COLOQUIO 2

Vista previa del material en texto

COLOQUIO 2. CALIBRACIÓN Y ESTUDIO DE LA LINEALIDAD
La calibración instrumental y metodológica, son 2 facetas de la química analítica que representan 2 instancias diferentes y complementarias, claves para cuantificar.
CALIBRACIÓN INSTRUMENTAL O DE EQUIPOS
Verificación de que un instrumento o aparato (espectrofotómetros, fluorímetros, fotómetros de llama, Cromatógrafos) funcione correctamente, determinante en la calidad analítica de los resultados emitidos. Cuyo objetivo es corregir la respuesta del aparato hasta alcanzar un valor considerado como verdadero.
CALIBRACIÓN METODOLÓGICA
Implica encontrar la relación matemática entre los valores de concentración de una serie de patrones y la señal analítica que estos producen en un equipo de medición (fotómetro, fluorímetro).
Procedimiento
1. Preparación de patrones
A partir de una solución madre, de concentración perfectamente conocida (exacta), preparada a partir de drogas solidas pro-análisis (99,9 % de pureza), se preparan 5 soluciones patrón, de concentraciones crecientes equidistantes, por triplicado, más un blanco (concentración igual a cero).
2. Registro de la señal analítica de patrones
Cada solución patrón se coloca en el instrumento de medida y se registra la señal, que variará (o no) según la concentración del analito de interés.
3. Ordenamiento de los datos (tablas)
4. Estudio de los datos
a. Construcción de un gráfico: señal analítica vs. Concentración. Dibujar pares de valores (concentración (x), señal analítica (y)). Luego, observar la distribución de estos puntos y trazar una línea que pase por el mayor número de ellos.
b. Estudio de los rangos de la curva.
Las curvas de calibrado se dividen en 3 regiones:
1. Rango Lineal: zona lineal, presente a [↓]. Su límite inferior se corresponde con el Límite de Cuantificación (LOQ). Es el de elección para la cuantificación debido a que:
a. Cuando las [↑] ocurren interacciones (choques) entre moléculas del analito a cuantificar, razón por la cual las curvas de calibrado a [↑] se desvían. Es preferible trabajar cuando las moléculas se comportan como entes independientes.
b. Una de las propiedades que debe cumplir un transductor o detector es tener una respuesta constante en un amplio intervalo de λ y que responda de manera lineal frente al ↑ del n° de moléculas en solución.
c. Para el cálculo, siempre es más fácil predecir una [] con una ecuación de 1° orden y no superior, ya que al ser lineal se puede ajustar con una ecuación simple (y = A x + B).
2. Rango dinámico: desde la menor [detectable] hasta la pérdida de relación entre respuesta y concentración, es decir, abarca el rango lineal y la región donde la recta se transforman en una curva. Su límite inferior se corresponde con el Límite de Detección (LOD). Se puede cuantificar gráficamente o en el caso de disponer de un software que permita realizar una regresión exponencial, logarítmica o polinómica, puede también cuantificarse mediante ecuación matemática.
3. Pérdida de la relación entre respuesta instrumental y concentración: Región donde la concentración es demasiado elevada y se pierde la relación con la respuesta instrumental, es decir, por más que siga aumentando la concentración, la señal analítica permanece constante. No puede utilizarse para cuantificar, no aporta información ya que no existe relación entre señal analítica y concentración (r0). Dicha zona se descarta
c. Estudio de la linealidad
1. Gráficamente
a. Curva de calibrado: Señal Analítica vs Concentración
b. Gráfico de los Residuos (ep,n= y p,n yˆ p,n) vs Concentración.
Herramienta eficaz para determinar el cumplimiento o no de la linealidad. Es útil tanto para verificar los supuestos de normalidad, homocedasticidad, como así también evaluar la linealidad, además brinda información sobre la incertidumbre en la preparación de los patrones. Hacer hincapié en la necesidad de contar con patrones cuya [] se conozca con mayor precisión que el ruido instrumental, y así suponer que el error cometido en “x” es despreciable.
El modelo de RL también supone que los residuos siguen una distribución normal; para evaluarlo, se utiliza el gráfico cuantil-cuantil (Normal Q-Q): permite comparar la distribución de los residuos con la distribución normal teórica. Por lo tanto, si los residuos tienen una distribución normal deberías observar que siguen aproximadamente la línea recta diagonal en el gráfico Q-Q normal, en caso contrario los residuos se van a apartar de la diagonal.
