluyen automáticamente (1:200 para leucocitos, 1:40000 para eritrocitos) en una cámara de mezcla. Para el recuento, las células una vez diluidas son transferidas a otro cámara y finalmente a los sistemas de recuento electrónicos, y en menos de 60 segundos suministran un completo informe de los aspectos cuantitativos (valores absolutos y relativos) y cualitativos de las células sanguíneas analizadas. 
Los reactivos utilizados son diluyente, lisante y detergente y deben cumplir los siguientes requisitos:
· Diluyente: Diluir las muestras sanguíneas, proporcionar a las células un entorno similar al del plasma sanguíneo, mantener el volumen celular durante el recuento, proporcionar un medio conductor para el recuento de glóbulos rojos, blancos y plaquetas por método de impedancia.
· Lisante: Romper las paredes de los glóbulos rojos, liberar la hemoglobina de la célula y reducir el tamaño de detritus celulares a un nivel que no interfiera con el recuento de leucocitos. 
· Detergente: Enjuagar las cubetas y tubos de medida.
Determinaciones
Hemoglobina (Hb)
Se realiza por medición fotométrica y pueden emplearse dos métodos:
1. Método de la cianometahemoglobina. La sangre aspirada se pone en contacto con el lisante de eritrocitos. La Hb liberada se transforma en metahemoglobina por acción del ferricianuro, para luego unirse al cianuro de potasio formando cianometahemoglobina de color estable que se mide fotométricamente. Los leucocitos no son lisados por lo que un alto número de ellos puede provocar interferencia. Así mismo, la presencia de un alto contenido de triglicéridos interfiere en la medición.
2. Método SLS-HGB, de tecnología más avanzada, ya que se realiza la determinación de Hb en un canal separado del recuento de leucocitos por lo que se puede utilizar un agente lítico más potente que el cianuro de potasio, que permite que los leucocitos también sean lisados y los lípidos digeridos, para que no interfieran en la determinación. Es un método igualmente satisfactorio y comparable, pero con la ventaja de presentar menor interferencia por turbidez, debida a triglicéridos altos o a un alto número de leucocitos y de ser el reactivo no tóxico y biodegradable.
Recuento de hematíes, leucocitos y plaquetas
El método más utilizado es impedancia eléctrica. Con el avance de la tecnología se comenzó a utilizar el método óptico de dispersión frontal de luz que informa sobre tamaño celular.
En contadores más avanzados se utiliza junto con la dispersión frontal de luz, fluorescencia como control de calidad del recuento de impedancia.
En el caso de las plaquetas se utiliza CD61 (antígeno plaquetario). Estos antígenos son reconocidos por anticuerpos monoclonales antiplaquetarios producidos en el laboratorio y a los cuales se les agrega un fluorocromo con el fin de ser detectados en el citómetro de flujo.
La recopilación de las señales electrónicas registradas constituye la información primaria; mediante procedimientos de digitalización, selección informática del umbral y cálculos matemáticos y estadísticos, los analizadores brindan informes numéricos y gráficos: histogramas y dispersogramas.
Informe numérico
Medición directa
Derivados del histograma
Parámetros calculados
Informe gráfico
Histogramas
Son gráficas de frecuencias de volúmenes celulares representados en el eje X (expresado en femtolitros) versus su número relativo representado en el eje Y. Femtolitros (fL) = 10-15L.
El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas. Los umbrales de tamaño separan las poblaciones celulares en el histograma, y el recuento corresponde a las células cuantificadas entre los umbrales fijos, inferior y superior, para cada población. Los histogramas están basados en comparaciones relativas, por ende, no se puede estimar valores absolutos en función del histograma.
Histograma de hematíes
La escala de proyección para hematíes es de 36 a 360 fL, el umbral inferiores de 36 fL, lo que significa que todas las partículas mayores a 36 fL se cuentan como hematíes. 
La curva normal de glóbulos rojos presenta distribución gausseana y se encuentra representada en tamaños de 50 a 130 fL, puede presentar una curva secundaria (dedo), ligeramente cóncava con muy poca altura que va desde 130 a 150 fL (eritrocitos que pasan juntos por la apertura). En los autoanalizadores en los que el recuento se realiza por enfoque hidrodinámico, se elimina la coincidencia celular. El histograma muestra el tamaño real de los hematíes.
A partir de este histograma se pueden determinar otros parámetros:
· VCM: Calculado del área completa bajo la curva y expresado en fL. Microcitosis < 82 normal 98 < macrocitosis.
· ADE: Informa sobre el grado de anisocitosis o presencia de eritrocitos con diferente tamaño. Se puede expresar como CV o SD. 
· .
· : Asumiendo que la altura máxima del pico de la curva representa el 100%, el ancho de distribución eritrocitaria será tomado a una altura del 20% de la distribución del gráfico. A esta altura es donde se encuentra la mayor variación de tamaños de las células. Analizando cómo se determina ADE-CV se puede observar que el mismo está influenciado por el VCM, en cambio el ADE-SD es una medición directa del ancho de la curva, se independiza del VCM. Esto adquiere importancia ante la presencia de VCM extremos (muy chicos o muy grandes) que afectan el ADE-CV y no el ADE-SD. Cuanto mayor es el ADE, mayor es la anisocitosis.
La observación del histograma o curva de distribución de los eritrocitos según su tamaño, resulta especialmente útil en caso de que existan dos poblaciones eritrocitarias con diferente VCM, en este caso el ADE estará muy aumentado, pero ningún parámetro numérico informará curva bimodal. Por ejemplo en caso de tratamiento de las anemias carenciales. En este caso tener en cuenta que el VCM aportado por el contador es poco útil ya que promedia los tamaños en una curva muy amplia.
El hematocrito, HCM y CHCM son calculados a partir de otros parámetros.
Hematocrito
 
Algunos contadores lo miden electrónicamente, a través de la altura del pulso acumulado, comparando el volumen total o acumulado de hematíes con respecto al volumen de sangre completa en la dilución. De esta manera el valor del hematocrito se define como:
; basado en el principio de que el pulso producido cuando un hematíe pasa a través de la apertura es proporcional al volumen de la célula.
Hemoglobina corpuscular media
Indica el peso promedio de la Hb en el hematíe. Se correlaciona con el VCM, de modo que la HCM disminuye cuando disminuye el VCM y aumenta cuando este lo hace.
 
Concentración de hemoglobina corpuscular media
Concentración promedio de Hb en los hematíes. Determinada indirectamente a partir de la concentración de Hb y HCT.
; hipocromía < 32 normal 36 < evaluar escasos casos fisiológicos en donde puede aumentar o considerar errores. El aumento de la CHCM puede ocurrir en casos en los que haya pérdida de área del hematíe, sin haber pérdida del contenido de hemoglobina o cuando hay pérdida de líquido del hematíe hacia el medio extracelular. Por lo que solamente puede aumentar en esferocitosis, drepanocitosis, deshidratación severa (exceso de equinocitos deshidratados, como por ejemplo en insuficiencia renal aguda). Un hematíe macrocítico (VCM aumentado) tiene más hemoglobina en peso (aumento HCM) pero es normoconcentrado de hemoglobina, por lo tanto su CHCM es normal, no aumentada, no contiene más Hb que su saturación.
Algunos contadores hematológicos informan CHCM directa obtenida por la tecnología láser. Miden la concentración interna de Hb en cada eritrocito, hacen sumatoria y la dividen por el número de hematíes contados. Realizan un gráfico CHCM vs frecuencia. El desvío de esa CHCM directa se informa como HDW (grado de anisocromía).
CHCM es un dato útil para controlar el trabajo diario, porque si da sistemáticamente en el límite inferior o superior, o fuera del límite superior se debe revisar la calibración del analizador hematológico. Sus variaciones suelen ser muy pequeñas, puede dar normal incluso en presencia de hipocromía.
Histograma de plaquetas
La curva normal de plaquetas es cónica, con una representación amplia en tamaños que va desde 2 a 20 fL. El histograma representa el tamaño natural de las plaquetas.
Dado que el recuento y distribución de plaquetas se realiza en la misma dilución de los glóbulos rojos, los hematíes microcíticos pueden incluirse en el recuento plaquetario, e introducirse en el extremo superior del histograma. A su vez, todas las partículas pequeñas como burbujas, polvo, fragmentos celulares pueden interferir en el extremo inferior. 
A partir de este histograma se pueden determinar otros parámetros como:
· VPM: Promedio del volumen de las plaquetas.
· PDW: Ancho de distribución plaquetaria.
· P-LCR: Porcentaje de plaquetas mayores de 12 fL.
· PCT: Plaquetocrito, medida del paquete de plaquetas en 100 mL de sangre.