Homocedasticidad: propiedad deseable de los errores de un modelo de RL simple. Significa homo (igual) y cedasticidad (dispersión). Supone que para cada valor de variable independiente (eje x), la varianza de los residuos es constante a lo largo de las observaciones (eje y). Para ver si el modelo tiene esta propiedad, es decir, ver si la varianza de sus errores es constante, calcularemos los residuos y los representaremos en el gráfico de residuos frente a las predicciones, permite evaluar:
· Si se utilizó el tipo de relación adecuada. Entonces, si el tipo de modelo utilizado no es el adecuado habrá sesgos o tendencias en los residuos.
· Si la varianza es constante (homocedasticidad) o por el contrario existen problemas de dispersión irregular (heterocedasticidad). Uno de los supuestos del modelo de RL es que la varianza de los residuos es constante, es decir, los residuos se distribuyen al azar alrededor del 0.
· Si existen datos extremos (outliers) que perturben e invalidar el modelo. Este tipo de datos se aparta del comportamiento del resto de residuos, tendrán un valor muy distinto al 0.
2. Pruebas estadísticas F:
a. F = (Sfit )2 / (Sy)2
b. F= (Sfit)2 / 2
Se evalúa la linealidad es a través de la relación que existe entre la variancia de la RL {medida por (Sfit)2} y la del ruido instrumental {medida por (Sy)2 o por ()2}. Si (Sfit)2 es significativamente mayor que las otras 2, se supone que hay causas de desvío de la linealidad estadísticamente superiores al ruido en la respuesta. Para emplear estas pruebas es esencial que se cumpla el supuesto bajo el cual se realiza el ajuste lineal, esto es, que no existan errores en las concentraciones. De lo contrario, se acumularían en Sfit incertidumbres provenientes de las [patrones], las cuales no estarán relacionadas con ruido instrumental. Tanto Sy como son desviaciones de la variable dependiente (y).
Para aceptar que el conjunto de datos se ajusta según la ecuación de una recta, debe cumplirse para:
a) F=(Sfit)2/(Sy)2 que: Fcalc<Ftab para (M-2, M-P, 1- α, una cola)
b) F=(Sfit)2/2 que: Fcalc<Ftab para (M-2, 20, 1- α, una cola)
Con 1- α representando un determinado nivel de probabilidad (por ejemplo, si α = 0.05, sería para un 95% de probabilidad).
· En la ecuación de Sfit se utilizan M-2 grados de libertad, ya que existen M datos disponibles y 2 parámetros estimados en la regresión (a y b).
· En la ecuación de Sy, el denominador es M-P, ya que de los M datos disponibles, P grados de libertad se reservan para el cálculo de las P medias de nivel (yp , una por nivel de concentración).
· Alternativamente, a partir del Fcalculado se calcula la probabilidad asociada a este valor (pF) y se considera que la prueba de linealidad es aceptada si pF> 0,05.
c. Análisis de la varianza residual F= MSlof/ MSe
Test estadístico más utilizado en publicaciones científicas.
Debe cumplirse:
Fcalc < Ftab
Para (P-2, M-P, 1- ).
Donde Fcalc es
F = MSlof / MSE
EXTRA (r2): Al realizar una RL, además de calcular la pendiente y la ordenada al origen, los programas normalmente informan el Coeficiente de Determinación, r2. Este coeficiente, para el caso de una RL, es el cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson r, y se define:
r2 tendrá valores entre 0 y 1. En el denominador se halla la suma de cuadrados total (SSE). En el numerador, al denominador, se le resta la suma de cuadrados explicada por la regresión (SSR). Notar que si la variación es totalmente explicada por la regresión lineal (SSR=0), entonces r2 valdrá 1. 
Es importante aclarar que ni r ni r2 deben ser considerados estimadoresde linealidad, sino de correlación.
5. Cuantificación
Predicción de la [analito] en la muestra incógnita y puede efectuarse de 2 maneras: 
a) Cuantificación gráfica
Obtener la [analito] en la muestra ingresando en la curva de calibrado, sea esta una recta o no, con el valor de “Señalmuestra“ e interpolando
b) Cuantificación matemática.
Luego de realizar la gráfica de la curva de calibrado, se observa que tipo de función matemática ajusta mejor la distribución de los datos.