Histograma de glóbulos blancos
El agente lisante destruye la membrana citoplasmática de leucocitos, colapsa el citoplasma alrededor del núcleo, por lo que el histograma no muestra tamaños reales. El tamaño de cada población será relativo al tamaño y forma nuclear. Así los linfocitos que poseen núcleo más pequeño serán la población más pequeña, el tamaño de los granulocitos será la sumatoria de sus lóbulos más las granulaciones perinucleares, lo que dará como resultado ser considerados de mayor tamaño. De este modo, los leucocitos se agrupan formando tres curvas claramente definidas y éstas configuran la arquitectura normal del histograma de glóbulos blancos.
La escala de proyección para leucocitos es de 30 a 450 fL, el umbral es de 35 fL. Se grafican las diferentes poblaciones de leucocitos. Primera curva corresponde a Linfocitos, segunda a células intermedias y por último la curva de granulocitos. Tener en cuenta que ante la presencia de células nucleadas como eritroblastos, estos aparecerán graficados a la izquierda del histograma, antes de la curva de linfocitos.
· Curva de linfocitos: Cónica, 35-90 fL.
· Curva de intermedios: Plana a cóncava, 90-160 fL.
· Curva de granulocitos: Cóncava y ancha, 160-450 fL.
A partir del recuento total de leucocitos, y de los datos obtenidos del histograma, el analizador calcula los valores absolutos de las tres poblaciones.
Los eritroblastos se informan como número de eritroblastos cada 100 leucocitos, pero no forman parte de la fórmula leucocitaria.
Dispersogramas
Son otro tipo de representación gráfica utilizada para el recuento diferencial de glóbulos blancos y para el recuento óptico de plaquetas.
El recuento diferencial leucocitario lo realiza dividiendo la población leucocitaria en cinco partes (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos, monocitos). Los gráficos obtenidos con los equipos son tridimensionales, pero dada la imposibilidad de presentarlos en esta forma existen diferentes cortes para su presentación plana, cada equipo comercial presenta uno o más gráficos (los que a su juicio son los más representativos para la tecnología empleada). Por lo anterior, es necesario que al analizar los dispersogramas aportados por cada equipo se preste atención a los parámetros que se grafican y, sobre todo, al esquema de representación normal para cada propuesta, el cual es diferente en cada caso.
Dispersogramas de los equipos más utilizados:
1. Citometría de flujo fluorescente: El diagrama de dispersión muestra la intensidad de la luz dispersa lateral en el eje X y la intensidad de la luz fluorescente en el eje Y. Un surfactante del reactivo induce la lisis de los eritrocitos y las membranas celulares de los leucocitos se perforan dejando poros ultramicroscópicos a través de los cuales pasa un marcador fluorescente con base de polimetina para unirse a los ácidos nucleicos. A continuación, esta muestra se analiza mediante citometría de flujo con fluorescencia. Cuando son expuestos al a luz láser de 633 nm, la intensidad de fluorescencia detectada es directamente proporcional al contenidode ácidos nucleicos de la célula.
2. Equipos con tecnología MAPSS: La información de la dispersión en ángulos diferentes se traza en varias combinaciones.
· 90° vs. 10° (lobularidad vs. complejidad): Permite la separación de las subpoblaciones mononucleares (MONO) y polimorfonucleares (POLY). Los basófilos se agrupan con los mononucleares porque en este análisis los gránulos de los basófilos se disuelven en el reactivo y el mismo degranulado es considerado por el equipo una célula menos compleja.
· 0° vs. 10° (tamaño vs. complejidad): Se grafica la subpoblación MONO. Se observan con claridad tres poblaciones (linfocitos, monocitos y basófilos).
· 90°D vs. 90° (granularidad vs. lobularidad): La subpoblación GRAN se grafica en este trazado de dispersión. Debido a la naturaleza singular de los gránulos de los eosinófilos, éstos dispersan la luz más de 90°D, lo que permite la separación clara de eosinófilos y neutrófilos.
3. Tecnología citoquímica: Los datos son mostrados en dos dimensiones, graficando tamaño celular (dispersión de luz) vs. actividad peroxidasa. Se mide la luz dispersa a:
· Altos ángulos (5 a 15 grados) reflejando la complejidad-lobularidad de la célula que se grafica en el eje X.
· Bajos ángulos (2 a 3 grados) reflejando el volumen celular que se grafica en el eje Y.
Recuento óptico de plaquetas
Es un análisis complementario al conteo por impedancia. Generalmente se realizan en simultáneo. Se debe tener en cuenta que el método óptico es más efectivo en la localización y exclusión de elementos no plaquetarios.
A. Recuento de plaquetas con citometría de flujo: Las plaquetas se tiñen de verde con Auramina O (colorante fluorescente que se une al ARN celular). La intensidad de fluorescencia determina el contenido del ARN de la plaqueta. En el dispersograma se grafica, dispersión lateral (eje X) fluorescencia proporcional al contenido de RNA vs. dispersión frontal (eje Y) proporcional al tamaño.
B. Equipos MAPSS: Se utiliza análisis óptico de doble ángulo, que posee la virtud de eliminar las interferencias más comunes, como los fragmentos celulares o eritrocitos de pequeño tamaño. Se mide luz dispersa a 7° vs. 90°.
Con esta última tecnología mencionada, se ofrece un tercer método de recuento de plaquetas, el recuento inmunológico de plaquetas con anticuerpos monoclonales CD61 específico de plaquetas. Este método opcional suministra valiosa información en los recuentos críticos de plaquetas debidos, por ejemplo, a sustancias de interferencia (fragmentos de glóbulos rojos, fragmentos citoplasmáticos de leucocitos, etc.) donde el impacto de dichas interferencias por elementos no plaquetarios se vuelve proporcionalmente más alto a medida que el recuento de plaquetas es más bajo, mejorando la gestión del paciente y los criterios transfusionales.
El método inmunológico diseñado para la exclusión de estos interferentes es el recuento por CD61. Para correr el ensayo, se coloca un tubo CD61 en el lugar contiguo al tubo de hemograma en la gradilla. Este tubo contiene el anticuerpo monoclonal anti-CD61 marcado con fluorescencia. El instrumento dispensa la muestra en el tubo con CD61, la mezcla y la incuba previo a pasarla por la celda de flujo de óptica y fluorescencia. De esta manera, sólo son consideradas plaquetas, aquellas con fluorescencia positiva.
Pseudotrombocitopenia por EDTA
Falsa disminución de la cuenta plaquetaria por debajo del valor normal inferior (menos de 150.000/μL) cuando se mide en sistemas automatizados. Secundaria a la formación de agregados plaquetarios en las muestras sanguíneas, o a la formación de rosetas de plaquetas alrededor de los neutrófilos (“satelitismo plaquetario”).
Autoanticuerpos plaquetarios que se comportan como aglutininas frías, dependientes del anticoagulante EDTA. Generalmente tipo IgG aunque se han descrito de clase IgA e IgM, dirigidos contra el complejo GPIIb/IIIa de la membrana plaquetaria. Los anticuerpos que median el satelitismo plaqueta-neutrófilos son capaces de reaccionar con un epitope en la GPIIb/IIIa de la plaqueta y con el receptor FcγIII del neutrófilo.
La aglutinación de las plaquetas puede resultar en la formación de grumos de tamaño similar a los leucocitos, que son difíciles de distinguir en un contador automático reconociéndolos como leucocitos, lo que resulta en pseudoleucocitosis.
· Principal causa de pseudotrombocitopenia.
· Consecuencia: Agregación de plaquetas in vitro ante EDTA.
· Características: Trombocitopenia, pseudoleucocitosis, tiempo de sangrado, coagulación y fibrinógeno en rango normal, así como los agregados plaquetarios en el frotis de sangre.
· Resolución: Recolección de la muestra con citrato como anticoagulante y conteo de PLT en frotis.
Recuento de reticulocitos
El reticulocito es definido en esta metodología como un estadio en el desarrollo del eritrocito antes de que este pierda el núcleo, en el cual la célula contiene cantidades medibles de RNA. La automatización involucra el uso de colorantes fluorescentes que se unen a ácidos nucleicos, como Thiazol naranja, Auramina O, Polyrnethine, Oxazina 750, tiazina azul de metileno N (nuevo), CD4KS30, de acuerdo a cada equipo comercial.
Estos analizadores evalúan los reticulocitos basados en la dispersión óptica o la fluorescencia después de tratar los eritrocitos con colorantes fluorescentes o la coloración del ácido nucleico para teñir el RNA residual en los reticulocitos.
· Analizador de reticulocitos con tecnología de fluorescencia que utiliza Auramina O, un colorante fluorescente supravital y mide la dispersión frontal y la fluorescencia lateral cuando las células se dirigen a través de un flujo celular laminar por el que pasa un láser de argón. Las señales se trazan en un diagrama de dispersión con intensidad de dispersión frontal, que se correlaciona con el tamaño, graficado con respecto a la intensidad de la fluorescencia, que es proporcional al contenido de RNA. Estos equipos informan en el canal de reticulocitos:
· Recuento exacto de reticulocitos en porcentaje y número de la fracción de reticulocitos inmaduros (IRF).
· Medición del equivalente de Hb de los reticulocitos (RET-He). Es un parámetro que es usado para medir la incorporación de hierro a la Hb del eritrocito. Esto permite la evaluación de una anemia y además es un parámetro usado en guías médicas de enfermedades renales.
· Actualmente se cuenta con analizadores más avanzados que utilizan la tecnología MAPSS pero agregan la detección fluorescente para el recuento de reticulocitos automatizado por completo. Los eritrocitos se colorean con un colorante fluorescente, que atraviesa la membrana (CD4KS30) que se une de modo estequiométrico con el ácido nucleico y emite luz verde a medida que las células atraviesan un flujo celular laminar por el que pasa un láser del ion argón. Las plaquetas y los reticulocitos se separan de acuerdo con la intensidad de fluorescencia verde (dispersión medida a 7° y 90°) y se determina el recuento de reticulocitos junto con el IRF. 
· Analizadores que cuantifican los reticulocitos en el mismo flujo de células óptico con láser utilizado en los canales eritrocitos, plaquetas y BASO descritos antes. El reactivo para reticulocitos contiene Oxazina 750, un colorante que se une al ácido nucleico. Tres detectores miden la dispersión en ángulo bajo (2-3°), la dispersión en ángulo alto (5-15°) y la absorbancia en forma simultánea a medida que las células pasan a través del flujo celular. Se generan tres citogramas:
· Dispersión en ángulo alto con respecto a la absorción.
· Dispersión en ángulo bajo con respecto a la dispersión en angulo alto.
· Volumen con respecto a la concentración de Hb.
El citograma de absorción permite la separación y la cuantificación de los reticulocitos, con subdivisión adicional en células absorbentes bajas, medias y altas basadas en la cantidad de coloración. La suma de las células absorbentes medias y altas refleja el IRF.
Se proporcionan varios índices de reticulocitos:
· VCMr: Volumen celular reticulocitario.
· CHCMr: Concentración de Hb reticulocitario.· CHr: Contenido de Hb celular reticulocitaria. Es una medida directa de la Hb presente en los reticulocitos nuevos en sangre periférica. Indican la disponibilidad de hierro para una óptima eritropoyesis.
· RDWr: Distribución de la población de reticulocitos.
La IRF es un indicador confiable de cambios en la actividad eritropoyética y una herramienta valiosa para el monitoreo terapéutico en los pacientes con insuficiencia renal crónica. 
La medición de la madurez de reticulocitos también puede ser útil para evaluar la supresión de la médula ósea durante la quimioterapia, el monitoreo de la regeneración hematopoyética después del trasplante de médula ósea o células troncales, la supervisión de la aceptación del trasplante renal y la supervisión de la eficacia del tratamiento para la anemia.
MÉTODOS AUTOMATIZADOS PARA LA DETERMINACIÓN DE ERITROSEDIMENTACIÓN (VSG)
Existen en el mercado sistemas parcial o totalmente automatizados. Un ejemplo de sistema semiautomatizado es el de Sediplast® (Polymedco), que utiliza pipetas regladas con citrato sódico al 3,8 g%, para un volumen de muestra de 1 mL. Además de este sistema existen otros que utilizan directamente el tubo de hemograma y así evitan manipulaciones intermedias. En este caso, aunque el método empleado sigue el principio de Westergren (al igual que el anterior), en lugar de sangre citratada emplean sangre anticoagulada con EDTA, lo que permite organizar una estación de trabajo única para hematología (medición de VSG, recuentos celulares y análisis diferencial sobre una misma muestra). 
La mayoría de estos sistemas llevan a cabo un mezclado automático de la muestra y utilizan sistemas de lectura basados en fotometría de luz que cuantifica el progreso de los procesos de agregación y sedimentación de los eritrocitos en función del tiempo.